CN116068167A - 一种胞外生物大分子的分离和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种胞外生物大分子的分离和检测方法,属于分子生物技术领域。所述方法包括采用荧光染料标记目标胞外生物大分子的步骤,采用磁捕获子和外加磁场分离胞外生物大分子的步骤,采用粒子分析检测设备进行单纳米颗粒分析,所述捕获剂为能与目标胞外生物大分子结合的捕获剂。所述方法具有操作步骤少,准确性高,胞外生物大分子生物特征破坏少等优点,有临床应用的巨大潜力。
Description
技术领域
本发明属于分子生物技术领域,具体涉及一种胞外生物大分子的分离和检测方法。
背景技术
胞外生物大分子为细胞外的核酸、蛋白、碳水化合物或脂质或其组合。例如细胞外可作为肿瘤标志物的蛋白,例如血清肿瘤标志物蛋白,例如CEA、AFP、CA19-9、SCC、NSE、CK19、CA125、CA 15-3、CA 19-9;例如细胞外具有临床诊断价值的核酸,例如细胞外具有临床诊断价值的脱氧核糖核酸;例如血浆循环肿瘤细胞释放的游离脱氧核糖核酸;例如细胞外具有质膜结构生物大分子,例如细胞外囊泡;例如细胞外有生命特质的核蛋白颗粒,例如体液中具有致病或者感染性的病原体,例如具有血液感染性的病毒,例如血液中艾滋病病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、巨细胞病毒。
近年来,随着人们对胞外生物大分子的研究和认识加深,胞外生物大分子检测作为一种新型的液体活检热点技术已被许多临床科研机构广泛地应用于肿瘤和疾病的无创诊断、治疗和监测;如何高效地提取胞外生物大分子是实现这项新兴液体活检技术临床常规化应用的关键。胞外生物大分子作为液体活检的三大领域之一,其潜在的生物靶标众多,但能同时将微量核酸和蛋白,通常,为获取纯度高的胞外生物大分子,需要应用到外泌的分离技术。
传统的胞外生物大分子富集分离方法有超速离心法、聚合物沉淀法等,它们普遍的缺点共性是纯度差、得率低、批间差异大。免疫磁珠吸附法能够克服上述缺点具有临床应用的潜力。尽管如此,以上所述技术包括传统的免疫磁珠吸附法均只能分离的胞外生物大分子中一个其中一个总组分(例如总胞外生物大分子或总的外囊泡),无法对特定亚群的胞外大分子(例如胞外生物大分子),当然也就无法实现使用特定来源胞外大分子亚群反映疾病程度的目的。传统的免疫磁珠吸附法缺陷还包括:
1.无法洗脱,即使能够洗脱也需要借助极端的物理条件(高温、强碱强酸),这无疑造成了胞外生物大分子的损失或破坏;
2.目前流行的免疫磁珠分离胞外生物大分子的方法中,只能收获总胞外生物大分子,意味着具有疾病标志物的特定胞外生物大分子受到总胞外生物大分子中干扰,使得其被检出的灵敏度受限。在精准医学不断发展的今天,根据不同细胞来源对胞外大分子进行精准分型成为迫切需要解决的问题,这一要求,也是液体活检开发进步以及应用于临床的第一步。
3.目前的无损洗脱效果的磁珠均需要借助洗脱试剂实现洗脱效果,并且这种洗脱试剂往往是过量的,这些过量的洗脱剂浓度高导致背景高,影响检测。而且一些洗脱试剂浓度过高有可能把胞外生物大分子上的有意义的组分都给洗脱和破坏了。所以需要一种高效洗脱且洗脱试剂浓度可控的方案来兼容下游的单颗粒分析。
因此,仍亟需一种检测准确度高,操作简便,且能对胞外生物大分子的单颗粒进行分离和检测的方法。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供一种胞外生物大分子的分离和检测方法。
一种生物液体中胞外生物大分子的分离和检测方法,其包括:采用荧光染料标记目标胞外生物大分子的步骤,采用磁捕获子和外加磁场分离胞外生物大分子的步骤,采用粒子分析检测设备进行单纳米颗粒分析,所述捕获剂为能与目标胞外生物大分子结合的捕获剂;所述磁捕获子包括固相载体、连接介质和捕获剂,或者所述磁捕获子包括固相载体和捕获剂。
在一些实施例中,所述荧光染料含能与目标胞外生物大分子结合的适配结构。
在一些实施例中,所述磁捕获子中的捕获剂为能与目标胞外生物大分子结合的捕获剂。在一些实施例中,所述磁捕获子中的捕获剂为能与目标胞外生物大分子特异性结合的捕获剂。
在本发明的一些实施方式中,一种生物液体中胞外生物大分子的分离和检测方法,其包括:
步骤S1:所述荧光染料含能与目标胞外生物大分子结合的适配结构,使荧光染料与目标胞外生物大分子通过适配结构结合;
步骤S2:所述磁捕获子中的捕获剂为能与目标胞外生物大分子结合的捕获剂,使磁捕获子与目标胞外生物大分子通过捕获剂结合;
步骤S3:通过外加磁场,将目标胞外生物大分子与生物液体分离;
步骤S4:用洗脱液解除磁捕获子与目标胞外生物大分子的结合,并除去固相载体固相载体;
步骤S5:经过步骤S1、S2、S3和S4后,得到结合荧光染料的目标胞外生物大分子,采用粒子分析检测设备对结合荧光染料的目标胞外生物大分子进行单纳米颗粒分析;
其中,所述步骤S1、步骤S2、步骤S3、步骤S4和步骤S5的顺序为:(1)步骤S1→步骤S2→步骤S3→步骤S4→步骤S5;或者(2)步骤S2→步骤S1→步骤S3→步骤S4→步骤S5;或者(3)步骤S1和步骤S2同时进行→步骤S3→步骤S4→步骤S5;或者(4)步骤S2→步骤S3→步骤S1→步骤S4→步骤S5。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述步骤S1、步骤S2、步骤S3、步骤S4和步骤S5的顺序为:步骤S2→步骤S3→步骤S1→步骤S4→步骤S5。采用本实施方式,有利于免去超速离心去除染料的步骤,避免超速离心对目标胞外生物大分子的破坏,具有操作步骤少,准确性高,胞外生物大分子生物特征破坏少等优点。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述步骤S1、步骤S2、步骤S3、步骤S4和步骤S5的顺序为:步骤S1→步骤S2→步骤S3→步骤S4→步骤S5。采用本实施方式,有利于免去超速离心去除染料的步骤,避免超速离心对目标胞外生物大分子的破坏,具有操作步骤少,准确性高,胞外生物大分子生物特征破坏少等优点。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述步骤S1、步骤S2、步骤S3、步骤S4和步骤S5的顺序为:步骤S1和步骤S2同时进行→步骤S3→步骤S4→步骤S5。采用本实施方式,有利于免去超速离心去除染料的步骤,避免超速离心对目标胞外生物大分子的破坏,具有操作步骤少,准确性高,胞外生物大分子生物特征破坏少等优点。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述步骤S1、步骤S2、步骤S3、步骤S4和步骤S5的顺序为:步骤S2→步骤S1→步骤S3→步骤S4→步骤S5。采用本实施方式,有利于免去超速离心去除染料的步骤,避免超速离心对目标胞外生物大分子的破坏,具有操作步骤少,准确性高,胞外生物大分子生物特征破坏少等优点。
所述固相载体可以包括选自纳米磁珠或者固相芯片。
所述固相载体可以具有超顺磁性。
所述固相载体可以负载有官能基团。
所述纳米磁珠可以为具有超顺磁性的纳米磁珠。
所述固相载体的粒径可以为10nm-2000nm。在一些实施例中,所述固相载体的粒径为100nm-1200nm。在一些实施例中,所述固相载体的粒径为30nm-200nm。
在本发明的一些优选实施方式中,一种生物液体中胞外生物大分子的分离和检测方法,其包括:将荧光染料与生物液体混合,所述荧光染料含能与目标胞外生物大分子结合的适配结构,孵育,使荧光染料与目标胞外生物大分子通过适配结构结合;再加入磁捕获子,所述磁捕获子中的捕获剂为能与目标胞外生物大分子结合的捕获剂,孵育,使磁捕获子与目标胞外生物大分子通过捕获剂结合;置外加磁场进行分离富集,去除上清液,洗涤,将目标胞外生物大分子与生物液体分离,得到结合荧光染料和磁捕获子的目标胞外生物大分子,用洗脱液洗脱解除磁捕获子与目标胞外生物大分子的结合,并除去固相载体,得到结合荧光染料的目标胞外生物大分子;采用粒子分析检测设备对包含荧光染料的目标胞外生物大分子进行单纳米颗粒分析。
在本发明的一些优选的实施方式中,一种生物液体中胞外生物大分子的分离和检测方法,其包括:将磁捕获子与生物液体混合,所述磁捕获子中的捕获剂为能与目标胞外生物大分子结合的捕获剂,孵育,使磁捕获子与目标胞外生物大分子通过捕获剂结合;再加入荧光染料,所述荧光染料含能与目标胞外生物大分子结合的适配结构,孵育,使荧光染料与目标胞外生物大分子通过适配结构结合;置外加磁场进行分离富集,去除上清液,洗涤,将目标胞外生物大分子与生物液体分离,得到结合荧光染料和磁捕获子的目标胞外生物大分子,用洗脱液洗脱解除磁捕获子与目标胞外生物大分子的结合,并除去固相载体,得到结合荧光染料的目标胞外生物大分子;采用粒子分析检测设备对包含荧光染料的目标胞外生物大分子进行单纳米颗粒分析。
在本发明的一些优选的实施方式中,一种生物液体中胞外生物大分子的分离和检测方法,其包括:将磁捕获子和荧光染料与生物液体混合,所述磁捕获子中的捕获剂为能与目标胞外生物大分子结合的捕获剂,所述荧光染料含能与目标胞外生物大分子结合的适配结构,孵育,使磁捕获子和荧光染料与目标胞外生物大分子通过捕获剂结合;置外加磁场进行分离富集,去除上清液,洗涤,将目标胞外生物大分子与生物液体分离,得到结合荧光染料和磁捕获子的目标胞外生物大分子,用洗脱液洗脱解除磁捕获子与目标胞外生物大分子的结合,并除去固相载体,得到结合荧光染料的目标胞外生物大分子;采用粒子分析检测设备对包含荧光染料的目标胞外生物大分子进行单纳米颗粒分析。
在本发明的一些的实施方式中,一种生物液体中胞外生物大分子的分离和检测方法,其包括:将磁捕获子与生物液体混合,所述磁捕获子中的捕获剂为能与目标胞外生物大分子结合的捕获剂,孵育,使磁捕获子与目标胞外生物大分子通过捕获剂结合;置外加磁场进行分离富集,去除上清液,洗涤,将目标胞外生物大分子与生物液体分离;将荧光染料与目标胞外生物大分子混合,所述荧光染料含能与目标胞外生物大分子结合的适配结构,孵育,使荧光染料与目标胞外生物大分子通过适配结构结合,通过离心、超滤或透析除去游离的荧光染料,得到结合荧光染料和磁捕获子的目标胞外生物大分子,用洗脱液解除磁捕获子与目标胞外生物大分子的结合,并除去固相载体,得到结合荧光染料的目标胞外生物大分子;采用粒子分析检测设备对结合荧光染料的目标胞外生物大分子进行单纳米颗粒分析。
在一些实施例中,所述捕获剂可以包括选自多肽、蛋白质、抗体、配体和/或受体、酶、生长因子、糖脂类、多糖、核酸中的至少一种或其组合。
在一些实施例中,所述捕获剂为抗体、脂类、多糖中的至少一种或其组合。
在一些实施例中,所述抗体包括选自CD9抗体、CD63抗体、CD81抗体、TIM4蛋白、Annexin V蛋白、细胞外囊泡蛋白特异抗体、疾病标志物蛋白特异抗体或病毒特异抗体中的至少一种或其组合。
在一些实施例中,所述疾病包括肿瘤、炎症、慢性病或神经退行性疾病等。
在一些实施例中,所述脂类包括选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基丙烷、1,2-二油酰-3-三甲基-丙烷、3β-[N-(N',二甲基氨基乙烷盐酸盐)-氨基甲酰基]胆固醇、1,2-二-O-十八碳烯基-3-二甲基的丙烷、1,2-二油酰-3-二甲基-丙烷、蛋磷脂酰胆碱、L-α-磷脂酰胆碱、胆固醇、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、饱和脂肪酸、1-1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]中的至少一种或其组合。
在一些实施例中,所述多糖包括选自肝素、聚乳糖胺、α2,6结合唾液酸、高甘露糖聚糖、复合型N-糖链中的至少一种或其组合。
在一些实施例中,所述核酸包括选自核酸适配体、核酸探针中的至少一种或其组合。
在一些实施例中,所述抗体可以包括选自CD63抗体。
在一些实施例中,所述固相载体表面可以负载官能基团,所述官能基团包括选自羟基、羧基、氨基、醛基、环氧基、马来酰亚胺、对甲苯磺酰基、N-羟基琥珀酰亚胺或巯基中的至少一种或其组合。。
在一些实施例中,所述捕获剂可以通过直接连接与固相载体连接。在一些实施例中,所述捕获剂可以通过连接介质与固相载体连接。
在一些实施例中,所述捕获剂可以通过直接连接的方式与固相载体连接,所述捕获剂选自TIM4、核酸适配体、肝素。
在一些实施例中,所述捕获剂可以通过连接介质与固相载体连接,所述捕获剂选自TIM4、核酸适配体、肝素。所述连接介质具有将固相载体和捕获剂的连接作用的化合物、基团、分子材料的其中一种及其组合。
在一种优选的实施例中,所述捕获剂可以通过连接介质与固相载体连接,固相载体表面的负载官能基团可以通过连接介质而实现捕获剂与固相载体的结合。该实现方式允许采用特定洗脱剂对所述连接介质在温和反应条件下进行断裂和/或解聚反应从而使固相载体与胞外生物大分子分离。在直接连接或者所述间接连接方式中连接介质无法在温和条件下进行断裂和/或解聚的情况下,可以采用特定洗脱剂以在所述的温和反应条件下以竞争性洗脱的方式从而使固相载体与胞外生物大分子分离。
在一些实施例中,所述连接介质可以包括选自寡核苷酸单链、寡核苷酸双链、含特异限制性酶切位点的寡核苷酸双链,或者包含二硫键桥连分子的的连接分子。
在一些实施例中,所述包含二硫键桥连分子的的连接分子可以包括选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-二硫键(DSPE-PEG-SS)、生物素二硫键(NHS-SS-biotin)、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)、二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)、辛二酸二琥珀酰亚胺(DSS)、双(硫代琥珀酰亚胺基)辛二酸酯钠盐(BS3)、酒石酸二琥珀酰亚胺(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-DST)、双(2-(琥珀酰亚胺氧羰基氧)乙基)砜(BSOCOES)、双(2-(磺基琥珀酰亚胺氧羰基氧)乙基)砜(sulfo-BSOCOES)、乙二醇-双(琥珀酰亚胺酯丁二酸酯)(EGS)、乙二醇-双(磺基琥珀酰亚胺酯丁二酸酯)(sulfo-EGS)、双琥珀酰亚胺戊二酸酯(DSG)、N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、二甲基己二亚酰胺酯(DMA)、庚二酰亚胺酸二甲酯(DMP)、二甲基辛二硝酸酯(DMS)、3,3'-二硫代双丙亚氨酸二甲酯(DTBP)、1,4-二(3'-(2'-二硫基吡啶)丙酸酰氨基)丁烷(DPDPB)、二马来酰亚胺基己烷(BMH)、二氟二硝基苯(DFDNB)、二氟二硝基苯基砜(DFDNPS)、二硫化二(β-(4-叠氮水杨酰氨基)乙基)(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇缩水甘油醚、已二酸二酰肼(ADH)、碳酰肼、二氨二甲基联苯、对二氨基联苯、氮-琥珀星氩氨-3(2-吡啶二硫代)-酸酯(SPDP)、长链-氮-琥珀星氩氨-3(2-吡啶二硫代)-酸酯(LC-SPDP)、磺基长链-氮-琥珀星氩氨-3(2-吡啶二硫代)-酸酯(sulfo-LC-SPDP)、琥珀酰亚胺基氧代羰基-甲基-(2-吡啶基硫代)苯(SMPT)、磺基长链-琥珀酰亚胺基氧代羰基-甲基-(2-吡啶基硫代)苯(sulfo-LC-SMPT)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸3-硫代-N-琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)、马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(MBS)、M-马来酰亚胺苯甲酸琥珀酰亚胺酯(sulfo-MBS)、N-琥珀酰亚胺(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸(SIAB)、磺基-N-琥珀酰亚胺(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸(sulfo-SIAB)、4-(4-马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(SMPB)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(P-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(sulfo-SMPB)、4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)、磺基马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯(sulfo-GMBS)、琥珀酰亚胺基-6-((碘乙酰基)氨基)己酸酯(SIAX)、琥珀酰亚胺基-6-(6-(((4-碘代乙酰基)氨基)己酰)氨基)己酸(SIAXX)、琥珀酰亚胺基-4-(((碘代乙酰基)氨基)甲基)环己烷-1-羧酸(SIAC)、琥珀酰亚胺基-6-((((4(碘代乙酰基)氨基)甲基)环己烷-为-1-羰基)氨基)己酸(SIACX)、4-硝基苯酯碘乙酸(NPIA)、4-(4-N-马来酰亚胺苯甲胺酯)丁酸酰肼(MPBH)、4-N-马来酰亚胺甲基环己烷-1-羧基酰肼(M2C2H)、3-(2-吡啶基二硫代)丙酰酰肼(PDPH)、N-羟基琥珀酰亚胺-4-叠氮基水杨酸(NHS-ASA)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺-4-叠氮基水杨酸(sulfo-NHS-ASA)、磺基琥珀酰亚胺-4-叠氮水杨基氨基己酸(sulfo-NHS-LC-ASA)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(P-叠氮基-水杨酰氨基)乙基-1,3'-二硫基丙酸酯(SASD)、琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯(HSAB)、磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯(sulfo-HSAB)、N-琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯(SANPAH)、磺基琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯(sulfo-SANPAH)、5-叠氮基-2-硝基苯甲酸-N-琥珀酰亚胺酯(ANB-NOS)、磺基琥珀酰亚胺-2-(M-硝基叠氮基-苯甲酰胺基)-乙基-1,3'-二硫代二丙酸酯(SAND)、N-琥珀酰亚胺基-(4-叠氮基苯基)-1,3'-二硫代丙酸酯(SADP)、N-磺基琥珀酰亚胺基-(4-叠氮基苯基)-1,3'-二硫代丙酸酯(sulfo-SADP)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(P-叠氮苯基)丁酸(Sulfo-SAPB)、磺基琥珀酰亚胺-2-(7-叠氮-4-甲基甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1,3'-二硫代丙酸酯(SAED)、磺基琥珀酰亚胺-7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸酯(Sulfo-SAMCA)、对硝基苯基重氮丙酮酸(pNPDP)、对硝基苯基-2-重氮3,3,3-三氟丙酸(PNP-DTP)、1-(p-叠氮水杨酰氨基)-4-(碘乙酰胺基)丁烷(ASIB)、N-(4-(p-叠氮水杨酰胺基)丁基)-3'-(2'-吡啶基二硫)丙酰胺(APDP)、二苯甲酮-4-碘乙酰胺、二苯甲酮-4-马来酰亚胺、p-叠氮苯甲酰肼、4-(P-叠氮水杨酰氨基)-丁胺(ASBA)、P-叠氮苯基乙二醛(APG)、4-叠氮-2-硝基苯基生物素-4-硝基苯基酯(ABNP)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(6-(生物素酰胺基)-2-(p-叠氮苯甲酰氨基)已酰氨基)乙基-1,3-二硫基丙酸酯(sulfo-SBED)、甲烷硫代磺酸叠氮基四氟-长链-生物素(MTS-ATF-biotin)、甲烷硫代磺酸叠氮基四氟生物素(MTS-ATF-LC-biotin)、三(羟基甲基)磷化氢(THP)、三(羟基甲基)磷基丙酸(THPP)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐中的至少一种或其组合。
在一些实施例中,所述官能基团可以包括选自羟基(-OH)、羧基(-COOH)、氨基(-NH2)、醛基(-CHO)、环氧基(Epoxy)、马来酰亚胺基、N-羟基琥珀酰亚胺基(Maleimide)、对甲苯磺酰基(Tosyl)、N-羟基琥珀酰亚胺(-NHS)或巯基(-SH)中的至少一种或其组合或其组合。
在一些实施例中,所述连接介质可以在采用特定洗脱剂的条件下发生断裂和/或解聚反应,或者所述连接介质可以在采用特定洗脱剂的条件下通过竞争性洗脱的方式使捕获剂与目标胞外生物大分子分离;有利于提高胞外生物大分子的生物特征的保留。所述连接介质选自离子交换复合物、酶及其底物复合物、抗原抗体复合物、配体及其受体复合物、光催化介导能够发生化学键断裂的化学物、还原剂或氧化剂介导能够发生化学键断裂的化学物。
在优选一些实施例中,所述连接介质可以在采用特定洗脱剂的条件下发生断裂和/或解聚反应,或者所述连接介质可以在采用特定洗脱剂的条件下通过竞争性洗脱的方式使捕获剂与目标胞外生物大分子分离;有利于提高胞外生物大分子的生物特征的保留。所述连接介质选自氯化镍或硫酸镍与his(组蛋白)亲合结构,或者谷胱甘肽与谷胱甘肽巯基转移酶的亲合结构。在一些实施例中,所述连接介质选自氯化镍或硫酸镍与his(组蛋白)亲合结构,所述特定洗脱剂选自咪唑。在一些实施例中,所述连接介质选自谷胱甘肽与谷胱甘肽巯基转移酶的亲合结构,所述特定洗脱剂还原性谷胱甘肽。在一些实施例中,所述竞争性洗脱可以包括采用互补序列、结构类似物、螯合剂、溶剂置换的一种或几种方式进行洗脱。在一些实施例中,所述连接介质为寡核苷酸单链,所述竞争性洗脱为采用与所述寡核苷酸单链互补的序列进行洗脱,从而改变连接介质与连接介质之间、连接介质与捕获剂之间、捕获剂与靶标之间中的一种或几种的亲和力,进而达到所述洗脱效果。在一些实施例中,所述竞争性洗脱为应用离子螯合剂对溶剂中的特定离子进行螯合,从而改变连接介质与连接介质之间、连接介质与捕获剂之间、捕获剂与靶标之间中的一种或几种的亲和力,进而达到所述洗脱效果。在一些实施例中,所述连接介质为脱硫生物素或其类似物和亲和素蛋白,所述竞争性洗脱为应用生物素或其类似物的一种或几种对含有脱硫生物素或其类似物的一种或几种的所述连接介质和/或所述捕获剂进行竞争性洗脱,从而改变连接介质与连接介质之间、连接介质与捕获剂之间、捕获剂与靶标之间中的一种或几种的亲和力,进而达到所述洗脱效果。在一些实施例中,所述竞争性洗脱为通过改变所述竞争性洗脱的方式发生溶剂离子强度变化,从而改变连接介质与连接介质之间、连接介质与捕获剂之间、捕获剂与靶标之间中的一种或几种的亲和力,进而达到所述洗脱效果。
在一些实施例中,所述断裂和/或解聚反应的反应温度可以为0℃-55℃。在一些实施例中,所述断裂和/或解聚反应的反应温度为4℃-42℃。在一些实施例中,所述断裂和/或解聚反应的反应温度为20℃-37℃。在一些实施例中,所述断裂和/或解聚反应的反应温度为0℃、4℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、42℃、45℃、50℃或55℃。
在一些实施例中,所述断裂和/或解聚反应的反应pH可以为5-8。在一些实施例中,所述断裂和/或解聚反应的反应pH为6.5-7.5。在一些实施例中,所述断裂和/或解聚反应的反应pH为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0或7.5。
在一些实施例中,所述断裂和/或解聚反应可以包括选自采用生物酶和/或化学试剂介导对连接介质进行断裂和/或解聚。
在一些实施例中,所述生物酶可以包括选自核酸酶或限制性内切酶。
在一些实施例中,所述化学试剂可以包括选自三氯乙基磷酸酯(TCEP)、三氯丙基磷酸酯、磷酸正乙酯、2-巯基乙胺(2-MEA)、还原型谷肮甘肤、氧化型谷肮甘肤、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、半胱氨酸、胱氨酸、二硫丁胺或亚硫酸纳中的至少一种或其组合。
在一些实施例中,所述断裂和/或解聚反应可以包括采用核酸酶对具有寡核苷酸单链或寡核苷酸双链的所述连接介质上的磷酸二酯键进行断裂和/或解聚反应。
在一些实施例中,所述断裂和/或解聚反应可以包括采用限制性内切酶对的具有寡核苷酸双链的所述连接介质上包含有的特异限制性酶切位点进行断裂和/或解聚反应。
在一些实施例中,所述断裂和/或解聚反应可以包括采用所述洗脱剂包括选自三氯乙基磷酸酯(TCEP)、三氯丙基磷酸酯、磷酸正乙酯、2-巯基乙胺(2-MEA)、还原型谷肮甘肤、氧化型谷肮甘肤、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、半胱氨酸、胱氨酸、二硫丁胺或亚硫酸纳中的至少一种或其组合化学试剂对包含二硫键桥连分子的所述连接介质的二硫键进行断裂和/或解聚反应。
在一些实施例中,所述目标胞外生物大分子表面可以含有能与捕获剂特异性结合的物质。
在一些实施例中,所述能与捕获剂特异性结合的物质可以包括选自抗原、核酸、脂肪、糖类中的至少一种或其组合。
在一些实施例中,所述目标胞外生物大分子表面可以含有CD63抗原,所述捕获剂可以为CD63抗体。
在一些实施例中,所述目标胞外生物大分子表面可以含有磷脂酰丝氨酸,所述捕获剂可以为T细胞免疫球蛋白域粘蛋白域蛋白家族成员。包括TIM1、TM3、TIM4蛋白。
在一些实施例中,所述目标胞外生物大分子表面可以含有CD63抗原和磷脂酰丝氨酸,所述捕获剂可以为CD63抗体和TIM4蛋白。
在一些实施例中,所述目标胞外生物大分子为细胞外囊泡,所述细胞外囊泡表面含有脂膜,所述捕获剂为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺。
在一些实施例中,所述目标胞外生物大分子为细胞外囊泡,所述细胞外囊泡表面含有脂膜和磷脂酰丝氨酸,所述捕获剂为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和TIM4蛋白。
在一些实施例中,所述捕获剂与固相载体可以通过聚乙二醇-二硫键进行连接。在一些实施例中,所述捕获剂与固相载体可以通过生物素和亲和素蛋白进行连接。在一些实施例中,所述捕获剂与固相载体可以通过生物素和链霉亲和素蛋白进行连接。
在一些实施例中,所述CD63抗体与固相载体可以通过聚乙二醇-二硫键进行连接,所述TIM4蛋白与固相载体可以通过生物素和亲和素蛋白进行连接。在一些实施例中,所述CD63抗体与固相载体可以通过聚乙二醇-二硫键进行连接,所述TIM4蛋白与固相载体可以通过生物素和链霉亲和素蛋白进行连接。
在一些实施例中,所述固相载体与捕获剂采用亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇作为连接介质进行连接,得到结构为固相载体-亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇-捕获剂的磁捕获子。在一些实施例中,所述固相载体与捕获剂采用链霉亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇作为连接介质进行连接,得到结构为固相载体-链霉亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇-捕获剂的磁捕获子。
在一些实施例中,所述固相载体与捕获剂采用亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇作为连接介质进行连接,所述捕获剂为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺,得到结构为固相载体-亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺的磁捕获子。在一些实施例中,所述固相载体与捕获剂采用链霉亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇作为连接介质进行连接,所述捕获剂为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺,得到结构为固相载体-链霉亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺的磁捕获子。
在一些实施例中,所述TIM4蛋白与固相载体采用生物素和亲和素蛋白进行连接,得到结构为固相载体-亲和素蛋白-生物素-TIM4蛋白的磁捕获子。在一些实施例中,所述TIM4蛋白与固相载体采用生物素和链霉亲和素蛋白进行连接,得到结构为固相载体-链霉亲和素蛋白-生物素-TIM4蛋白的磁捕获子。
在一些实施例中,所述捕获剂与固相载体通过DTSSP-链霉亲和素蛋白-生物素作为连接介质进行连接。
在一些实施例中,所述洗脱液可以为含洗脱剂的水溶液。
在一些实施例中,所述捕获剂与固相载体通过DTSSP-链霉亲和素蛋白-生物素作为连接介质进行连接,所述洗脱液为含洗脱剂的水溶液,所述洗脱剂可以包括选自三氯乙基磷酸酯(TCEP)、三氯丙基磷酸酯、磷酸正乙酯、2-巯基乙胺(2-MEA)、还原型谷肮甘肤、氧化型谷肮甘肤、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、半胱氨酸、胱氨酸、二硫丁胺或亚硫酸纳中的的至少一种或其组合至少一种或其组合。
在一些实施例中,所述捕获剂与固相载体可以通过链霉亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇作为连接介质进行连接,所述洗脱剂可以包括选自三氯乙基磷酸酯(TCEP)、三氯丙基磷酸酯、磷酸正乙酯、2-巯基乙胺(2-MEA)、还原型谷肮甘肤、氧化型谷肮甘肤、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、半胱氨酸、胱氨酸、二硫丁胺或亚硫酸纳中的的至少一种或其组合至少一种或其组合。
在一些实施例中,所述捕获剂可以为TIM4蛋白,所述洗脱液为含洗脱剂的水溶液,所述洗脱剂可以包括选自能够螯合钙离子的金属螯合剂。
在一些实施例中,所述连接介质为脱硫生物素或其类似物和亲和素蛋白,所述洗脱液为含洗脱剂的水溶液,所述洗脱剂包括生物素、生物素类似物及其组合。
在一些实施例中,所述洗脱液为含洗脱剂的水溶液,所述洗脱剂可以包括选自所述洗脱剂包括选自2所述洗脱剂包括选自三氯乙基磷酸酯(TCEP)、三氯丙基磷酸酯、磷酸正乙酯、2-巯基乙胺(2-MEA)、还原型谷肮甘肤、氧化型谷肮甘肤、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、半胱氨酸、胱氨酸、二硫丁胺或亚硫酸纳中的的至少一种或其组合至少一种或其组合,以所述洗脱液的总质量计算,所述洗脱剂的含量为10mM-500mM或者为10mM、20mM、30mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM或500mM。
在一些实施例中,所述捕获剂可以为TIM4蛋白,所述洗脱液为含洗脱剂的水溶液,所述洗脱剂可以为能够螯合钙离子的金属螯合剂,以所述洗脱液的总质量计算,所述能够螯合钙离子的金属螯合剂的含量为1mM-200mM或者为1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、150mM或200mM。
在一些实施例中,所述能够螯合钙离子的金属螯合剂包括选自依地酸钙。
在一些实施例中,所述连接介质为脱硫生物素或其类似物和亲和素蛋白,所述洗脱液为含洗脱剂的水溶液,所述洗脱剂包括生物素、生物素类似物及其组合,以所述洗脱液的总质量计算,所述洗脱剂的含量为2mM-100mM或者为2mM、5mM、10mM、15mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM。
在一些实施例中,所述适配结构可以包括选自CD9抗体和PSA抗体中的至少一种或其组合。
在一些实施例中,所述荧光染料为荧光分子、荧光材料或其组合。
在一些实施例中,所述荧光染料包括选自有机荧光分子、荧光蛋白、核酸染料、脂膜染料、量子点、Polymer Dots中的至少一种或其组合至少一种或其组合至少一种或其组合。
在一些实施例中,所述荧光基团可以包括选自Alexa Fluor 488。
在一些实施例中,所述生物液体可以包括选自血液、血浆、血清、尿液、痰液、脊髓液、脑脊液、胸腔积液、乳头抽吸吸液、淋巴液、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的流体、泪液、唾液、母乳、来自淋巴系统的流体、精液、脑脊液、器官内系统流体、腹水、肿瘤囊肿液、羊水、细菌细胞培养物、哺乳动物细胞培养物、细胞培养物上清液、无细胞蛋白转录-翻译反应物中的至少一种或其组合。
在一些优选的实施例中,所述磁捕获子包括结构为固相载体-链霉亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇-捕获剂的磁捕获子和结构为固相载体-链霉亲和素蛋白-生物素-TIM4蛋白的磁捕获子。采用两种磁捕获子,更有利于胞外生物大分子的分离,有利于获得更准确的胞外生物大分子单颗粒检测数据。
在一些优选的实施例中,所述磁捕获子包括结构为结构为固相载体-链霉亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺的磁捕获子和结构为固相载体-链霉亲和素蛋白-生物素-TIM4蛋白的磁捕获子。采用两种磁捕获子,更有利于胞外生物大分子的分离,有利于获得更准确的胞外生物大分子单颗粒检测数据。
在一些实施例中,所述粒子分析检测设备可以包括所述流式颗粒检测设备或者纳米流式颗粒检测设备。
所述流式颗粒检测设备为可实现样本流定向流动的颗粒分析检测设备。
在一些实施例中,所述粒子分析检测设备包括定向流体系统、光学系统和颗粒检测器。
在一些实施例中,所述定向流体系统可以由上样单元以及流动单元组成。
在一些实施例中,所述颗粒检测器为光电传感器和具有限带过滤高频噪音功能的信号调理电路组成。
在一些实施例中,所述磁捕获子的制备方法包括:将连接链霉亲和素蛋白的固体载体(例如链霉亲和素蛋白-纳米磁珠)与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-二硫键-生物素混合,孵育,再加入生物素标记的牛血清白蛋白的Tris缓冲液进行反应,再用PBS缓冲液洗涤,再加入含链霉亲和素蛋白的Tris缓冲液进行反应,再用PBS缓冲液洗涤,用牛血清白蛋白封闭,得到结构为固相载体-链霉亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺的磁捕获子。
在一些实施例中,所述磁捕获子的制备方法包括:将羧基化PEG、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、1,3-二环己基碳二亚胺、盐酸多巴胺和无水碳酸钠于有机溶剂中进行反应,然后加入油酸包裹的固相载体(例如纳米磁珠)进行反应,得到羧基化的固相载体,除去有机溶剂,再将羧基化的固相载体与链霉亲和素蛋白于2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液进行反应,在加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐进行反应,超滤除去多余试剂,再用含链霉亲和素蛋白的BB缓冲液重悬并进行反应,用外加磁场分离,沉淀用100nm孔径的滤膜过滤,得到链霉亲和素蛋白-固相载体,将链霉亲和素蛋白-固相载体与生物素化的TIM4蛋白进行反应,外加磁场分离,洗涤,外加磁场分离,得到结构为固相载体-链霉亲和素蛋白-生物素-TIM4蛋白的磁捕获子。
在一些实施例中,所述有机溶剂可以包括选自氯仿、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的至少一种或其组合。
在一些实施例中,所述荧光染料可以包括选自:PE、PE-Cy5荧光基团、Alexa Fluor488荧光基团或FITC(异硫氰酸荧光素)、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PE-Cy7、APC、eFluor 660、Alexa Fluor647、ALexa Fluor700、ALexa Fluor780中任意一种中的染料。
另一方面,本发明提供另一种生物液体中胞外生物大分子的分离和检测方法,其包括:将磁捕获子与生物液体混合,孵育,使磁捕获子与目标胞外生物大分子通过捕获剂结合;置外加磁场进行分离富集,去除上清液,洗涤,将目标胞外生物大分子与生物液体分离;用洗脱液解除磁捕获子与目标胞外生物大分子的结合,并除去固相载体;将荧光染料与目标胞外生物大分子混合,使荧光染料与目标胞外生物大分子通过适配结构结合,再通过离心、超滤或透析除去游离的荧光染料,得到结合荧光染料的目标胞外生物大分子,采用粒子分析检测设备对结合荧光染料的目标胞外生物大分子进行单纳米颗粒分析。
有益效果
相比现有技术,本发明的某一实施例具有以下至少一种或其组合有益效果:
(1)相比在用洗脱液洗脱解除磁捕获子与目标胞外生物大分子的结合后进行荧光染料染色,本发明通过采用在洗脱前完成荧光染料标记的操作,有利于减少游离荧光染料对检测的干扰,且有利于免去超速离心除游离染料的操作步骤,减少了操作步骤。
(2)本发明采用间接连接的方式连接捕获剂和固相载体,有利于在检测前采用特定洗脱剂对所述连接介质在温和反应条件下进行断裂和/或解聚反应从而使固相载体与胞外生物大分子分离,有利于胞外生物大分子的单颗粒检测的准确性。
(3)相比采用其他生物酶进行洗脱,采用核酸酶或限制性内切酶有利于避免破坏胞外生物大分子(例如细胞外囊泡、蛋白、碳水化合物或脂质)的生物特征。
(4)本发明采用两种捕获剂,更有利于胞外生物大分子的分离,有利于获得更准确的胞外生物大分子单颗粒检测数据;例如:相比采用单独采用TIM4蛋白为捕获剂或单独采用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺为捕获剂,同时采用TIM4蛋白和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-为捕获剂,更有利于准确地检测前列腺癌患者样品或健康人群样品PSA+胞外生物大分子的数量。
(5)相比采用其他捕获剂,采用TIM4蛋白和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺为捕获剂,更有利于准确地检测前列腺癌患者样品或健康人群样品PSA+胞外生物大分子的数量。
(6)相比采用其他前列腺癌细胞表面具有的其他抗原对应的抗体进行检测,本发明采用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和TIM4蛋白作为捕获剂比采用其他类型的捕获剂,检测所得结果更准确。
附图说明
图1为实施例4中胞外生物大分子的分离与检测(采用AF488-PSA抗体进行光学标记)的原理图。
图2为前列腺癌患者血清池用实施例4所述分离与检测方法分裂和检测所得PSA+外泌体的占总胞外生物大分子的比例结果统计图。
图3为前列腺癌患者血清池用实施例4所述分离与检测方法分裂和检测所得总外泌体的平均粒径结果统计图。
图4为前列腺癌患者血清池用实施例4所述分离与检测方法分裂和检测所得总外泌体的浓度结果统计图。
图5为实施例4、对比例5、对比例6和对比例7的分离和检测方法的ROC曲线图。
图6为实施例4、对比例5、对比例6三种分离和检测方法的抑制效应曲线图。
图7为采用实施例4所述分离和检测方法对30份健康人群生物液体样品和25份前列腺癌患者生物液体样品进行检测所得PSA+胞外生物大分子测定结果统计分析图。
图8为采用实施例4所述分离和检测方法对对30份处于不同Gleason分期的前列腺癌患者生物液体样品进行检测所得PSMA+胞外生物大分子测定结果统计分析图。
图9为实施例6中在透射电子显微镜下观察在纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-脱硫生物素-VSV-G抗体捕获及洗脱HIV后的图像。
术语说明
本发明中,“室温”表示环境温度,可以为20℃-30℃;在一些实施例中,为22℃-28℃;在一些实施例中,为24℃-26℃;在一些实施例中,为25℃。
在本发明的上文中,无论是否使用“大约”或“约”等字眼,所有在此公开了的数字均为近似值。基于公开的数字,每一个数字的数值有可能会出现±10%以下的差异或者本领域人员认为的合理的差异,如±1%、±2%、±3%、±4%或±5%的差异。
术语“胞外生物大分子”表示细胞外的核酸、蛋白、碳水化合物或脂质或其组合。例如细胞外可作为肿瘤标志物的蛋白,例如血清肿瘤标志物蛋白,例如CEA、AFP、CA19-9、SCC、NSE、CK19、CA125、CA 15-3、CA 19-9;例如细胞外具有临床诊断价值的核酸,例如细胞外具有临床诊断价值的脱氧核糖核酸;例如血浆循环肿瘤细胞释放的游离脱氧核糖核酸;例如细胞外具有质膜结构生物大分子,例如细胞外囊泡;例如细胞外有生命特质的核蛋白颗粒,例如体液中具有致病或者感染性的病原体,例如具有血液感染性的病毒,例如血液中艾滋病病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、巨细胞病毒。
术语“atm”表示标准大气压,例如1atm表示1个标准大气压的值,即101325Pa。
术语“适配结构”表示包括抗体,抗体片段、抗体类似物、血凝素、配体和/或受体、适体、核酸适配体、肽或其组合。
术语“细胞外囊泡”表示是一种由细胞释放到细胞外基质的膜性小囊泡包括细胞外泌体等。术语“任选”、“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情形可以但不一定出现。例如,“任选的表面活性剂”是指表面活性剂可以存在或可以不存在。
术语“重量百分比”或“以重量计的百分比”或“wt%”定义为组合物中单个组分的重量除以组合物所有组分的总重量然后乘以100。
术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或多项的组合。
术语“SA”表示链霉亲和素蛋白。
术语“Biotin”表示生物素。
在本文中,术语“治疗”指意欲改变正在接受治疗的个体中疾病之天然过程的临床介入。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态,以及缓解或改善预后。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
在本申请中,“组合物”可以方便地表现为单位剂量形式并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的载体相结合的步骤。通常,通过均匀并充分地使活性化合物与液体载体、细碎固体载体或这两者相结合,制备组合物。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案,下面进一步披露一些非限制实施例以对本发明作进一步的详细说明。
本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。
1)标本来源
1.1)前列腺癌患者生物液体样品
从9ml外周血中分离获得血清池(2.7ml),所述血清池由在厦门大学附属医院收治的前列腺癌患者当天采集的外周血,所述外周血收集至含有50u/ml肝素钠的规格为13*75mm,BD真空采血管中。
1.2)健康人群生物液体样品
从8ml外周血中分离获得血清池(2.5ml),所述血清池由厦门大学附属医院检验科样品库分装提供的外周血,所述外周血收集至含有50u/ml肝素钠的规格为13*75mm,BD真空采血管中。
2)主要试剂和仪器
AF488-CD9(AF488 mouse anti-human CD9)、AF488-PSA(AF488 mouse anti-human PSA9)来自NanoFCM Inc.;
TIM4(Human TIM-4protein,human IgG1 Fc tag(active))购自Genetex;
Anti-VSV-G[8G5F11],Mouse IgG2a,Kappa购自absoluteantibody;
SA(Streptavidin Protein,链霉亲和素蛋白)和Biotin购自MCE公司;
二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺购自阿拉丁公司;
生物素标记的牛血清白蛋白购自西格玛公司;
洗涤液:10mM TBS溶液(10mM三乙醇胺缓冲盐水溶液);
洗脱液1:含25mM TCEP的10mM TBS溶液,购自生工生物工程(上海)股份有限公司;
洗脱液2:含2mM EDTA的10mM TBS溶液,购自生工生物工程(上海)股份有限公司;
洗脱液3:含20mM生物素的10mM TBS溶液,购自生工生物工程(上海)股份有限公司;
脱硫生物素购自瑞禧生物;
纳米磁珠-链霉亲和素蛋白购自苏州海狸生物医学工程有限公司;
Flow NanoAnalyzer来自厦门福流生物科技有限公司;
Centrifuge 5810R 冷冻离心机购自Eppendorf;
OptimaTMMax-XP Tabletop Ultracentrifuge超速离心机购自Beckman coulter。
2)Flow NanoAnalyzer检测方法
在激光检测器488nm+638nm;双通道检测SSC(488/10nm),FL2(710/40nm);衰减率:10%;检测压力:1kpa;信号类型:small siginal的条件下进行检测,通过二维散点、直方图记录血清池样品中CD9+胞外生物大分子或PSA+胞外生物大分子的检测数据。
实施例1:纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺的制备
收集150μl体积的纳米磁珠-链霉亲和素蛋白(即1.3×108磁珠),用99%的乙醇洗涤磁珠去除污染物并且增加纳米磁珠湿度。向洗涤的纳米磁珠-链霉亲和素蛋白加入生物素-二硫键-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺,室温孵育12h,将多余二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-二硫键-生物素用去离子水洗脱。然后向纳米磁珠-链霉亲和素蛋白加入含有1mg/ml生物素标记的牛血清白蛋白的10mM Tris缓冲液,4℃反应1h,将多余残留用PBS缓冲液洗涤。改用含有200μg/ml的SA的10mM Tris缓冲液,4℃反应30min,将多余残留用PBS缓冲液洗涤。最后4℃反应1h,1%牛血清白蛋白水溶液封闭,制备成纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺,储存于4℃。
实施例2:纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-TIM4蛋白的制备
1.Biotin化的TIM4蛋白的制备
2.磁珠标记修饰链霉亲和素蛋白制备纳米磁珠-链霉亲和素蛋白
首先在6ml氯仿和3ml DMF加入60mg的羧基化PEG,9mg NHS,11mg DCC,3.9mg盐酸多巴胺和30mg无水Na2CO3于35℃搅拌反应4h。向反应后产物逐滴滴加1.5ml油酸包裹的Fe3O4于35℃搅拌反应10h。羧基化PEG修饰的Fe3O4纳米颗粒通过外加磁场分离并在氮气下干燥。羧基化PEG修饰的Fe3O4纳米颗粒分散在蒸馏水中并用30KDa透析袋透析去除其它残留试剂。将羧基化PEG修饰的Fe3O4纳米颗粒中Fe终浓度定量到1mg/ml,取15ml羧基化PEG修饰的Fe3O4纳米颗粒和11.25mg SA溶解到0.01M MES缓冲液(PH=5.5)振荡反应30min,随后加入7.5mg的EDC继续4℃振荡反应4h。采用30KDa超滤管超滤去除上述反应物中的多余试剂,并且用含有11.25mg SA的BB缓冲液(PH=8.0)重悬并于4℃振荡反应12h。用外加磁场分离,沉淀用100nm孔径的注射器过滤,得到纳米磁珠-链霉亲和素蛋白。
3.纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-TIM4蛋白的制备:
转移60ul的纳米磁珠-链霉亲和素蛋白到1.5ml Ep管中,并加入500μl的洗涤剂,涡旋混匀。快速离心10s,然后将Ep管放置于磁力架上,静置1min,使磁珠与溶液分离,弃上清。加入500μl的洗涤剂和10μl的Biotin化的TIM4蛋白,2-10℃混合反应10min。快速离心10s,然后将Ep管放置于磁力架上,静置1min,使磁珠与溶液分离,弃上清。加入500μl的洗涤剂,涡旋混匀。快速离心10s,然后将Ep管放置于磁力架上,静置1min,使磁珠与溶液分离,弃上清。加入500μl的洗涤剂,涡旋混匀。快速离心10s,然后将Ep管放置于磁力架上,静置1min,使磁珠与溶液分离,弃上清,获得的纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-TIM4蛋白,储存于4℃。
实施例3:胞外生物大分子的分离与检测(双磁捕获子的连续磁分离方法,先标记后洗脱,AF488-CD9抗体光学标记)
1.样品预处理
对血清池样品优先进行离心处理,所述处理由下述的两步差速离心和过滤组成。将血清池样品(2.5-2.7ml体积)在4℃以500g离心10min,以便排除血细胞和细胞碎片,然后在4℃以16500g离心20min以从生物液体中除去微粒和凋亡小体。在0.45μm滤膜上进行过滤步骤以便排除粒度大于450nm的蛋白质聚集体,得预处理后的样品。
2.分离富集胞外生物大分子
将2.5ml体积的预处理后的样品与100μl的纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-TIM4蛋白的混合物(纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-TIM4蛋白的体积比为1:2.3)在室温下旋转搅拌孵育3h进行处理,得到纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-TIM4蛋白与胞外生物大分子形成的复合物,采用磁力架对所述复合物进行分离富集,去除上清液,得到沉淀物,用500μl含10mM PBS和0.5%Tween的缓冲液清洗上述沉淀物5次,每次5分钟,得到分离富集的胞外生物大分子。
3.光学标记目标胞外生物大分子
用含10mM PBS和0.5%Tween的缓冲液重悬上述步骤2所得分离富集的胞外生物大分子,用10mM PBS缓冲液稀释50倍后,取50ul稀释后的分离富集的胞外生物大分子与20ulAF488-CD9抗体于37℃孵育30min,之后用磁力架吸附,去除上清液。用500μl洗涤液清洗5次,每次5分钟,再用150μl 10mM PBS缓冲液重悬清洗后的复合物,得光学标记后的复合物溶液。
4.洗脱并除去纳米磁珠
(1)取实施例3步骤3所得复合物溶液与100μl的洗脱液1混合,37℃反应30min,再采用磁力架使磁珠与溶液分离,得上清液i和沉淀磁珠ii,去除上清液i。
(2)取沉淀磁珠ii与50μl的洗脱液2混合,快速离心10s,然后采用磁力架使磁珠与溶液分离,得上清液iii和沉淀磁珠iv,向沉淀磁珠iv加入50μl的洗脱液2,快速离心10s,然后采用磁力架使磁珠与溶液分离,得上清液v,合并上清液iii和上清液v,得采用双磁捕获子的连续磁分离方法分离所得含标记AF488-CD9的胞外生物大分子的溶液。
5.样品检测
取采用双磁捕获子的连续磁分离方法分离所得含标记AF488-CD9的胞外生物大分子的溶液(即上述步骤所得含标记AF488-CD9的胞外生物大分子的溶液),采用FlowNanoAnalyzer(纳米流式检测仪)进行检测,结果的诊断分析方法见实施例5。
对比例1:胞外生物大分子的分离与检测(双磁捕获子的连续磁分离方法,先洗脱后标记)
1.样品预处理
对血清池样品优先进行离心处理,所述处理由下述的两步差速离心和过滤组成。将血清池样品(2.5-2.7ml体积)在4℃以500g离心10min,以便排除血细胞和细胞碎片,然后在4℃以16500g离心20min以从生物液体中除去微粒和凋亡小体。在0.45μm滤膜上进行过滤步骤以便排除粒度大于450nm的蛋白质聚集体,得预处理后的样品。
2.分离富集胞外生物大分子
将2.5-2.7ml体积的预处理后的样品与100μl的纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-TIM4蛋白的混合物(纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-TIM4蛋白的体积比为1:2.3)在室温下旋转搅拌孵育3h进行处理,得到纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-TIM4蛋白与胞外生物大分子形成的复合物,采用磁力架对所述复合物进行分离富集,去除上清液,得到沉淀物,用500μl含10mM PBS和0.5%Tween的缓冲液清洗上述沉淀物5次,每次5分钟,得到分离富集的胞外生物大分子。
3.洗脱除去纳米磁珠
(1)取对比例1步骤2所得分离富集的胞外生物大分子与100μl的洗脱液1混合,37℃反应30min,再采用磁力架使磁珠与溶液分离,得上清液a和沉淀磁珠b,去除上清液a。
(2)取沉淀磁珠b与50μl的洗脱液2混合,快速离心10s,然后采用磁力架使磁珠与溶液分离,得上清液c和沉淀磁珠d,向沉淀磁珠d加入50μl的洗脱液2,快速离心10s,然后采用磁力架使磁珠与溶液分离,得上清液e,合并上清液c和上清液e,得含胞外生物大分子的溶液。
4.光学标记目标胞外生物大分子
用含10mM PBS和0.5%Tween的缓冲液重悬上述步骤3所得分离富集的胞外生物大分子,用10mM PBS缓冲液稀释50倍后,取50ul稀释后的分离富集的胞外生物大分子与20ulAF488-CD9抗体于37℃孵育30min,超速离心除去游离AF488-CD9抗体,再用100μl的10mMPBS缓冲液重悬超速离心后的沉淀物,得光学标记后的复合物溶液。
5.样品检测
取对比例1步骤4所得光学标记后的复合物溶液,采用Flow NanoAnalyzer(纳米流式检测仪)进行检测,结果的诊断分析方法见实施例6。
对比例2:单磁捕获子的磁分离方法(采用纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-TIM4蛋白作为磁捕获子)1.样品预处理
对血清池样品优先进行离心处理,所述处理由下述的两步差速离心和过滤组成。将血清池样品(2.5-2.7ml体积)在4℃以500g离心10min,以便排除血细胞和细胞碎片,然后在4℃以16500g离心20min以从生物液体中除去微粒和凋亡小体。在0.45μm滤膜上进行过滤步骤以便排除粒度大于450nm的蛋白质聚集体,得预处理后的样品。
2.分离富集胞外生物大分子
将2.5-2.7ml体积的预处理后的样品与100μl的纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-TIM4蛋白在室温下旋转搅拌孵育3h进行处理,得到纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-TIM4蛋白与胞外生物大分子形成的复合物,采用磁力架对所述复合物进行分离富集,去除上清液,得到沉淀物,用500μl含10mM PBS和0.5%Tween的缓冲液清洗上述沉淀物5次,每次5分钟,得到分离富集的胞外生物大分子。
3.光学标记目标胞外生物大分子
用含10mM PBS和0.5%Tween的缓冲液重悬上述对比例2步骤2所得分离富集的胞外生物大分子,用10mM PBS缓冲液稀释50倍后,取50ul稀释后的分离富集的胞外生物大分子与20ul AF488-CD9抗体于37℃孵育30min,之后用磁力架吸附,去除上清液。用500μl洗涤液清洗5次,每次5分钟,再用150μl10mM PBS缓冲液重悬清洗后的复合物,得光学标记后的复合物溶液。
4.洗脱除去纳米磁珠后检测
取上一步骤所得光学标记后的复合物溶液与50μl的洗脱液2混合,快速离心10s,然后采用磁力架使磁珠与溶液分离,得上清液vi和沉淀磁珠vii,向沉淀磁珠加入50μl的洗脱液2,快速离心10s,然后采用磁力架使磁珠与溶液分离,得上清液viii,合并上清液vi和上清液viii,得含标记AF488-CD9的胞外生物大分子的溶液,采用Flow NanoAnalyzer(纳米流式检测仪)进行检测,结果的诊断分析方法见实施例5。对比例3:单磁捕获子的磁分离方法(采用纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺作为磁捕获子)
1.样品预处理
对血清池样品优先进行离心处理,所述处理由下述的两步差速离心和过滤组成。将血清池样品(2.5-2.7ml体积)在4℃以500g离心10min,以便排除血细胞和细胞碎片,然后在4℃以16500g离心20min以从生物液体中除去微粒和凋亡小体。在0.45μm滤膜上进行过滤步骤以便排除粒度大于450nm的蛋白质聚集体,得预处理后的样品。
2.分离富集胞外生物大分子
将2.5-2.7ml体积的预处理后的样品与100μl的纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺在室温下旋转搅拌孵育3h进行处理,得到纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺与胞外生物大分子形成的复合物,采用磁力架对所述复合物进行分离富集,去除上清液,得到沉淀物,用500μl含10mM PBS和0.5%Tween的缓冲液清洗上述沉淀物5次,每次5分钟,得到分离富集的胞外生物大分子。
3.光学标记目标胞外生物大分子
用含10mM PBS和0.5%Tween的缓冲液重悬上述对比例3步骤2所得分离富集的胞外生物大分子,用10mM PBS缓冲液稀释50倍后,取50ul稀释后的分离富集的胞外生物大分子与20ul AF488-CD9抗体于37℃孵育30min,之后用磁力架吸附,去除上清液。用500μl洗涤液清洗5次,每次5分钟,再用150μl10mM PBS缓冲液重悬清洗后的复合物,得光学标记后的复合物溶液。
4.洗脱除去纳米磁珠后检测
取对比例3步骤3所得光学标记后的复合物溶液与100μl的洗脱液1混合,37℃反应30min,再采用磁力架使磁珠与溶液分离,得上清液,采用Flow NanoAnalyzer(纳米流式检测仪)对上清液进行检测,结果的诊断分析方法见实施例5。
对比例4:超速离心法
1)取血浆样本,4℃300g离心5min,去除细胞等大颗粒;
2)取上清,在4℃1200g离心20min,去除可能凋亡体和细胞碎片;
3)取上清,4℃100000g离心80min,弃上清液;
4)用PBS重悬沉淀,4℃100000g离心20min,弃上清液;
5)加入100ul的10mM PBS缓冲液重悬沉淀即得到超速离心法后胞外生物大分子;
6)取100ul步骤5)所得超速离心法后胞外生物大分子,加入10μl 0.1mg/mlAF488-CD9抗体,37℃孵育30min。4℃100000g离心80min,弃上清液,用PBS重悬沉淀,4℃100000g离心20min,弃上清液,加入100μl的10mM PBS缓冲液重悬沉淀即得到超速离心法后的含标记AF488-CD9的胞外生物大分子的溶液,采用Flow NanoAnalyzer(纳米流式检测仪)进行检测,结果的诊断分析方法见实施例5。
实施例4:胞外生物大分子的分离与检测(采用AF488-PSA抗体进行光学标记)
将AF488-CD9换为AF488-PSA,其余操作同实施例3,实施例4的分离与检测的原理图见图1中a图;采用实施例4所述分离和检测方法测得前列腺癌患者血清池中的PSA+外泌体的占总胞外生物大分子的比例为18.27%(结果见图1中b图)。采用实施例4所述分离和检测方法测得前列腺癌患者血清池中总外泌体浓度为6.5×109颗粒/ml,平均粒径为67.2±12nm(结果见图1中c图)。结果的诊断分析方法见实施例5。
对比例5:直接化学发光法
1)使用的试剂盒和仪器
前列腺特异性抗原测定试剂盒(直接化学发光法)【注册证号】国食药监械(进)字2013第3402084号、ADVIA Centaur XP全自动化学发光免疫分析仪购自西门子医学诊断产品(上海)有限公司
2)按照操作说明书将血清池样品和前列腺特异性抗原测定试剂盒装载试剂入ADVIA Centaur XP全自动化学发光免疫分析仪指定位置,运行系统。系统自动执行以下步骤:
a.将35μL血清池样品加入到比色杯内。
b.加入250μL固相试剂和100μL标记试剂,在37℃下孵育7.5min。
c.分离,吸出,用洗液洗涤比色杯。
d.加入酸性试剂和碱性试剂各300μL,激发化学发光反应。
e.记录系统检测的光量子数(RLUs)根据PSA标准曲线换算出患者血清池样品的PSA含量(ng/ml)。对比例6:单磁捕获子的磁分离方法(采用纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-TIM4蛋白作为磁捕获子,AF488-PSA光学标记)
将AF488-CD9换为AF488-PSA,其余操作同对比例2,结果的诊断分析方法见实施例5。
对比例7:单磁捕获子的磁分离方法(纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺,AF488-PSA光学标记)
将AF488-CD9换为AF488-PSA,其余操作同对比例3,结果的诊断分析方法见实施例5。
实施例5:结果的诊断分析方法
1)采用Origin 9.5软件,通过统计取前列腺癌患者生物液体样品或健康人群生物液体样品分别由实施例4,对比例5、对比例6、对比例7方法测得的PSA+胞外生物大分子颗粒浓度(颗粒/ml),应用ROC曲线表征上述各方法的诊断效能图5。
2)采用SPSS 11.0软件和依据美国临床与实验室标准化协会(CLSI)EP12-A2、美国临床与实验室标准化协会(CLSI)EP15-A2文件,通过一定的比例稀释使得浓度恰好在临界值的标本进行一系列重复检测,结果有50%为阴性,50%为阳性,该分析物浓度标本即称为C50,以此方法类推制备获得C5和C95,对其按照上述3种方法分别重复测定40次(批内),记录并进行统计获得的数据,比较上述3种方法的批内不精密度、总不精密度,结果见表2。
3)采用SPSS 11.0软件和依据美国临床与实验室标准化协会(CLSI)EP-7文件,用剂量效应实验方法评价干扰效应。选择C95标本。干扰物和空白对照为Sysmex公司提供的含有结合型胆红素、游离型胆红素、乳糜、溶血的A试剂盒。将干扰物与标本按1∶9体积比混合,制成样本A;将空白对照与标本按1∶9体积比混合,制成样本B,将样本A与样本B分别按10B(10体积份样品B)、9B+1A(9体积份样品B和1体积份样品A)、8B+2A(8体积份样品B和2体积份样品A)、7B+3A(7体积份样品B和3体积份样品A)、6B+4A(6体积份样品B和4体积份样品A)、5B+5A(5体积份样品B和5体积份样品A)、4B+6A(4体积份样品B和6体积份样品A)、3B+7A(3体积份样品B和7体积份样品A)、2B+8A(2体积份样品B和8体积份样品A)、1B+9A(1体积份样品B和9体积份样品A)、10A(10体积份样品A)混合,调制成不同稀释比例的样本。每个样本重复测定3次,绘制以干扰物浓度、干扰效应值组成的散点图通过剂量效应方程拟合计算产生的相对偏倚等于最大偏倚10%时,各个干扰物的对应浓度,结果见图3。
4)取处于不同Gleason分期的前列腺癌患者生物液体样品和健康人群生物液体样品,按实施例4所述方法进行分离和检测,所得结果采用Graphpad Prism 8.0软件进行处理,并应用双尾T检验方差进行分析,分析PSA+胞外生物大分子的检测数据是否有显著性差异以及是否与前列腺癌的进展情况相关联,结果见图4。
结果:结果如表1和表2所述。
表1五种外泌体提取方法的提取效果评价
表2四种检测方法的不精密度评价
由表1可知,实施例3的外泌体提取浓度与对比例4和表1所述其它方法相当,并且实施例3的外泌体提取浓度在Cell mask染料阳性率和AF488-CD9阳性率均优于表1所述其它方法(如:对比例1、对比例2、对比例3和对比例4)。
由表2可知,实施例4所有浓度水平的总CV值均显著小于国际临床化学和实验室医学联盟(IFCC)建议的总CV值(15%),实施例4所提供的分离和检测方法被认为较好且不精密度水平低(即精密度高),符合IVD试剂盒的方法学标准。对比例6、对比例7所有浓度水平的总CV值均大于国际临床化学和实验室医学联盟(IFCC)建议的总CV值(15%),其方法学较差。
由图5可知,采用实施例4的方法进行分离和检测,统计52份血清池样本检测结果,其AUC为0.959,血清PSA+外泌体浓度cutoff值设置为5.4×107颗粒/ml,敏感度为93.3%,特异性为88%;采用对比例6的方法分离和检测,统计统计37份血清池样本检测结果,其AUC为0.807,血清PSA+外泌体浓度cutoff值设置为7.5×107颗粒/ml,敏感度为70%,特异性为72%;采用对比例7的方法分离和检测,统计37份外周血样本检测结果,其AUC为0.527,血清PSA+外泌体浓度cutoff值设置为4.8×107颗粒/ml,敏感度为53.3%,特异性为56%。采用对比例5的方法分离和检测,统计46份血清池样本检测结果,其AUC为0.645,血清PSA浓度cutoff值设置为2.35ng/mL,敏感度为67.3%,特异性为52%;在上述4种方法中,基于胞外生物大分子的分离与检测(采用AF488-PSA抗体进行光学标记)(实施例4)对于前列腺癌的诊断效能最好。
由图6可知,通过剂量效应方程,采用实施例4所述方法进行分离和检测,当检测产生相对偏倚等于最大偏倚10%时,血红蛋白的质量浓度为4263.2mg/L、乳糜的浓度为769.2FTU、游离型胆红素的质量浓度为246.3mg/L、结合型胆红素的质量浓度为279.9mg/L;通过剂量效应方程,采用对比例5所述方法进行分离和检测,当检测产生相对偏倚等于最大偏倚10%时,血红蛋白的质量浓度为4946.3mg/L、乳糜的浓度为823.2FTU、游离型胆红素的质量浓度为266.3mg/L、结合型胆红素的质量浓度为309.1mg/L;通过剂量效应方程,采用对比例6所述方法进行分离和检测,当检测产生相对偏倚等于最大偏倚10%时,血红蛋白的质量浓度为6824.6mg/L、乳糜的浓度为1569.2FTU、游离型胆红素的质量浓度为642.8mg/L、结合型胆红素的质量浓度为362.5mg/L。由此可见,相比其他方法,采用本发明所提供的实施例4等的分离和检测方法对于常见血清/外周血干扰物的抗干扰效应最好。
由图7可知,采用实施例4所述分离和检测方法对30份健康人群生物液体样品和25份前列腺癌患者生物液体样品进行检测,所得PSA+胞外生物大分子测定结果应用双尾T检验方差分析(t=12.61,df=24)进行分析,得P<0.0001,****,具有极其显著差异,说明采用实施例4所述分离和检测方法能显著区分健康人群和前列腺癌患者。
由图8可知,采用实施例4所述分离和检测方法对对30份处于不同Gleason分期的前列腺癌患者生物液体样品进行检测,所得PSMA+胞外生物大分子测定结果应用多重比较方差分析,以Gleason I期6例患者为基准,统计分析显示:Gleason I期与Gleason II期5例患者之间P=0.8761,无统计学显著差异,与Gleason III期5例患者P=0.0495,具有统计学显著差异(*),与Gleason IV期9例患者和Gleason V期5例患者的P<0.0001,具有极其显著的统计学差异(****)。说明本发明所提供的分离和检测方法对处于不同Gleason分期的前列腺癌患者进行疾病辅助分型的能力。
实施例6:单磁捕获子的磁分离方法(采用纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-脱硫生物素-VSV-G抗体作为磁捕获子)
1.样品预处理
将293T细胞转染HIV包装质粒及骨架质粒后48h,于直径为100mm培养皿培养,收集10ml细胞培养上清,并补加入10ml新鲜细胞培养液,继续培养24-48h,收集所有含有HIV的细胞培养上清保存在4℃冰箱中。
2.脱硫生物素标记VSV-G抗体
2.1脱硫生物素标记加入量计算:使用浓度为10mM的脱硫生物素,用来标记1mL的1mg/ml的VSV-G抗体(IgG,58KD),
2.2VSV-G抗体溶液的制备取1mg待标记VSV-G抗体于超滤管中,并加入不超过超滤管最大体积的标记缓冲液,12,000g离心10min;重复此步骤3次;最后一次超滤完成,加入适量标记缓冲液调整抗体的浓度到2mg/mL。
2.3脱硫生物素标记:加入34.5μL浓度为10mM的脱硫生物素DMSO溶液至上述超滤管中,并轻轻吹打混匀。放入37℃恒温箱中避光温育30min。12,000x g离心10min。加入适量标记缓冲液至上述超滤管中,并轻轻吹打混匀,12,000g离心10min,重复此步骤2次。收集超滤管中的溶液(即脱硫生物素标记的VSV-G抗体),加入等体积保存液,-20℃保存。
3.纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-脱硫生物素-VSV-G抗体的制备
收集150μl体积的纳米磁珠-链霉亲和素蛋白,用99%的乙醇洗涤磁珠去除污染物并且增加纳米磁珠湿度。向洗涤的纳米磁珠-链霉亲和素蛋白加入10μl体积的脱硫生物素标记的VSV-G抗体,室温孵育12h。然后向纳米磁珠-链霉亲和素蛋白加入含有1mg/ml生物素标记的牛血清白蛋白的10mM Tris缓冲液,4℃反应1h,制备成纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-脱硫生物素-VSV-G抗体,储存于4℃。
4.分离富集含有HIV的细胞培养上清
将3.5ml体积的预处理后的样品与100μl的纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-脱硫生物素-VSV-G抗体在室温下旋转搅拌孵育3h进行处理,得到纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-脱硫生物素-VSV-G抗体与HIV形成的复合物,采用磁力架对所述复合物进行分离富集,去除上清液,得到沉淀物,用500μl含10mM PBS和0.5%Tween的缓冲液清洗上述沉淀物5次,每次5分钟,得到分离富集的HIV。将分离富集的HIV与100μl的洗脱液3混合,37℃反应30min,再采用磁力架使磁珠与溶液分离,得上清液。
5、在透射电子显微镜下观察在纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-生物素-脱硫生物素-VSV-G抗体捕获及洗脱HIV后的图像,结果见图9。
结论::纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-脱硫生物素-VSV-G抗体与HIV的细胞培养上清孵育后;而经过20mM生物素的10mM TBS溶液的洗脱,在透射电子显微镜显示,纳米磁珠-链霉亲和素蛋白-脱硫生物素-VSV-G抗体已具备快速捕获和无损释放HIV的功能。该方法不影响HIV的结构形态,分离特异性强,重复性好,并在温和条件下无损释放捕获的HIV。
本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明内。
Claims (14)
1.一种生物液体中胞外生物大分子的分离和检测方法,其包括:采用荧光染料标记目标胞外生物大分子的步骤,采用磁捕获子与目标胞外生物大分子结合的步骤,采用外加磁场分离目标胞外生物大分子的步骤,采用洗脱液解除目标胞外生物大分子与磁捕获子的结合的步骤,以及采用粒子分析检测设备进行单纳米颗粒分析,所述捕获剂为能与目标胞外生物大分子结合的捕获剂;所述磁捕获子包括固相载体、连接介质和捕获剂,或者所述磁捕获子包括固相载体和捕获剂。
2.根据权利要求1所述的方法,其包括:
步骤S1:所述荧光染料含能与目标胞外生物大分子结合的适配结构,使荧光染料与目标胞外生物大分子通过适配结构结合;
步骤S2:所述磁捕获子中的捕获剂为能与目标胞外生物大分子结合的捕获剂,使磁捕获子与目标胞外生物大分子通过捕获剂结合;
步骤S3:通过外加磁场,将目标胞外生物大分子与生物液体分离;
步骤S4:用洗脱液解除磁捕获子与目标胞外生物大分子的结合,并除去固相载体;
步骤S5:经过步骤S1、S2、S3和S4后,得到结合荧光染料的目标胞外生物大分子,采用粒子分析检测设备对结合荧光染料的目标胞外生物大分子进行单纳米颗粒分析;
其中,所述步骤S1、步骤S2、步骤S3、步骤S4和步骤S5的顺序为:(1)步骤S1→步骤S2→步骤S3→步骤S4→步骤S5;或者(2)步骤S2→步骤S1→步骤S3→步骤S4→步骤S5;或者(3)步骤S1和步骤S2同时进行→步骤S3→步骤S4→步骤S5;或者(4)步骤S2→步骤S3→步骤S1→步骤S4→步骤S5。
3.根据权利要求1-2任一项所述的方法,其包括:选自以下任一方法:
将荧光染料与生物液体混合,所述荧光染料含能与目标胞外生物大分子结合的适配结构,孵育,使荧光染料与目标胞外生物大分子通过适配结构结合;再加入磁捕获子,所述磁捕获子中的捕获剂为能与目标胞外生物大分子结合的捕获剂,孵育,使磁捕获子与目标胞外生物大分子通过捕获剂结合;置外加磁场进行分离富集,去除上清液,洗涤,将目标胞外生物大分子与生物液体分离,得到结合荧光染料和磁捕获子的目标胞外生物大分子,用洗脱液洗脱解除磁捕获子与目标胞外生物大分子的结合,并除去固相载体,得到结合荧光染料的目标胞外生物大分子;采用粒子分析检测设备对包含荧光染料的目标胞外生物大分子进行单纳米颗粒分析;或者
其包括:将捕获子与生物液体混合,所述磁捕获子中的捕获剂为能与目标胞外生物大分子结合的捕获剂,孵育,使磁捕获子与目标胞外生物大分子通过捕获剂结合;再加入荧光染料,所述荧光染料含能与目标胞外生物大分子结合的适配结构,孵育,使荧光染料与目标胞外生物大分子通过适配结构结合;置外加磁场进行分离富集,去除上清液,洗涤,将目标胞外生物大分子与生物液体分离,得到结合荧光染料和磁捕获子的目标胞外生物大分子,用洗脱液洗脱解除磁捕获子与目标胞外生物大分子的结合,并除去固相载体,得到结合荧光染料的目标胞外生物大分子;采用粒子分析检测设备对包含荧光染料的目标胞外生物大分子进行单纳米颗粒分析;
或者
其包括:将磁捕获子和荧光染料与生物液体混合,所述磁捕获子中的捕获剂为能与目标胞外生物大分子结合的捕获剂,所述荧光染料含能与目标胞外生物大分子结合的适配结构,孵育,使磁捕获子和荧光染料与目标胞外生物大分子通过捕获剂结合;置外加磁场进行分离富集,去除上清液,洗涤,将目标胞外生物大分子与生物液体分离,得到结合荧光染料和磁捕获子的目标胞外生物大分子,用洗脱液洗脱解除磁捕获子与目标胞外生物大分子的结合,并除去固相载体,得到结合荧光染料的目标胞外生物大分子;采用粒子分析检测设备对包含荧光染料的目标胞外生物大分子进行单纳米颗粒分析;或者
其包括:将磁捕获子与生物液体混合,所述磁捕获子中的捕获剂为能与目标胞外生物大分子结合的捕获剂,孵育,使磁捕获子与目标胞外生物大分子通过捕获剂结合;置外加磁场进行分离富集,去除上清液,洗涤,将目标胞外生物大分子与生物液体分离;荧光染料与目标胞外生物大分子混合,所述荧光染料含能与目标胞外生物大分子结合的适配结构,孵育,使荧光染料与目标胞外生物大分子通过适配结构结合,得到结合荧光染料和磁捕获子的目标胞外生物大分子,通过离心、超滤或透析除去游离的荧光染料,用洗脱液解除磁捕获子与目标胞外生物大分子的结合,并除去固相载体,得到结合荧光染料的目标胞外生物大分子;采用粒子分析检测设备对结合荧光染料的目标胞外生物大分子进行单纳米颗粒分析。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法,所述捕获剂包括选自多肽、蛋白质、抗体、配体和/或受体、酶、生长因子、糖脂类、多糖、核酸中的至少一种或其组合;和/或
所述捕获剂为抗体、脂类、多糖中的至少一种或其组合。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法,所述抗体包括选自CD9抗体、CD63抗体、CD81抗体、TIM4蛋白、Annexin V蛋白、细胞外囊泡蛋白特异抗体、疾病标志物蛋白特异抗体或病毒特异抗体中的至少一种或其组合;和/或
所述疾病包括肿瘤、炎症、慢性病或神经退行性疾病;和/或
所述脂类包括选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基丙烷、1,2-二油酰-3-三甲基-丙烷、3β-[N-(N',二甲基氨基乙烷盐酸盐)-氨基甲酰基]胆固醇、1,2-二-O-十八碳烯基-3-二甲基的丙烷、1,2-二油酰-3-二甲基-丙烷、蛋磷脂酰胆碱、L-α-磷脂酰胆碱、胆固醇、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、饱和脂肪酸、1-1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]中的至少一种或其组合;和/或
所述多糖包括选自肝素、聚乳糖胺、α2,6结合唾液酸、高甘露糖聚糖、复合型N-糖链中的至少一种或其组合;和/或
所述核酸包括选自核酸适配体、核酸探针中的至少一种或其组合。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法,所述固相载体表面负载官能基团,所述官能基团包括选自羟基、羧基、氨基、醛基、环氧基、马来酰亚胺、对甲苯磺酰基、N-羟基琥珀酰亚胺或巯基中的至少一种或其组合。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法,所述捕获剂通过直接连接或间接连接的方式与固相载体连接,或者所述捕获剂通过连接介质与固相载体连接,和/或
所述捕获剂通过间接连接的方式与固相载体连接,固相载体表面的负载官能基团通过连接介质而实现捕获剂与固相载体的结合;和/或
所述连接介质包括选自寡核苷酸单链、寡核苷酸双链、含特异限制性酶切位点的寡核苷酸双链,或者包含二硫键桥连分子的连接分子;和/或
所述包含二硫键桥连分子的的连接分子包括选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-二硫键(DSPE-PEG-SS)、生物素二硫键(NHS-SS-biotin)、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)、二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)、辛二酸二琥珀酰亚胺(DSS)、双(硫代琥珀酰亚胺基)辛二酸酯钠盐(BS3)、酒石酸二琥珀酰亚胺(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-DST)、双(2-(琥珀酰亚胺氧羰基氧)乙基)砜(BSOCOES)、双(2-(磺基琥珀酰亚胺氧羰基氧)乙基)砜(sulfo-BSOCOES)、乙二醇-双(琥珀酰亚胺酯丁二酸酯)(EGS)、乙二醇-双(磺基琥珀酰亚胺酯丁二酸酯)(sulfo-EGS)、双琥珀酰亚胺戊二酸酯(DSG)、N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、二甲基己二亚酰胺酯(DMA)、庚二酰亚胺酸二甲酯(DMP)、二甲基辛二硝酸酯(DMS)、3,3'-二硫代双丙亚氨酸二甲酯(DTBP)、1,4-二(3'-(2'-二硫基吡啶)丙酸酰氨基)丁烷(DPDPB)、二马来酰亚胺基己烷(BMH)、二氟二硝基苯(DFDNB)、二氟二硝基苯基砜(DFDNPS)、二硫化二(β-(4-叠氮水杨酰氨基)乙基)(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇缩水甘油醚、已二酸二酰肼(ADH)、碳酰肼、二氨二甲基联苯、对二氨基联苯、氮-琥珀星氩氨-3(2-吡啶二硫代)-酸酯(SPDP)、长链-氮-琥珀星氩氨-3(2-吡啶二硫代)-酸酯(LC-SPDP)、磺基长链-氮-琥珀星氩氨-3(2-吡啶二硫代)-酸酯(sulfo-LC-SPDP)、琥珀酰亚胺基氧代羰基-甲基-(2-吡啶基硫代)苯(SMPT)、磺基长链-琥珀酰亚胺基氧代羰基-甲基-(2-吡啶基硫代)苯(sulfo-LC-SMPT)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸3-硫代-N-琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)、马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(MBS)、M-马来酰亚胺苯甲酸琥珀酰亚胺酯(sulfo-MBS)、N-琥珀酰亚胺(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸(SIAB)、磺基-N-琥珀酰亚胺(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸(sulfo-SIAB)、4-(4-马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(SMPB)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(P-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(sulfo-SMPB)、4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)、磺基马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯(sulfo-GMBS)、琥珀酰亚胺基-6-((碘乙酰基)氨基)己酸酯(SIAX)、琥珀酰亚胺基-6-(6-(((4-碘代乙酰基)氨基)己酰)氨基)己酸(SIAXX)、琥珀酰亚胺基-4-(((碘代乙酰基)氨基)甲基)环己烷-1-羧酸(SIAC)、琥珀酰亚胺基-6-((((4(碘代乙酰基)氨基)甲基)环己烷-为-1-羰基)氨基)己酸(SIACX)、4-硝基苯酯碘乙酸(NPIA)、4-(4-N-马来酰亚胺苯甲胺酯)丁酸酰肼(MPBH)、4-N-马来酰亚胺甲基环己烷-1-羧基酰肼(M2C2H)、3-(2-吡啶基二硫代)丙酰酰肼(PDPH)、N-羟基琥珀酰亚胺-4-叠氮基水杨酸(NHS-ASA)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺-4-叠氮基水杨酸(sulfo-NHS-ASA)、磺基琥珀酰亚胺-4-叠氮水杨基氨基己酸(sulfo-NHS-LC-ASA)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(P-叠氮基-水杨酰氨基)乙基-1,3'-二硫基丙酸酯(SASD)、琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯(HSAB)、磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯(sulfo-HSAB)、N-琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯(SANPAH)、磺基琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯(sulfo-SANPAH)、5-叠氮基-2-硝基苯甲酸-N-琥珀酰亚胺酯(ANB-NOS)、磺基琥珀酰亚胺-2-(M-硝基叠氮基-苯甲酰胺基)-乙基-1,3'-二硫代二丙酸酯(SAND)、N-琥珀酰亚胺基-(4-叠氮基苯基)-1,3'-二硫代丙酸酯(SADP)、N-磺基琥珀酰亚胺基-(4-叠氮基苯基)-1,3'-二硫代丙酸酯(sulfo-SADP)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(P-叠氮苯基)丁酸(Sulfo-SAPB)、磺基琥珀酰亚胺-2-(7-叠氮-4-甲基甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1,3'-二硫代丙酸酯(SAED)、磺基琥珀酰亚胺-7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸酯(Sulfo-SAMCA)、对硝基苯基重氮丙酮酸(pNPDP)、对硝基苯基-2-重氮3,3,3-三氟丙酸(PNP-DTP)、1-(p-叠氮水杨酰氨基)-4-(碘乙酰胺基)丁烷(ASIB)、N-(4-(p-叠氮水杨酰胺基)丁基)-3'-(2'-吡啶基二硫)丙酰胺(APDP)、二苯甲酮-4-碘乙酰胺、二苯甲酮-4-马来酰亚胺、p-叠氮苯甲酰肼、4-(P-叠氮水杨酰氨基)-丁胺(ASBA)、P-叠氮苯基乙二醛(APG)、4-叠氮-2-硝基苯基生物素-4-硝基苯基酯(ABNP)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(6-(生物素酰胺基)-2-(p-叠氮苯甲酰氨基)已酰氨基)乙基-1,3-二硫基丙酸酯(sulfo-SBED)、甲烷硫代磺酸叠氮基四氟-长链-生物素(MTS-ATF-biotin)、甲烷硫代磺酸叠氮基四氟生物素(MTS-ATF-LC-biotin)、三(羟基甲基)磷化氢(THP)、三(羟基甲基)磷基丙酸(THPP)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐中的至少一种或其组合;和/或
所述官能基团包括选自羟基、羧基、氨基、醛基、环氧基、马来酰亚胺、对甲苯磺酰基、N-羟基琥珀酰亚胺或巯基中的至少一种或其组合或其组合;和/或
所述连接介质在采用特定洗脱剂的条件下发生断裂和/或解聚反应,或者所述连接介质在采用特定洗脱剂的条件下通过竞争性洗脱的方式使捕获剂与目标胞外生物大分子分离;和/或
所述连接介质选自氯化镍或硫酸镍与his(组蛋白)亲合结构,或者谷胱甘肽与谷胱甘肽巯基转移酶的亲合结构;和/或
所述连接介质选自氯化镍或硫酸镍与his(组蛋白)亲合结构,所述特定洗脱剂选自咪唑;和/或
所述连接介质选自谷胱甘肽与谷胱甘肽巯基转移酶的亲合结构,所述特定洗脱剂还原性谷胱甘肽;和/或
所述断裂和/或解聚反应的反应温度为0℃-55℃,或者为20℃-37℃;和/或
所述断裂和/或解聚反应的反应pH为5-8,或者为6.5-7.5;和/或
所述断裂和/或解聚反应包括选自采用生物酶和/或化学试剂介导对连接介质进行断裂和/或解聚;和/或
所述生物酶包括选自核酸酶或限制性内切酶;和/或
所述化学试剂包括选自三氯乙基磷酸酯(TCEP)、三氯丙基磷酸酯、磷酸正乙酯、2-巯基乙胺(2-MEA)、还原型谷肮甘肤、氧化型谷肮甘肤、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、半胱氨酸、胱氨酸、二硫丁胺或亚硫酸纳中的至少一种或其组合;和/或
所述断裂和/或解聚反应包括采用核酸酶对具有寡核苷酸单链或寡核苷酸双链的所述连接介质上的磷酸二酯键进行断裂和/或解聚反应;和/或
所述断裂和/或解聚反应包括采用限制性内切酶对的具有寡核苷酸双链的所述连接介质上包含有的特异限制性酶切位点进行断裂和/或解聚反应;和/或
所述断裂和/或解聚反应包括采用三氯乙基磷酸酯(TCEP)、三氯丙基磷酸酯、磷酸正乙酯、2-巯基乙胺(2-MEA)、还原型谷肮甘肤、氧化型谷肮甘肤、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、半胱氨酸、胱氨酸、二硫丁胺或亚硫酸纳中的至少一种或其组合化学试剂对包含二硫键桥连分子的所述连接介质的二硫键进行断裂和/或解聚反应。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法,所述目标胞外生物大分子表面或者内部含有能与捕获剂特异性结合的物质,所述能与捕获剂特异性结合的物质包括选自抗原、核酸、脂肪、糖类中的至少一种或其组合;或者
所述目标胞外生物大分子为细胞外囊泡,所述细胞外囊泡表面含有CD63抗原,所述捕获剂为CD63抗体;和/或
所述目标胞外生物大分子为细胞外囊泡,所述细胞外囊泡表面含有磷脂酰丝氨酸,所述捕获剂为TIM4蛋白;和/或
所述目标胞外生物大分子为细胞外囊泡,所述细胞外囊泡表面含有脂膜,所述捕获剂为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺;和/或
所述目标胞外生物大分子为细胞外囊泡,所述细胞外囊泡表面含有脂膜和磷脂酰丝氨酸,所述捕获剂为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和TIM4蛋白;和/或
所述捕获剂与固相载体采用聚乙二醇-二硫键进行连接;和/或
所述捕获剂与固相载体采用生物素和亲和素蛋白作为连接介质进行连接;和/或
所述固相载体与捕获剂采用亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇作为连接介质进行连接,得到结构为固相载体-亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇-捕获剂的磁捕获子;和/或
所述固相载体与捕获剂采用亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇作为连接介质进行连接,所述捕获剂为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺,得到结构为固相载体-亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺的磁捕获子;和/或
所述TIM4蛋白与固相载体采用生物素和亲和素蛋白进行连接,得到结构为固相载体-亲和素蛋白-生物素-TIM4蛋白的磁捕获子;和/或
所述捕获剂与固相载体通过DTSSP-链霉亲和素蛋白-生物素作为连接介质进行连接;和/或
所述连接介质为脱硫生物素或其类似物和亲和素蛋白。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法,所述洗脱液为含洗脱剂的水溶液;和/或
所述捕获剂与固相载体采用亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇作为连接介质进行连接,所述洗脱液为含洗脱剂的水溶液,所述洗脱剂包括选自所述洗脱剂包括选自三氯乙基磷酸酯(TCEP)、三氯丙基磷酸酯、磷酸正乙酯、2-巯基乙胺(2-MEA)、还原型谷肮甘肤、氧化型谷肮甘肤、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、半胱氨酸、胱氨酸、二硫丁胺或亚硫酸纳中的的至少一种或其组合;和/或
所述捕获剂与固相载体通过DTSSP-链霉亲和素蛋白-生物素作为连接介质进行连接,所述洗脱液为含洗脱剂的水溶液,所述洗脱剂可以包括选自三氯乙基磷酸酯(TCEP)、三氯丙基磷酸酯、磷酸正乙酯、2-巯基乙胺(2-MEA)、还原型谷肮甘肤、氧化型谷肮甘肤、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、半胱氨酸、胱氨酸、二硫丁胺或亚硫酸纳中的的至少一种或其组合至少一种或其组合
所述捕获剂为TIM4蛋白,所述洗脱剂包括选自能够螯合钙离子的金属螯合剂;和/或
所述连接介质为脱硫生物素或其类似物和亲和素蛋白,所述洗脱液为含洗脱剂的水溶液,所述洗脱剂包括生物素、生物素类似物及其组合。
10.根据权利要求9所述的方法,所述洗脱液为含洗脱剂的水溶液,所述洗脱剂包括选自三氯乙基磷酸酯(TCEP)、三氯丙基磷酸酯、磷酸正乙酯、2-巯基乙胺(2-MEA)、还原型谷肮甘肤、氧化型谷肮甘肤、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、半胱氨酸、胱氨酸、二硫丁胺或亚硫酸纳中的的至少一种或其组合,以所述洗脱液的总质量计算,所述洗脱剂的含量为10mM-500mM;和/或
所述捕获剂为TIM4蛋白,所述洗脱液为含洗脱剂的水溶液,所述洗脱剂为能够螯合钙离子的金属螯合剂,以所述洗脱液的总质量计算,所述能够螯合钙离子的金属螯合剂的含量为1mM-200mM;
所述连接介质为脱硫生物素或其类似物和亲和素蛋白,所述洗脱液为含洗脱剂的水溶液,所述洗脱剂包括生物素、生物素类似物及其组合以所述洗脱液的总质量计算,所述洗脱剂的含量为2mM-100mM。
11.根据权利要求2-10任一项所述的方法,所述适配结构包括选自CD9抗体和PSA抗体中的至少一种或其组合;和/或
所述荧光染料包括荧光分子、荧光材料或其组合,和/或所述荧光染料包括有机荧光分子、荧光蛋白、核酸染料、脂膜染料、量子点、Polymer Dots中的至少一种或其组合;和/或
所述有机荧光分子包括选自Alexa Fluor 488。
12.根据权利要求1-11任一项所述的方法,所述磁捕获子包括结构为固相载体-亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇-捕获剂的磁捕获子和结构为固相载体-亲和素蛋白-生物素-TIM4蛋白的磁捕获子;和/或
所述磁捕获子包括结构为结构为固相载体-亲和素蛋白-生物素-二硫键-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺的磁捕获子和结构为固相载体-亲和素蛋白-生物素-TIM4蛋白的磁捕获子。
13.根据权利要求1-12任一项所述的方法,所述生物液体包括选自血液、血浆、血清、尿液、痰液、脊髓液、脑脊液、胸腔积液、乳头抽吸吸液、淋巴液、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的流体、泪液、唾液、母乳、来自淋巴系统的流体、精液、脑脊液、器官内系统流体、腹水、肿瘤囊肿液、羊水、细菌细胞培养物、哺乳动物细胞培养物、细胞培养物上清液、无细胞蛋白转录-翻译反应物中的至少一种或其组合。
14.根据权利要求1-13任一项所述的方法,所述粒子分析检测设备包括流式颗粒检测设备;和/或
所述流式颗粒检测设备为可实现样本流定向流动的颗粒分析检测设备;和/或
所述粒子分析检测设备包括所述定向流体系统、光学系统和颗粒检测器;和/或
所述定向流体系统由上样单元以及流动单元组成;和/或
所述颗粒检测器为光电传感器和具有限带过滤高频噪音功能的信号调理电路组成。
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