CN116064784A - Fgf10在制备检测类风湿性关节炎试剂盒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种类风湿性关节炎的检测试剂盒及其应用。本发明首次发现能够治疗类风湿性关节炎骨破坏的潜在新靶点,证实了FGF10蛋白在活动期RA患者滑膜高表达,同时证实了FGF10蛋白在活动期类风湿性关节炎患者关节液高度表达,提示FGF10可作为一种评估类风湿关节炎疾病发展情况的监测指标,还可以用于制备类风湿性关节炎的检测试剂或试剂盒,为类风湿性关节炎的预后提供更多有效途径。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域,具体地说,是关于FGF10在制备检测类风湿性关节炎试剂盒中的应用。
背景技术
类风湿关节炎(Rheumatoidarthritis,RA)是一种病因未明的慢性、以炎性滑膜炎为主的系统性疾病。其特征是手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性关节炎症,经常伴有关节外器官受累及血清类风湿因子阳性,可以导致关节畸形及功能丧失。女性好发,发病率为男性的2~3倍。可发生于任何年龄,高发年龄为40~60岁。
FGFR1基因所编码的蛋白质是属于成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族成员之一,目前已确定了四种由FGFRs,即FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4。FGFR1是一种跨膜蛋白质,属于受体酪氨酸激酶,当FGF与FGFR1胞外段结合后,受体细胞内段酪氨酸激酶活性区首先发生自身磷酸化,然后使受体靶蛋白发生反式磷酸化,通过蛋白质级联反应将配体的信号传递给细胞核。FGF/FGFR1信号传递是细胞正常生长所必需的,但当过量时可引起多种疾病,在乳腺癌、脑胶质瘤、肝癌细胞等,都发现有高水平FGFR1的表达。
改善疾病的抗风湿药(DMARDs)是治疗类风湿性关节炎(RA)的一线用药,很大程度上改善了部分患者的病情并能一定程度上保护患者关节。但是临床上,DMARDs常带来的胃肠道反应、肝肾损害以及免疫抑制等的副作用。也存在一部分患者对其治疗不敏感。非甾体抗炎药(NSAIDs)能够减轻疼痛,但不会对RA患者提供实质性的关节保护。糖皮质激素可提供快速的症状和疾病缓解作用,但长期服用容易导致骨质疏松、胃肠道出血以及股骨头坏死等严重的副作用。相比之下,生物DMARDs和靶向合成的DMARDs调节与炎症产生有关的特定靶点,包括肿瘤坏死因子(TNF)抑制,白细胞介素6(IL6)受体抑制剂以及JAK抑制剂等明显改善了患者的病情,很大程度地保护了患者的关节。
中文专利CN112779327A,公开日2021.05.11,公开了一种标志物在制备类风湿关节炎诊断试剂盒中或治疗类风湿关节炎药物中的应用。该应用中标志物为滑膜细胞上清液外泌体lncRNASNHG5或其截短序列,该本发明研究发现滑膜细胞外泌体lncRNASNHG5在类风湿关节炎患者中较骨关节炎患者表达明显增高,利用外泌体lncRNASNHG5不仅将为类风湿关节炎早期快速检测,而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。另一中文专利CN107436358A,公开日2017.12.05,公开了人结缔组织生长因子在制备类风湿性关节炎诊断试剂或试剂盒中的应用,该发明本发明首次证实血清CTGF对RA患者的诊断、早期诊断、联合诊断、鉴别诊断价值及滑液CTGF对RA患者的诊断价值,该发明操作简单方便,可准确、高灵敏度地检测到类风湿性关节炎病人血清及滑液中的CTGF蛋白的含量,为临床检验和基础研究提供了一种新的手段和方法。
而目前部分类风湿关节炎(RA)患者,尤其是难治性类风湿关节炎患者,对现有药物治疗反应性差,所以寻找治疗RA新靶点,成为未来的研究方向,而目前关于本发明的关于FGF10在制备检测类风湿性关节炎试剂盒中的应用还未见报道。
发明内容
本发明的目的是,针对现有技术中的不足,提供关于FGF10在制备检测类风湿性关节炎试剂盒中的应用。
一方面,提供了FGF10基因或蛋白在制备检测类风湿性关节炎试剂盒中的应用。
优选地,所述试剂盒可用于评估类风湿关节炎疾病的发展情况,所述FGF10基因或蛋白可作为评估类风湿关节炎疾病发展情况的监测指标。
第二方面,提供了一种类风湿性关节炎的诊断试剂盒,所述试剂盒包括检测FGF10基因或蛋白表达量的试剂。
作为一个优选例,所述FGF10基因或蛋白在活动期类风湿性关节炎中高表达。
第三方面,提供上述检测试剂盒在评估类风湿关节炎发展情况中的应用。
第四方面,提供了检测FGF10基因或蛋白表达量的试剂在制备类风湿性关节炎检测试剂盒中的应用
本发明优点在于:
本发明证实实FGF10蛋白在活动期RA患者滑膜和关节液中高表达,可将FGF10蛋白作为评估类风湿关节炎疾病发展情况的监测指标,为类风湿性关节炎的预后提供更多有效途径,为治疗类风湿性关节炎骨破坏提供新思路。
附图说明
附图1为单细胞测序及免疫组化分析FGF10/FGFR1信号通路在活动期RA滑膜中的表达情况。
附图2为ELISA检测FGF10在活动期、缓解期RA以及OA患者滑液中表达的情况。
具体实施方式
下面结合具体实施方式,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明记载的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1实验方法
1.1病例资料
研究所用RA活动期和缓解期滑膜组织、关节液标本以及骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者关节液标本均来自于2022年2月-2022年11月于上海中医药大学附属光华医院行膝关节置换术或者膝关节镜手术的患者。其中,单细胞测序样本,RA活动期和缓解期膝关节滑膜样本各3例;多色免疫组化样本,RA活动期和缓解期膝关节滑膜样本各6例;ELISA检测关节液样本,RA活动期患者关节液样本12例,RA缓解期患者关节液样本5例,OA患者关节液样本7例。
RA患者的纳入标准:
①符合2010年美国风湿病学会(American College of Rheumatology,ACR)/欧洲抗风湿联盟(the European League Against Rheumatism,EULAR)分类标准明确诊断为RA患者;
②类风湿因子(rheumatoid factor,RF)及抗瓜氨酸肽抗体(Anti-citrullinatedpeptide antibodies,ACPA)阳性,且定期服用标准剂量的甲氨蝶呤;
③无关节感染性病史;
④患者签署知情同意书。RA患者的疾病活动度根据DAS28评分标准评定,其中活动期RA患者DAS28-CRP/ESR评分>3.2,且有2个及以上的肿胀关节;缓解期RA患者DAS28-CRP/ESR评分<2.6,且符合2011ACR/EULAR疾病缓解标准;
OA患者的纳入标准:
①影像学诊断为膝关节骨性关节炎;
②经实验室检验排除自身免疫性疾病;
③无关节感染病史;
④患者签署知情同意书。本研究得到上海中医药大学附属光华医院伦理委员会的批准,所有入组患者样本的采集均获得患者本人的知情同意(伦理批号:2022-K-02)。
1.2实验试剂
1.3单细胞测序技术分析FGF10/FGFR1信号通路在活动期RA中表达情况
为了探索作为滑膜基质细胞的FLS与其他细胞类型在活动期和缓解期的互作的异同,我们进行了CellChat分析以及对不同FLS亚群中FGFR的转录组表达水平进行分析。
1.4免疫组化测定FGF10蛋白在活动期RA患者滑膜中的表达情况
为了验证FGF10蛋白水平在活动期RA是否高表达,我们首先进行了多色免疫组化(mIHC)实验,随后通过免疫组化(IHC)对来自活动期和缓解期RA患者的12个血管翳样本中的FGF10蛋白表达进行定量分析。实验步骤包括:烤片、脱蜡复水、抗原修复、3%H2O2室温中封闭、羊血清室温湿盒内封闭、孵育一抗及二抗,随后DAB显色或者荧光染色。随后封片,镜下观察分析。1.5ELISA检测FGF10蛋白在活动期RA患者关节液中的表达量
为了检测FGF10蛋白是否在活动期RA患者关节液中高表达,我们通过ELISA检测了活动期RA、缓解期RA以及OA患者关节液中FGF10蛋白表达量。实验步骤如下:
(1)样本处理:将预先冻存的活动期RA、缓解期RA以及OA患者的关节液室温下放置1小时,然后800g,离心2min,取上清液。
(2)标准品稀释:按照试剂盒说明书制备不同浓度的标准品,轻轻混匀后,静置10分钟。
(3)室温下平衡1小时后,取出所需的板条放置在框架内,设置标准品孔、空白孔和样本孔。
(4)标准品孔中各加入预先配置的标准品50ul,样本孔中加入待测样本各50ul,空白孔加入稀释液50ul。
(5)标准品孔、样本孔及空白孔中各加入辣根过氧化物酶(HPR)标记的检测抗体人FGF10抗体100ul,随后反应孔用封板模封闭后,37℃恒温箱中孵育60min。
(6)弃孔内液体,于吸水纸上拍干,每孔加入洗涤液350ul,室温下静置1min,甩掉洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次。
(7)每孔各加入底物A、B液各50ul,37℃恒温箱中避光孵育15min。
(8)每孔加入终止液各50ul,15min内在450nm波长处测定各孔的OD值。
(9)绘制标准曲线:在Excel工作表中,将标准品浓度作为横坐标,将对应的OD值作为纵坐标,以绘制标准品的线性回归曲线,按照曲线方程计算出各样本的浓度值。
2统计与分析
利用GraphPadPrism(V9.4.1)软件对免疫组化和Elisa数据进行统计分析,计量资料符合正态分布采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
3实验结果
3.1单细胞测序技术分析FGF10/FGFR1信号通路在活动期RA的liningFLS高度活化
结果表明,活动期RA中FBL-CD55与其他FLS亚群具有很强的FGF信号通路相互作用(图1A)。此外,我们观察到FGF10-FGFR1在活动期RA的FBL-CD55中被高度激活(图1B)。而对于衬里下层的FLS,FGF7/FGFR1信号通路占优势;然而,在活动期和缓解期RA之间没有明显差异(图1B)。我们进一步分析FGF7、FGF10和FGF14在不同FLS亚群中的转录组表达水平,发现FGF10在活动期RA的FBL-CD55中高表达(图1C)。
3.2免疫组化证实FGF10蛋白在活动期RA患者滑膜高表达
结果表明PDPN+FGF10+FLS主要在活动期RA血管翳衬里层中被检测到(图1D)。血管翳样本中的FGF10蛋白表达进行定量分析表明,活动期RA患者血管翳FGF10蛋白阳性区域的比例显着高于缓解期RA患者(图1E)。通过结合scRNAseq和IHC数据,我们证明了FGF10/FGFR1信号通路在活动期RA的衬里层FLS中高度活化。
3.3ELISA检测结果显示FGF10蛋白在活动期RA患者关节液高度表达
结果显示,在活动期RA患者滑液中的FGF10蛋白水平显着高于RA缓解期和OA患者,而RA缓解期和OA患者之间没有明显的差异(图2)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.FGF10基因或蛋白在制备检测类风湿性关节炎试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述试剂盒可用于评估类风湿关节炎疾病的发展情况,所述FGF10基因或蛋白可作为评估类风湿关节炎疾病发展情况的监测指标。
3.一种类风湿性关节炎的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括检测FGF10基因或蛋白表达量的试剂。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒,其特征在于,所述FGF10基因或蛋白在活动期类风湿性关节炎中高表达。
5.权利要求3和4所述的检测试剂盒在评估类风湿关节炎发展情况中的应用。
6.检测FGF10基因或蛋白表达量的试剂在制备类风湿性关节炎检测试剂盒中的应用。
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