CN116063489A - 一种治疗痛风的单克隆抗体及其相应的组合物 - Google Patents

一种治疗痛风的单克隆抗体及其相应的组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN116063489A
CN116063489A CN202211292796.3A CN202211292796A CN116063489A CN 116063489 A CN116063489 A CN 116063489A CN 202211292796 A CN202211292796 A CN 202211292796A CN 116063489 A CN116063489 A CN 116063489A
Authority
CN
China
Prior art keywords
monoclonal antibody
beta
gout
antibody
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211292796.3A
Other languages
English (en)
Inventor
王虎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Target Food Technology Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Target Food Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Target Food Technology Co ltd filed Critical Hangzhou Target Food Technology Co ltd
Priority to CN202211292796.3A priority Critical patent/CN116063489A/zh
Publication of CN116063489A publication Critical patent/CN116063489A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/245—IL-1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种治疗痛风的单克隆抗体及其相应的组合物。本发明制备并获得了重组的IL‑1β蛋白，以该蛋白为免疫原，通过免疫小鼠，并通过杂交瘤技术制备并获得了IL‑1β单克隆抗体，所述抗体具有较好的特异性以及亲和力，通过痛风模型实验也证实了能够有效的抑制细胞模型中的IL‑1β的表达，提供了一种治疗痛风的有效药物。

Description

一种治疗痛风的单克隆抗体及其相应的组合物
技术领域
本申请涉及生物领域，更具体的涉及一种治疗痛风的单克隆抗体及其相应的组合物。
背景技术
痛风(Gout)是一种常见且复杂的关节炎类型，各个年龄段均可能罹患本病，男性发病率高于女性。痛风患者经常会在夜晚出现突然性的关节疼，发病急，关节部位出现疼痛、水肿、红肿和炎症，疼痛感慢慢减轻直至消失，持续几天或几周不等。痛风发作与体内尿酸浓度有关，痛风会在关节腔等处形成尿酸盐沉积，进而引发急性关节疼痛。痛风是由单钠尿酸盐沉积所致的晶体相关性关节病。痛风主要包括急性发作性关节炎、痛风石形成、痛风石性慢性关节炎、尿酸盐肾病、尿酸性尿路结石、关节残疾、肾功能衰竭等症状。痛风发病的诱因主要是食用了富含大量嘌呤的食物。
对于痛风主要有药物治疗法和饮食治疗法两种方法。痛风急性发作期推荐及早(一般应在24h内)进行抗炎止痛治疗，非甾体消炎药(NSAIDs)、秋水仙碱和糖皮质激素可有效抗炎镇痛，提高患者生活质量。急性发作期不进行降酸治疗，但已服用降酸药物者不需停用，以免引起血尿酸波动，导致发作时间延长或再次发作。非甾体类消炎药对缓解关节疼痛及肿胀通常有效，常用药物：吲哚美辛、双氯芬酸、依托考昔等。疼痛和炎症缓解后，应继续使用非甾体类抗炎药，以防症状再次出现。秋水仙碱是传统的治疗药物，在痛风急性发作期，对非甾体类抗炎药有禁忌者建议单独使用低剂量秋水仙碱，低剂量秋水仙碱(1.5mg/d-1.8mg/d)有效，不良反应少，在48小时内使用效果更好。糖皮质激素主要用于非甾体类消炎药、秋水仙碱治疗无效或禁忌、肾功能不全者，在痛风急性发作期，短期单用糖皮质激素(30mg/d，3天)，其疗效和安全性与非甾体类消炎药类似。
研究发现在痛风性关节炎及高尿酸血症患者血清中均可检测到高水平的IL-1β。研究发现在急性痛风性关节炎的动物实验模型中检测到IL-1mRNA的高表达，发现IL-1β的活性均较痛风的其他不同时期明显增高，可见IL-1β在痛风性关节炎的关节损害过程中扮演了关键的角色。动物实验研究也表明NALP3炎症体和IL-1β在痛风炎症过程中发挥重要作用。在小鼠模型实验中向小鼠的腹膜腔注入尿酸盐晶体，研究结果表明，腹膜腔内的中性粒细胞在尿酸盐晶体释放的部位聚集，并未在小鼠缺乏IL-1β受体的部位聚集，而且，应用IL-1阻断剂可阻止中性粒细胞聚集于腹膜腔，然而注入肿瘤坏死因子α抑制剂的小鼠中性粒细胞在腹膜腔的聚集并未受影响，以上表明IL-1β信号是感应尿酸盐晶体引起的炎症中必不可少的。通过动物模型研究也证实不论在急性还是慢性痛风性关节炎中IL-1均起重要作用，尿酸盐晶体刺激血液及关节液中单核细胞和吞噬细胞，引起IL-1大量释放。研究表明痛风急性发作期间IL-1β在大量促炎症细胞因子产生中充当着关键的调控角色，正如前一部分讨论的，缺乏IL-1β受体或阻断IL-1信号关键组分的小鼠，可以避免炎症袭击和中性粒细胞在尿酸盐晶体存在部位的聚集。
近年来，生物制剂的出现为风湿性疾病治疗打开了新局面，很大程度上改变了疾病的转归。新的观点认为痛风性关节炎不仅是一组关节内疾病，更是系统性自身炎性疾病。国外已有一些生物制剂用于改善痛风的关节症状，其靶向目标即痛风性关节炎发病中的重要炎症介质IL-1，在IL-1阻断剂中，被受到广泛关注及研究最多的药物主要包括阿那白滞素(anakinra)、利纳西普(rilonacept)、康奈单抗(canakinumab)。康奈单抗是IL-1β特异性的全人源化单克隆抗体，首次被应用于混合型冷球蛋白血症。康奈单抗治疗急性痛风性关节炎发作的有效性首次在2010年的一项为期8周的Ⅱ期临床试验(多剂量对照)中被报道，在评价康奈单抗治疗痛风的有效性及安全性临床试验中，选取200例难治性痛风性关节炎患者，随机接受皮下注射康奈单抗(10、25、50、90或150mg，n＝143)，或肌内注射曲安奈德(40mg，n＝57)治疗，用药72h后，用100mm视觉类比评量尺(VAS评分)评价受试者疼痛程度并作为疗效指标，试验结果显示，卡纳单抗剂量组的受试者疼痛缓解程度比肌内注射曲安奈德组更高，痛风复发率明显减低，生活质量较曲安奈德组有明显改善，整个试验过程中两组总体不良事件发生率相似，严重程度均为轻至中度，差异无统计学意义。
但是目前，IL-1β特异性的单克隆抗体国内的研究还不够多，可提供的可选替代类型的单抗的种类也不够丰富，容易被国外制药公司形成卡脖子效应，因此，开发国产的类型丰富的IL-1β特异性的单克隆抗体是目前的当务之急。
发明内容
本发明克服现有技术的缺陷，提供了一种特异性针对IL-1β的特异性的单克隆抗体。
所述单克隆抗体采用杂交瘤技术制备并获得，具体的涉及单抗4D14，该抗体通过特异性鉴定具有较好的特异性和亲和活性。其可变区序列通过试剂盒鉴定并测序后，获得了轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。
进一步的，本发明的单克隆抗体还包括功能性变体。“功能性变体”指与天然存在序列具有基本上同一的氨基酸序列或由基本上同一的核苷酸序列编码并能够具有天然存在序列的一种或多种活性的多肽。在本申请的上下文中，任何给定序列的变体是指其中残基的特定序列(无论是氨基酸或核苷酸残基)已经经过修饰而使得所述多肽或多核苷酸基本上保留至少一种内源功能的序列。可以通过天然存在的蛋白质和/或多核苷酸中存在的至少一个氨基酸残基和/或核苷酸残基的添加、缺失、取代、修饰、替换和/或变异来获得变体序列，只要保持原来的功能活性即可。
一方面，本申请提供一种改造的IL-1β的特异性的单克隆抗体，其在Biacore测定中，可以以1E-08M或以下的KD值(例如，所述KD不高于约1E-08M、不高于约9E-09M、不高于约8E-09M、不高于约7E-09M、不高于约6E-09M、不高于约5E-09M、不高于约4E-09M、不高于约3E-09M、不高于约2E-09M、不高于约1E-09M或以下)与人IL-1β蛋白特异性结合。
进一步的，本发明还通过了含有IL-1β单克隆抗体的药物组合物。
进一步的，所述药物组合物可包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、所述的多肽、所述的免疫缀合物、所述分离的核酸分子、所述的载体、所述的细胞，和/或药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。在本申请中，所述药学上可接受的佐剂可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂。除非与本申请所述的细胞不相容，否则任何常规介质或试剂均可以考虑用于本申请的药物组合物中。在本申请中，所述药学上可接受的赋形剂可以包括在药物制剂中除主药以外的附加物，也可称为辅料。例如，所述赋形剂可以包括片剂中的粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂。例如，所述赋形剂可以包括中药丸剂中的酒、醋、药汁等。例如，所述赋形剂可以包括半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分。例如，所述赋形剂可以包括液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂。
进一步的，本发明还提供了IL-1β单克隆抗体在制备治疗痛风的药物中的用途。
进一步的，所述治疗意指给予受试者内用或外用治疗剂，例如包含本公开的任一种抗体或其药物组合物作为治疗剂，所述受试者已经患有、疑似患有、倾向于患有一种或多种增殖性疾病或其症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗受试者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床能测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如受试者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在受试者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本公开的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解某个受试者中目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的受试者中应当减轻目标疾病症状。
进一步的，“有效量”包含足以改善或预防医学病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、受试者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。本公开的受试者可以是动物或人类受试者。
有益效果
本发明制备并获得了重组的IL-1β蛋白，以该蛋白为免疫原，通过免疫小鼠，并通过杂交瘤技术制备并获得了IL-1β单克隆抗体，所述抗体具有较好的特异性以及亲和力，通过痛风模型实验也证实了能够有效的抑制细胞模型中的IL-1β的表达，提供了一种治疗痛风的有效药物。
附图说明
图1SDS-PAGE法验证诱导表达情况结果图；
图2单抗特异性鉴定结果图；
图3单抗对IL-1β水平的影响结果图。
具体实施方式
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
通过阅读以下详述和所附的权利要求，这些和其它的方面、特征和优点对本领域普通技术人员而言将是显而易见的。为避免疑义，本发明的一个方面的任何特征可以用于本发明的任何其它方面。词语“包含(comprising)”旨在意为“包含(including)”但不必然为“由…组成(consisting of)”或“由…构成(composed of)”。换言之，列举的步骤或选项不需要是穷尽的。应注意在下文描述中给出的实施例旨在阐明本发明并且不旨在限制本发明至那些实施例本身。类似地，所有百分比是重量/重量百分比，除非另有说明。除了在操作和比较实施例中，或其中另有明确说明，该描述中表示材料的量或反应条件、材料的物理特性和/或使用的全部数字均应理解为通过词语“约”修饰。如本文可见的本发明的公开应考虑为覆盖彼此为多项从属的权利要求中可见的全部实施方案，而与可能发现权利要求没有多项从属或冗余(redundancy)的事实无关。
实施例1IL-1β重组蛋白的制备
人IL-1β的分子克隆、原核表达及纯化：根据人的IL-1β基因序列，应用Primer5.0引物设计软件，设计引物。上游引物为：5’-TCTGGATCCATGGCAG AAGTACCTGAGC-3’，下游引物为5’-ATCGCTCGAGGGAAGACACAAATTGC-3’，下划线分别为BamHI和XholI的酶切位点。以人DNA为模板，进行PCR反应，PCR产物大约810bp，经试剂盒纯化后，用BamHI和XholI同时双酶切纯化的PCR产物和原核表达质粒pET-32a(+)，并连接双酶切后的PCR产物和原核表达质粒pET-32a(+)，转化入感受态菌DH5α中，挑选阳性克隆进行测序，将测序正确的克隆抽取质粒，并转入BL21(DE3)表达菌株，IPTG诱导表达，SDS-PAGE法验证诱导表达的结果，结果如图1所示，采用0.5mM IPTG诱导重组蛋白表达，在诱导12h时重组蛋白的表达量较高，条带如诱导1所示，在诱导4h时重组蛋白的表达量较低，条带如诱导2所示。将诱导12h的菌液进行目的蛋白纯化，并调整蛋白浓度为2mg/mL备用。
实施例2IL-1β单克隆抗体的制备
将实施例1纯化好的IL-1β重组蛋白作为免疫原，蛋白60μg与等体积的佐剂(弗氏完全(首次)/不完全(二免和三免))进行混匀后，放入三通阀玻璃乳化器中进行乳化，直至滴一滴于水中油滴成团不扩散，完成乳化。将乳化好的免疫原按照分别进行三次免疫(第1天，第14天，第28天)，对6周龄左右的BALB/c小鼠进行皮下免疫。在三免后七天左右采集尾部血，利用间接ELISA法检测其血清抗体效价，并且选择效价高的BALB/c的2号小鼠进行加强免疫。加强免疫抗原量为110μg，不添加佐剂，皮下免疫。免疫三天后，小鼠，进行眼球采血之后脱颈致死，放入75％酒精中浸泡10min进行消毒。将小鼠固定在解剖板上，用无菌剪剪开皮肤及腹膜，使脾脏暴露。剥离脾脏周围组织，将取出的脾脏用无血清的1640进行冲洗后，放入已置于平皿的200目灭菌铜网中，边碾碎脾脏边用无血清的1640将脾细胞冲洗至平皿中，将收集的脾细胞悬液加入到离心管中，1000rpm离心10min。用无血清的1640重悬沉淀并进行细胞计数。按照脾细胞和SP2/0细胞10:1的比例，放入50mL离心管内，1000rpm离心10min。弃上清，将离心管底部细胞沉淀轻轻弹起，并将离心管放入37℃水浴中，对细胞融合剂进行预热，吸取1mL细胞融合剂以1mL/min的速度缓慢加入，边加边轻轻摇动离心管，使细胞与融合剂得到充分接触混匀，放在37℃水浴中静置90s。加入1mL无血清的1640，以1mL/min的速度边滴加边轻轻摇动离心管，此过程再重复一次。然后加入1mL无血清的1640，以1mL/30s的速度进行滴加，最后在2min内加完7mL无血清的1640，边滴加边轻轻摇动离心管。1000rpm离心10min，弃上清。加入预热的HAT培养基进行细胞重悬，以100μL/孔加入到铺有饲养层细胞的96孔细胞板中，于37℃5％CO2细胞培养箱中培养。融合后第7天，用预热的HT培养基进行半换液。每天观察细胞状态，并且标记融合的细胞孔，待杂交瘤细胞长到96孔细胞板孔底的1/3-1/2时，对细胞上清进行检测，并设阴、阳性对照孔，在亚克隆之前进行两次检测，并对两次检测均为阳性的杂交瘤细胞孔进行亚克隆。经过四次亚克隆筛选后，得到2株能够稳定分泌IL-1β单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为3A6和4D14。
用灭菌的液体石蜡注射到10周龄的BALB/c小鼠腹腔，0.5mL/只。10d后，用无血清的1640重悬杂交瘤细胞，并进行计数，以2×106个杂交瘤细胞/mL，0.5mL/只的量注射到小鼠腹腔内。接种后，观察小鼠状态，约一周后小鼠腹部开始出现隆起，待小鼠腹围胀大、行动迟缓时，开始收集腹水。用注射器对小鼠腹腔内液体进行抽取。2000rpm离心10min，吸取上清，去掉油脂和细胞，利用柱纯化，得到纯化的二株抗体，-20℃分装保存备用。
实施例3单抗3A6和4D14特异性鉴定
利用制备的纯化单抗进行Westernblot抗原性鉴定，Westernblot方法步骤如下：
(1)制备SDS-PAGE，下层的15％分离胶和上层的5％浓缩胶；
(2)处理蛋白样品，IL-1β重组蛋白样品或His标签蛋白:SDS:DTT＝5:4:1放于离心管中，100℃水中煮10min使蛋白变性；
(3)加样：将蛋白样品调整成相同浓度进行上样；
(4)电泳：浓缩胶90V电压先跑30分钟左右，分离胶120V电压跑至底端；
(5)转膜：转印时叠放的由上到下的顺序是：滤纸—蛋白胶—NC膜—滤纸，转印条件：60mA，350min左右，转印结束后将膜放入20mL的5％脱脂乳封闭液中，4℃封闭过夜；
(6)抗体孵育：倒掉封闭液，将膜用PBST洗，洗5次，每次5min，以制备的单抗作为一抗，PBST进行1:1000稀释倍数，4℃封闭孵育8h；一抗回收，用PBST洗，洗5次，每次5min；加山羊抗小鼠IgG-HRP二抗，PBST进行1:5000稀释倍数，37℃摇床孵育2h；二抗回收，用PBST洗，洗5次，每次5min；避光保存现用现配的ECL曝光液，将膜铺于曝光盒中，与曝光液作用30s进行曝光成像。结果如图2所示。从图2可以看出，单抗3A6和4D14分别在诱导2和4出现特异性的目的条带，单抗3A6在泳道1以及单抗4D14在泳道3分别都不与对照蛋白进行反应，无条带产生，说明本发明的单抗具有较好的特异性。
实施例4单抗4D14的亲和力以及亚型鉴定
用Biacore检测单抗4D14与抗原IL-1β重组蛋白的结合亲和性。混合100mL 10×HBS-EP+缓冲液和900mL Milli-Q水，得到1L 1×HBS-EP+缓冲液。用1:1混合的50mM NHS和200mM EDC(NHS和EDC来自氨基偶联试剂盒)活化CM5芯片1-3通道的表面，流速为10μL/min，时间420秒。以10μL/min流速注射Anti-hFc或抗小鼠Fc抗体(稀释在pH4.5的醋酸钠溶液中，浓度20μg/mL)200秒，最后用1M乙醇胺盐酸盐(pH8.5)封闭芯片上多余的有活性的羧基。用1×HBS-EP+以10μL/min流速，冲洗芯片表面2小时，以稳定基线，仪器设定温度为25℃。初始循环，由测样和再生两步组成，测量前重复3次，以稳定基线。测样：以30μL/min流速向1-3通道注射1×HBS-EP+缓冲液120秒，解离60秒。再生：向1-3通道注射10mM甘氨酸pH1.5，30μL/min，30秒，稳定30秒。结合动力学参数测定的实验步骤:动力学测定的运行缓冲液是1×HBS-EP+(pH7.4)溶液。捕获：在Anti-hFc或抗小鼠Fc芯片第1-3通道的测试通道分别注射抗体，流速10μL/min，60s，进行捕获。用1×HBS-EP+(pH 7.4)将抗原IL-1β重组蛋白稀释至100nM。测样：以30μL/min流速向1-3通道注射，1个0浓度样品用于去除背景信号；抗原抗体的结合和解离时间分别为180和400秒。再生：以30μL/min流速向1-3通道注射10mM甘氨酸pH1.5，30秒，然后稳定60秒。使用Biacore8K分析软件计算每个本申请抗体的平衡解离常数(KD值)。参比通道(FC1)用于背景的扣减。结果显示，单抗4D14的解离常数为(4.25±0.17)nM，以上试验表明，本申请的单抗具有与抗原较好的结合亲和力。
同时，利用mouse单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定4D14单抗的亚型。经鉴定，制备的4D14单抗重链类型为IgG2b，轻链类型为Kappa链。
实施例5 4D14单抗在痛风模型中的应用
称取40mgMSU白色粉末，加入1mL吐温80，并用RMPI-1640培养基定容至100mL，采用磁力搅拌器加热、搅拌至晶体完全溶解，配成浓度为400μg·mL-1MSU混悬液。高压灭菌、密封分装后，于4℃保存备用。
将THP-1细胞从液氮罐中迅速取出，放入预热至37℃恒温水浴箱中快速摇晃解冻。将细胞悬液转移至15mL无菌离心管中；加入含1％青霉素+链霉素双抗和10％FBS的RPMI1640培养基10倍稀释，将细胞悬液1000rpm离心5min，弃去上清液，向细胞沉淀中重新加入1mL新鲜培养基，轻轻吹打至细胞重悬后转移至培养瓶中，继续添加5mL新鲜培养基，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。通过倒置显微镜观察细胞生长状态，可见细胞呈亮圆形、悬浮于培养基中。每2-3d换液一次，当细胞生长融合达80-90％时将细胞悬液移至15mL离心管，于1000r/min离心5min，弃上清液同时加入适量培养基，轻轻吹打使细胞重悬，以细胞浓度2.0×105/mL进行传代培养，加入适量培养基于37℃、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中继续培养，THP-1细胞以1.0×106/孔接种于6孔板，100ng/mL PMA刺激THP-1细胞24h，诱导其分化为巨噬细胞，与空白对照组比较，经100ng/mL PMA刺激后，巨噬细胞特异性蛋白CD11b的表达显著升高，提示100ng·mL-1PMA可成功诱导THP-1单核细胞分化为巨噬细胞。
单抗活性验证：巨噬细胞作为靶细胞，正常组和模型组不加单抗，其余各组分别加入不同浓度(1、10、50、100μg/mL)4D14单抗，阳性对照为50μg/mL康奈单抗，6h后加入终浓度为400μg/mL MSU，每个浓度梯度设置5个复孔，继续培养24h。取细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书测定细胞培养上清液中细胞炎症因子IL-1β水平。
结果如图3所示，与正常组比较，模型组经MSU刺激THP-1源性巨噬细胞后，细胞上清液中炎症因子IL-1β的分泌水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较，经4D14单抗治疗后，在1-100μg/mL范围内IL-1β的含量显著降低，其中4D14单抗在50μg/mL浓度治疗情况下，IL-1β分泌水平相较于模型组治疗性价比最为明显(P<0.01)。与阳性对照组相比，效果相近，其IL-1β表达量只有(25.7±4.3)pg/L，与正常组相比也是差异显著，治疗效果较好。通过这一实验，证明了IL-1β单克隆抗体4D14能够有效的抑制痛风模型细胞中IL-1β的表达，进而实现痛风的治疗。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方式的范围内。

Claims (7)

1.一种特异性针对IL-1β的单克隆抗体4D14，其特征在于该抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。
2.一种用于抑制IL-1β表达的药物组合物，其特征在于所述药物组合物含有权利要求1所述的IL-1β的单克隆抗体。
3.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物含有药学上可接受的载体。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于药学上可接受的载体包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂或非离子表面活性剂。
5.权利要求1所述的IL-1β的单克隆抗体在制备通过抑制IL-1β的表达进而治疗痛风的药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述药物含有药学上可接受的载体。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于药学上可接受的载体包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂或非离子表面活性剂。
CN202211292796.3A 2022-10-21 2022-10-21 一种治疗痛风的单克隆抗体及其相应的组合物 Pending CN116063489A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211292796.3A CN116063489A (zh) 2022-10-21 2022-10-21 一种治疗痛风的单克隆抗体及其相应的组合物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211292796.3A CN116063489A (zh) 2022-10-21 2022-10-21 一种治疗痛风的单克隆抗体及其相应的组合物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116063489A true CN116063489A (zh) 2023-05-05

Family

ID=86170621

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211292796.3A Pending CN116063489A (zh) 2022-10-21 2022-10-21 一种治疗痛风的单克隆抗体及其相应的组合物

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116063489A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI784988B (zh) 治療發炎症狀的方法
EP1808446B1 (en) Il-18 receptor antagonist and pharmaceutical composition containing the antagonist
JP2018135370A (ja) 感染性疾患を治療及び予防する組み合わせ医薬組成物及び方法
CN104995212A (zh) 以il-4r拮抗剂治疗特应性皮炎的方法
CN106068125B (zh) 治疗脂肪组织积聚的组合物和方法
WO2018124009A1 (ja) 低体温改善剤
BR112021008778A2 (pt) Métodos de tratamento da oftalmopatia de graves usando anticorpos anti-fcrn
TW201623330A (zh) Ｉｌ－２１抗體
CN115867316A (zh) 抗pd-1抗体药物组合物及其用途
CN107106681A (zh) 治疗或预防中风的方法
US7147854B2 (en) Topical treatment of psoriasis using neutralizing antibodies to interleukin-8
CN110156890B (zh) Semaphorin7A单克隆抗体及其在制备用于治疗炎症疾病药物方面的应用
CN116063489A (zh) 一种治疗痛风的单克隆抗体及其相应的组合物
CN116063488A (zh) 一种单克隆抗体及其治疗痛风的用途
CN112079922B (zh) 抗人p40蛋白域抗体及其用途
WO2018102654A1 (en) Compositions and methods for treating obesity and hyperphagia
WO2021179106A1 (zh) 一种gp73抑制剂在制备治疗糖尿病的药物中的应用
WO2011085574A1 (zh) 全人TNFα单克隆抗体及其制备方法与应用
CN114316046B (zh) 一种稳定的抗体组合物
CN114874320B (zh) 含有外泌体的药物组合物及其制备方法
CN115028720B (zh) 外泌体以及提高药物敏感性的抑制剂在治疗癌症中的用途
CN108969762B (zh) IgD-Fc-Ig融合蛋白用于制备治疗类风湿关节炎药物的应用
EP4375296A1 (en) An a-fabp neutralizing monoclonal antibody and preparation method and use thereof
RU2790561C2 (ru) Соединение, связывающее адреномедуллин (adm), для применения для терапии или профилактики симптомов заболевания
CN115028729A (zh) 抗尿酸氧化酶单克隆抗体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination