CN116059182A - 纳米粒子及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纳米粒子及其制备方法和应用，包括：阳离子脂质，聚合物；聚合物包括两亲性嵌段共聚物；两亲性嵌段共聚物为疏水聚合物与亲水化合物组成的嵌段共聚物，且至少部分的两亲性嵌段共聚物偶联有靶向元件；通过本发明的纳米粒子递送药物，可以解决蛋白药物在体内不稳定，易分解的难题；本发明发现偶联靶向元件的两亲性嵌段共聚物和阳离子脂质制备得到的纳米粒子在斑块部位有较强的靶向性，在具有靶向性的同时纳米粒子还具有优秀的转染效率，所以递送和治疗效果好。

Description

纳米粒子及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及纳米药物领域，具体地，本发明提供了一种纳米粒子及其制备方法和应用。
背景技术
炎症消退缺陷导致持续的病理刺激将会加速多种疾病的发展。巨噬细胞是炎症过程中的关键细胞，其在心血管疾病、中风、糖尿病、肺纤维化、癌症等多种炎症相关疾病的病理过程中起着关键作用。最近的研究表明炎症消退缺陷是动脉粥样硬化临床进展的主要致病因素。动脉粥样硬化进展过程中，内皮所载的载脂蛋白B水平增加引起巨噬细胞病变并在斑块处聚集，特别是病变巨噬细胞的某些亚群呈现出炎症性的M1样表型，这将进一步激活内皮并导致更多的单核细胞募集。人类晚期动脉粥样硬化的临床表现为斑块部位出现高水平的氧化应激、死亡细胞清除程序(胞吞作用)发生缺陷、纤维帽变薄和组织损伤性坏死。此类易损斑块可导致急性管腔血栓形成和急性心血管事件，包括心肌梗塞、不稳定心绞痛、冠心病猝死和中风。目前动脉粥样硬化的临床治疗以降低低密度脂蛋白(LDL)水平的小分子他汀类药物为主，缺乏靶向炎症的新型药物。心血管疾病仍然是世界范围内的主要死亡原因，开发新型靶向抗炎疗法，以增强局部斑块环境内炎症的有效自然消退，是新药研发的主要方向，具有紧迫性和重要性。
在先天环境中，特定的蛋白质介质例如，白细胞介素10(IL-10)、转化生长因子β(TGF-β)和膜联蛋白A1)可以抑制炎症细胞的积累并促进其排出。这类介质具有清除病原体、细胞碎片和炎症细胞因子、刺激胞吐作用以及修复受损组织的功能。其中，IL-10是一种由各种炎症细胞(包括巨噬细胞和调节性T细胞)产生的可溶性细胞因子。IL-10具有强大的抗炎作用，尤其是它能抑制单核细胞释放几种炎症细胞因子(包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素6(IL-6))，并通过抑制趋化性细胞因子(如中性粒细胞趋化因子(Cxcl15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1))的表达减少中性粒细胞和单核细胞在炎症部位的募集。除此之外，IL-10具有一定的抑制金属蛋白酶(MMP)产生、抗细胞凋亡、调节巨噬细胞分化和脂质代谢的治疗效果。已发现易损斑块患者的IL-10水平显著低于健康对照，而且这种细胞因子已被证明可以抑制动脉粥样硬化。IL-10在动脉粥样硬化诊疗上展现了广阔的应用前景，但其临床应用尚存在瓶颈。需要克服的问题包括：(1)IL-10全身性半衰期短，且十分昂贵；(2)很多细胞表达IL-10受体，有可能在非靶向细胞中激活信号通路，导致免疫抑制；(3)长期全身性高水平的IL-10疗法可能加剧炎症的代偿性反应。
核酸替代疗法可有效地解决由于蛋白药物半衰期短而频繁给药导致的患者顺应性问题。近期，mRNA新药由于其在新冠疫苗上的成功开发获得了举世瞩目。体外合成的mRNA具有独特优越性，包括：在转染过程中它不需要进入细胞核，不会整合到宿主基因组中，化学修饰增强了mRNA的稳定性和蛋白翻译效率并减少了先天免疫反应的激活，等。使用mRNA来下调炎症反应很有前景，但将mRNA有效地递送至炎症部位仍然是一个重大挑战。目前已经在临床试验中探索了几种针对不同疾病(例如癌症、纤维化和病毒感染等)的mRNA药物和递送技术，但仍缺乏针对动脉粥样硬化的mRNA药物和递送技术。
综上所述，本领域尚缺乏一种针对动脉粥样硬化的mRNA药物组合物，本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种靶向治疗动脉粥样硬化的纳米粒子，本发明通过纳米粒子递送药物解决了蛋白药物在体内不稳定，易分解的难题；本发明意外的发现偶联有靶向元件的两亲性嵌段共聚物和阳离子脂质制备得到的纳米粒子在斑块部位有较强的靶向性，这样的纳米粒子还具有优秀的转染效率，从而提高了药物的递送效率和治疗效果。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种纳米粒子，其特征在于，包括：阳离子脂质，聚合物；聚合物包括两亲性嵌段共聚物；
两亲性嵌段共聚物为疏水聚合物与亲水化合物组成的嵌段共聚物，且至少部分的两亲性嵌段共聚物偶联有靶向元件；需要说明的是，至少部分的两亲性嵌段共聚物偶联有靶向元件的定义为：聚合物可以只有偶联有靶向元件的两亲性嵌段共聚物，也可以由偶联有靶向元件的两亲性嵌段共聚物和没有偶联靶向元件的两亲性嵌段共聚物组成。
阳离子脂质和含有两亲性嵌段共聚物的聚合物的质量比为0.5-2:0.5-2，较佳地为0.8-1.2:0.8-1.2；作为一种优选例，质量比为0.5:0.5-2、0.6:0.5-2、0.7:0.5-2、0.8:0.5-2、0.9:0.5-2、1:0.5-2、1.1:0.5-2、1.2:0.5-2、1.3:0.5-2、1.4:0.5-2、1.5:0.5-2、1.6:0.5-2、1.7:0.5-2、1.8:0.5-2、1.9:0.5-2、或2:0.5-2；在另一优选例中，质量比为0.5-2:0.5、0.5-2:0.6、0.5-2:0.7、0.5-2:0.8、0.5-2:0.9、0.5-2:1、0.5-2:1.1、0.5-2:1.2、0.5-2:1.3、0.5-2:1.4、0.5-2:1.5、0.5-2:1.6、0.5-2:1.7、0.5-2:1.8、0.5-2:1.9、或0.5-2:2。
前述的一种纳米粒子，阳离子脂质为G0-C14，G0-C14由低代PAMAM树状分子与1,2-环氧十四烷以摩尔比为1:1-1:7；作为一种优选，1:4-1:6；(如1:2、1:3、1:4、1:5、1:6优选：1:5)制备得到。
前述的一种纳米粒子，疏水聚合物选自下组：聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚原酸酯、聚酸酐(PAH)、聚(β-氨基酯)(PBAE)，或其组合。
前述的一种纳米粒子，亲水化合物为PEG。
前述的一种纳米粒子，靶向元件选自下组：单糖糖苷、聚糖或肽段中，或其组合；作为一种优选，单糖糖苷为半乳糖或甘露糖；聚糖为葡聚糖或甘露聚糖；肽段为环状LyP-1(CRKRLDRNC)或S2P肽段(CRTLTVRKC)；需要说明的是：这里的举例并非穷举。
前述的一种纳米粒子，靶向元件偶联的两亲性嵌段共聚物选自下组：PLGA-PEG-Galactose、PLA-PEG-Galactose、PCL-PEG-Galactose、PAH-PEG-Galactose、PBAE-PEG-Galactose、PLGA-PEG-S2P、PLA-PEG-S2P、PCL-PEG-S2P、PAH-PEG-S2P、PBAE-PEG-S2P、PLGA-PEG-Mannose、PLA-PEG-Mannose、PCL-PEG-Mannose、PAH-PEG-Mannose、PBAE-PEG-Mannose中的一种或多种。
前述的纳米粒子，聚合物还包括偶联有荧光标记物或造影剂的两亲性嵌段共聚物；较佳地，荧光标记物选自下组：Cyanine5.5、Cyanine3、Alexa Fluor 488、6-Carboxyfluorescein，或其组合；造影剂选自下组：氟代脱氧葡萄糖(18F-FDG)、硫酸钡、泛影葡胺、碘苯六醇，或其组合；需要说明的是：本发明的纳米粒子除了递送药物到靶向部位，同时也可以作为诊断辅助产品，先通过偶联造影剂的纳米粒子靶向性地递送至斑块炎症部位，再通过造影识别造影剂富集的位置，确定斑块炎症部位的位置和大小，达到示踪和诊断的目的。
前述的一种纳米粒子，还包括：治疗有效量的药物。
前述的一种纳米粒子，药物为编码IL-10的核酸，IL-10的核酸来源于人源或鼠源。
前述的一种纳米粒子，核酸编码选自下组的IL-10的氨基酸序列：如SEQ ID NO:1或2所示的序列，与SEQ ID NO:1或2所示的序列相比具有至少80％同一性的序列，或与SEQID NO:1或2所示的序列相比具有1个或多个保守替换的氨基酸序列；
编码IL-10的DNA包含如SEQ ID NO:3或4所示的序列，与SEQ ID NO:3或4所示的序列相比具有至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO:3或4所示的序列相比具有1个或多个保守替换的核酸序列。
前述的一种纳米粒子，核酸为编码IL-10的信使核糖核酸(IL-10mRNA)；
编码IL-10的mRNA包含如SEQ ID NO:5或6所示的序列，与SEQ ID NO:5或6所示的序列相比具有至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO:5或6所示的序列相比具有1个或多个保守替换的核酸序列；较佳地，
编码IL-10的mRNA的5’端包含加帽元件、5’UTR、信号肽序列、3’UTR，和/或polyA；更优选的，所述加帽结构包含与5’UTR连接的3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G；
更佳地，5’UTR包含如SEQ ID NO:7或8中第1位至第47位所示的序列，与SEQ IDNO:7或8中第1位至第47位所示的序列相比具有至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO:7或8中第1位至第47位所示的序列相比具有1个或多个保守替换的核酸序列；
信号肽序列包含如SEQ ID NO:7中第48位至第101位所示的序列，与SEQ ID NO:7中第48位至第101位所示的序列相比具有至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO:7中第48位至第101位所示的序列相比具有1个或多个保守替换的核酸序列；
开放阅读框包含如SEQ ID NO:7或9中第102位至第584位所示的序列，与SEQ IDNO:7中第102位至第584位所示的序列相比具有至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO:7中第102位至第584位所示的序列相比具有1个或多个保守替换的核酸序列；
3’UTR包含如SEQ ID NO:7中第585位至第677位所示的序列，与SEQ ID NO:7中第585位至第677位所示的序列相比具有至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO:7中第585位至第677位所示的序列相比具有1个或多个保守替换的核酸序列；
polyA的核酸序列包含65-250个A；
最佳地，编码IL-10的mRNA包含如SEQ ID NO:7-10中任一项所示的序列，与SEQ IDNO:7-10中任一项所示的序列相比具有至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO:7-10中任一项所示的序列相比具有1个或多个保守替换的核酸序列。
前述的一种纳米粒子，阳离子脂质和核酸的质量比为10-50:0.8-1.2；作为一种优选，阳离子脂质和核酸的质量比为10:0.8-1.2、15:0.8-1.2、20:0.8-1.2、25:0.8-1.2、30:0.8-1.2、35:0.8-1.2、40:0.8-1.2、45:0.8-1.2、50：0.8-1.2；作为进一步优选，阳离子脂质和核酸的质量比为10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50：1。
前述的一种纳米粒子，还包括：药物辅助剂，药物辅助剂包括：稳定剂或保护剂。
前述的一种纳米粒子，稳定剂选自下组：ceramide-PEG、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺-N-聚乙二醇(DSPE-PEG)、聚乙烯醇、聚甘油脂肪酸酯、吐温80、吐温20、Span80、Span60、十二烷基磺酸钠，或其组合；优选为聚乙烯醇或DSPE-PEG；较佳地，所述的聚乙烯醇分子量范围为10,000-250,000kDa，优选为13,000-23,000kDa；稳定剂DSPE-PEG的使用浓度范围为0.005％～1％(w/v)，优选为0.1％(w/v)、0.15％(w/v)、0.25％(w/v)、0.5％(w/v)、0.75％(w/v)、1％(w/v)、1.25％(w/v)、1.5％(w/v)、1.75％(w/v)、2％(w/v)、2.25％(w/v)、2.5％(w/v)、2.75％(w/v)、3％(w/v)、3.25％(w/v)、3.5％(w/v)、3.75％(w/v)、4％(w/v)、4.25％(w/v)、4.5％(w/v)、4.75％(w/v)、5％(w/v)、5.25％(w/v)、5.5％(w/v)、5.75％(w/v)、6％(w/v)、6.25％(w/v)、6.5％(w/v)、6.75％(w/v)、7％(w/v)、7.25％(w/v)、7.5％(w/v)、7.75％(w/v)、8％(w/v)、8.25％(w/v)、8.5％(w/v)、8.75％(w/v)、9％(w/v)、9.25％(w/v)、9.5％(w/v)或9.75％(w/v)；作为进一步的优选，稳定剂DSPE-PEG的使用浓度范围为0.005％～1％(w/v)，优选为0.005％(w/v)、0.01％(w/v)、0.02％(w/v)、0.03％(w/v)、0.04％(w/v)、0.05％(w/v)、0.06％(w/v)、0.07％(w/v)、0.08％(w/v)、0.09％(w/v)、0.1％(w/v)、0.15％(w/v)、0.2％(w/v)、0.25％(w/v)、0.3％(w/v)、0.35％(w/v)、0.4％(w/v)、0.45％(w/v)、0.5％(w/v)、0.55％(w/v)、0.6％(w/v)、0.65％(w/v)、0.7％(w/v)、0.75％(w/v)、0.8％(w/v)、0.85％(w/v)、0.9％(w/v)或0.95％(w/v)。
前述的一种纳米粒子，保护剂为盐类保护剂、糖类保护剂、醇类保护剂、酸类保护剂或聚合物保护剂；
盐类保护剂选自下组：硫代硫酸钠、乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、硫酸钠、醋酸氨、氯化铵，或其组合。
糖类保护剂选自下组：蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、棉子糖、果糖或己糖，或其组合。
醇类保护剂选自下组：山梨醇、乙醇、甘油、甘露醇、肌醇或木糖醇中，或其组合。
酸类保护剂选自下组：柠檬酸、磷酸、酒石酸、氨基酸或乙二胺四乙酸(EDTA)，或其组合。
聚合物保护剂选自下组：葡聚糖、聚乙二醇或PVP，或其组合。
前述的一种纳米粒子，纳米粒子的水合直径为80-140nm；作为一种优选，水合直径为80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、或140nm。
一种纳米粒子的制备方法，
步骤包括：
(1)将阳离子脂质溶于溶剂中，形成阳离子脂质浓度为5-20mg/ml(如6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml)的第一溶液；
(2)将聚合物溶于溶剂中，形成聚合物浓度为5-20mg/ml(如6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml)的第二溶液；
两亲性嵌段共聚物为疏水聚合物与亲水化合物组成的嵌段共聚物；聚合物包含有偶联有靶向元件的两亲性嵌段共聚物；需要说明的是：含有的定义为聚合物可以只有偶联有靶向元件的两亲性嵌段共聚物，也可以由偶联有靶向元件的两亲性嵌段共聚物和没有偶联靶向元件的两亲性嵌段共聚物组成；阳离子脂质和含有两亲性嵌段共聚物的聚合物的质量比为0.5-2:0.5-2；
(3)将所述的第一溶液、第二溶液和核酸混合均匀，形成第一有机相分散体；
(4)将稳定剂加入无菌水中，形成第一水相分散体；
(5)将所述第一有机相分散体加入所述的第一水相分散体中，第一有机相分散体和第一水相分散体的混合比例为0.8-1.2(如0.9、1.0、1.1):40-60(如45、50、55)(v/v)；
(6)对步骤(5)得到的混合物进行搅拌，然后超滤获得纳米粒子。
前述的一种纳米粒子的制备方法，溶剂选自下组：二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸甲酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯、二氧六环、乙醚、四氢呋喃、乙腈、甲醇、丙二醇、二甲亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或丙酮，或其组合。
一种纳米粒子的应用，前述的纳米粒子用于制备治疗动脉粥样硬化的药物。
本发明的有益之处在于：
本发明合成了编码IL-10的化学修饰的mRNA(IL-10mRNA)，并提供了一种安全有效的纳米粒子，将所述IL-10mRNA特异性递送至动脉粥样硬化斑块处。IL-10mRNA和纳米粒子提供了一种针对动脉粥样硬化的安全有效的蛋白替代疗法，解决了临床应用IL-10蛋白药物的关键困难：
(1)采用纳米粒子技术成功递送IL-10mRNA，从而利用细胞持续表达IL-10，解决了蛋白药物半衰期短的临床应用困难；
(2)本发明的纳米粒子可以靶向斑块部位，提高药物的递送效果；
(3)本发明发现CD206阳性巨噬细胞与本发明的纳米粒子能够在主动脉根部实现共定位，靶向元件偶联的两亲性嵌段共聚物搭配本发明阳离子脂质制备得到的纳米粒子在提高斑块部位靶向性上具有意想不到的技术效果。由实验验证可知本发明纳米粒子可以特异性识别动脉粥样硬化斑块巨噬细胞表面的甘露糖受体，有利于纳米粒子在斑块部位富集，促进IL-10在目标细胞的表达，避免非特异性的激活IL-10受体而导致的免疫抑制等副作用；将表达IL-10蛋白的mRNA包裹在纳米粒子进行静脉给药，大大提高了IL-10蛋白在体内的存留时间。
本发明使用WD诱导的Ldlr-/-动脉粥样硬化小鼠模型证明，所述纳米粒子将IL-10mRNA靶向性地递送至斑块炎症部位，上调斑块内病变巨噬细胞中IL-10的表达并降低炎症反应、抑制氧化应激和细胞凋亡、增加纤维帽厚度以及减少斑块坏死面积。本发明所述IL-10mRNA和纳米粒子可以改善IL-10这种强效细胞因子的药学、药理学和药代动力学特性，为心血管疾病的治疗提供了一个有效的新方法，并具有重要的临床价值；
本发明的组合物制备得到的靶向纳米粒子的巨噬细胞转染效率远远高于商业化转染试剂制备的纳米载体，且从实验可知，阳离子脂质和含有两亲性嵌段共聚物的聚合物之间在提高转染效率上具有协同作用。
附图说明
图1显示了甘露糖偶联的mRNA纳米粒子的制备和表征。(A)带有靶向元件的纳米粒子设计的示意图。(B)IL-10mRNA@M-HNPs的透射电子显微镜(TEM)图像；(C)由不同摩尔比的低代树形高分子与1,2-环氧十四烷反应所得的一系列G0-C14，我们将它们命名为G0-C14(1:1)、G0-C14(1:3)、G0-C14(1:5)和G0-C14(1:7)；由这些G0-C14分别与两亲性嵌段共聚物和IL-10mRNA制备纳米粒子并转染骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)，通过蛋白免疫印迹，分析目标蛋白的表达对磷酸化的信号转导及转录激活因子(pSTAT3)的调控作用；(D)通过琼脂糖凝胶电泳，分析以不同质量比混合的G0-C14(1:5)与mRNA之间的相互作用；(E)通过琼脂糖凝胶电泳，分析IL-10mRNA@M-HNPs暴露在血清和RNase环境下的稳定性；
图2显示了IL-10mRNA@M-HNPs转染BMDMs后，利用蛋白免疫印迹分析IL-10、信号转导及转录激活因子(STAT3)及其磷酸化产物(pSTAT3)的表达；
图3显示了M2型巨噬细胞对不同纳米粒子(HNPs或M-HNPs)的摄取情况；(A)流式细胞术结果显示，与M2型巨噬细胞孵育不同时间后，带有靶向元件的纳米粒子M-HNPs显著增强细胞摄取；数据为平均值±SD(n＝3)，*P＜0.05，***P＜0.001，****P＜0.0001；(B)流式细胞术结果显示，甘露聚糖有效抑制带有靶向元件的纳米粒子M-HNPs对细胞摄取的增强作用；数据为平均值±SD(n＝3)，**P＜0.01，***P＜0.001，n.s.无显著差异；
图4显示了BMDMs在与不同剂量的IL-10mRNA@M-HNPs孵育12小时或24小时后的细胞活力值(n＝5)；n.s.无显著差异；
图5A显示了纳米粒子在不同pH环境中的表面电势(n＝5)。图5B所示Cy5.5标记的纳米粒子在与BMDMs孵育6小时的溶酶体逃逸情况，大量的纳米粒子已经从酸性的溶酶体环境中逃逸出来。细胞核用DAPI(蓝色)标记，溶酶体用Lysotracker(绿色)标记。比例尺，10μm。
图6显示了EGFP mRNA@M-HNPs在BMDMs中的转染效率。提前24小时，BMDMs以5×104细胞密度接种在24孔板上。用含有不同mRNA浓度(0.0625、0.1250、0.2500和0.5000μg/ml)的EGFP mRNA@M-HNPs转染细胞24小时。将完全培养基，空纳米粒子(M-HNP)，和裸EGFP mRNA处理24小时的BMDMs作为阴性对照。利用商业化转染试剂Lipofectamine 2000替换纳米粒子组分中的阳离子脂质体(G0-C14)，其他组分保持不变，形成的纳米粒子(EGFP mRNA@L2K)以0.5000μg/ml的mRNA浓度处理BMDMs 24小时作为阳性对照。使用流式细胞仪测量GFP阳性细胞的百分比以评估转染效率。
图7显示了IL-10mRNA@M-HNPs有效抑制脂多糖(LPS)诱导的BMDMs炎症；qRT-PCR结果显示，IL-10mRNA@M-HNPs显著增加了BMDMs内IL-10的基因表达水平，并显著降低了BMDMs内炎症细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS)以及趋化因子(Cxcl15、G-CSF和MCP-1)的基因表达水平；所有数据均表示为平均值±SD(n＝4)，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001，n.s.无显著差异；
图8显示了IL-10mRNA@M-HNPs对小鼠腹膜炎引起的急性炎症的消退作用；(A)腹膜炎小鼠模型的治疗方案示意图；(B和C)流式细胞术结果显示，静脉注射的IL-10mRNA@M-HNPs在体内显著抑制了酵母聚糖(Zymosan A)引起的中性粒细胞(PMN)的浸润；所有数据均表示为平均值±SD(n＝3)，**P＜0.01。(D至F)qRT-PCR结果显示，IL-10mRNA@M-HNPs显著增加了腹膜渗出液的细胞中IL-10的基因表达水平，并显著抑制了细胞中炎症细胞因子(TNF-α和IL-1β)的基因表达水平；所有数据均表示为平均值±SD(n＝6)，**P＜0.01，****P＜0.0001；
图9显示了，向西方饮食(WD)诱导的Ldlr-/-动脉粥样硬化小鼠模型静脉注射偶联有荧光标记物的纳米粒子(HNPs和M-HNPs)，通过IVIS光谱系统检测各组纳米粒子在动脉粥样硬化斑块处的积累。IVIS光谱系统对主动脉的成像结果显示，与不带有靶向元件的纳米粒子HNPs相比，带有靶向元件的纳米粒子M-HNPs在主动脉处显示了更强的荧光信号，表明主动脉处积累了更多的带有靶向元件的纳米粒子；数据为平均值±SD(n＝5)，*P＜0.05，**P＜0.01；
图10显示了，向WD诱导的Ldlr-/-动脉粥样硬化小鼠模型静脉给药IL-10mRNA@M-HNPs的治疗效果；(A至C)油红O(ORO)染色结果显示，IL-10mRNA@M-HNPs显著减少了头臂动脉、主动脉弓和主动脉根的相对斑块面积。所有数据均表示为平均值±SD(n＝6)，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；(D)H&E染色结果显示，IL-10mRNA@M-HNPs显著减少了主动脉根中坏死核心面积与斑块面积的比率。所有数据均表示为平均值±SD(n＝6)，***P＜0.001，****P＜0.0001；(E)天狼星红染色结果显示，IL-10mRNA@M-HNPs显著增加了主动脉根中胶原蛋白帽的厚度与斑块面积的比率；所有数据均表示为平均值±SD(n＝6)，**P＜0.01；
图11显示了，向WD诱导的Ldlr-/-动脉粥样硬化小鼠模型静脉注射IL-10mRNA@M-HNPs，评估其对小鼠模型体内炎症的抑制作用；(A至D)对主动脉根的冷冻切片进行免疫荧光染色分析，结果显示IL-10mRNA@M-HNPs显著增加了主动脉根中IL-10的表达，并显著抑制了主动脉根中炎症细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的表达水平。所有数据均表示为平均值±SD(n＝6)，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001；
图12显示，向WD诱导的Ldlr-/-动脉粥样硬化小鼠模型静脉注射PBS、Luc mRNA@M-HNP或IL-10mRNA@M-HNPs，记录各治疗组体重数据和血生化参数；(A)体重，(B)脏器系数，(C)丙氨酸转氨酶(AST)，(D)天冬氨酸转氨酶(AST)，(E)血浆总胆固醇(TC)，(F)甘油三酯(TG)，(G)低密度脂蛋白(LDL)；所有数据均表示为平均值±SD，n.s.无显著差异；
图13显示了，向WD诱导的Ldlr-/-动脉粥样硬化小鼠模型静脉注射纳米粒子，对小鼠模型进行组织学分析；12周WD诱导的Ldlr-/-小鼠每周静脉注射给药(PBS、Luc mRNA@M-HNP或IL-10mRNA@M-HNPs)两次，持续4周，同时维持WD喂养；最后一次注射后三天，将小鼠安乐处死，将指定的器官切片并用H&E染色，进行成像分析。比例尺，100μm。黑色箭头指向组织中脂肪积累的区域。
图14显示了，BMDMs以每孔5×104个细胞的密度接种在24孔板上过夜，然后在含有20ng/ml IL-4的完全培养基中培养48小时。将BMDMs与Cy5.5标记的HNP或M-HNP以0.5μg/ml的IL-10mRNA浓度孵育4小时，通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)捕获细胞的荧光图像。细胞核用DAPI(蓝色)染色，巨噬细胞被CD206免疫荧光染色(绿色)。白色箭头表示纳米粒子与CD206的共定位。比例尺，25μm。
图15显示了，向WD诱导的Ldlr-/-动脉粥样硬化模型小鼠静脉内注射Cy5.5标记的HNP或M-HNP，给药剂量为每只小鼠15μg的IL-10mRNA，注射PBS的小鼠作为对照。给药后24小时，将小鼠麻醉，使用含有4％多聚甲醛(PFA)的PBS灌注小鼠，然后采集小鼠心脏进行冰冻切片，对主动脉根部进行CD206免疫荧光染色，使用共聚焦显微镜获取主动脉根部CD206阳性巨噬细胞与纳米粒子的共定位图片。细胞核用DAPI(蓝色)染色，巨噬细胞被CD206免疫荧光染色(绿色)。白色箭头表示纳米粒子与CD206的共定位。比例尺，40μm。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
术语解释：
术语“核酸”是指至少两种碱基-糖-磷酸酯组合。通常，可以用作为治疗活性成分的核酸包括信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、质粒DNA、质粒DNA的一部分、miRNA、反义寡核苷酸(ASO)和非编码RNA。核酸可以为天然核酸或者人工核酸，其中天然核酸具有磷酸骨架，人工核酸可能含有其他类型的骨架，但含有与天然核酸相同的碱基。在一个优选例中，作为活性成分的RNA可以是tRNA(转移RNA)、RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、质粒DNA、质粒DNA的一部分、miRNA、反义寡核苷酸(ASO)和非编码RNA的形式。
DNAase和/或RNAase指DNA酶和/或RNA酶；
DSPE-PEG化学全名指1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-polyethylene glycol；
NPs指纳米粒子(nanoparticles)；
HNPs指两亲性嵌段共聚物为PLGA-PEG的纳米粒子；
M-HNPs指两亲性嵌段共聚物为PLGA-PEG-Mannose的纳米粒子；
Cy5.5-HNPs指两亲性嵌段共聚物PLGA-PEG中掺入10％ Cy5.5-PP的纳米粒子；
Cy5.5-M-HNPs指两亲性嵌段共聚物PLGA-PEG-Mannose中掺入10％ Cy5.5-PP的纳米粒子；
BMDMs(Bone-marrow-derived macrophages)指原代骨髓来源的巨噬细胞；
PCR(Polymerase Chain Reaction)指聚合酶链式扩增；
IL-10mRNA@M-HNPs指包载IL-10mRNA的M-HNPs；
Luc mRNA@M-HNPs指包载Luciferase mRNA的M-HNPs；
IL-4指白细胞介素-4；
LPS指脂多糖；
IVIS(Interactive Video Information System)指小动物活体光学成像系统；
PBS(Phosphate Buffer Saline)指磷酸盐缓冲溶液；
qRT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)指将RNA的反转录(RT)和PCR相结合的技术。
VSMC(Vascular Smooth Muscle Cell)指平滑肌细胞。
Ldlr-/-指低密度脂蛋白受体敲除的转基因小鼠模型。
TNF-α(Tumor Necrosis Factor-alpha)指抑制肿瘤坏死因子-α。
IL-1β指白细胞介素-1β。
IL-6指白细胞介素-6。
iNOS指诱导型一氧化氮合酶。
WD指西方饮食。
“至少80％同一性”表示为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
术语“mRNA”是指信使核糖核酸，是以DNA作为模板转录而来的一种单链分子，其携带的遗传信息能够指导蛋白质的合成。mRNA可以是天然存在的或人工体外合成的，然而所有的mRNA都是由结合在5'-末端的7'-甲基鸟苷残基(5'-帽)、在3'端的多聚腺苷尾(poly(A)尾)、开放阅读框(ORF)和位于帽/尾和ORF之间的非翻译区(5’-和3’-UTR)元件组成的。mRNA将从DNA获取的遗传信息保存到ORF序列中，每三个碱基组成一个密码子对应编码特定的氨基酸，以此决定肽链或蛋白产物的氨基酸序列，而蛋白质的合成在遇到终止密码子时停止。mRNA中的其他元件通过影响mRNA的稳定性、翻译过程和翻译效率来调控目标蛋白的表达。
本发明中，一种治疗活性成分为信使核糖核酸，指一种肽段或蛋白质的合成模板，通过体外转录(IVT)过程合成。为增加mRNA稳定性和蛋白质翻译水平，本发明在合成过程中通过添加帽类似物以实现Cap0，Cap1，Cap2等的加帽目的；用生物信息学的方法对编码区的序列进行密码子优化，同时通过用假尿苷(Ψ)，N1-甲基-假尿苷(N1M-Ψ)，5-甲基尿苷(m5U)，甲氧基尿苷(mo5U)，2-硫尿苷(s2U)，羧甲基尿苷(cam5U)，5-甲氧基尿苷(5moU)，N6-甲基腺苷(m6A)，N1-甲基腺苷(m1A)，甲基胞嘧啶(m5C)，甲氧基胞嘧啶(mo5C)，羟甲基胞嘧啶(hm5C)等多种化学修饰的核苷酸，将天然的核苷酸UTP，ATP，CTP，GTP进行全部或部分替换以达到对碱基进行化学修饰的目的。此外也将通过加尾酶，PCR加尾，化学合成加尾等方法将64-250个多聚腺苷酸poly(A)尾加到mRNA序列末端以达到稳定mRNA的目的。特别地，一种适用于本发明的优选信使核糖核酸为编码IL-10的mRNA(IL-10mRNA)。
本发明中，靶向递送mRNA的纳米粒子用于治疗动脉粥样硬化的作用机理如下：随着动脉粥样硬化病理发展，单核细胞在斑块内募集，凋亡细胞清除程序发生缺陷，不断累积的凋亡细胞和脂质造成斑块和坏死核心的形成，使纤维帽变薄，斑块趋于破裂。含有IL-10mRNA、并且可以靶向斑块巨噬细胞的纳米粒子通过上调斑块内IL-10的表达量；抑制炎症细胞因子的产生、降低氧化应激、减少细胞凋亡、同时促进斑块内低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的外排；以此消退斑块内的炎症，阻止易破裂斑块和血管闭塞性血栓的形成，达到治疗动脉粥样硬化的目的。
本发明的mRNA靶向纳米粒子包括：阳离子脂质(G0-C14)、含有两亲性嵌段共聚物的聚合物，和治疗有效量的核酸；其中，上述各个组分通过自组装形成纳米粒子，从而将核酸包封于纳米粒子中。所述两亲性嵌段共聚物为疏水聚合物与亲水化合物组成的嵌段共聚物；所述聚合物含有偶联有靶向元件的两亲性嵌段共聚物。所述阳离子脂质和含有两亲性嵌段共聚物的聚合物的质量比为0.5-2:0.5-2。
靶向巨噬细胞的靶向元件包括单糖糖苷(半乳糖(Galactose)、甘露糖(Mannose))、聚糖(葡聚糖(Dextran)、甘露聚糖(Mannan))、肽段(环状LyP-1(CRKRLDRNC)、S2P(CRTLTVRKC))等，将上述靶向元件与两亲性嵌段共聚物偶联，获得偶联靶向元件的两亲性嵌段共聚物。其中优选材料为PLGA-PEG-Galactose、PLA-PEG-Galactose、PCL-PEG-Galactose、PAH-PEG-Galactose、PBAE-PEG-Galactose、PLGA-PEG-S2P、PLA-PEG-S2P、PCL-PEG-S2P、PAH-PEG-S2P、PBAE-PEG-S2P、PLGA-PEG-Mannose、PLA-PEG-Mannose、PCL-PEG-Mannose、PAH-PEG-Mannose、PBAE-PEG-Mannose中的一种或多种。
阳离子脂质为低代PAMAM树状分子(即G0)与1,2-环氧十四烷(其烷烃链上具有14个碳原子)反应获得的G0-C14，低代PAMAM树状分子(即G0)与1,2-环氧十四烷可以以不同的比例反应，例如1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8等。在本发明中，优选的G0-C14类脂聚合物是低代PAMAM树状分子与1,2-环氧十四烷以1:3-1:7的摩尔比(优选1:5)混合并在90℃下反应2天获得的G0-C14阳离子脂质。
本发明制备阳离子脂质使用的PAMAM(聚酰胺胺型)树枝状聚合物具有高度枝化、高正电性官能团密度和内部空腔的特性。本发明所使用的PAMAM聚合物优选为低代PAMAM分子，例如G0/G1代，优选G0，其结构式如下式I：
H
在使用上述PAMAM聚合物情况下，本发明的G0-C14类脂聚合物的反应和结构式如下：
Figure BDA0003905774610000091
核酸为信使核糖核酸，例如IL-10mRNA。
含有两亲性嵌段共聚物的聚合物组分包括两亲性嵌段共聚物，且两亲性嵌段共聚物为聚乙二醇(PEG)与选自下组中一种或多种多聚物嵌段聚合而形成的共聚物：聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚原酸酯、聚酸酐(PAH)、聚(β-氨基酯)(PBAE)，或其组合；较佳地，两亲性嵌段共聚物包括PLGA-PEG、PLA-PEG、PCL-PEG、PAH-PEG和/或PBAE-PEG。更佳地，嵌段共聚物为可降解的嵌段共聚物，且两亲性嵌段共聚物任选地偶联有靶向元件。
靶向巨噬细胞的靶向元件包括单糖糖苷(半乳糖(Galactose)、甘露糖(Mannose))、聚糖(葡聚糖(Dextran)、甘露聚糖(Mannan))、肽段(环状LyP-1(CRKRLDRNC)、S2P(CRTLTVRKC))等，将上述靶向元件与两亲性嵌段共聚物偶联，获得偶联靶向元件的两亲性嵌段共聚物。其中优选材料为PLGA-PEG-Galactose、PLA-PEG-Galactose、PCL-PEG-Galactose、PAH-PEG-Galactose、PBAE-PEG-Galactose、PLGA-PEG-S2P、PLA-PEG-S2P、PCL-PEG-S2P、PAH-PEG-S2P、PBAE-PEG-S2P、PLGA-PEG-Mannose、PLA-PEG-Mannose、PCL-PEG-Mannose、PAH-PEG-Mannose、PBAE-PEG-Mannose中的一种或多种。
mRNA纳米粒子可以通过阳离子脂质和含有两亲性嵌段共聚物的聚合物组分自组装的方法制备，本发明中一种优选的mRNA靶向纳米粒子通过以下方法制备：
步骤1：将阳离子脂质溶于有机溶剂中，浓度为10mg/ml；
步骤2：将两亲性嵌段共聚物、或偶联靶向元件的两亲性嵌段共聚物、或偶联显影/放射性标记/荧光标记分子元件的两亲性嵌段共聚物、或上述一种或多种聚合物的组合，溶于有机溶剂中，浓度为10mg/ml；
步骤3：依次加入阳离子脂质(G0-C14)、含有两亲性嵌段共聚物的聚合物(PLGA-PEG-Galactose、PLA-PEG-Galactose、PCL-PEG-Galactose、PAH-PEG-Galactose、PBAE-PEG-Galactose、PLGA-PEG-S2P、PLA-PEG-S2P、PCL-PEG-S2P、PAH-PEG-S2P、PBAE-PEG-S2P、PLGA-PEG-Mannose、PLA-PEG-Mannose、PCL-PEG-Mannose、PAH-PEG-Mannose、PBAE-PEG-Mannose中的一种或多种)、核酸(mRNA)的水相母液(不含DNAase和/或RNAase)，质量比为G0-C14：含有两亲性嵌段共聚物的聚合物：核酸＝30：30：1，溶剂与步骤1相同，混合均匀；
步骤4：将稳定剂加入无菌水(不含DNAase和/或RNAase)中，混合均匀；
步骤5：将步骤3的混合物加入步骤4的混合物，体积比为1：50，混合均匀；
步骤6：磁力搅拌20分钟，通过超滤的方法，对所获得的纳米粒子进行纯化和浓缩；
所述方法中，使用的稳定剂包括ceramide-PEG、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺-N-聚乙二醇(DSPE-PEG，本段末尾备注中提供的是英文全名)、聚乙烯醇、聚甘油脂肪酸酯、吐温80、吐温20、Span80、Span60、十二烷基磺酸钠中的一种或多种，优选为聚乙烯醇和DSPE-PEG。其中，聚乙烯醇分子量范围为10，000-250，000kDa，优选为13,000-23,000kDa。所述稳定剂聚乙烯醇的使用浓度范围为0.1％～10％(w/v)，如0.1％、0.2％、0.2％、0.3％、0.4％、1％、1.2％、2％、2.8％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％，优选为0.25％(w/v)；所述稳定剂DSPE-PEG的使用浓度范围为0.005％～1％(w/v)，优选为0.01％(w/v)。备注：1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-Poly(ethyleneglycol)(DSPE-PEG)
使用的有机溶剂没有特别限制，优选包括二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸甲酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯、二氧六环、乙醚、四氢呋喃、乙腈、甲醇、丙二醇、二甲亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或丙酮中的一种或多种，更佳地为DMF和DMSO。
经上述方法制备得到的纳米粒子的水合直径通常为80-140nm。
在另一优选例中，所述的纳米粒子的水合直径为80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、或140nm。
通过以下材料制备得到样品纳米粒子并进行实验验证：
50:50的聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)购自Lactel Absorbable Polymers。
异双功能的PEG聚合物NH2-PEG-OH(MW＝3kDa)、NH2-PEG-MAL(MW＝3.4kDa)和BOC-HN-PEG-NHS(MW＝3kDa)购自键凯科技，NH2-PEG-SH(MW＝3.4kDa)购自Layson Bio。
磺基-cy5-马来酰亚胺购自Lumiprobe。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)和三氟乙酸(TFA)购自北京伊诺凯。
4-氨基苯基α-D-甘露吡喃糖苷(MAN)购自Synthose Inc.。4-氨基苯基β-D-吡喃半乳糖苷(GAL)购自上海毕得药业有限公司。CRTLTVRKC肽购自吉尔生化(上海)有限公司。三乙胺(TEA)购自上海摩楷生物技术有限公司。
第零代聚酰胺胺树形大分子G0(PAMAM)，1,2-环氧十四烷(C14)和聚乙烯醇(PVA，MW＝13,000-23,000kDa)购自Sigma-Aldrich。
实施例1纳米粒子的制备
(1)PLGA-PEG(PP)、PLGA-PEG-Galactose(PPG)、PLGA-PEG-S2P(PPS)、PLGA-PEG-Mannose(PPM)、Cy5.5-PLGA-PEG(Cy5.5-PP)和G0-C14的合成
PLGA-PEG(PP)的合成方法：PLGA经EDC和NHS活化2小时后，在预冷的甲醇/乙醚(50/50v/v)中沉淀两次。然后，将获得的PLGA-NHS与NH2-PEG-OCH3、DIPEA另外反应48小时，去除残留的有机溶剂，产物纯化后利用1H NMR进行表征。1H NMR(CDCl3,400MHz):(5.30-5.08)ppm(m,-OCH(CH3)CONH-),(4.90-4.56)ppm(m,-OCH2COO-),3.62ppm(s,-CH2CH2O-),(1.81-1.37)ppm(m,-OCH(CH3)CONH-)。
PLGA-PEG-Galactose(PPG)的合成方法：tBOC-NH-PEG-NHS和GAL在DIPEA的催化下反应48小时，在无水乙醚中沉淀两次。将真空干燥后获得的tBOC-NH-PEG-Galactose在含50vol％的TFA中搅拌50分钟，并将产物NH2-PEG-Galactose透析后冷冻干燥。PLGA经EDC和NHS活化2小时后，在预冷的甲醇/乙醚(50/50v/v)中沉淀两次。然后，将获得的PLGA-NHS与NH2-PEG-Galactose、DIPEA另外反应48小时，去除残留的有机溶剂，产物纯化后利用1H NMR进行表征。1H NMR(DMSO-D6,400MHz):7.51,6.97ppm(d,phenyl proton),5.21ppm(m,-OCH(CH3)CONH-),4.93ppm(m,-OCH2COO-),3.53ppm(s,-CH2CH2O-),1.49(d,-OCH(CH3)CONH-)ppm。
PLGA-PEG-S2P(PPS)的合成方法：PLGA经EDC和NHS活化2小时后，在预冷的甲醇/乙醚(50/50v/v)中沉淀两次。然后，将获得的PLGA-NHS与NH2-PEG-Maleimide、DIPEA另外反应48小时，去除残留的有机溶剂。将产物PLGA-PEG-Maleimide和S2P多肽(CRTLTVRKC)、TEA反应24小时后，在预冷的甲醇中沉淀，将产物透析后冷冻干燥利用1HNMR进行表征。1H NMR(DMSO-D6,400MHz):5.32ppm(t,-NHCH(CH)CO-),5.20ppm(m,-OCH(CH3)CONH-),4.91ppm(m,-OCH2COO-),1.47ppm(m,-CH2CH2CH-),1.23ppm(s,-CH2CH2CH2-),0.85ppm(t,-CHCH3)。
PLGA-PEG-Mannose(PPM)的合成方法：tBOC-NH-PEG-NHS和MAN在DIPEA的催化下反应48小时，在无水乙醚中沉淀两次。将真空干燥后获得的tBOC-NH-PEG-Mannose在含50vol％的TFA中搅拌50分钟，并将产物NH2-PEG-Mannose透析后冷冻干燥。PLGA经EDC和NHS活化2小时后，在预冷的甲醇/乙醚(50/50v/v)中沉淀两次。然后，将获得的PLGA-NHS与NH2-PEG-Mannose、DIPEA另外反应48小时，去除残留的有机溶剂，产物纯化后利用1H NMR进行表征。1H NMR(DMSO-D6,400MHz):7.5,7.0ppm(d,phenyl proton),5.20ppm(m,-OCH(CH3)CONH-),4.91ppm(m,-OCH2COO-),3.51ppm(s,-CH2CH2O-),1.48(d,-OCH(CH3)CONH-)ppm.
Cyanine5.5-PLGA-PEG(Cy5.5-PP)的合成方法：NH2-PEG-Thiol和Sulfo-Cyanine5.5-Maleimide(Sulfo-Cy5.5-Mal)在磷酸盐缓冲溶液中混和，鼓氮气除氧后在室温下反应48小时。所得产物NH2-PEG-Cy5.5透析后冷冻干燥。PLGA经EDC和NHS活化2小时后，在预冷的甲醇/乙醚(50/50v/v)中沉淀两次。然后，将获得的PLGA-NHS与NH2-PEG-Cy5.5、DIPEA另外反应48小时，去除残留的有机溶剂并纯化产物。
G0-C14的合成方法：PAMAM树枝状大分子和1,2-环氧十四烷分别以1:1、1:3、1:5和1:7的摩尔比混合，并在90℃下反应2天，所获得的一系列产物经过纯化后，利用1H NMR进行表征。以1:5摩尔比反应为例，所获产物利用1H NMR(CDCl3,400MHz)表征如下:(3.65-2.20)ppm(m,-NHCH2CH2NH2,-NCH2CH2CONH-,-CH(OH)-),1.22ppm(s,-CH2-),0.85ppm(t,J＝6.7Hz,-CH3)。
(2)纳米粒子的制备
将含有两亲性嵌段共聚物的聚合物(PP、PPG、PPS、PPM、或它们的任意组合)、阳离子脂质(G0-C14)、核酸(mRNA)的混合溶液加入到含有0.25％(w/v)PVA或0.01％(w/v)DSPE-PEG的水溶液中，室温搅拌15-30分钟左右。使用超滤系统对纳米粒子进行纯化和浓缩。
(3)荧光标记纳米粒子的制备
将含有两亲性嵌段共聚物的聚合物(PP、PPG、PPS、PPM或它们的任意组合)、荧光标记的两亲性嵌段共聚物(Cy5.5-PP)、阳离子脂质(G0-C14)、核酸(mRNA)的混合溶液加入到含有0.25％(w/v)PVA或0.01％(w/v)DSPE-PEG的水溶液中，室温搅拌15-30分钟左右。使用超滤系统对纳米粒子进行纯化和浓缩。所获得的纳米粒子的示意图如图1A所示。
实施例2体外合成编码白介素10(IL-10)的mRNA(IL-10mRNA)
使用体外转录(IVT)技术合成了IL-10mRNA。mRNA的5'末端设计有一个非翻译区(UTR)，以增强mRNA的翻译起始，3'末端的UTR用于稳定mRNA。使用3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G的抗反向帽类似物(ARCA)在5’端加帽，在3’端添加poly(A)尾，并使用假尿苷-5'-三磷酸(Pseudo-UTP)替代常规的UTP，以提高mRNA的稳定性和翻译效率，减低mRNA引起的免疫刺激。
携带T7启动子的鼠IL-10基因开放阅读框(ORF)的质粒购自优宝生物。由所购质粒，通过PCR扩增合成含有T7启动子的DNA线性化模板。DNA线性模板通过纯化回收试剂盒(天根生化科技有限公司，中国)回收。使用T7转录试剂盒体外转录合成IL-10mRNA。使用RNAClean&Concentrator试剂盒(Zymo Research，美国)纯化所得的mRNA。使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific)测量mRNA的浓度。所得mRNA在1×TE中稀释至所需浓度，储存在-80℃条件下。相关序列见表1-4；表4中，5’UTR采用单下划线标出，信号肽采用加粗表示，3’UTR采用双下划线标出)。
自组装的过程是首先将带有正电荷的脂质体和含有两亲性嵌段共聚物的聚合物溶解到有机溶液中，然后将含有核酸的少量水溶液混合到有机相中，核酸带有负电荷，通过静电作用与脂质体结合到一起，最后将混合溶液滴加到水中，这时含有两亲性嵌段共聚物的聚合物就会在水中自组装，并将脂质体和核酸的混合物包裹在内部。
利用纳米粒子将体外合成的IL-10mRNA递送到BMDMs中，BMDMs用IL-10mRNA@M-HNPs处理，以新鲜培养基或Luc mRNA@M-HNPs作为对照。24小时后裂解细胞并对IL-10、STAT3、pSTAT3和β-肌动蛋白进行免疫印迹分析。免疫印迹结果显示，该纳米粒子能高效介导IL-10mRNA的表达，并激活下游STAT3通路(图2)。
表1 IL-10的氨基酸序列(5’→3’)
Figure BDA0003905774610000131
表2编码IL-10的cDNA序列(即ORF，5’→3’)
Figure BDA0003905774610000132
Figure BDA0003905774610000141
表3 IL-10的cDNA对应的mRNA(5’→3’)
Figure BDA0003905774610000142
表4 IL-10的mRNA(5’→3’)
Figure BDA0003905774610000143
Figure BDA0003905774610000151
Figure BDA0003905774610000161
实施例3纳米粒子的表征
使用动态光散射仪(DLS)测量纳米粒子的粒径和电势，结果显示靶向元件的偶联对所获得的纳米粒子的粒径和电势均无显著影响，水合直径约为80-140nm。透射电子显微镜(TEM)显示纳米粒子为球形结构，大小均一，直径为50-60nm(图1B)。
根据上述合成方法，由低代PAMAM与1,2-环氧十四烷以不同的摩尔比反应制备一系列G0-C14，使用所得一系列G0-C14分别制备包载IL-10mRNA的纳米粒子，使用所得纳米粒子分别转染BMDMs，24小时后利用免疫印迹检测IL-10蛋白表达，结果如图1C所示，由1:5摩尔比反应所得的G0-C14(1:5)制备的纳米粒子具有最佳的转染效率，因此在下述所有实施例中优选其进行实验。
利用琼脂糖凝胶电泳实验，分析mRNA分别和不同浓度的G0-C14静电络合相互作用。根据图1D的结果，优选G0-C14(1:5)与mRNA的质量比为30:1制备纳米粒子。另外，实施琼脂糖凝胶电泳实验，在暴露于10％胎牛血清(FBS)或RNase条件下，指定时长内，对裸露的mRNA和被纳米粒子包裹的mRNA进行稳定性分析。如图1E所示，与游离的mRNA相比，纳米粒子包载的mRNA即使暴露在10％ FBS或RNase环境中，也表现出显著提高的稳定性，在长达24h的时间内可以保持不降解。
实施例4细胞实验研究
(1)体外细胞摄取
通过流式细胞仪分析M2型巨噬细胞对于偶联有荧光标记物的纳米粒子的摄取情况。分别将带有相同荧光强度的两种纳米粒子(偶联靶向元件的纳米粒子M-HNPs和未偶联靶向元件的纳米粒子HNPs)与IL-4诱导的BMDMs共同培养。在指定时间点收集细胞，利用流式细胞仪分析细胞所摄取的纳米粒子的荧光强度。如图3A所示，与HNPs相比，M-HNPs能更加有效地进入M2型巨噬细胞，并且这种增强细胞摄取的优势随着时间延长更加显著。
将游离的甘露聚糖溶液加入到BMDMs的培养基中，利用流式细胞仪分析甘露聚糖对细胞摄取的影响。如图3B所示，甘露聚糖显著降低巨噬细胞对偶联靶向元件的纳米粒子的摄取。这说明巨噬细胞对纳米粒子的摄取是由纳米粒子偶联的靶向元件与M2型巨噬细胞表面受体相互作用介导的。
(2)细胞活力测定
对纳米粒子的生物相容性进行评估。将BMDMs以1.0×104个细胞/孔接种在96孔板中，过夜培养后，与不同剂量的纳米粒子孵育。指定时间点后，将培养基更换为每孔含10μL的CCK8溶液的新鲜无血清培养基，孵育2小时，于450nm处测量吸光度值并计算细胞活力(％)。结果显示，纳米粒子在所检测的浓度范围内均显示良好的生物相容性(图4)。
(3)内涵体逃逸能力分析
如图5所示，本发明中的纳米粒子在血液循环(pH为中性环境)中的表面电势呈电负性，在进入溶酶体(pH为微酸性环境)后，表面电势成正电性，在溶酶体内产生质子海绵效应，能够快速将溶酶体涨破并逃逸到细胞质中，释放mRNA并表达目的蛋白。
(4)阳离子脂质体-两亲性嵌段共聚物-靶向元件在转染效率上具有协同作用分析
对纳米粒子的转染效率进行评估。如图6所示，随着mRNA浓度的增加，EGFP mRNA@M-HNPs的转染效率不断增强，具有浓度依赖的特性；在相同mRNA浓度的情况下，本发明中的靶向纳米粒子的巨噬细胞转染效率远远高于商业化转染试剂制备的纳米载体；所以本发明的阳离子脂质配合偶联有靶向元件的两亲性嵌段共聚物在提高转染效率上具有协同作用。
(5)炎症细胞因子检测
动脉粥样硬化发展过程中，大量单核细胞在斑块中募集并产生炎症性细胞因子导致病程加剧。在这里，我们使用LPS刺激BMDMs，模拟斑块内的炎症反应，利用qRT-PCR检测细胞裂解液中炎症细胞因子和趋化因子的基因表达水平。如图7A-E所示，利用偶联靶向元件的纳米粒子M-HNPs包载上述自合成的IL-10mRNA能够有效地的抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)等炎症细胞因子的产生，同时下调白细胞趋化因子(Cxcl15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和单核细胞趋化因子(MCP-1)，从而抑制白细胞和单核细胞的运输(图7F-H)。
实施例5动物实验结果
(1)小鼠腹膜炎模型
实施动物实验，评估IL-10mRNA@M-HNPs在体内抑制急性炎症的效率，图8A为动物实验示意图。使用腹腔注射酵母聚糖A(Zymosan A,4mg/kg)引发的自限性腹膜炎小鼠模型，将模型小鼠随机分成PBS组(空白对照组)、Luc mRNA@M-HNPs组(纳米粒子对照组)和IL-10mRNA@M-HNP组(治疗组)，以未造模小鼠作为阴性对照，给药剂量为每只小鼠给予含有15μg mRNA的纳米粒子，给药方式为静脉注射。如图8B，C所示，IL-10mRNA@M-HNPs显著抑制了由酵母聚糖刺激所产生的多形核中性粒细胞(PMN)。
使用qRT-PCR定量检测腹膜液细胞内炎症细胞因子的mRNA表达水平的变化，结果显示治疗组的TNF-α和IL-1β等关键炎症基因的表达水平明显被抑制(图8D-F)。
(2)动脉粥样硬化小鼠模型的建立
6-8周龄的雄性低密度脂蛋白受体基因敲除(Ldlr-/-)的C57BL/6小鼠购自南京集萃药康。动脉粥样硬化小鼠模型通过12周的西方饮食(WD)诱导建立。本发明中的所有动物实验均在上海交通大学实验动物伦理与使用委员会的批准下进行。
(3)荧光标记的纳米粒子在动脉粥样硬化小鼠模型中的生物分布
使用WD诱导的Ldlr-/-动脉粥样硬化小鼠模型检测上述纳米粒子的体内靶向能力。上述纳米粒子偶联荧光标记物，通过静脉注射对小鼠给药，包括Cy5.5-HNPs和Cy5.5-M-HNPs。24小时后，收集主动脉、心、肝脏、脾、肺和肾脏。使用小动物活体光学成像系统(IVIS)对主动脉荧光成像，结果表明偶联靶向元件的纳米粒子(Cy5.5-MHNPs)通过静脉注射后，主动脉中Cy5.5的荧光信号比未偶联靶向元件的纳米粒子(Cy5.5-H NPs)高两倍左右(图9)。
(4)IL-10mRNA@M-HNPs在动脉粥样硬化小鼠模型中的治疗作用
本发明主要研究，动脉粥样硬化进展到斑块坏死期间，纳米粒子的治疗作用。随着动脉粥样硬化病理进展，巨噬细胞持续不断地转化为泡沫细胞并在血管壁上累积；同时氧化应激导致的细胞凋亡与胞吞作用缺陷使斑块坏死面积逐渐增大。斑块坏死通过放大炎症和促进纤维帽变薄来破坏斑块稳定性，然后引发急性、闭塞性腔内血栓形成和组织梗塞。因此，通过阻止细胞凋亡、加厚帽盖和减少坏死核心尺寸来干预疾病进展的治疗措施可有效稳定中晚期动脉粥样硬化斑块。
使用WD诱导的Ldlr-/-动脉粥样硬化小鼠模型，评价IL-10mRNA@M-HNPs对中晚期动脉粥样硬化的保护作用。将小鼠模型随机分成PBS组(空白对照组)、Luc mRNA@M-HNPs组(纳米粒子对照组)和IL-10mRNA@M-HNP组(治疗组)，给药剂量为每只小鼠给予含有15μgmRNA的纳米粒子，通过静脉注射对小鼠给药，给药频率为一周两次持续四周。在实验终点，收集主动脉中的头臂动脉、主动脉弓和主动脉根，分析其横截面，通过以下指标评估动脉粥样硬化斑块的进展程度，包括脂质沉积、纤维帽厚度和坏死面积。使用油红O(ORO)染色评估小鼠主动脉斑块处的脂质沉积，结果显示未治疗小鼠的头臂动脉(斑块面积～40％)、主动脉弓(斑块面积～26％)和主动脉根(斑块面积～49％)显示出较高的ORO阳性区域。相比之下，IL-10mRNA@M-HNPs治疗小鼠的头臂动脉(斑块面积～15％)、主动脉弓(斑块面积～6％)和主动脉根(斑块面积～36％)中的脂质沉积显著减少(图10A-C)。
(5)动脉粥样硬化小鼠模型主动脉根的组织学分析
在实验终点收集主动脉组织，切片染色通过组织化学方法分析实验动物中斑块的成分。使用苏木精/伊红(H&E)染色评估斑块的组成，结果显示未治疗组中的斑块主要由凋亡细胞和富含脂质的坏死核心组成。与之相较IL-10mRNA@M-HNPs治疗组中斑块的坏死核心面积显著降低(图10D)。使用天狼星红染色评估斑块的纤维帽厚度，结果显示IL-10mRNA@M-HNPs治疗组的斑块周围的胶原蛋白含量更高，纤维帽厚度增加(图10E)。由于斑块稳定性与斑块和血管平滑肌细胞周围的胶原蛋白密切相关，上述结果，结合坏死核心面积的减少，表明载有IL-10mRNA的靶向纳米粒子具有稳定、修复和重塑易损斑块的能力，这是炎症消退的关键特征。
(6)免疫荧光分析
收集主动脉根进行冰冻切片，对组织切片进行免疫荧光染色，评估IL-10mRNA@M-HNPs在WD诱导的Ldlr-/-动脉粥样硬化小鼠模型中的抗炎作用，包括主动脉根处IL-10、TNF-α、IL-1β和IL-6等关键炎症细胞因子的表达水平。结果表明炎症细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6在未治疗组显示出较高的阳性区域，相较之下，IL-10mRNA@M-HNPs治疗组的炎症水平较低(图11A-D)。由此得出结论，IL-10mRNA@M-HNPs能够有效抑制动脉粥样硬化斑块部位的炎症。
重组IL-10蛋白经皮下给药的半衰期为3-4.5小时，经静脉给药后的血浆半衰期仅为3-5分钟。本发明中，将表达IL-10蛋白的mRNA包裹在纳米粒子进行静脉给药，大大提高了IL-10蛋白在体内的存留时间。
(7)安全性评价
实施动物实验评估纳米粒子的体内安全性，在指定的时间点牺牲动物，记录各组实验动物体重，结果显示各组之间的体重变化及脏器系数无显著差异(图12A和B)；采集各组实验动物的血清进行肝功能生物标志物(ALT和AST)分析，三组未有显著变化(图12C至D)；血液生化分析结果显示，IL-10mRNA@M-HNP治疗组的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL)相比于其他两个对照组水平略低，但未发现显着变化(图12E至F)。收集各组实验动物的心、肝、脾、肺和肾等主要脏器进行组织学研究，结果显示用PBS和Luc mRNA@M-HNP处理的小鼠的肝脏切片中一些区域有低水平的脂肪积累，而在IL-10mRNA@M-HNP治疗组的肝脏切片中没有观察到这种情况，其他器官切片在三个组别中均未观察到明显损伤(图13)。这些综合数据表明，在本专利的给药剂量下，IL-10mRNA@M-HNPs的静脉内注射是安全的。
实施例6共定位实验：
巨噬细胞，尤其是M2极化巨噬细胞，位于斑块脂质核心周围的纤维帽中，并表达高水平的甘露糖受体(CD206)，使其成为动脉粥样硬化诊断和治疗的有吸引力的靶点。实验中观察到斑块周围大量的巨噬细胞表达CD206，同时M-HNP在CD206+病变区域内大量共定位，这归因于大多数M2样巨噬细胞存在于围绕斑块富含脂质的核心的纤维帽中并表达高水平的CD206。
如图14所示，IL-4刺激后的BMDMs表面表达大量的CD206；在与Cy5.5标记的纳米粒子(红色)孵育4小时后，观察到更多的靶向纳米粒子与巨噬细胞表面CD206共定位。细胞核用DAPI(蓝色)染色，BMDMs用CD206(绿色)免疫染色。白色箭头表示纳米粒子与CD206的共定位。比例尺，25μm
如图15所示,动脉粥样硬化模型小鼠主动脉根部的斑块周围含有大量表达CD206的巨噬细胞，静脉注射Cy5.5标记的纳米粒子(红色)后，观察到与非靶向纳米粒子相比，大量靶向纳米粒子和CD206阳性巨噬细胞(绿色)在主动脉根部的共定位。
综上所述，本发明通过纳米粒子递送药物解决蛋白药物在体内不稳定，易分解的难题；本发明组合为制备得到的纳米粒子不仅能够实现斑块部位的高度靶向性，而且具有优秀的转染效率，递送和治疗效果好。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (19)

1.一种纳米粒子，其特征在于，包括：阳离子脂质，聚合物；所述的聚合物包括两亲性嵌段共聚物；
所述两亲性嵌段共聚物为疏水聚合物与亲水化合物组成的嵌段共聚物，且至少部分的两亲性嵌段共聚物偶联有靶向元件；
且所述阳离子脂质和所述聚合物的质量比为0.5-2:0.5-2。
2.根据权利要求1所述的纳米粒子，其特征在于，所述阳离子脂质为G0-C14，所述G0-C14由低代PAMAM树状分子与1,2-环氧十四烷以摩尔比为1:1-1:7制备得到。
3.根据权利要求1所述的纳米粒子，其特征在于，所述疏水聚合物选自下组：聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚原酸酯、聚酸酐(PAH)、聚(β-氨基酯)(PBAE)，或其组合。
4.根据权利要求1所述的纳米粒子，其特征在于，所述亲水化合物为PEG。
5.根据权利要求1所述的纳米粒子，其特征在于，所述靶向元件选自下组：单糖糖苷、聚糖、肽段，或其组合；较佳地，
所述的单糖糖苷为半乳糖或甘露糖；
所述聚糖为葡聚糖或甘露聚糖；
所述肽段为环状LyP-1(CRKRLDRNC)或S2P肽段(CRTLTVRKC)。
6.根据权利要求1所述的纳米粒子，其特征在于，所述偶联有靶向元件的两亲性嵌段共聚物选自下组：PLGA-PEG-Galactose、PLA-PEG-Galactose、PCL-PEG-Galactose、PAH-PEG-Galactose、PBAE-PEG-Galactose、PLGA-PEG-S2P、PLA-PEG-S2P、PCL-PEG-S2P、PAH-PEG-S2P、PBAE-PEG-S2P、PLGA-PEG-Mannose、PLA-PEG-Mannose、PCL-PEG-Mannose、PAH-PEG-Mannose、PBAE-PEG-Mannose，或其组合。
7.根据权利要求1所述的纳米粒子，其特征在于，所述聚合物还包括偶联有荧光标记物或造影剂的两亲性嵌段共聚物；较佳地，所述荧光标记物选自下组：Cyanine5.5、Cyanine3、Alexa Fluor 488、6-Carboxyfluorescein，或其组合；所述造影剂选自下组：氟代脱氧葡萄糖(18F-FDG)、硫酸钡、泛影葡胺、碘苯六醇，或其组合。
8.根据权利要求1所述的纳米粒子，其特征在于，还包括：治疗有效量的药物。
9.根据权利要求8所述的纳米粒子，其特征在于，所述药物为编码IL-10的核酸；较佳地，所述IL-10的核酸来源于人源或鼠源。
10.根据权利要求9所述的靶向治疗动脉粥样硬化的纳米粒子，其特征在于，所述的核酸编码选自下组的IL-10的氨基酸序列：如SEQ ID NO:1或2所示的序列，与SEQ ID NO:1或2所示的序列相比具有至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO:1或2所示的序列相比具有1个或多个保守替换的氨基酸序列；
编码IL-10的DNA包含如SEQ ID NO:3或4所示的序列，与SEQ ID NO:3或4所示的序列相比具有至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO:3或4所示的序列相比具有1个或多个保守替换的核酸序列。
11.根据权利要求9所述的纳米粒子，其特征在于，所述核酸为编码IL-10的信使核糖核酸(IL-10mRNA)；
编码IL-10的mRNA包含如SEQ ID NO:5或6所示的序列，与SEQ ID NO:5或6所示的序列相比具有至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO:5或6所示的序列相比具有1个或多个保守替换的核酸序列；较佳地，
编码IL-10的mRNA包含加帽元件、5’UTR、信号肽序列、开放阅读框、3’UTR，和/或polyA；更优选的，所述加帽结构包含与5’UTR连接的3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G；
更佳地，5’UTR包含如SEQ ID NO:7或8中第1位至第47位所示的序列，与SEQ ID NO:7或8中第1位至第47位所示的序列相比具有至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO:7或8中第1位至第47位所示的序列相比具有1个或多个保守替换的核酸序列；
信号肽序列包含如SEQ ID NO:7中第48位至第101位所示的序列，与SEQ ID NO:7中第48位至第101位所示的序列相比具有至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO:7中第48位至第101位所示的序列相比具有1个或多个保守替换的核酸序列；
开放阅读框包含如SEQ ID NO:7或9中第102位至第584位所示的序列，与SEQ ID NO:7中第102位至第584位所示的序列相比具有至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO:7中第102位至第584位所示的序列相比具有1个或多个保守替换的核酸序列；
3’UTR包含如SEQ ID NO:7中第585位至第677位所示的序列，与SEQ ID NO:7中第585位至第677位所示的序列相比具有至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO:7中第585位至第677位所示的序列相比具有1个或多个保守替换的核酸序列；
polyA的核酸序列包含65-250个A；
最佳地，所述的编码IL-10的mRNA包含如SEQ ID NO:7-10中任一项所示的序列，与SEQID NO:7-10中任一项所示的序列相比具有至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO:7-10中任一项所示的序列相比具有1个或多个保守替换的核酸序列。
12.根据权利要求1所述的纳米粒子，其特征在于，所述阳离子脂质和核酸的质量比为10-50:0.8-1.2。
13.根据权利要求1所述的纳米粒子，其特征在于，还包括：药物辅助剂，所述药物辅助剂包括：稳定剂或保护剂。
14.根据权利要求13所述的纳米粒子，其特征在于，所述稳定剂选自下组：ceramide-PEG、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺-N-聚乙二醇(DSPE-PEG)、聚乙烯醇、聚甘油脂肪酸酯、吐温80、吐温20、Span80、Span60、十二烷基磺酸钠，或其组合；优选为聚乙烯醇或DSPE-PEG；较佳地，所述的聚乙烯醇分子量范围为10,000-250,000kDa，所述稳定剂DSPE-PEG的使用浓度范围为0.005％～1％(w/v)。
15.根据权利要求13所述的纳米粒子，其特征在于，所述保护剂选自下组：盐类保护剂、糖类保护剂、醇类保护剂、酸类保护剂、聚合物保护剂，或其组合；较佳地
所述的盐类保护剂选自下组：硫代硫酸钠、乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、硫酸钠、醋酸氨、氯化铵，或其组合；
所述糖类保护剂选自下组：蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、棉子糖、果糖、己糖，或其组合；
所述醇类保护剂选自下组：山梨醇、乙醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇，或其组合；
所述酸类保护剂选自下组：柠檬酸、磷酸、酒石酸、氨基酸、乙二胺四乙酸(EDTA)，或其组合；
所述聚合物保护剂选自下组：葡聚糖、聚乙二醇、PVP，或其组合。
16.根据权利要求1所述的纳米粒子，其特征在于，所述纳米粒子的水合直径为80-140nm。
17.纳米粒子的制备方法，其特征在于，
步骤包括：
(1)将阳离子脂质溶于溶剂中，形成阳离子脂质浓度为5-20mg/ml的第一溶液；
(2)将聚合物溶于溶剂中，形成聚合物浓度为5-20mg/ml的第二溶液；
所述两亲性嵌段共聚物为疏水聚合物与亲水化合物组成的嵌段共聚物；所述聚合物含有偶联有靶向元件的两亲性嵌段共聚物；所述阳离子脂质和含有两亲性嵌段共聚物的聚合物的质量比为0.5-2:0.5-2；(3)将所述的第一溶液、第二溶液和核酸混合均匀，形成第一有机相分散体；
(4)将稳定剂加入无菌水中，形成第一水相分散体；
(5)将所述第一有机相分散体加入所述的第一水相分散体中；第一有机相分散体和第一水相分散体的混合比例为0.8-1.2:40-60(v/v)；
(6)对步骤(5)得到的混合物进行搅拌，然后超滤获得纳米粒子。
18.根据权利要求17所述的靶向治疗动脉粥样硬化的纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述溶剂选自下组：二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸甲酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯、二氧六环、乙醚、四氢呋喃、乙腈、甲醇、丙二醇、二甲亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮，或其组合。
19.靶向治疗动脉粥样硬化的纳米粒子的应用，其特征在于，权利要求1所述的纳米粒子用于制备治疗动脉粥样硬化的药物。
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