CN116057379A - 用于将包含对生物分析物具有结合亲和力的一个或更多个多糖的涂层施加到医疗取样装置的表面上的方法以及提供有该涂层的用于捕获生物分析物的医疗取样装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了包含对生物分析物具有结合亲和力的一个或更多个多糖的涂层,其用于施加在医疗取样装置的表面上,其中所述一个或更多个多糖与医疗装置的表面端点连接,并且其中该一个或更多个端点连接的多糖具有端点接枝至其主链上伸出的侧基的一个或更多个多糖。本发明还提供了用于制备涂层的方法以及包含所述涂层的医疗诊断装置。本发明中还涵盖了用于捕获生物分析物(例如CTC)的相应的方法、用于释放所捕获的生物分析物的方法、以及用于分析生物分析物的方法。
Description
技术领域
本发明涉及用于捕获生物分析物的涂层,其包含与医疗取样装置的表面端点连接(end-point attached)的一个或更多个多糖。此外,本发明涉及提供有新的涂层的医疗取样装置,所述涂层引起对生物分析物并且特别是对循环肿瘤细胞(circulating tumorcell,CTC)的捕获增强,所述生物分析物随后可被释放以用于分析和诊断。
背景技术
已知装置用于捕获生物分析物,其中待分析对象具有生物活性并选自包含以下的组:大分子、多核苷酸、RNA、DNA、蛋白质、标志物蛋白质、脂蛋白、多肽、抗体、自身抗体、激素、抗原、细胞、CD44+细胞、病毒、细菌细胞、寄生虫、真菌细胞、肿瘤细胞、来源于妊娠期间胎儿的干细胞和/或细胞、或其部分。特别令人感兴趣的是用于捕获循环肿瘤细胞的装置。
在过去的二十年中,化学治疗已变得更加先进。虽然较旧的“通用”化学治疗简单地杀伤体内快速生长的所有细胞(导致对健康组织的损害),但现代靶向化学治疗被设计成仅影响特定(癌症)细胞并使附带损伤最小化。尽管靶向化学治疗在癌症治疗方面已提供了大的改善,但其真正潜力仍未实现。由于癌细胞持续突变,其可适应并变得针对靶向化学治疗具有抗性。这最终导致靶向化学治疗变得无效。考虑到癌症通常是致命的并且靶向化学治疗是昂贵的,因此非常需要允许追踪肿瘤细胞何时以及如何变得具有抗性的工具,使得可相应地调整治疗。
目前用于追踪肿瘤突变的最广泛接受的方法是进行活检,即肿瘤的直接组织样品。这是侵入性操作,其固有地是疼痛的,具有局部传播疾病的风险,并且即使当进行良好时也只给出了在特定时间取样的精确位置的反映。由于患者考虑,很少对所有肿瘤进行连续活检。液体活检取样血液而不是肿瘤,并且由于其相对容易且安全,因此是用于持续追踪肿瘤突变的最有前景的工具。有许多不同的液体活检方法,包括分离循环肿瘤细胞(CTC)、肿瘤来源的囊泡(例如外排体)和循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)。在所有这些方法中,CTC提供关于肿瘤抗性的最全面和深入的信息,因为其包含完整的DNA、RNA和蛋白质的谱。然而,CTC在血液中极为罕见:在数十亿个其他细胞中,典型的血液样品平均少于1CTC/毫升血液。需要多得多的细胞(100+)来可靠地追踪肿瘤抗性,这是需要可有效地将CTC从血液分离的技术的原因。因此,本发明涉及CTC的选择性捕获。
类似地令人感兴趣的是用于诊断脓毒症的医疗取样装置。脓毒症是由感染引发的炎性免疫应答。细菌感染是最常见的原因,但真菌、病毒和原生动物感染也可导致脓毒症。脓毒症指南建议尽可能快地获得血液培养物以获得准确诊断。然而,血液培养物可花费多至数天,而脓毒症是急性危险病症,并且应尽可能快地开始治疗。因此,能够快速并且选择性地分析感染源将非常有益。
将用生物活性分子装饰的基于光纤、导管或线材的装置用于诊断任务的应用是已知的,所述诊断任务例如从生物样品或甚至从活生物体中检测和捕获DNA、蛋白质、细胞和其他。
WO 2006131400教导用金属岛(metallic island)装饰不锈钢丝,所述金属岛用抗体修饰以用于特异性细胞捕获。通过在金层(gold layer)的沉积步骤期间使用球形单层作为阴影掩模来制造尺寸在100nm范围内的金属岛。将金岛(gold island)用结合特异性抗体的硫醇化接头分子进行修饰。
在EP1907848中,描述了诊断性纳米传感器,例如导管或弹簧丝形式的诊断性纳米传感器,其由包含具有检测分子的二维拱形金属纳米结构上的区域的载体组成。诊断性纳米传感器可用于直接检测和分离离开外周血或身体的稀有分子或细胞。这种应用技术能够实现以前不可能的诊断操作:使用母体循环中存在的胎儿滋养层进行染色体畸变的产前诊断;基于体内播散型癌细胞的检测的癌症诊断和癌症治疗监测。
EP2344021涉及用于检测分析物的装置,其包含聚合物纤维和捕获分子,其中捕获分子与分析物和/或接头分子结合。捕获分子选自包含以下的组:抗体、抗原、受体、多核苷酸、DNA探针、RNA探针、多肽、蛋白质和/或细胞。可将如在表面上具有微结构或表面几何形状的本文件中描述的官能化聚合物纤维引入到生物样品(例如血液样品)中或活生物体的静脉中。在至少数秒和数小时的时间期间,纤维通过其生物功能涂层收集相应的靶分析物。在收集过程完成之后,将纤维收回并将所捕获的物质从纤维分离以用于分析。
同样地,从EP2547250中,已知具有用于从人体分离分子或细胞的官能化表面的生物检测器。将该生物检测器引入到人体中以用于分离和富集靶分子和靶细胞,并在短时间之后再次从人体中移出。
在Jinling Zhang等人在Chem.Commun.,2014,50,6722中的“An ensemble ofaptamers and antibodies for multivalent capture of cancer cells”中,可发现经优化的集合作为多价黏附结构域发挥作用以用于捕获和分离癌细胞。所述集合可并入到包含微柱阵列的微流体装置中。使用抗生物素蛋白和生物素反应将抗体和适配体固定到微流体通道上,如Sheng W,Chen T,Katnath R,Xiong XL,Tan WH,Fan ZH.Anal.Chem.2012;84:4199–4206的“Aptamer-enabled Efficient Isolation of Cancer Cells from WholeBlood Using a Microfluidic Device”中所述。据报道,该微流体装置在600nL/秒的流量下产生>95%的捕获效率以及约81%的纯度。这表明了技术可行性,但该流量不足以在临床上应用。更确切地,在该速率下,将需要以100%效率连续运行多于46小时以得到100CTC的假设产率,这完全不切实际。
目前在体外以高灵敏度和选择性分离肿瘤细胞,以用于随后筛选临床相关参数。然而,鉴于血液中CTC的出现率非常低,即使可采集最大的血液样品但仍然提供很少的信息。进一步改善灵敏度和选择性将允许替代地在体内进行这些,这将极大地帮助进一步筛选临床相关参数。类似的考虑应用于脓毒症方面。
直接从人静脉中的血流内捕获生物分析物(例如循环肿瘤细胞(CTC))是具有挑战性的。如上所述,捕获生物分析物通常用抗体完成,所述抗体是高度选择性的并提供强且近乎永久的键。然而,抗体仅能够以非常低的相对速度形成这些键,并且它们迅速丧失其以高于1mm/秒的速度捕获生物分析物的能力,而在血流中速度仍然高出多个数量级。此外,现有技术中的问题是经捕获的生物分析物(例如CTC)在捕获之后收回装置时或在释放时经常被损坏或破坏。作为结果,检测或诊断不再可能或不再可信。
因此,仍然需要具有改善的灵敏度和选择性以从循环系统(circulatingsystem)、优选地从循环系统(circulatory system)、更优选地直接在血流中分离生物分析物(例如CTC)的医疗取样装置,即允许释放以用于进一步筛选临床相关参数的具有提高的捕获率的经修饰的导丝或导管。
在Zhi Sheng-liang等人的文章“Fabrication of Carbohydrate Microarrayson Gold surfaces:Direct Attachment of Nonderivatized Oligosaccharides toHydrazide-modified Self-Assembled Monolayers”,Analytical chemistry,第78部分,No.14,2006,第4788至4793页中,公开了用于在微阵列的表面上施加包含肝素的涂层的方法,其中肝素与其表面上的胺基端点连接。微阵列可用于对碳水化合物-蛋白质识别事件进行作图。
WO2010019189尤其描述了具有表面的医疗装置,其包含基于端点连接的肝素的涂层,所述肝素通过包含1,2,3-三唑的连接与所述表面共价连接。所述肝素用作抗凝剂化合物。所述医疗装置不用作取样装置。虽然提及了支化,但这既不是肝素,也不是提及以改善捕获率。
在WO2013188073中,描述了用于通过使身体外的血液与固体接触而从血液中除去有助于癌症发病机制的介质的方法。因此这不是诊断装置。所述方法特别地针对肝素进行描述,因为其他碳水化合物表面可比肝素化表面具有显著更低的血液相容性并且可导致提高的血栓形成。在另一方面,具有将进一步改善除去这样的介质的效率的涂层将是特别令人感兴趣的。
发明内容
本发明提供了包含对生物分析物具有结合亲和力的一个或更多个多糖的涂层,其用于施加在医疗取样装置的表面上,其中所述一个或更多个多糖与医学装置的表面端点连接,并且其中一个或更多个端点连接的多糖具有端点接枝至其主链上伸出的侧基的一个或更多个多糖。本发明还提供了用于施加涂层的方法,其包括使表面官能化的步骤(A),随后是将一个或更多个多糖与表面上的官能团端点连接的步骤(B),随后是将一个或更多个多糖端点连接到与表面上的官能团端点连接的多糖上的步骤(C)。优选地,将一个或更多个多糖与表面上的官能团端点连接的步骤之后是封闭表面上的任何剩余官能团的步骤(D)。步骤(C)和(D)的顺序可颠倒。本发明还提供了用于捕获生物分析物(例如循环肿瘤细胞)的医疗取样装置,其具有施加在其上的涂层。
本发明还提供了用于捕获生物分析物(例如循环肿瘤细胞)的方法,以及用于释放和分析所捕获的生物分析物的方法。
附图说明
图1,在医疗取样装置表面上施加的基底上施加基于非端基(end-group)连接的多糖的现有技术涂层的示意图。
图2,在基底的表面上的活性基团被封闭的情况下,在基底上施加基于经端基连接的多糖的本发明涂层的示意图。
图3,在基底上施加本发明涂层的示意图,其中将受体和/或配体接枝到一个或更多个多糖上。
图4,举例说明涂层对细胞速度和对捕获率的作用的直方图。
具体实施方式
根据本发明的医疗取样装置具有改善的灵敏度和选择性以直接在血流中分离生物分析物并且特别是CTC。其可以是导丝或导管的形式。重要的是,其显示出提高的捕获率,而同时允许释放所捕获的生物分析物以用于进一步筛选临床相关参数。另外,涂层可施加在固体上,以用于通过使血液与经涂覆的固体接触来从血液中除去有助于癌症发病机制的介质。
本发明的方法从医疗取样装置表面的官能化开始。这优选地通过胺化,即通过在表面上引入游离氨基来完成。
本方法的步骤(A)优选地包括使医疗取样装置的表面胺化。优选地,胺化是用二胺进行的。接下来,连接充当接头的化合物,优选二醛,更优选戊二醛。
本方法的步骤(B)包括将多糖与已与胺基反应的接头端点连接。优选地使用透明质酸作为多糖,在其上通过还原胺化的方式将二胺与其末端连接。还原胺化可在存在还原剂的情况下进行。优选地在存在氰基硼氢化钠的情况下用己二酸二酰肼进行。
本方法的步骤(C)包括接枝,即将多糖端点连接到与医疗取样装置表面连接的多糖的主链上。在这种情况下,透明质酸用于步骤(B)和步骤(C)。这通过碳二亚胺偶联来完成,但是其他反应也是可能的。该过程可重复两次或更频繁,以产生在碳水化合物上接枝在碳水化合物上接枝的碳水化合物层。这些多糖可以是相同的、属于相同的类别但分子量不同、或者是不相关的。
然而,多糖的端点连接在医疗取样装置的表面上留下来自接头的未反应的氨基和醛基。这些剩余官能团将负面影响所施加涂层的选择性,并且因此需要被封闭。优选地,在步骤(D)中在温和条件下封闭这些剩余官能团,而不影响经端基连接的碳水化合物。例如,可将剩余氨基转化为醛基,并且这些剩余醛基可通过与氨基酸反应而被封闭,从而产生不再影响所施加涂层的选择性的游离酸性基团。出于稳定性原因,可还原亚胺键,优选地在使用氰基硼氢化钠的情况下。步骤(C)和步骤(D)的顺序可颠倒。
在本发明中,使用对生物分析物具有结合亲和力的多糖。对生物分析物具有结合亲和力的多糖在本领域中是公知的。亲和力可以是固有的以及例如由生物分析物表面上的检测受体产生,但也可以是连接在多糖上的检测受体的结果。在本专利申请的范围内,通过生物分析物上的受体与多糖本身的相互作用和/或通过连接在多糖上的检测受体的相互作用,使对生物分析物(例如CTC)具有结合亲和力的多糖与生物分析物形成至少暂时的连接。相互作用可通过与基底表面端点连接的多糖、通过接枝到上述多糖上的多糖、或二者的组合来实现。
用于本发明涂层的多糖是由通过糖苷键结合在一起的单糖单元构成的长链聚合碳水化合物。一些实例包括贮藏多糖(例如淀粉、糖原和半乳糖原(galactogen))以及结构多糖(例如纤维素和甲壳质)。优选地,多糖是异质的,更优选血液相容性糖胺聚糖,更优选对人体天然的糖胺聚糖。其可以是仅由少数重复糖单元组成的寡糖、以及分子量超过一百万道尔顿的长多糖、及其混合物。通常来说,其在聚合物主链中具有40至3000个单糖作为重复单元。
通过使用端点连接,并且由于通常存在于多糖中的带负电荷的侧基,多糖分子彼此排斥并且因此可远离医疗取样装置的表面而突出,进一步延伸到血液中,从而使其结合肿瘤细胞上的特异性受体的可用性最大化。该原理同样适用于接枝到多糖上的多糖。通常来说,涂层的厚度在0.1μm至2μm的范围内。
更优选地,本发明的涂层包含透明质酸(HA)或甚至完全由透明质酸组成,透明质酸是对人体天然的血液相容性糖胺聚糖。因此,HA优选地用于与医疗取样装置的表面端基连接,但也用于与和医疗取样装置表面端基连接的多糖端基连接。如下文中所讨论的,出于数种原因,HA是优选的。
由于HA的羧酸侧基,因此HA可容易地被化学修饰并被涂覆到表面上。此外,HA的侧基允许容易地偶联另外的分子(例如抗体和其他受体)。
HA是特别令人感兴趣的,因为已经发现肿瘤细胞通常显示出丰富表达的透明质酸黏素(hyaladherin),例如特异性结合HA的受体CD44。因此,大多数肿瘤细胞可黏附至HA涂层,而HA在其他方面通常是排斥性(repellant)和抗吸附(non-fouling)的。通过使用端点连接,施加HA使得其最大化地可用于结合某些类型的细胞(最显著的是肿瘤细胞)上的特异性受体。
CD44与HA之间的相互作用不限于简单的细胞黏附。本发明人已表明CD44阳性细胞可在经HA涂覆的基底上滚动(roll)。这种相互作用可在免疫细胞的外渗和归巢中发挥作用,并且因此也可参与CTC外渗和转移。已发现经HA涂覆的表面诱导细胞滚动的能力在富集CTC中非常有益,因为滚动作用可能降低速度。这是有益的,因为:CTC沿涂层表面的流动速度(flow velocity)越高,细胞与涂层结合的机会越低。换言之,除了肿瘤细胞特异性黏附至经HA涂覆的表面的能力之外,流动中的肿瘤细胞由于其滚动作用也可更容易地被捕获。
方便地,HA可通过细菌发酵产生,这避免了动物来源的HA的潜在毒素和病原体。细菌发酵已使HA能够工业生产,如通过许多临床和化妆品产品以及甚至膳食补充剂所证明的。优选地,HA的分子量在40kDa至2MDa的范围内,优选地在50kDa至1.5MDa的范围内。HA也可被取代,其中至少一些沿聚合物主链的官能团已被其他官能团取代。
重要的是,HA可在温和条件下被酶特异性降解,从而允许CTC的控制释放。例如,可在温和条件下使用透明质酸酶选择性降解HA,其也已观察到临床应用。总之,HA是通用性分子,其在癌症治疗和诊断中具有许多应用。作为涂层,其可提供选择性肿瘤细胞黏附、血液相容性和丰富化学性质的独特组合。换言之,HA涂层被优化以用于在体内和体外两种情况下从全血中捕获循环肿瘤细胞。
如上所述,涂层中多糖的结合亲和力可通过在其上添加CTC的受体和/或配体来产生或增强,所述受体和/或配体例如抗体,优选单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段或氨基酸结构和氨基酸序列、核酸结构或核酸序列等。例如,HA与适配体和抗体的相互作用使得认为端点连接的HA、适配体和抗体一起减缓通过的CTC并且因此提高选择性捕获。
如上所述,本发明的涂层优选地通过首先在取样装置表面上引入胺基,随后是接头,并随后端点连接多糖(优选HA)来提供。在具有聚合物表面的医疗取样装置上可最好地实现胺化。这可例如通过含酯聚合物(例如聚氨酯(polyurethane,PU)、聚酯(例如PET)或在其侧基中含酯的聚合物(例如PMMA))的氨解(aminolysis)来实现。原则上可使用任何能够氨解的聚合物。表面胺化也可通过硅烷化或基于氨的等离子体处理来实现。氨解优选地用二胺进行,更优选地用乙二胺或六亚甲基二胺进行。
接下来,将接头与表面上的胺基连接。优选地使用二醛,因为其允许末端胺化的多糖在非常温和的条件下进行端点连接。然而,也可使用例如柠檬酸/二胺-柠檬酸(一种三羧酸)通过二胺中间体与经羧酸涂覆的表面缀合。如果每个柠檬酸通过其羧酸中的单一一个与胺化表面结合,则对于表面上暴露的每个胺基而言将有2个羧基。这将有效地使表面上羧基的数目翻倍,并且因此使接枝密度翻倍。
多糖可直接与接头端点连接,或者多糖的末端可被修饰以允许与连接至胺化表面的接头反应。例如,多糖的末端和/或表面胺基可用硫醇基修饰。
前述步骤已产生了具有与表面末端连接(end-attached)的多糖的基底。然而,端点连接反应不可能将多糖分子与表面上的每个可用接头偶联。因此,表面上将存在活性基团,例如游离醛基,出于以下两个原因这是不利的:来自接头的剩余官能团可提供非特异性黏附位点,以及剩余官能团可导致端点连接的多糖在基底上平坦化。因此,优选地用阻止基底和多糖之间相互作用的官能团封闭剩余表面官能团。封闭剩余的表面官能团还可在下游反应中阻止基底与其他反应物之间的不期望的化学反应,例如检测受体的偶联。如上所述,如果表面胺已与二醛反应,则优选地用氨基酸来实现,因为该反应简单、快速并且不影响端点连接的多糖。二醛可以是具有两个或更多个醛基的任何分子,但戊二醛是优选的,因为它容易获得并且有效地反应。二醛将用未反应的醛装饰基底,然后所述未反应的醛可基于所期望特性与任何氨基酸反应。优选地使用6-氨基己酸,因为它没有任何侧基。另一些良好的替代方案是天冬氨酸和谷氨酸,因为这些氨基酸包含另外的羧基部分,其有利于产生用于连接多糖或(下文中讨论的)用于连接受体的另外的位点。
接下来,通过将另外的多糖接枝到与表面端点连接的多糖来进一步修饰涂层。如前所述,优选具有相同分子量的相同透明质酸。
端点连接的多糖将具有“刷(brush)”样结构,其可通过将多糖与已端点连接的多糖的侧基偶联来制成“瓶刷(bottlebrush)”样结构,从而产生分支结构。可使用多种偶联反应。使用碳二亚胺偶联反应将末端胺化的碳二亚胺与已端点连接的多糖偶联是优选的。该方法是优选的,因为末端胺化的多糖也已用于先前的反应中,并且因为碳二亚胺偶联反应是允许控制每个瓶刷样结构的分支点的最大数目的两步反应。优选地,这在两步方法中完成,以确保用于接枝的多糖只可与已端点连接的多糖偶联,而不与自身偶联。例如,用良好的离去基团(例如N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)或N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS))来活化端点连接的多糖的羧基可以是有帮助的。可重复接枝过程以将多糖接枝在已经接枝的多糖上,从而提高瓶刷的尺寸并产生较厚且较致密的涂层。这可显著影响涂层与生物分析物相互作用的能力。
因此,根据本发明的医疗取样装置可通过以下来制备:首先在其上施加聚合物基底,然后将其官能化,随后是多糖(优选HA)的端点连接,接着封闭表面上的任何剩余官能团。然后接枝端点连接的多糖,产生分支结构(本文中称为瓶刷)。任选地,然后对多糖(优选HA)进行进一步修饰,以在其上添加另外的检测受体。
例如,如果检测受体具有氨基,则HA的羧基易于用检测受体来装饰,这通常是在抗体和其他蛋白质的情况下。如果需要的话,适配体可用氨基来官能化。用具有可用氨基的检测受体装饰的HA是优选的,因为可使用简单且有效的碳二亚胺偶联。在有或没有中间接头的情况下以及根据检测受体上可用的部分,另一些非碳二亚胺偶联方法可用于用检测受体装饰HA。
在图1(A至D)中,提供了涂层的效果图(artist impression),其中将多糖X03施加到聚合物基底X01上而无端基连接。在该现有技术方法中,提供胺基X02到基底上。多糖侧基X04被活化,产生与胺基X02反应的X05,形成连接X06,由此多糖与基底表面的氨基偶联。这俗称为“意大利面式(spaghetti)”。
转到图2,提供了一系列步骤以将本发明的涂层施加到聚合物基底X01上。再次,提供胺基X02到基底X01上(图2A至B)。同时(图2H至I),多糖X03在其末端X09处与二胺X08(优选二酰肼)反应,产生促进端基连接的端基X10。在图2J中,基底与二醛反应以在其表面上形成醛基X11。在图2K中,端基X10与醛基X11连接,形成连接X12。在图2N中,经末端连接的多糖的侧基被活化(X05),以用于随后与X10偶联,产生图2O中的键X14,多糖X15通过该键与X03末端连接。在图2P中,剩余氨基被二醛封闭,而在图2Q中,醛基被氨基酸封闭。
最后,通过重复图2N至O中的步骤,使多糖X16与图2Q中的X15末端连接。
在图3中,提供受体X17到侧基X04上。
转到图4,直方图示出了接枝方法对流动池中培养的乳腺癌细胞的速度的作用的举例说明。直方图包含阳性和阴性对照,其中“意大利面式HA”作为基线。应注意的是,在涂层与细胞之间不存在任何相互作用的情况下(-对照),绝大多数细胞流动太快而不能进行定量。反之亦然,与它们黏附的涂层相互作用如此强烈的细胞将被视为最低速度棒(bar)(<5μm/秒)。因此,该棒(5μm/秒)越高,涂层可捕获的细胞越多。下面的实验部分中提供了详细的讨论。而瓶刷1是根据具有单一接枝步骤的实验部分的涂层。在瓶刷2和瓶刷3中,实验部分的接枝步骤分别重复一次或两次。重复接枝步骤产生更高数目的分支点和更高的量的经接枝多糖链。
HA对减慢细胞和使细胞黏附的作用通过以下实验来举例说明,其中在流动池中测试经涂覆基底形式的测试样品。将效率与两个对照:COOH涂层和NH2涂层相比较。还与其中HA既未端点连接也未延伸到流动中的经涂覆基底相比较。
实施例
使用的材料:
1.表面胺化
氨解是胺与酯反应以形成酰胺键的反应。使用EDA是因为它有效地反应。使用下面描述的方案。
a.使用MQ和清洁剂用手彻底清洁基底
b.在室温下在使用Branson 5510超声处理器的情况下在具有洗涤剂的MQ中以40kHz超声处理基底60分钟
c.用MQ洗涤基底
d.在室温下在MQ中以40kHz超声处理基底60分钟
e.让基底干燥
f.制备在96% EtOH中的2M EDA
g.将基底在EDA溶液中孵育2小时(hr)
h.用96% EtOH轻轻漂洗基底
i.在轻的搅拌下在96% EtOH中洗涤基底2+小时
j.用新鲜的96% EtOH重复前述步骤
k.在40℃下干燥2+小时。
经胺化的基底将在流动设置实验中作为阳性对照发挥作用,因为氨基是以其非特异性黏附许多细胞的能力而公知的部分。
2.HA的末端胺化(iHA)
该步骤的目标是向多糖的还原末端提供氨基。这是通过将二胺与多糖还原末端上的醛(其用内半缩醛(lactol)平衡)偶联并将所得键用还原剂还原来实现的。为了使多糖与二胺的两个胺的偶联最小化,在该反应中使用摩尔过量的二胺。透明质酸(HA)用作多糖。氰基硼氢化钠用作还原剂,因为其相对温和且容易获得。己二酸二酰肼用于该反应,因为偶联效率高。
a.将0.1M Na2Br4O7和0.4M NaCl溶解在MQ中
b.用HCl调节pH至8.4(使用VOS-70005pH计)
c.用N2气将所得缓冲液鼓泡2+小时
d.将5%w/v HA和1000×摩尔当量的ADH溶解在硼酸盐缓冲液中
e.将0.07M NaBH3CN溶解在硼酸盐缓冲液的体积中
f.将硼酸盐缓冲液在40℃下孵育3天
g.在MQ中充分透析硼酸盐缓冲液
i.使用具有10kDA截留的透析膜或管
ii.在为硼酸盐缓冲液体积的至少100×大的MQ体积中透析
iii.更新MQ至少5次,间隔至少6小时
h.使经透析的溶液冻干
3.戊二醛偶联
该步骤的目标是使胺化的聚合物表面与末端胺化的多糖反应。这是通过将二醛与表面氨基偶联,在表面上提供随后可与末端胺化HA的氨基结合的反应性醛来实现的。大多数二醛都应发挥作用,但优选相对短且简单的二醛(如戊二醛),因为它们限制了两个醛与表面偶联的机会。
a.将2%v/v GA溶解在MQ中
b.在室温(room temperature,RT)下将聚合物表面在GA溶液中孵育6+小时
c.频繁地轻轻搅拌
d.用MQ轻轻洗涤聚合物表面三次或更多次
4.末端胺化的多糖与基底偶联
该步骤的目标是将末端胺化的多糖与醛官能化的表面偶联,从而产生端点连接的多糖。末端胺化多糖的还原末端上的氨基将自发地与表面醛反应。
a.将1%w/v的末端胺化的MDa HA溶解在MQ中
b.将聚合物表面与iHA溶液孵育6+小时
c.频繁地轻轻搅拌
d.用1×PBS pH=7.4轻轻洗涤聚合物表面三次或更多次
5.剩余表面基团的封闭
前述步骤已产生了具有与表面末端连接的透明质酸的聚氨酯基底。还原胺化反应不可能将透明质酸分子与每个可用的表面胺偶联。因此,将存在剩余的表面胺,出于以下两个原因这是不利的:剩余表面胺是可提供非特异性黏附位点的部分,以及在生理pH下剩余表面胺的正电荷可导致端点连接的带负电荷的透明质酸在基底上平坦化。
剩余的表面胺通过与二醛(GA)和随后的氨基酸(6AC)反应而被封闭,因为这些反应简单、快速并且不影响端点连接的透明质酸。
a.制备在MQ中的2%v/v GA
b.在室温下将基底在GA溶液中孵育6+小时
c.频繁地轻轻搅拌
d.用MQ轻轻洗涤基底三次或更多次
e.制备在MQ中的100mM 6AC
f.将基底在6AC溶液中孵育6+小时
g.频繁地轻轻搅拌
h.用1×PBS pH=7.4轻轻洗涤基底三次或更多次
6.将多糖接枝到已端点连接的多糖上
通过以下方法进行接枝:
a.将100mM NHS和100mM EDC溶解在0.1M MES缓冲液pH=5.5中
b.在室温下将聚合物表面用EDC溶液孵育1小时
c.频繁地轻轻搅拌
d.用1×PBS pH=7.4轻轻洗涤基底
e.将1%w/v iHA溶解在1×PBS pH=7.4中
f.在室温下将聚合物表面与iHA溶液孵育5+小时
g.频繁地轻轻搅拌
h.用1×PBS pH=7.4轻轻洗涤聚合物表面三次或更多次
7.(任选地)用检测受体装饰HA
以下方案描述了用于将碳二亚胺与抗EpCAM抗体VU1D9偶联的一种方法。还有其他抗EpCAM抗体可用,但大多数(如果不是全部的话)IgG1抗体的方案将最可能是相同的。
a.将100mM NHS和随后的100mM EDC溶解在0.1M MES缓冲液pH=5.5中
b.在室温下将聚合物表面与EDC/NHS溶液孵育2小时
c.频繁地轻轻搅拌
d.用1×PBS pH=7.4轻轻洗涤基底
e.制备5μg/ml的VU1D9溶液
f.在室温下将聚合物表面与VU1D9溶液孵育2小时
g.频繁地轻轻搅拌
h.用1×PBS pH=7.4轻轻洗涤基底
8.意大利面式HA的制备(比较)
前述步骤已产生了具有端点连接的HA的样品。为了比较端点连接的HA对意大利面式HA的作用,将PU的胺化样品如下进行处理:
a.将5%w/v 50kDA HA溶解在0.1M MES缓冲液pH=5.5中
b.添加100mM NHS和随后的100mM EDC,频繁地轻轻搅拌
c.在室温下将聚合物表面与HA溶液孵育3+小时
d.频繁地轻轻搅拌
e.用1×PBS pH=7.4轻轻洗涤基底三次或更多次。
9.细胞悬液制备
为了测试端点连接的透明质酸对流动中的癌细胞的黏附和滚动的作用,已培养癌细胞并使其沿着经处理的基底流动。MCF7细胞系因其稳健性质以及表达CD44和EpCAM而被使用。第一步是制备细胞悬液。
a.根据ATCC提供的方案培养MCF7细胞至汇合
c.根据ThermoFisher的方案将MCF7细胞用CMFDA染色
d.将MCF7细胞以20.000个细胞/ml的浓度悬浮于DMEM+10% FBS中
10.流动池
为了测试端点连接的透明质酸对流动中的癌细胞的黏附和滚动的作用,使用了由改进的注射泵、定制的流动池组件和落射荧光显微镜组成的设置。改进注射泵以经由与流动池中的通道连接的管来泵送细胞悬液,其中维持1mm/秒的平均速度,同时落射荧光显微镜捕获经处理基底的腔表面的图像持续20分钟。
该设置的要求如下:
a.注射泵:
i.具有两个5至60ml注射器
ii.具有垂直安装的注射器
iii.具有用于注射器的单独可配置的输注/抽出速率
iv.其中针对两个注射器控制加热至37℃
v.具有0.001至128ml/分钟的可配置的输注/抽出速率
b.流动池组件:
i.能够在以下的组件上提供3.2MPa的均匀(even)夹持压力
1.1mm厚的显微镜载片尺寸的经处理基底
2.0.5mm厚的显微镜载片尺寸的PDMS衬垫
3.具有0.6mm通道高度的Ibidi黏性载片I Luer(80188)
ii.具有控制加热至37℃的经处理基底
c.落射荧光显微镜:
i.具有420至490nm的带通激发滤光片
ii.具有520nm的长通(longpass)发射滤光片
iii.具有4×物镜
iv.具有能够在ISO100下以100毫秒曝光时间捕获RGB24格式的1280*960JPEG图像的相机。
11.数据分析
分析在前述步骤中捕获的图像以量化端点连接的透明质酸对流动速度和滚动速度以及固定率的作用。数据分析如下进行:
a.在Fiji(基于ImageJ的开源图像处理包)中将图像用自定义宏进行预处理,由此
i.分离了绿色通道
ii.使用滚动球半径为50的“减去背景(Subtract Background)”函数
iii.从所有图像中减去静态值
b.使用Trackmate插件分析图像
i.具有20px直径和1.0阈值的DoG检测器
ii.具有30pix距离和50Y罚分的LAP追踪器
c.追踪在MS Excel中导出和处理
i.删除<5个点的所有追踪
ii.制作0.25区块(bin)尺寸的直方图
iii.将区块尺寸转化为μm/秒
d.将直方图与阳性和阴性对照相比较
e.将直方图与非端点连接的HA相比较
图4中的直方图示出了细胞/细胞簇在多种基底上的行进速度的分布。丢弃所有无法追踪至少5帧的细胞/细胞簇。各棒表示区块的速度范围,即0至4.9、5至9.9、10至14.9、15至19.9、20至24.9、和25至30μm/秒。完全固定的细胞/细胞簇被包含在0至4.9μm/秒区块中。不包含行进快于30μm/秒的细胞/细胞簇。细胞悬液的浓度相等,这意味着如果细胞/细胞簇计数低,则细胞一般不与基底相互作用或不黏附至基底。
将阴性对照样品用-COOH基团装饰,-COOH基团不与细胞或细胞簇相互作用并阻止与基底的连接,如由非常低的0至4.9μm/秒区块所证明的。将阳性对照样品用-NH2基团装饰,已知-NH2基团良好地黏附细胞。意大利面式样品涂覆有HA,所述HA沿分子长度与基底偶联,这导致滚动和黏附的细胞/细胞簇的少量增加。具有端点连接的HA的样品显示出多得多的进行黏附或相互作用的细胞/细胞簇。因为意大利面式HA和端点连接的HA仅在连接方法上不同,所以数据显示端点连接极大地改善了细胞/细胞簇与基底的相互作用和黏附。
12.释放CTC
与经涂覆的基底结合的所捕获的CTC可通过HA的酶促降解从基底轻轻释放。与经典方法如胰蛋白酶消化不同,这种方法对CTC的生存力和表型的影响最小,并且因此理想地用于需要未受影响细胞的随后分析。来自牛睾丸的透明质酸酶是优选的,因为其是选择性的、有效的和经济的。可替代地使用可降解HA的其他酶或来自其他来源的透明质酸酶。以下方案描述了用透明质酸酶溶液的简单孵育。
a.制备200U/ml透明质酸酶在1×PBS pH=7.4中的溶液
b.将溶液预热至37℃
c.将基底与CTC在37℃下孵育5分钟
d.收获溶液以获得CTC悬液
可获得具有未受影响表型的可生存CTC,这非常难以实现并且对于进一步筛选临床相关参数是高度期望的。
Claims (15)
1.包含对生物分析物具有结合亲和力的一个或更多个多糖的涂层,其用于施加在医疗取样装置的表面上,其中所述一个或更多个多糖与所述医疗装置的表面端点连接,并且其中该一个或更多个端点连接的多糖具有端点接枝至其主链上伸出的侧基的一个或更多个多糖。
2.权利要求1所述的涂层,其中除了所述端点连接的多糖之外,接枝的多糖也具有端点接枝至其主链上伸出的侧基的一个或更多个多糖。
3.用于将包含对生物分析物具有结合亲和力的一个或更多个多糖的涂层施加到医疗取样装置的表面上的方法,其中所述一个或更多个多糖与所述装置的表面端点连接,所述方法包括使所述表面胺化的步骤(A),随后是将所述一个或更多个多糖与所述表面上的胺基端点连接的步骤(B),以及以下二者之一:将一个或更多个多糖与端点连接到所述表面上的多糖的主链上伸出的侧基进行端点连接的步骤(C),随后是封闭所述表面上的任何剩余官能团的步骤(D);或者步骤(D),随后是步骤(C)。
4.权利要求3所述的方法,其中所述装置的表面通过氨解进行胺化,优选通过二胺的氨解,优选用乙二胺或二亚乙基三胺进行氨解。
5.权利要求3至4中任一项所述的方法,其中所述多糖通过还原胺化与所述表面上的胺基连接。
6.权利要求3至5中任一项所述的方法,其中所述端点连接的一个或更多个多糖包含一个或更多个糖胺聚糖,更优选透明质酸(HA)或经取代的HA。
7.权利要求6所述的方法,其中所述HA的分子量在40kDa至2MDA的范围内,优选地在50kDa至1.5MDa的范围内。
8.权利要求3至7中任一项所述的方法,其中剩余胺基通过以下被封闭:与二醛优选戊二醛反应,随后与氨基酸优选6-氨基己酸反应,优选地随后是亚胺键的还原。
9.权利要求3至8中任一项所述的方法,其还包括将受体和/或配体接枝到所述一个或更多个多糖上的步骤(E)。
10.医疗取样装置,其用于捕获生物分析物,优选循环肿瘤细胞,所述医疗取样装置具有包含端点连接的多糖的胺化表面,所述多糖对生物分析物具有结合亲和力,其中该一个或更多个端点连接的多糖具有端点接枝至其主链上伸出的侧基的一个或更多个多糖,并且其中所述表面上的任何剩余胺基均被封闭。
11.权利要求10所述的医疗取样装置,其具有聚合物表面,所述聚合物表面优选地由能够氨解的聚合物构成,优选地由聚氨酯或聚酯构成,优选地由聚氨酯构成。
12.权利要求10至11所述的医疗取样装置,其中所述表面位于所述装置的内侧或外侧。
13.使用权利要求10至12中任一项所述的医疗取样装置从循环系统捕获生物分析物优选CTC的方法,所述医疗取样装置优选地为经修饰的导丝或导管的形式。
14.用于从权利要求13所述的方法中使用的医疗取样装置释放所捕获的生物分析物优选CTC的方法,所述方法通过使所述装置的涂层进行酶促降解来进行,优选地用透明质酸酶进行酶促降解,更优选地用来自牛睾丸的透明质酸酶进行酶促降解。
15.用于分析生物分析物优选CTC的方法,其包括根据权利要求13所述的方法捕获生物分析物,根据权利要求14所述的方法释放所捕获的生物分析物,以及对所述生物分析物进行临床相关参数的筛选。
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