CN116042725A - 一种杂食性家蚕的分子育种方法及应用方法 - Google Patents

一种杂食性家蚕的分子育种方法及应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于农业生物技术领域，涉及家蚕育种技术领域，具体涉及一种杂食性家蚕的分子育种方法及应用。本发明以家蚕味觉受体GR43为靶基因，设计靶向其第一个外显子的sgRNA，通过基因编辑技术敲除该基因，证明了缺失GR43的家蚕突变体可以取食多种非寄主植物，食谱范围大大拓宽，成为了一种杂食性家蚕，并且该突变体家蚕在人工饲料上的存活率也显著高于野生型家蚕，有利于家蚕的大规模饲养。可见，本发明获得了一种杂食性家蚕，大大拓宽了家蚕的食谱，十分有利于寻找可替代桑叶的非寄主植物来饲养家蚕。此外，该杂食性家蚕在人工饲料上的存活率也显著高于野生型家蚕，有利于家蚕的大规模人工饲养。

Description

一种杂食性家蚕的分子育种方法及应用方法
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，涉及家蚕育种技术领域，具体涉及一种杂食性家蚕的分子育种方法及应用。
背景技术
家蚕(Bombyxmori L.)是我国重要的经济昆虫，在中国古代的丝绸之路中起着十分重要的作用。经过几千年的人工选育，家蚕几乎只能以桑叶为食，成为了典型的单食性昆虫。家蚕的饲养严重依赖于新鲜的桑叶，因此家蚕的养殖区域受到了严格的地理和气候条件的限制。并且，家蚕饲养通常以农户散养为主，很难进行大规模工厂化生产，从而严重制约了整个蚕桑业的发展。因此，如何进行家蚕的大规模饲养，是整个蚕桑业面临的瓶颈之一。解决这个问题的关键，是培育杂食性的家蚕新品种。
家蚕幼虫的食性主要决定于位于头部口器上的下颚组织，该组织上分布有大量的味觉感受受体，可以鉴别桑叶中特有的次生代谢产物。如果鉴定出了特定的次生代谢产物，即可以产生取食行为，否则就可能导致拒食。有研究表明，通过显微手术去除家蚕的下颚，家蚕的食性会大大地拓宽，从而能够取食平时根本不吃的非寄主植物。
家蚕下颚非常微小，长度通常只有几个微米。因此，通过手术去除下颚来获得大量的杂食性家蚕几乎是不可能的。Crispr/cas9是一种基因组编辑技术，能够对特定的基因进行缺失突变。因此，采用该方法通过缺失突变从而敲除关键的味觉受体基因，也可以达到拓宽家蚕食谱的目的，从而获得杂食性家蚕品系。杂食性家蚕由于食谱范围广泛，有利于研制桑叶以外的替代食物来饲养家蚕。此外，杂食性家蚕由于不挑食，因此也将更适宜于采用人工饲料来进行饲养。因此，有必要开发杂食性家蚕的分子育种方法。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明一种杂食性家蚕的分子育种方法，获得了一种杂食性家蚕，大大拓宽了家蚕的食谱，有利于家蚕的大规模饲养。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供了一种杂食性家蚕的分子育种方法，即通过基因编辑技术使家蚕缺失GR43基因或使家蚕的GR43基因表达量降低，从而培育出杂食性家蚕。
优选地，所述基因编辑技术为crispr/cas9技术。
本发明鉴定出了一种味觉受体基因GR43，通过基因编辑技术缺失该受体基因后获得了一种杂食性家蚕新品种，其食谱大大拓宽，可以取食生菜、白菜、苹果和梨等多种非寄主植物。该方法大大拓宽了家蚕的食谱，十分有利于家蚕人工饲养以及寻找可替代桑叶的非寄主植物。
作为本发明的一个优选实施方式，上述杂食性家蚕的分子育种方法包括以下步骤：
S1、针对家蚕GR43基因设置引物，对家蚕基因组cDNA进行PCR扩增；
S2、以家蚕GR43基因的外显区域作为靶位点合成sgRNA引物，然后通过PCR法从家蚕cDNA扩增产物中获得sgRNA的双链DNA，再体外转录合成sgRNA；
S3、用步骤S2的sgRNA与cas9蛋白对家蚕基因组DNA进行切割，获取具有体外切割活性的sgRNA；
S4、将步骤S3的sgRNA与cas9蛋白一起注入发育早期的家蚕卵内，然后将鉴定出GR43基因发生了移码突变的阳性个体与野生型个体交配，再从下代挑选发生了移码突变的阳性个体进行自交，最后从自交后代中鉴定出纯合的缺失突变体，即为杂食性家蚕。
优选地，步骤S1所述引物包括上游引物和下游引物，其中上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
优选地，步骤S1所述PCR扩增的体系为：rTaq酶0.3μL、10×PCR Buffer 2μL、家蚕cDNA 1μL、上游引物1μL、下游引物1μL、dNTP 2μL、灭菌水12.7μL。PCR扩增参数为：94℃3min,35个循环(94℃30s、54℃30s、72℃60s)，72℃10min。
优选地，步骤S2所述外显区域为靠近N端的外显区域，所述外显区域如SEQ ID NO：3所示。
优选地，步骤S2所述sgRNA引物包括上游引物和下游引物，其中上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示。
优选地，步骤S2所述PCR的体系为：rTaq酶0.5μL、10×PCR Buffer 2μL、上游引物2μL、下游引物2μL、dNTP 2μL、灭菌水11.5μL。PCR扩增参数如下：94℃5min,32个循环(94℃30s、56℃30s、72℃30s)，72℃10min。
优选地，步骤S3所述切割具体为：先以家蚕基因组DNA为模板进行PCR扩增获取PCR产物，然后按照以下体系进行切割：Cas9蛋白1μL、Cas9蛋白缓冲液1μL、PCR产物200～500ng、sgRNA 200～500ng、灭菌水加水至10μL。切割条件为：37℃反应1h。
进一步地，以家蚕基因组DNA为模板进行PCR扩增获取PCR产物的PCR扩增的体系为：rTaq酶0.5μL、10×PCR Buffer 2μL、基因组DNA 1μL、上游引物1μL、下游引物1μL、dNTP2μL、灭菌水12.5μL；所述上游引物如SEQ ID NO：7所示，所述下游引物如SEQ ID NO：8所示。PCR扩增参数如下：94℃5min,35个循环(94℃30s、56℃30s、72℃30s)，72℃10min。
优选地，步骤S4所述sgRNA的注入量为500-600ng/μL，所述cas9蛋白的注入量为400-500ng/μL。
优选地，步骤S4所述鉴定采用PCR法，PCR扩增的体系为：rTaq酶0.5μL、10×PCRBuffer 2μL、基因组DNA 1μL、上游引物1μL、下游引物1μL、dNTP 2μL、灭菌水12.5μL；所述上游引物如SEQ ID NO：7所示，所述下游引物如SEQ ID NO：8所示。PCR扩增参数如下：94℃5min,35个循环(94℃30s、56℃30s、72℃30s)，72℃10min。
本发明还提供了上述杂食性家蚕的分子育种方法在家蚕大规模饲养中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明以家蚕味觉受体GR43为靶基因，设计靶向靠近N端的外显子的sgRNA，通过基因编辑技术敲除该基因，证明了缺失GR43的家蚕突变体可以取食多种非寄主植物，食谱范围大大拓宽，成为了一种杂食性家蚕，并且该突变体家蚕在人工饲料上的存活率也显著高于野生型家蚕，有利于家蚕的大规模饲养。可见，本发明获得了一种杂食性家蚕，大大拓宽了家蚕的食谱，十分有利于寻找可替代桑叶的非寄主植物来饲养家蚕。此外，该杂食性家蚕在人工饲料上的存活率也显著高于野生型家蚕，有利于家蚕的大规模人工饲养。
附图说明
图1为家蚕Gr43全长cDNA的克隆图谱；
图2为家蚕Gr43 sgRNA的体外切割活性检测结果；
图3为家蚕Gr43突变体的测序分析(A为杂合体的测序峰图；B为纯合突变体的基因型，缺失了一个碱基)；
图4为家蚕Gr43突变体在非寄主植物上的取食行为；
图5为家蚕Gr43突变体取食非寄主植物后的中肠；
图6为家蚕Gr43突变体取食非寄主植物的个体比例；
图7为杂食性家蚕在人工饲料和桑叶上的存活率比较。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
实施例1一种杂食性家蚕的分子育种方法及应用
(一)PCR扩增家蚕GR43基因全长cDNA片段
1、从GenBank中下载家蚕基因Gr43(基因号：LOC119629395)的核酸序列；
2、采用Primer premier 5软件针对Gr43的核酸序列设计引物：
Gr43_F1:ATGAAGTCTCCAGAGTATCTAT(SEQ ID NO：1)；
GR43_R1:CTGAAAATTTTGAGTAATTAATAACATTTTAC(SEQ ID NO：1)。
3、提取家蚕总RNA，并反转录成cDNA；
4、采用PCR法扩增家蚕Gr43基因片段，扩增体系为：
PCR扩增参数为：94℃3min,35个循环(94℃30s、54℃30s、72℃60s)，72℃10min。
5、家蚕Gr43全长cDNA的扩增图谱如图1所示，对扩增的PCR产物进行测序，并与GenBank中的家蚕Gr43序列进行比较，核酸相似性为98％。
(二)合成靶向Gr43的sgRNA
1、根据N20NGG的原则选择家蚕Gr43的cDNA中靠近N端的外显区域(GCACGGTCAATTAATACTTCTGG，SEQ ID NO：3)作为靶位点，合成靶向该位点的一对sgRNA引物：
家蚕Gr43全长cDNA的核酸序列(SEQ ID NO：6)：
然后通过PCR法，获得119bp的该sgRNA的双链DNA：
PCR扩增体系如下：
PCR扩增参数如下：94℃5min,32个循环(94℃30s、56℃30s、72℃30s)，72℃10min。
2、体外转录合成sgRNA：将上述PCR产物与氯仿：异戊醇(24：1)按1：1比例混匀，12000rpm离心10min，取上清，加入2.5倍体积无水乙醇于-20℃静置2h，12000rpm离心15min，弃上清，加入1mL 75％乙醇，12000rpm离心5min，重复一次，弃上清，室温晾干后加入无核酸酶水溶解。以获得的PCR产物为DNA模板，使用MEGAscriptTM T7转录试剂盒(Promega)在体外合成sgRNA，合成体系如下：
将反应液按照上表依次配制混匀后，37℃反应6h，然后加入1μLTURBO Dnase，37℃消化15min，去除多余的DNA模板。再加入189μL无核酸酶水，200μL的氯仿：异戊醇(24：1)溶液，4℃下12000rpm离心15min，取上清，加入1.5倍体积异丙醇，-20℃静置2h，4℃下12000rpm离心20min，弃上清，加入1mL 75％乙醇，12000rpm离心10min，弃上清，室温干燥，加入10μL无核酸酶水溶解沉淀，即为sgRNA，其RNA序列为：
(三)sgRNA体外切割活性检测
1、提取家蚕基因组DNA；
2、设计引物GR43_F3(GGTGCAAATGGCGCTAGGATCATGCAGAGT，SEQ ID NO：9)和GR43_R3(CGAAGGTTAGCAGGCTCATTACAATTAG，SEQ ID NO：10)，以家蚕基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系如下：
PCR扩增参数如下：94℃5min,35个循环(94℃30s、56℃30s、72℃30s)，72℃10min。
3、配置以下体外切割的反应体系：
将上述反应液混合后置于37℃反应1h。
4、电泳检测：将上述反应液进行凝胶电泳，此时可以发现该PCR产物被切割，这说明sgRNA具有体外切割活性，可用于后续的显微注射实验(如图2所示)。
(三)显微注射及阳性突变体鉴定
1、通过显微注射将sgRNA(600ng/μL)与cas9蛋白(400ng/μL)一起注射入发育早期的家蚕卵内(总的注射量为1μg)，记为G0代，收集末龄幼虫退的皮，提取基因组DNA，用于后续的PCR鉴定；
2、采用引物GR43_F3和GR43_R3来进行PCR扩增，并测序。如果测序峰图在靶位点附近出现杂峰(图3A)，则认为该个体的GR43基因发生了移码突变；
3、对于发生了移码突变的阳性个体，将其与野生型个体交配，并获得其卵，记为G1代；
4、采用GR43_F3和GR43_R3进行PCR扩增和测序，鉴定出G1代阳性个体，并自交，产下的卵记为G2代；
5、采用GR43_F3和GR43_R3进行PCR扩增和测序，从G2代中鉴定出纯合的缺失突变体(sgRNA靶位点的两条DNA链均出现移码突变)，即为杂食性家蚕(GR43缺失突变体)。GR纯合的缺失突变体的基因型如图3B所示。
(四)杂食性分析
1、先让GR43缺失突变体饥饿12h，然后喂食生菜叶、白菜叶、苹果和梨等非寄主植物，观察其取食行为。此时可以观察到GR43缺失突变体能够取食上述4种非寄主植物，而野生型家蚕不会取食(如图4所示)。
2、12h后解剖中肠，可观察到突变体家蚕中肠中有相应取食植物的食物残渣(如图5所示)。统计中肠中含有食物残渣的个体比例，可以发现，在喂食苹果的情况下，有大约60％的突变体中肠中能够发现食物残渣，喂食其它非寄主植物的情况下，有大约20％的突变体中肠中发现了对应食物的残渣(如图6所示)。这说明，Gr43缺失突变体家蚕能够取食这4种不同的非寄主植物，并且对苹果具有最强的偏好性。
3、杂食性家蚕在人工饲料上的存活情况：
将杂食性家蚕和野生型家蚕的初孵幼虫分别放置于人工饲料(Silkmate PM，Nosan Corporation Life-Tech Department,日本)上进行饲养，10天后观察比较幼虫的存活情况。结果发现，杂食性家蚕的存活率大约为50％，显著高于野生型家蚕(20％)，并且与喂食新鲜桑叶的存活率(大约60％)没有明显的差异(如图7所示)。这说明，杂食性家蚕在人工饲养上比野生型家蚕具有很好的适应性。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种杂食性家蚕的分子育种方法，其特征在于，通过基因编辑技术使家蚕缺失GR43基因或使家蚕的GR43基因表达量降低，从而培育出杂食性家蚕。
2.根据权利要求1所述的一种杂食性家蚕的分子育种方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、针对家蚕GR43基因设置引物，对家蚕基因组cDNA进行PCR扩增；
S2、以家蚕GR43基因的外显区域作为靶位点合成sgRNA引物，然后通过PCR法从家蚕cDNA扩增产物中获得sgRNA的双链DNA，再体外转录合成sgRNA；
S3、用步骤S2的sgRNA与cas9蛋白对家蚕基因组DNA进行切割，获取具有体外切割活性的sgRNA；
S4、将步骤S3的sgRNA与cas9蛋白一起注入发育早期的家蚕卵内，然后将鉴定出GR43基因发生了移码突变的阳性个体与野生型个体交配，再从下代挑选发生了移码突变的阳性个体进行自交，最后从自交后代中鉴定出纯合的缺失突变体，即为杂食性家蚕。
3.根据权利要求2所述的一种杂食性家蚕的分子育种方法，其特征在于，步骤S1所述引物包括上游引物和下游引物，其中上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
4.根据权利要求2所述的一种杂食性家蚕的分子育种方法，其特征在于，步骤S1所述PCR扩增的体系为：rTaq酶0.3μL、10×PCR Buffer 2μL、家蚕cDNA 1μL、上游引物1μL、下游引物1μL、dNTP 2μL、灭菌水12.7μL。
5.根据权利要求2所述的一种杂食性家蚕的分子育种方法，其特征在于，步骤S2所述外显区域为靠近N端的外显区域，所述外显区域如SEQ ID NO：3所示。
6.根据权利要求2所述的一种杂食性家蚕的分子育种方法，其特征在于，步骤S2所述sgRNA引物包括上游引物和下游引物，其中上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO：4和SEQID NO：5所示。
7.根据权利要求2所述的一种杂食性家蚕的分子育种方法，其特征在于，步骤S2所述PCR的体系为：rTaq酶0.5μL、10×PCR Buffer 2μL、上游引物2μL、下游引物2μL、dNTP 2μL、灭菌水11.5μL。
8.根据权利要求2所述的一种杂食性家蚕的分子育种方法，其特征在于，步骤S3所述切割具体为：先以家蚕基因组DNA为模板进行PCR扩增获取PCR产物，然后按照以下体系进行切割：Cas9蛋白1μL、Cas9蛋白缓冲液1μL、PCR产物200～500ng、sgRNA 200～500ng、灭菌水加水至10μL。
9.根据权利要求2所述的一种杂食性家蚕的分子育种方法，其特征在于，步骤S4所述sgRNA的注入量为500～600ng/μL，所述cas9蛋白的注入量为400～500ng/μL。
10.权利要求1-9任一项所述的杂食性家蚕的分子育种方法在家蚕大规模饲养中的应用。
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