CN116042697A - GhLPL2基因在提高棉花黄萎病抗病性中的应用 - Google Patents

GhLPL2基因在提高棉花黄萎病抗病性中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116042697A
CN116042697A CN202310001792.3A CN202310001792A CN116042697A CN 116042697 A CN116042697 A CN 116042697A CN 202310001792 A CN202310001792 A CN 202310001792A CN 116042697 A CN116042697 A CN 116042697A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cotton
ghlpl2
gene
plants
verticillium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202310001792.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116042697B (zh
Inventor
郭旺珍
王桂林
王心宇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Agricultural University
Original Assignee
Nanjing Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Agricultural University filed Critical Nanjing Agricultural University
Priority to CN202310001792.3A priority Critical patent/CN116042697B/zh
Publication of CN116042697A publication Critical patent/CN116042697A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116042697B publication Critical patent/CN116042697B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01005—Lysophospholipase (3.1.1.5)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Abstract

本发明公开GhLPL2基因在提高棉花黄萎病抗病性中的应用，属于生物技术应用领域。本发明涉及的GhLPL2基因，其编码一个溶血磷脂酶。本发明提供了GhLPL2在异源四倍体陆地棉品种军棉1号中A亚组、D亚组中全长ORF核苷酸序列和氨基酸序列。棉花GhLPL2与黄萎病菌毒蛋白VdNLP1互作并参与棉花黄萎病抗性。该基因在棉花所有组织中均有表达，受黄萎病菌诱导显著上调表达。GhLPL2是棉花生长发育关键基因，在棉花中敲除该基因影响植株糖代谢及磷脂代谢过程，显著干扰植株生长发育，不能产生后代。将该基因在棉花中过量表达抑制VdNLP1的毒力并激活免疫反应，显著提高植株抗病性，但不影响植株正常生长发育。

Description

GhLPL2基因在提高棉花黄萎病抗病性中的应用
技术领域
本发明属于生物技术应用领域，涉及棉花GhLPL2基因在提高棉花黄萎病抗病性中的应用，该基因编码一个溶血磷脂酶。通过对黄萎病菌中的毒蛋白VdNLP1进行系统分析及克隆，利用构建的受黄萎病菌VD8诱导陆地棉品种军棉1号根部酵母表达文库进行互作蛋白筛选，进一步进行基因全长序列克隆及互作验证，结合转基因验证及分子机理解析，明确棉花中GhLPL2与黄萎病菌毒蛋白VdNLP1互作并参与棉花黄萎病抗性。棉花中GhLPL2基因保守，在四倍体棉花中存在2个拷贝，A、D亚组各一个。该基因在所有组织中均有表达，受黄萎病菌诱导显著上调表达。利用PCR技术在陆地棉品种军棉1号中获得该基因的全长ORF序列及编码的氨基酸序列。利用生物技术对该基因参与的植物抗病性以及功能机制进行了具体的研究，GhLPL2是棉花生长发育关键基因，在棉花中敲除该基因影响植株糖代谢及磷脂代谢过程，显著干扰植株生长发育，不能产生后代。将该基因在棉花中过量表达抑制VdNLP1的毒力并激活免疫反应，显著提高植株抗病性，但不影响植株正常生长发育。
背景技术
黄萎病菌为一种土传的半活体营养型真菌，其可以侵染200多种双子叶植物，其中包括棉花、番茄、黄瓜、辣椒、茄子和马铃薯等主要的经济作物，具有寄主范围广泛、传播速度快及土壤中存活时间久等特点，在田间难以防治(Bhat and Subbarao,1999)。棉花是世界上重要的经济作物，也是主要的战略物资，在我国国民经济中占有不可取代的地位。然而，在新疆等主要棉花种植区，由大丽轮枝菌引发的黄萎病病情严重，危害棉花的产量和品质，是目前威胁我国棉花可持续生产的主要障碍之一。自1914年美国首次发现棉花黄萎病后，以极快的速度蔓延至其它主要棉花种植国；1935年，随美国种质资源的引入传入中国并逐年传播扩散，造成大面积的流行及减产(林玲等，2014；喻树迅，2018)。针对黄萎病害化学防治策略并不理想，田间轮作等管理手段也只能适当缓解病害的发生，挖掘棉花中关键抗病基因并创制抗病材料是提高抗病性最直接和有效的策略。
黄萎病菌的生活周期从微菌核的萌发开始，当感知到植物根部所释放的分泌物为信号后，微菌核开始产生胚芽管，并沿根表皮细胞纵向延伸。其中少量的菌丝顶端膨胀肿大，以附着枝的形式紧紧吸附在根表面，形成狭小的侵染钉结构穿透表皮进行侵染；在侵染的过程中，病原菌将分泌一些胶状物使其附着枝牢牢固定在侵染界面，用以承受穿透瞬间所产生的后座力；同时释放大量的细胞壁水解酶，如果胶酶、角质酶及纤维素酶等，破坏植物细胞壁组织(Sesma and Osbourn,2004；Zhao et al.,2014；Zhao et al.,2016)；大量效应因子破坏或干扰植物的免疫反应(de Jonge et al.,2011)。成功侵入后的菌丝逐渐向中心位置蔓延，最终进入木质部并定殖，在细胞内或细胞间生长繁殖，并顺着木质部导管向上扩展至茎部或叶部(Shaban et al.,2018)。
深入探究黄萎病菌的致病机理将有助于推动棉花抗病分子育种的发展进程。“堵塞学说””和“毒素学说”是目前两种黄萎病菌引起发病的主流假说。当菌丝和孢子在导管中大量繁殖，会激活邻近的薄壁细胞产生胶状物和侵填体，堵塞导管并影响水分的运输，最终导致植株枯萎(Baidez et al.,2007)。此外，黄萎病菌分泌的某些毒素成分也是致萎的重要原因(Ming et al.,2015)，这些毒素破坏植物的细胞壁，引起细胞线粒体功能失调及叶绿体解体，或诱发细胞膜破损及胞质溶解，导致植物组织损坏，代谢及防御能力降低。在早期的研究中，鉴定到黄萎病菌的毒素成分可能是一种糖蛋白(Dubery and Meyer,1996)，后续又鉴定到一些细胞壁降解酶类蛋白及坏死和乙烯诱导型VdNLP类蛋白等都是黄萎病菌重要的毒素成分(Klosterman et al.,2011；Santhanam et al.,2013)。
经过数十年的研究，鉴定到大量在黄萎病菌与宿主互作过程中产生的差异表达分子，对于不同的宿主植物差异分子的数目和类型有所不同，包括释放的各种酶类或蛋白质，它们以相似的途径分泌至宿主细胞，却以不同方式识别细胞并发挥功能(Dobinson etal.,2004)。如一些效应因子抑制植物防御反应，毒力因子或致病因子破坏细胞及免疫系统，激发子激活植物的免疫响应并导致局部程序性细胞死亡(Thomma et al.,2011)。随着黄萎病菌基因组序列的释放，陆续鉴定到大量分泌蛋白，例如早期鉴定的无毒效应蛋白Ave1，携带此蛋白的菌株对缺乏类受体蛋白Ve1抗性基因的宿主植株具有更强的毒性作用(Jonge et al.,2012)。几丁质是真菌细胞壁的主要结构成分，植物不产生几丁质，但能通过质膜上的受体将几丁质识别为非自身的模式分子，进一步激活免疫响应，但黄萎病菌分泌的几丁质结合蛋白VdLysM会干扰宿主免疫反应的激活并促进自身毒力作用(Kombrink,2014)。PR5-like是棉花中鉴定到的一个病程相关蛋白，在体外表达具有明显的抗真菌活性，然而其作用被黄萎病菌分泌蛋白PevD1所抑制(Zhang et al.,2019).植物释放几丁质酶水解病原真菌的细胞壁并释放小分子的几丁质寡糖，寡糖是免疫激活的重要信号分子，黄萎病菌分泌的VdSSEP1蛋白酶能够对棉花的几丁质酶进行切割并降解，阻断免疫反应的发生(Han et al.,2019)。另一方面，黄萎病菌侵入植物后为了更好的吸收并利用体内营养物质，会分泌Aspf2-like蛋白调控宿主体内MYB6转录因子的激活并触发防御(Ma et al.,2021)。黄萎病菌的关键木聚糖酶VdXyn4能够降解植物细胞壁结构屏障，同时操纵宿主细胞免疫(Wang et al.,2021)。这些研究结果体现了宿主防御系统与黄萎病菌侵染机制在互作过程中的复杂性。
植物与病原菌相互斗争及协同进化过程中，也表现出各种抵御病菌的方式和能力。首先，植株的物理机械屏障和化学防御很关键，包括细胞壁结构性修饰及抗毒物质的合成等(Ahuja et al.,2012)。同时，植株具备PTI和ETI两套复杂且精密的防御系统，即植物免疫锯齿模型(Jones and Dangl,2006)。当植物受到病原菌攻击后，细胞表面的受体感知到病原相关分子模式触发PTI免疫反应，包括诱导活性氧爆发、激素信号响应及抗性相关基因激活等；为了抑制病原菌释放的各种效应蛋白，植物能够分泌抗病的R蛋白进一步识别效应蛋白触发ETI过程，反应通常伴随局部组织的细胞程序性坏死，阻止病原菌在细胞间传播感染，最终建立整株植物的系统获得性抗性(Zipfel,2008)。同时，PTI和ETI过程具有潜在的复杂协作机制，受体和R蛋白能协同作用并激活植物的免疫相关通路(Bruno et al.,2021；Yuan et al.,2021)。在棉花中已经功能表征了很多抗病相关基因，广泛涉及细胞壁修饰、次级代谢改变、免疫受体识别及与效应蛋白的互作机理。漆酶GhLac1的过量表达导致棉花木质素积累，木质化程度增加，赋予植株高的黄萎病抗性(Hu et al.,2018)。在棉花中存在保守的几丁质传感器及信号传导网络，细胞壁相关激酶GhWAK7A在促进几丁质受体复合物GhLYK5-GhCERK1识别几丁质的过程中发挥重要作用，有助于棉花抵御黄萎病菌(Wanget al.,2020)。为了阻止VdSSEP1蛋白酶对棉花几丁质酶的降解，棉花进化出富含半胱氨酸重复序列的蛋白CRR1，保护几丁质酶不被破坏(Han et al.,2019)。结合黄萎病菌致病机制，进一步探究棉花的多层免疫系统，将是棉花抗病育种研究的重点。
坏死和乙烯诱导型蛋白NLP1(Necrosis-and ethylene-inducing peptide 1-like proteins)是病原菌中鉴定的一类重要毒素成分，其广泛存在于植物病原真菌、细菌和卵菌中。自1995年，从被诱导的尖孢镰刀菌滤液中分离到第一个NLP1，原核表达纯化的蛋白能引起叶片的坏死并诱导乙烯合成，由此这类包含保守的坏死和乙烯诱导蛋白(NPP1)结构域的毒性蛋白被发现(Bailey,1995)。尽管NLPs分布广泛，但其在不同病原物体内的数量差异很大，卵菌的基因组中数量很多，每个菌种中都达到50-60个。卵菌是感染双子叶植物的主要病原体，极具破坏性，NLP1的晶体结构分析明确了氨基酸D104及保守的七肽基序GHRHDWE是触发植物细胞质膜透化和胞质溶解的必要条件，揭示了NLPs对于膜损伤、诱导细胞死亡及促进毒力的特性，并提出NLP与宿主膜的互作模式。此外，NLP1引起的细胞死亡以及对宿主膜的独特作用需要宿主活跃的细胞代谢(Ottmann et al.,2014)。
Figure BDA0004035272700000031
等(2017)鉴定到了NLP1在植物细胞膜的靶点，其并不是蛋白质，而是一种特异性的鞘脂-糖基肌醇磷酸神经酰胺(GIPC)，NLP1靶向细胞膜双分子层的外叶并造成胞质溶解，整个过程中GIPC的完整性及有序的质膜环境是毒力所必需的；当GIPC途径被阻断后提高了植株对NLP1毒力的耐受性，然而植株表现为生长发育缺陷或无法生存。由于NLP1与GIPC单体的己糖残基部分结合，所以在单子叶和双子叶植物间GIPC己糖结合位点的差异导致其对NLP1的耐受性有所差异。
除了对细胞的毒力作用外，NLP1也作为激发子激活植物的系统性免疫响应。在拟南芥中异源表达卵菌的NLP1导致叶片局部坏死，同时伴随着宿主免疫反应的激活，包括乙烯、活性氧、胼胝质积累及抗病基因表达(Fellbrich,2002)；体外表达的NLP1蛋白同样也能诱导拟南芥的免疫反应，复杂的分子网络变化类似于模式分子Flg22所触发的免疫，包括RLK受体、抗病蛋白、PR基因、WRKY及抗病激素SA、ET等相关基因的诱导表达(Qutob et al.,2006)。据报道，NLP1含有保守的20个氨基酸残基(nlp20)，其可以作为模式分子被植物受体识别触发免疫应答。拟南芥中的富亮氨酸重复序列受体蛋白(LRR-RLP)RLP23识别多数NLP1中的nlp20，并与AtSOBIR1形成复合物后招募另一个(LRR-RLK)AtBAK1配体结合生成三联复合物介导免疫反应激活。将RLP23在马铃薯中过量表达显著增强植株对破坏性病原卵菌和真菌的抗性(Albert et al.,2015)。NLP1诱导的这种免疫反应需要氨基酸的完整性，若N端或C端截断其作用将被抑制(Fellbrich et al.,2002)。
相比之下，真菌中的NLP基因较少，在黄萎病菌的基因组中只鉴定到8个，其中2个NLPs(VdNLP1和VdNLP2)具有细胞毒性(Zhou et al.,2012)。Wang等(2004)首次鉴定了黄萎病菌中VdNLP1蛋白，编码233个氨基酸，与卵菌中的NLP1蛋白具有高度的相似性，在体外原核表达的VdNLP1蛋白能够触发烟草叶片局部坏死，诱导拟南芥叶片活性氧的积累及PR基因表达。Zhou等(2012)进一步证明了VdNLP1蛋白可诱导棉花子叶坏死，并诱导免疫反应激活。尽管很多报道揭示了NLP1在细胞毒力及免疫激活过程中的作用，但在棉花在与黄萎病菌协同进化的过程中，植株为了保护自身的生长发育，如何感知VdNLP1并影响其细胞毒性作用的分子机制仍知之甚少。本发明在研究中，克隆并鉴定了黄萎病菌中的VdNLP1基因，其在棉花根部的诱导下大量表达。以VdNLP1为诱饵进行黄萎病菌诱导棉花根部的酵母表达文库筛选，并通过全长序列体内和体外的互作验证，明确棉花中的一个溶血磷脂酶GhLPL2(Lysophospholipase 2)与VdNLP1互作。本发明研究发现，过量表达GhLPL2限制了VdNLP1的毒力作用，提高棉花对黄萎病菌的抗性。
LPL2是细胞膜磷脂代谢过程中的关键酶，同时也是逆境胁迫的重要参与者(Zabela et al.,2002)。在外界的刺激下，LPL2能迅速做出反应，通过调节溶血磷脂的含量影响植物各种代谢及生命活动(Wang and Dennis,1999)。在拟南芥中的溶血磷脂酶LysoPL1受病原菌诱导后上调表达，可能参与植物对病原菌的响应(de Torres Zabela etal.,2002)；LysoPL2对重金属胁迫过程中产生的溶血磷脂及H2O2具降解作用(Gao et al.,2010)。植物中对LPL的研究较少，其在植物抵御病原菌过程中的功能机制尚缺少系统的研究。我们发现棉花中的GhLPL2定位在过氧化物酶体，其转运至细胞膜发挥功能。通过基因敲除、基因沉默及过量表达的方法获得GhLPL2的转基因植株，明确了GhLPL2在棉花生长发育及抗病性中的重要作用。黄萎病被称为棉花的“癌症”，发掘植物中阻止其致病因子的关键基因，并通过有效的基因工程手段创造抗病种质尤为关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种棉花GhLPL2基因在提高目标植物抗病性或培育抗病性提高的目标植物新种质中的应用。利用转GhLPL2基因的拟南芥以及棉花材料证明了过量表达GhLPL2可以显著提高植株对黄萎病的抗性。以此基因为靶基因，通过转基因等基因工程方法，在植株中过量表达GhLPL2基因，培育生长发育正常，棉纤维产量、品质与对照无显著差异，且抗性显著提高的棉花新种质并在生产上应用。
本发明的另一目的在于提供一种提高棉花抗黄萎病的方法。
本发明的又一目的在于提供一种棉花GhLPL2基因，并提供该基因在陆地棉品种军棉1号A亚组(GhLPL2A)和D亚组(GhLPL2D)中的全长cDNA ORF核苷酸序列及编码的氨基酸序列。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的GhLPL2基因在提高目标植物抗病性或培育抗病性提高的目标植物新种质中的应用。
含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的GhLPL2基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在提高目标植物抗病性或培育抗病性提高的目标植物新种质中的应用。
上述的应用，具体是以所述的GhLPL2基因为靶基因，通过基因工程方法，过量表达GhLPL2基因，提高目标植物抗病性或培育抗病性提高的目标植物新种质并在生产上应用。
优选的，所述的抗病性为黄萎病抗病性。所述的目标植物为棉花或拟南芥。
一种提高棉花抗黄萎病的方法，在棉花中过量表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的GhLPL2基因。
一个能显著提高植物抗病性的GhLPL2基因，该基因为(1)～(2)中的任意一种：
(1)该基因在陆地棉军棉1号的基因组A亚组(GhLPL2A)中，其全长cDNA ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)该基因在陆地棉军棉1号的基因组D亚组(GhLPL2D)中，其全长cDNA ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
由GhLPL2基因编码的蛋白，如(1)所述的基因GhLPL2A，该基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；如(2)所述的基因GhLPL2D，该基因编码的蛋白具有如SEQID NO.4所示的氨基酸序列。
含有上述GhLPL2基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
研究发现，将所述的GhLPL2基因过量表达到模式植物拟南芥及棉花中能显著提高植株的抗病性，且不影响植株正常生长发育。以所述的GhLPL2基因为靶基因，获得抗病性显著提高的棉花材料，并通过与生产上主推品种进行杂交及回交转育，将目标基因/位点导入现有的推广品种中，对推广品种进行抗病性改良。
本发明的优点表现在：
(1)首次鉴定了棉花中的溶血磷脂酶基因GhLPL2与黄萎病菌毒蛋白VdNLP1互作提高棉花黄萎病抗病性的分子机制。
到目前为止，还没有关于植物抵御胞质毒素VdNLP1的相关研究报道。我们以VdNLP1为诱饵蛋白，利用构建的受黄萎病菌VD8诱导陆地棉品种军棉1号根部酵母表达文库，筛选到棉花中的GhLPL2与VdNLP1互作。GhLPL2与VdNLP1在棉花与黄萎病菌的互作过程中均显著上调表达，二者共表达在烟草或棉花的叶片中发现GhLPL2显著抑制VdNLP1表达，并阻止叶片细胞的坏死。过量表达GhLPL2的转基因棉花材料其黄萎病抗性显著提高，同时植株的生长发育未受到影响。这是首次在植物中报道抑制VdNLP1表达的抗病基因，为通过分子设计育种或基因工程改良棉花抗病性提供理论指导和遗传资源。
(2)首次对棉花中的LPL2基因进行系统的序列结构、表达模式及功能分析，明确GhLPL2在棉花生长发育及抗病性中的重要作用。
溶血磷脂酶在动物基因功能研究中被广泛报道参与各种疾病抗性，然而在植物中未见报道。我们通过系统的分子生物学实验证实了棉花中GhLPL2表达水平的下降抑制了植株的生长发育，体内磷脂信号分子、糖代谢进程及活性氧的积累均受到显著影响；这种生长发育的缺陷同样不利于病原菌的定殖及生存。在棉花和拟南芥中过量表达GhLPL2基因对植株没有影响，但在黄萎病菌侵染后，其抗病相关的免疫通路被增强，广泛涉及受体的识别、激素信号转导、活性氧的积累及抗病基因表达。研究结果揭示了棉花中GhLPL2调控植物生长发育及黄萎病抗性的分子机制，也为进一步探究植物如何精准平衡生长-免疫的研究方向提供了新思路与参考。
附图说明
图1黄萎病菌中坏死和乙烯诱导蛋白VdNLP1的特征分析
(A)NLP1在黄萎病菌和其它5种植物病原菌中的氨基酸序列比对。(B)VdNLP1蛋白引起烟草、棉花和拟南芥叶片坏死表型的鉴定。(C)棉花根部诱导后黄萎病菌中VdNLP1的表达水平变化。(D)VdNLP1在细胞膜及质外体的亚细胞定位观察。
图2 VdNLP1与棉花溶血磷脂酶GhLPL2互作分析
(A)通过酵母双杂交实验(Y2H)验证VdNLP1与GhLPL2的互作。转化的酵母菌株在选择性培养基SD/-Ade/-Trp/-His/-Ura/-X-α-gal上生长，互作蛋白生长并呈蓝色。BD-53/AD-RecT和BD-Lam/AD-RecT转化菌株作为阳性和阴性对照。(B)通过双荧光素酶互补实验(LCI)验证VdNLP1与GhLPL2互作。(C)通过双分子荧光互补实验(BiFC)验证VdNLP1与GhLPL2互作。VdNLP1融合到YFP的n端，GhLPL2融合到YFP的c端。(D)通过蛋白质体外互作实验(Pulldown)验证VdNLP1与GhLPL2互作。将VdNLP1-GST和GhLPL2-His融合蛋白在大肠杆菌中表达并纯化，以谷胱甘肽亲和树脂结合VdNLP1-GST或GST蛋白，并与GhLPL2-His蛋白共同孵育。用单克隆抗体Anti-His及Anti-GST对洗脱蛋白进行免疫印迹分析。
图3 GhLPL2在植物体内抑制VdNLP1的毒力作用分析
(A,B)35S:GhLPL2-GFP和35S:VdNLP1-GFP在烟草和棉花叶片中共同表达能显著减轻叶片的坏死表型。(C)利用DAB对棉花叶片进行染色观察H2O2的积累。(D,E)利用Anti-GFP抗体检测烟草和棉花叶片总蛋白中VdNLP1-GFP和GhLPL2-GFP的表达。考马斯亮蓝(CBB)染色检测总蛋白并进行定量。上箭头表示GhLPL2-GFP蛋白，下箭头表示VdNLP1-GFP蛋白。数字表示蛋白质相对含量。
图4 GhLPL2在棉花中的特征分析
(A)LPL2基因在陆地棉和海岛棉中A/D亚基因组的氨基酸序列比对分析。黑色框表示脂肪酶、磷脂酶、溶血磷脂酶或丝氨酸蛋白酶基序，灰色框表示脂质结合基序。Gh代表陆地棉G.hirsutum，Gb代表海岛棉G.barbadense。(B)LPL2的染色体位置分析。(C)LPL2在棉花不同组织和器官中的表达模式分析。(D)LPL2在黄萎病菌诱导棉花根部的转录组测序数据中的表达变化趋势。表达数据为相对于0小时的FPKM值差异倍数。(E-F)通过定量PCR(qPCR)分析LPL2在黄萎病菌诱导下不同时间的表达变化。
图5 GhLPL2定位在过氧化物酶体及其相连的质膜
(A)GhLPL2-GFP融合蛋白在烟草细胞中的定位观察。(B)GhLPL2-GFP融合蛋白与过氧化物酶体标记的PTS1-RFP红色荧光蛋白共定位分析。(C)GhLPL2-GFP融合蛋白与质膜标记AtPIP2A-RFP红色荧光蛋白共定位分析。(D)烟草叶片质壁分离后，GhLPL2-GFP融合蛋白与质膜标记AtPIP2A-RFP红色荧光蛋白共定位分析。白色箭头表示质外体空间。
图6 GhLPL2基因编辑转基因棉花材料的创制
(A)选择两个sgRNA位点，通过CRISPR/Cas9系统对GhLPL2基因进行编辑。(B)通过PCR检测GhLPL2-sgRNA1和GhLPL2-sgRNA2靶位点。(C)通过对T0代转基因棉花植株基因编辑区域的片段进行克隆，对GhLPL2-sgRNA1和GhLPL2-sgRNA2靶点进行检测及分析。核苷酸的缺失和插入如图所示。(D)GhLPL2基因被编辑后导致植株矮化表型，严重影响棉花的生长发育。sgRNA-1 35,sgRNA-2 150,422,21是不同的GhLPL2基因编辑株系。植株生长两个月后的表型图。
图7 GhLPL2基因沉默后的表型分析
(A)烟草脆裂病毒(TRV)介导的基因沉默(VIGS)技术沉默GhCLA1的表型。(B)通过定量PCR(qPCR)验证GhLPL2的沉默效率。(C)GhLPL2沉默后影响植株生长，表型照片为生长至35天的棉花。(D)植株子叶节以上的株高调查。(E)GhLPL2沉默后显著提高棉花对黄萎病的抗性。接种黄萎病20天后拍照。(F)植株在黄萎病菌处理后的病叶率统计。(G)黄萎病菌接种11天后植株茎部的维管组织观察。(H)黄萎病菌接种11天后植株茎部及叶片，在土豆培养基中培养3天后的病菌复苏实验。(I)黄萎病菌接种6、11、15天后，根、茎、叶中的真菌生物量检测分析。
图8 GbLPL2基因沉默后的表型分析
(A)VIGS沉默海岛棉Hai7124中GbCLA1的叶片白化表型。(B)qPCR验证GbLPL2在沉默植株叶片中的沉默效率。(C)植株接种黄萎病菌25天后的发病表型。(D)植株在同一环境中生长至30天后的矮化表型。(E)GbLPL2基因沉默植株与对照植株的病叶率曲线。(F)GbLPL2沉默植株与对照植株生长至30天后，子叶节以上的高度调查。
图9 GhLPL2基因沉默后的转录组测序、切片观察及糖含量检测
(A)在水或黄萎病菌处理11天后，TRV:GhLPL2与TRV:00植株的茎和叶中差异表达基因数目。柱状图中灰色表示上调的差异基因数量，白色表示下调的差异基因数量。(B)在差异表达基因中GhLPL2基因的表达水平。(C)在水处理条件下，TRV:GhLPL2和TRV:00植株茎和叶中DEGs的GO富集分析。(D)TRV:GhLPL2和TRV:00植物茎和叶中，与糖代谢和细胞壁相关的差异表达基因的热图。不同灰度的梯度条数值为每个基因FPKM的标准化值。(E)选取水处理后转录组测序结果差异倍数2倍以上的25个基因进行定量PCR验证，绘制散点图并计算R2值检验拟合度，横坐标为转录组测序结果中TRV:GhLPL2/TRV:00FPKM值的差异倍数，结果取log2；纵坐标为定量PCR结果2-△Ct，结果取log2。(F)取两周龄植株茎部样品制作超薄切片，并用甲苯胺蓝对细胞结构进行染色，观察横截面。箭头表示木质部细胞。(G)利用UPLC/MS法检测TRV:GhLPL2和TRV:00植株茎和叶中葡萄糖、果糖和蔗糖的相对含量，蒽酮-硫酸比色法检测可溶性糖和淀粉的相对含量。
图10 GhLPL2基因沉默后的脂质组学测序分析
(A)正模式和负模式(ESI+和ESI-)下样本的PCA分析。每一个数据点代表一个处理组或对照组样本。每个处理组和对照组均由5个独立的生物学重复组成。(B)通过OPLS-DA对样本模型的验证。(C)针对检测到的全部701种不同脂质进行分类。(D)在不同处理的样本中LPI(8:0)含量的柱状图。纵坐标表示原始的峰面积值。
图11 GhLPL2基因过量表达对植株生长发育的观察
(A-B)PCR检测GhLPL2转基因拟南芥和棉花植株的基因组DNA，拟南芥AtUbq5(At3g62250)和棉花EF1α(XM_041112012.1)检测DNA质量。(C-D)qPCR检测转基因株系中GhLPL2的转录水平。以拟南芥AtUbq5和棉花组蛋白3(AF024716)为内参基因。(E)四周龄拟南芥植株的生长发育表型。(F)棉花植株的生长发育表型。(G)拟南芥植株莲座叶以上茎部的高度调查。(H)棉花植株子叶节以上高度的调查。N.S.表示无差异。
图12 GhLPL2过量表达转基因植株黄萎病抗性鉴定
(A)黄萎病菌接种3周后，转基因拟南芥植株的表型。(B)黄萎病菌接种20天后，转基因棉花植株的表型。(C)转基因拟南芥和WT植株的病级统计和疾病指数的计算。(D)转基因棉花和野生型W0植株的病叶率调查。
图13 GhLPL2过量表达植株和对照植株的可溶性糖含量检测
分别在黄萎病菌或水处理3天和11天后，采集根和茎组织的样本。通过蒽酮-硫酸比色法检测组织中可溶性糖的相对含量。
图14 GhLPL2过量表达植株应对VdNLP1毒力的检测
(A)GhLPL2过表达植株及对照植株叶片表达VdNLP1-GFP蛋白引起坏死的表型。(B)利用Anti-lysoPL2和Anti-GFP抗体检测GhLPL2过表达植株及对照植株叶片中GhLPL2和VdNLP1-GFP的蛋白水平。数字表示蛋白质相对含量。
图15 GhLPL2过量表达植株根部转录组测序分析
(A)水或黄萎病菌处理3天后，取植株根部进行转录组测序，拟南芥中4个和棉花中的6个RNA-seq样本的聚类分析，每个样本具有三个生物学重复。(B)qPCR检测GhLPL2转基因拟南芥AOE7和对照WT植株中GhLPL2的表达水平。(C)qPCR检测GhLPL2转基因棉花OE24、OE302和对照W0植株中GhLPL2的表达水平。(D)GhLPL2过量表达植株与对照植株根部在水处理或黄萎病菌处理后的差异基因数目分析。(E)由黄萎病菌侵染引起的GhLPL2过量表达拟南芥与WT植株间的934个差异基因，及GhLPL2过量表达棉花与W0植株间的2356和1332个基因的GO富集分析。(F)热图显示为由黄萎病菌侵染引起的差异基因，广泛涉及植物免疫相关通路。(G)qPCR检测GhLPL2过量表达和对照植株中重要免疫相关基因的表达水平。包括抗病相关的受体激酶GhWAK2和GhCRK25，病程相关蛋白基因GhPR4和GhPR5，激素相关转录因子GhERF1和GhWRKY72。
图16棉花中GhLPL2抵抗VdNLP1并激活植物免疫过程的模型
在正常生长条件下，GhLPL2维持细胞膜磷脂LPI的水平以及糖代谢正常，以保障植物正常生长。在黄萎病菌的攻击下，植物体内部分GhLPL2被用于对抗入侵到膜上的VdNLP1，导致LPI水平异常，糖代谢紊乱。此外，GhLPL2结合VdNLP1可能激活下游的免疫过程。然而，这两种反应均不足以抵御黄萎病菌。GhLPL2过表达为植株提供了足够的蛋白含量，用于对抗VdNLP1，同时维持体内LPI的水平，在维持植株正常生长发育的前提下，赋予植株更强的抗病性。
具体实施方式
以下通过实施例形式展示具体的实施方式，对本发明内容进行进一步的详细说明，但不应当将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡是基于本发明上述内容在本领域内所能实现的技术均应属于本发明的内容。
(一)黄萎病菌中VdNLP1的毒力分析、诱导表达模式分析以及定位分析
基于GenBank中提供的VdNLP1基因mRNA序列(AY524789.1)为参考(Wang et al.,2004)，在棉花黄萎病强致病力菌株Vd8中克隆了VdNLP1基因。结合被报道的几个具有重要毒力作用的NLP1基因序列进行分析，包括灰霉菌(Botrytis cinerea)中BcNLP1，核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)中ScNLP1，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)中FoNLP1，霉菌(Pythium aphanidermatum)中NLP1pya，疫霉菌(Phytophthora parasitica)中NLP1Pp，VdNLP1与几个具有毒性的NLP1都包含两个保守的半胱氨酸残基Cys，形成稳定的二硫键，以及保守的GHRHDWE七肽基序(图1A)。
为了明确VdNLP1蛋白的毒力作用，将其构建到35S启动子驱动的pBinGFP4瞬时表达载体，通过农杆菌介导的方法在烟草、棉花和拟南芥叶片中瞬时表达，均引起明显的局部坏死表型。在烟草叶片注射位置附近可以清晰看到细胞质的溶解；在海岛棉Hai7124或陆地棉军棉1号不同棉种的子叶中均表现出坏死；在拟南芥叶片坏死位置伴随活性氧的大量积累(图1B)。利用陆地棉遗传标准系TM-1的根部处理黄萎病菌Vd8的孢子悬浮液，分析VdNLP1的诱导表达模式。处理24小时后VdNLP1的表达水平上调，36小时后提高至数十倍以上(图1C)。结果表明VdNLP1在黄萎病菌与棉花互作过程中发挥重要毒力作用。
在农杆菌注射烟草叶片2天后观察VdNLP1的亚细胞定位情况，共聚焦显微镜下观察绿色荧光信号定位于细胞膜，当烟草叶片细胞经0.8M甘露醇处理3小时后，细胞质壁分离，VdNLP1部分定位于细胞膜外侧的质外体空间(图1D)。说明VdNLP1在细胞膜位置导致细胞破坏，其能够分泌至膜外侧发挥功能。研究所用引物列于表1
表1：扩增所用引物
引物名称 引物序列(5'-3') 用途
S6260F ACAGCCATCTGCACCTGC VdNLP1 cDNA克隆
S6260R GAATCCAGGACTGGCGAG VdNLP1 cDNA克隆
J485F ATTTACGAACGATAGGGTACCATGCTTCCCTCCGCAGTCTT pBinGFP4-VdNLP1载体构建
J485R GCCCTTGCTCACCATGGATCCAAACGCGGCGCGCATGTT pBinGFP4-VdNLP1载体构建
S4467F CAACAACAACAACCTCCA VdNLP1定量PCR
S4467R CAGTCCCAGATCCAGTAG VdNLP1定量PCR
W1596F TTCCTTCACTGGTACACT 黄萎病菌定量PCR内标
W1596R CTCCTCCTCCTCCTCATC 黄萎病菌定量PCR内标
(二)棉花溶血磷脂酶GhLPL2与VdNLP1互作并抑制其毒力作用
我们以克隆的VdNLP1基因全长序列构建酵母双杂交(Y2H)系统的诱饵载体，针对黄萎病菌诱导棉花根部的酵母表达文库进行互作蛋白筛选，鉴定到棉花中的一个溶血磷脂酶GhLPL2与VdNLP1存在互作关系，并进一步通过基因全长的酵母双杂交系统、双荧光素酶互补(LCI)、双分子荧光互补(BiFC)及蛋白质体外互作(Pull down)实验对两个蛋白进行互作验证，明确它们无论在体内或体外均互作，作用的位置在细胞膜及膜周围点状聚集(图2)。VdNLP1作用于双子叶植物的细胞膜导致细胞溶解，GhLPL2在膜附近结合VdNLP1，其可能是植物应对黄萎病菌毒力的关键蛋白。
为了探究VdNLP1与GhLPL2的作用机理，在烟草叶片和棉花子叶中共表达VdNLP1-GFP和GhLPL2-GFP蛋白。与单独表达VdNLP1-GFP蛋白的叶片相比，共表达蛋白的叶片细胞坏死表型明显受到抑制(图3A-B)。DAB染色结果也显示当两个蛋白共同表达时叶片活性氧积累减少(图3C)。此外，我们分别提取烟草和棉花叶片每个注射位置的总蛋白，通过GFP标签的抗体进行免疫印迹杂交，以检测蛋白表达的水平，不同的蛋白在注射区域均能够正常表达。当VdNLP1-GFP和GhLPL2-GFP共注射时，GhLPL2-GFP表达的蛋白水平几乎没有变化，但VdNLP1-GFP的表达水平显著降低(图3D-E)。结果说明GhLPL2-GFP可能抑制VdNLP1-GFP的表达或降解VdNLP1-GFP蛋白，从而在细胞膜位置保护膜系统。研究所用引物列于表2
表2：扩增所用引物
Figure BDA0004035272700000121
(三)GhLPL2定位在过氧化物酶体及相连的质膜
我们分别在海岛棉Hai7124和陆地棉TM-1中克隆了GhLPL2基因完整的编码框，除了D亚组存在一个氨基酸的差异外，其序列完全一致，保守的Hydrolase_4结构域无差异(图4A)。染色体位置分析发现GhLPL2位于海岛棉和陆地棉A02/D03的相同位置(图4B)。基于测序并释放的Hai7124和TM-1组织器官表达转录组数据，明确LPL2在棉花各组织中均有较高的表达，海岛棉和陆地棉中表达趋势基本一致(图4C)。结合本实验室前期利用黄萎病菌诱导棉花根部的转录组测序结果以及qRT-PCR验证，证明LPL2受病原菌诱导后显著上调表达，尤其在前期6和12小时(图4D-F)。结果显示LPL2在棉花中具有保守性，并且在棉花抗病响应过程中扮演着重要角色。
蛋白质的定位通常与其功能有关。初步通过Softberry网站进行亚细胞定位预测，结果显示GhLPL2可能定位在过氧化物酶体及与之相关的分泌途径。为了明确GhLPL2在细胞内的定位，我们构建了35S启动子启动的GhLPL2-GFP载体，并通过农杆菌转化烟草叶片观察绿色荧光在细胞内的位置。在农杆菌侵染3天后，共聚焦显微镜下明显观察到细胞质中的点状定位以及在细胞膜上的定位(图5A)。GhLPL2-GFP表达的绿色荧光与PST1标记的过氧化物酶体红色荧光共定位(图5B)。当叶片细胞质壁分离后，GhLPL2-GFP表达的绿色荧光仍在细胞膜及细胞质中，无法分泌到质外体空间(图5C-D)。结果表明GhLPL2定位于过氧化物酶体和连接的膜系统中，其可能通过过氧化物酶体的合成及转运过程到细胞膜行使功能，这也再次验证了GhLPL2在细胞膜与VdNLP1作用并保护膜系统。研究所用引物列于表3
表3：扩增所用引物
Figure BDA0004035272700000131
(四)GhLPL2表达水平的下降严重影响棉花生长，但提高植株抗病性
如上所述，GhLPL2在棉花抗黄萎病过程中可能具有重要作用。我们构建了两个带有不同sgRNA位点的CRISPR-Cas9载体(GhLPL2 sgRNA-1和sgRNA-2)(图6A)，并创制了稳定的GhLPL2基因编辑棉花材料。针对两个不同的sgRNA编辑位点我们分别获得3个稳定的转基因克隆株系，通过DNA检测明确CRISPR-Cas9载体骨架整合至棉花受体W0的基因组中(图6B)，并克隆编辑位点区域附近的序列，明确不同克隆系碱基缺失或增加的类型(图6C)。然而基因编辑的植株无法完成正常生长发育过程，植株生长矮小，不能结铃产生后代(图6D)。
因此，我们利用VIGS技术在陆地棉材料军棉1号中沉默GhLPL2基因并对其功能进行分析。选择基因CDS区特异的区段构建TRV:GhLPL2载体以沉默内源基因，TRV:00作为对照。为了验证VIGS体系在棉花中的可行性，以编码1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶的CLA1基因作为参考，其沉默后植株的叶片和茎杆均表现为白化的表型(Gao et al.,2013)。将载体通过农杆菌介导的方法注射到约七天大小的棉花幼苗子叶中，未注射的幼苗作为对照。两周后注射了TRV:CLA1载体的棉花叶片表现出高度均匀一致的白化表型(图7A)。为了进一步确定基因的沉默效率，对各个沉默株系以及对照株系分别提取RNA，通过实时荧光定量PCR(qPCR)方法验证基因的表达水平。与未注射的对照军棉1号以及注射TRV:00空载体的植株相比沉默株系中GhLPL2的表达水平显著降低(P<0.01)(图7B)。
确定靶基因沉默后，在正常温室培养条件下，监测并调查了植株的生长发育状况，GhLPL2沉默植株表现出明显的生长迟缓，高度降低(图7C)。在生长至35天时TRV:00植株子叶节以上高度约13cm，而TRV:GhLPL2植株只有7cm左右。在植株生长至14天两叶一心期进行抗病性鉴定(图7D)。使用培养的黄萎病菌菌株Vd8，25mL 1×107的孢子悬浮液，以撕底伤根的方式进行接病。每个材料种植30株以上，设置3个重复。接病后三天内不浇水，后每两天补水50mL。保证室内的温度和湿度一致。在接菌后11天开始调查植株的发病情况，发现TRV:GhLPL2植株的发病率显著降低(图7E)，接种25天后，TRV:GhLPL2植株发病率约50％，而TRV:00植株发病率已经达到90％左右(图7F)。在海岛棉Hai7124中沉默GbLPL2基因后得到了相同的结果(图8)。黄萎病菌侵染后会堵塞植物维管组织，使其呈现棕黑色(Fradin andThomma,2006)。在病原菌侵染初期，接病后11天对不同材料茎部维管组织真菌侵入情况进行劈杆及显微镜观察，在子叶节下方2cm位置由于微菌核和黑色素的积累，TRV:00和军棉1号植株维管组织黑化，而TRV:GhLPL2沉默植株几乎没有观察到真菌定殖(图7G)。同时取茎部及叶片同一位置进行病菌恢复实验，培养3天后，TRV:00和军棉1号植株组织在培养基中产生大量菌丝，而TRV:GhLPL2沉默植株没有菌丝产生(图7H)。在黄萎病菌接菌后的6、11和15天，对侵入根、茎和叶组织中的真菌生物量进行检测，将各组织研磨至粉末并提取基因组DNA，利用基于核糖体内部的DNA转录间隔区的特异引物ITS-F以及黄萎病菌特异的反向引物ST-Ve1-R测量真菌的含量，以棉花内标基因作为对照。真菌首先从根部侵染，在约11天左右才开始在茎部及叶片中大量定殖；TRV:GhLPL2沉默植株各组织中真菌相对含量显著降低，尤其在茎和叶中几乎检测不到(图7I)。
这些结果表明，GhLPL2是棉花生长发育的一个关键基因，其表达水平下降严重影响植株生长发育，同时也赋予了植株更强的抗病性，深入解析其功能机制对于棉花抗病育种研究工作具有重要意义。研究所用引物列于表4
表4：扩增所用引物
Figure BDA0004035272700000141
Figure BDA0004035272700000151
(五)GhLPL2基因表达水平的降低影响植株糖代谢及磷脂代谢过程
为了探究GhLPL2基因沉默影响植株生长发育及抗病性的潜在分子机制，我们分别用黄萎病菌和水处理的沉默和对照植株幼苗，在接菌11天后，取子叶节以上1cm位置的茎段以及第一真叶进行转录组测序分析。比较水处理及病处理的TRV:GhLPL2和TRV:00植株茎和叶中差异表达基因，TRV:GhLPL2植株在接病后富集的差异基因数目很少，茎和叶中仅有167和186个，而对照TRV:00植株中富集到1703和909个，其中大量基因上调表达。说明GhLPL2沉默植株受黄萎病菌的影响较小，而对照植株需要表达大量的基因以应对病原菌的侵染，这也再次验证了GhLPL2沉默植株有更高的抗病性。进一步比较分析水处理后两材料间的差异基因，分别在茎和叶中富集到681和710个显著差异的基因，数目较为相似，在TRV:GhLPL2植株中大量差异基因表达下调，在茎中占到72％，叶片中占65％(图9A)。在富集到的差异基因中，GhLPL2在水或病处理植株的茎和叶组织中表达水平降低了约5倍和10倍(图9B)，验证了VIGS实验的准确性。GO富集分析显示，GhLPL2的沉默显著影响植物多糖代谢、细胞壁及能量代谢相关的通路(图9C)。在681个和710个差异基因中存在大量与糖代谢及细胞壁相关的基因，其表达水平受到明显影响(图9D)。为了验证转录本的准确性，对转录组测序结果进行qRT-PCR验证，选取水处理后转录组测序结果差异倍数2倍以上的25个基因进行验证，分别对水处理与病处理的结果进行统计学分析，绘制标准曲线，计算R2值检验拟合度(图9E)。
木质部是黄萎病菌入侵及定殖的主要场所，我们在植株两叶一心期，取子叶节以上1cm左右的位置进行横切面的观察，利用甲苯胺蓝染液对细胞结构进行染色，发现木质部细胞的细胞壁明显增厚(图9F)。细胞壁由纤维素、半纤维素和果胶等多糖组成，糖代谢的变化将影响细胞壁结构。通过UPLC-MS超高效液相色谱-质谱联用技术检测内源的蔗糖、葡萄糖和果糖含量，同时利用蒽酮比色法检测可溶性多糖及总淀粉的含量，明确了当GhLPL2基因表达水平下降导致植株的糖含量明显降低。我们还观察到当黄萎病菌感染后的茎和叶片糖含量同样显著降低(图9G)。糖不仅是植物生长发育的主要能量来源，同时也是病原菌定殖及繁殖所需的主要碳源。因此，我们推测沉默GhLPL2基因影响糖代谢，并最终导致糖含量下降及细胞壁加厚，这种“饥饿效应”和细胞壁防御机制可能是棉花暂时抑制生长发育并抵御黄萎病菌定殖的一种策略。
溶血磷脂酶在磷脂代谢过程中发挥重要作用(Miao et al.,2019)。GhLPL2编码一个溶血磷脂酶，为了探究其表达水平下降后对植株脂质组成及分布的影响，我们通过LC-MS方法进行脂质组学的检测分析。样品的处理和采集与转录组测序相同，每个处理的样本具5个生物学重复。首先对所有的样本进行主成分分析(PCA)，在茎部的所有样品中，分别检测到正模式下的4个主成分(R2X＝0.762,Q2＝0.557)和负模式下的2个主成分(R2X＝0.644,Q2＝0.488)；在叶片中检测到正模式下的4个主成分(R2X＝0.644,Q2＝0.488)和负模式下的4个主成分(R2X＝0.696,Q2＝0.546)(图10A)。在非监督性模型分析中，R2X>0.4说明数据较稳定，拟合良好，能够用于差异脂质的分析。正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)结果显示，各处理组与对照组的数据点能够明显区分，说明各处理间的脂质代谢物数量、浓度和类型都存在显著差异，差异脂质分析结果可靠(图10B)。每个处理组均检测到701种不同的脂质，其中包括425种甘油磷脂，116种甘油酯，110种糖脂以及少数的其它脂质，其中甘油磷脂占61％。溶血磷脂中鉴定到15种LPC，1种LPI，1种LPE和1种LPG(图10C)。经过严格的差异脂质筛选标准(T-test<0.05，Log2(Fold change)>1，归一化的相对脂质含量>10，OPLS-DA检测结果中VIP>1)，在水处理下TRV:GhLPL2和TRV:00植株的茎和叶中分别富集到26和27种显著差异的脂质，其中只有3种脂质在茎和叶中均被显著富集(表5)。在茎和叶的差异脂质中，均富集到棉花中唯一的溶血磷脂酰肌醇LPI(8:0)，其在GhLPL2沉默植株中过量的积累，上调的差异倍数Log2(Fold change)分别达到6.5893和11.5664，远高于其他差异脂质变化的差异倍数。进一步提取脂质组测序数据中LPI(8:0)在各处理样本中的峰面积，5个生物学重复的结果高度一致，无论在水处理或黄萎病菌处理的条件下，LPI(8:0)在TRV:00植株中含量很低，但在TRV:GhLPL2植株中含量显著提高(图10D)。结果表明LPI(8:0)很可能是LPL2的底物。
在磷脂代谢过程中，磷脂酰肌醇(PI)2号碳原子上的C-O共价键能够被磷脂酶A(PLA)水解产生溶血磷脂酰肌醇(LPI)，LPI作为磷脂代谢的中间产物在信号传导过程中发挥重要作用。然而LPI在体内往往是不稳定的，其产生后将被溶血磷脂酶迅速的水解生成为甘油磷酸肌醇衍生物(GPI)(de Kroon et al.，2013)。LPI是一种具有生物活性的脂质，具有影响多种类型的细胞生长、分化和运动等功能。近期的研究表明，LPI作用于不同的生理和病理环境，包括调节代谢及葡萄糖的稳态。本研究中，我们发现棉花中GhLPL2表达水平的下降导致LPI过度积累，引起植株的糖代谢发生改变，并进一步影响植株生长发育和抗病性。
表5：TRV:GhLPL2和TRV:00植株茎和叶片差异脂质富集
Figure BDA0004035272700000171
(六)GhLPL2过量表达提高植株抗病性，且对生长发育无明显影响
由于LPL2基因的编辑或沉默会导致植株严重的生长迟缓，我们探究了LPL2过量表达后对植物生长发育及抗病性的影响。首先构建35S启动子驱动的GhLPL2过量表达载体，将其转化至拟南芥野生型Col-0和棉花受体材料W0中，分别获得了10个和12个稳定遗传的转基因克隆株系。分别提取植株组织DNA并进行鉴定，筛选至T3代纯合株系(图11A-B)。进一步取不同克隆系的根部和茎部提取RNA对GhLPL2基因的转录水平进行检测，明确GhLPL2在植株中过量表达(图11C-D)。针对转基因拟南芥株系选择3个LPL2表达水平不同的克隆系AOE1、AOE7和AOE8，棉花转基因克隆株系OE24、OE302和OE709以及阴性材料OE11进行后续研究。
由于棉花中GhLPL2的沉默影响了植株生长发育，首先对GhLPL2转基因株系的生长状况进行调查，在相同条件下培养的GhLPL2过表达拟南芥和棉花植株与对照植株相比没有明显变化，长势一致(图11E-F)；对每个转基因株系至少使用30株幼苗来计算平均株高，同样无显著性差异(图11G-H)。然后对于拟南芥植株采用蘸根法接种黄萎病菌Vd8，悬浮孢子液浓为107spores/mL，待三周后观察发病情况，并统计发病级数，计算病级指数。我们发现过量表达GhLPL2的转基因拟南芥植株抗病性同样显著提高，尤其AOE7和AOE8两个表达水平更高的克隆株系(图12A)。接病三周后野生型拟南芥WT的病级指数病级指数达到了69.2％，AOE1达到55％，而AOE7和AOE8只有20％和30％(图12B)。同样，采用伤根法接种Vd8后，GhLPL2转基因棉花的三个克隆株系OE24、OE302和OE709在接菌后也表现出较高的黄萎病抗性(图12C-D)。为了检测黄萎病菌的侵入情况，我们在接病10天后，通过劈杆实验观察了病原菌在维管组织的定殖情况，同时对侵入根和茎中的真菌的生物量进行检测，结果都表明GhLPL2过表达转基因棉花植株黄萎病抗性显著提高。对GhLPL2转基因棉花植株根组织的可溶性糖含量进行检测，水处理的条件下，各转基因克隆系与对照根中的可溶性糖含量相同。在黄萎病菌处理3天后，受诱导的可溶性糖含量均增加，而在11天后，由于病原菌的侵染及繁殖，对照植株根中可溶性糖含量显著降低，转基因植株未受到明显影响(图13)。说明GbLPL2过表达后可以更大程度的维持病原菌胁迫下的糖代谢稳定。
综合这些结果，我们有充足的证据证明GhLPL2过量表达后显著提高拟南芥和棉花的抗病性，同时对生长发育无明显影响。抗病性的提高可能主要体现在初期阻止大量病原菌在维管组织的定殖，这为植物抗病研究的方向提供了重要的基因资源。研究所用引物列于表6
表6：扩增所用引物
Figure BDA0004035272700000181
(七)GhLPL2过量表达抑制VdNLP1的毒力并激活免疫反应
为了验证过量表达GhLPL2的转基因棉花株系对VdNLP1的毒力作用影响，我们分别在OE24和OE302转基因棉花植株及对照W0植株的子叶中表达VdNLP1-GFP蛋白，表达空GFP蛋白的子叶作为对照。结果显示OE24和OE302转基因植株子叶对VdNLP1毒力有更强的抗性，注射部位附近的坏死表型明显被削弱(图14A)。对各植株子叶的总蛋白进行提取，首先通过Anti-lysoPL2特异性抗体检测GhLPL2蛋白表达水平，OE24和OE302中GhLPL2含量明显高于W0。以Anti-GFP抗体检测VdNLP1-GFP蛋白的表达水平，免疫印迹杂交实验结果显示，W0子叶中VdNLP1-GFP蛋白含量是OE24和OE302子叶中的3-7倍，而GFP蛋白在三个材料中的表达水平没有明显差异(图14B)。我们的结果说明，GhLPL2在细胞膜结合VdNLP1，并在体内抑制VdNLP1的表达，保护膜系统不被破坏。
进一步我们通过转录组测序解析GhLPL2过量表达提高拟南芥和棉花黄萎病抗性的分子机制。选择抗病性较高的转基因拟南芥克隆系AOE7，转基因棉花系OE24和OE302，以及对照植株W0和WT，分别在水和黄萎病菌处理3天后取根组织进行RNA-seq测序分析。针对各样本中所有基因的FPKM值进行聚类分析，每个处理的转基因系三个生物学重复聚在一起，说明样本的重复性好，分析的结果可信度较高(图15A)。通过qRT-PCR验证GhLPL2在拟南芥中的转录水平变化(图15B)，并从棉花转录组数据中提取GhLPL2的FPKM值，再次证实GhLPL2在转基因植株的根中具有更高的表达水平(图15C)。然而，与水处理相比，黄萎病菌处理后的转基因植物根中GhLPL2的表达量显著增加，说明其响应黄萎病菌侵染并参与植物的防御反应。
通过严格的筛选阈值对差异基因进行富集，在水处理条件下，GhLPL2转基因拟南芥和棉花株系与对照相比，只富集到了较少的差异基因，包括AOE7中358个，OE24和OE302中382进而529个。然而，在黄萎病菌处理后，转基因植株与对照植株间产生了大量的差异表达基因，AOE7中1063个，OE24和OE302中2588进而1462个。OE24和OE302无论水或黄萎病菌处理下差异基因都很少(图15D)。这说明GhLPL2过量表达后对植株分子环境造成的影响很小，在黄萎病菌感染后其响应黄萎病菌并发挥功能。
我们进一步针对GhLPL2过量表达植株中由黄萎病菌感染所引起的差异基因展开分析，分别为AOE7中的934个，OE24和OE302中的2356和1332个，其中在OE24和OE302中大部分差异基因重叠。对拟南芥和棉花中的这些差异基因进行GO分析，结果显示免疫、细胞壁和糖代谢相关的生物学过程显著被富集，如拟南芥中的“免疫应答”、“细胞壁多糖代谢”、“木聚糖代谢”等，棉花中“胁迫应答”、“细胞壁生物发生”、“多糖代谢”等(图15E)。无论在GhLPL2过量表达的拟南芥或棉花中，大量的免疫反应相关基因在病原菌处理下表现出更强烈的诱导趋势，广泛的涉及受体类激酶或受体类蛋白(RLKs和RLPs)、病程相关蛋白基因(PRs)、激素合成和信号转导相关基因、ROS代谢相关基因、抗病基因(Disease resistancegenes)和钙离子调控或结合相关基因(图15F)。这些基因在黄萎病菌诱导后的OE24和OE302植株根中表达趋势相似，例如抗病相关的受体激酶GhWAK2和GhCRK25，PRs基因GhPR4和GhPR5，激素相关转录因子GhERF1和GhWRKY72，相比于对照植株，它们在OE24和OE302的根中受黄萎病菌感染后显著上调表达(图15G)。
综合以上结果，我们的研究结果证明了GhLPL2通过识别病原菌感染，一方面抑制VdNLP1的毒力，同时能激活更强烈的免疫反应提高植株抗病性。在没有胁迫的条件下，GhLPL2保证膜系统中LPI的稳态，维持植物正常的糖代谢过程及生长发育。当受到黄萎病菌的侵染时，部分GhLPL2蛋白在细胞膜被用于抵御VdNLP1的毒力，从而无法维持细胞内正常的LPI水平，导致糖代谢受影响，植株生长受到抑制。此外，GhLPL2与VdNLP1的结合激活全面的免疫反应。但这两种反应不足以抵御黄萎病菌，GhLPL2的过量表达为植株提供了更多的蛋白质来抵御膜上的VdNLP1，同时维持植株正常的代谢水平和生长发育，为棉花提供更强的黄萎病抗病性(图16)。有望通过过量表达GhLPL2转基因棉花材料，通过与目前生产上主推品种进行杂交及回交转育，将目标基因导入现有陆地棉推广品种中完成推广品种抗病性改良，结合纤维品质与产量性状的筛选，创制高抗病性、高产及优质的陆地棉新材料及新品系。研究所用引物列于表7
表7：扩增所用引物
引物名称 引物序列(5'-3') 用途
J520F GAGGCACAGATAACTACAA GhWAK2定量PCR
J520R ATAACTCCATAAGCACAACT GhWAK2定量PCR
J521F TGTGTTGTTAGATGATGATATG GhCRK25定量PCR
J521R CTCTCAGTATTGGCTTCC GhCRK25定量PCR
J524F CGGTGGTCTATGTTGTAG GhPR4定量PCR
J524R CTTGATATAAGATTGGTTAGCC GhPR4定量PCR
J526F GATTCATACAGTTATCCTCAAG GhPR5定量PCR
J526R ACTTCCGACCATCTCTAT GhPR5定量PCR
J528F TTGAAGAAGAGGCATTACT GhERF1定量PCR
J528R GTTGTTGTTGTTGTTGTTG GhERF1定量PCR
J531F GATTCTTGTGCTGATGATG GhWRKY72定量PCR
J531R GAGATACCTTGTTGTTGTTG GhWRKY72定量PCR
序列表
SEQ ID NO.1(GhLPL2在陆地棉军棉1号中的基因组A亚组中cDNA ORF序列)
ATGGCAGGCGAAGCAGCTGCGGCGGCGAATTTCTGGGGTGATATGCCGGAGGAAGACTATTACAGGTCGCAGGGTGTACGCAACACCAAGTCTTACTTCGACACTCCCAACGGAAAGCTCTTCACCCAGAGCTTCTTACCCTTGGATAAAAAAGTGAAGGCCTCCGTCTACATGACCCACGGCTATGGATCCGACACTGGTTGGCTCTTCCAGAAGATCTGCATCAACTTTTCCAATTGGGGTTATGCTGTTTTCGCCGCTGATCTTCTCGGCCATGGCAGATCCGAGGGTCTCCGCTGCTACTTAGGTGACATGGAGAAAGTTGCTGCAACATCCTTATCATTCTTCAAGCACGTCCGGAACAGCGATGAATACAAAAACTTACCCGCATTCCTGTTTGGTGAATCCATGGGAGGAGCAGCAACAATGCTCATGTACTTTCAATCCGACCCTGAAACTTGGACCGGTCTAATTTTCTCGGCGCCGCTCTTTGTGATGCCTGAGAACATGAAGCCGAGTAAGGTGCGGTTGTTCGTGTACGGTCTGCTCTTCGGATTAGCTGATACATGGGCAACTATGCCGGATAACAAGATGGTTGGGAAAGCAATCAAAGACCCAGAAAAGCTTAAGATCATAGCATCAAATCCAAGAAGATACACTGGACCACCAAGGGTTGGAACCATGAGGGAGCTGGCTAGGGTTTGTCAGTACATTCAAGACAATTTCTCAAAGGTAAGGGCACCATTTTTGACAGTTCATGGGACAAGTGATGGTGTCACTTGCCCAACATCATCTAAATTGTTGTATGAGAAGGCATCAAGTGTGGACAAAACCTTGAAACTGTATGATGGGATGTATCATTCCTTGGTTCAAGGGGAGCCTGATGAGAATGCTGATCTTGTTTTGAAGGATATGAGAGAGTGGATTGATGAAAGGGTTGAGAGGTATGGGTCTAAATAA
SEQ ID NO.2(GhLPL2在陆地棉军棉1号中的基因组D亚组中cDNA ORF序列)
ATGGCAGGCGAAGCAGCAGCGGCGGCGAATTTCTGGGGTGATACGCCGGAGGAAGACTATTACAGGTCGCAGGGTGTACGCAACACCAAGTCTTACTTCGACACTCCCAACGGAACGCTCTTCACCCAGAGCTTCTTACCCTTGGATAAAAAAGTGAAGGCCTCCGTCTACATGACCCACGGCTATGGATCCGACACTGGTTGGCTCTTCCAGAAGATCTGCATCAACTTTTCCAATTGGGGTTACGCTGTTTTCGCCGCTGATCTTCTCGGCCATGGCAGATCCGAGGGTCTCCGCTGCTACTTAGGTGACATGGAGAAAGTTGCTGCAACATCCTTATCATTCTTCAAGCACGTCCGGAACAGCGATGAATACAAAGACTTACCTGCATTCCTGTTTGGTGAATCCATGGGAGGAGCAGCAACAATGCTCATGTACTTTCAATCCGACCCTGAAACTTGGACTGGTCTAATTTTCTCGGCGCCGCTCTTTGTGATGCCTGAGAACATGAAGCCGAGTAAGGTGCGGTTGTTCATGTATGGTCTGCTCTTCGGATTAGCTGATACATGGGCAACTATGCCGGATAACAAGATGGTTGGAAAAGCAATCAAAGACCCAGAAAAGCTTAAGATCATAGCATCAAACCCAAGAAGATACACTGGACCACCAAGGGTTGGAACCATGAGGGAGCTGGCTAGGGTTTGTCAGTACATTCAAGACAATTTCTCAAAGGTAAGGGCACCATTTTTGACAGTTCATGGGACTAGTGATGGTGTCACATGCCCAACATCATCTAAATTGTTGTATGAGAAGGCATCAAGTGTGGACAAAACCTTGAAACTGTATGATGGGATGTATCATTCCTTGATTCAAGGGGAGCCTGATGAGAATGCTGATCTTGTTTTGAAGGATATGAGAGAGTGGATTGATGAAAGGGTTGAGAGGTATGGGTCTAAATAA
SEQ ID NO.3(GhLPL2在陆地棉军棉中的基因组A亚组中氨基酸序列)
MAGEAAAAANFWGDMPEEDYYRSQGVRNTKSYFDTPNGKLFTQSFLPLDKKVKASVYMTHGYGSDTGWLFQKICINFSNWGYAVFAADLLGHGRSEGLRCYLGDMEKVAATSLSFFKHVRNSDEYKNLPAFLFGESMGGAATMLMYFQSDPETWTGLIFSAPLFVMPENMKPSKVRLFVYGLLFGLADTWATMPDNKMVGKAIKDPEKLKIIASNPRRYTGPPRVGTMRELARVCQYIQDNFSKVRAPFLTVHGTSDGVTCPTSSKLLYEKASSVDKTLKLYDGMYHSLVQGEPDENADLVLKDMREWIDERVERYGSK
SEQ ID NO.4(GhLPL2在陆地棉军棉1号中的基因组D亚组中氨基酸序列)
MAGEAAAAANFWGDTPEEDYYRSQGVRNTKSYFDTPNGTLFTQSFLPLDKKVKASVYMTHGYGSDTGWLFQKICINFSNWGYAVFAADLLGHGRSEGLRCYLGDMEKVAATSLSFFKHVRNSDEYKDLPAFLFGESMGGAATMLMYFQSDPETWTGLIFSAPLFVMPENMKPSKVRLFMYGLLFGLADTWATMPDNKMVGKAIKDPEKLKIIASNPRRYTGPPRVGTMRELARVCQYIQDNFSKVRAPFLTVHGTSDGVTCPTSSKLLYEKASSVDKTLKLYDGMYHSLIQGEPDENADLVLKDMREWIDERVERYGSK

Claims (9)

1.如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的GhLPL2基因在提高目标植物抗病性或培育抗病性提高的目标植物新种质中的应用。
2.含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的GhLPL2基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在提高目标植物抗病性或培育抗病性提高的目标植物新种质中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：以所述的GhLPL2基因为靶基因，通过基因工程方法，过量表达GhLPL2基因，提高目标植物抗病性或培育抗病性提高的目标植物新种质并在生产上应用。
4.根据权利要求1、2或3所述的应用，其特征在于：所述的抗病性为黄萎病抗病性。
5.根据权利要求1、2或3所述的应用，其特征在于：所述的目标植物为棉花或拟南芥。
6.一种提高棉花抗黄萎病的方法，其特征在于：在棉花中过量表达核苷酸序列如SEQID NO.1或SEQ ID NO.2所示的GhLPL2基因。
7.一个能提高植物抗病性的GhLPL2基因，该基因为(1)～(2)中的任意一种：
(1)该基因在陆地棉军棉1号的基因组A亚组GhLPL2A中，其全长cDNAORF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)该基因在陆地棉军棉1号的基因组D亚组GhLPL2D中，其全长cDNAORF的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
8.由权利要求7所述的GhLPL2基因编码的蛋白，其特征在于，由如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码的蛋白具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；由如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码的蛋白具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
9.含有权利要求7所述GhLPL2基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
CN202310001792.3A 2023-01-03 2023-01-03 GhLPL2基因在提高棉花黄萎病抗病性中的应用 Active CN116042697B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310001792.3A CN116042697B (zh) 2023-01-03 2023-01-03 GhLPL2基因在提高棉花黄萎病抗病性中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310001792.3A CN116042697B (zh) 2023-01-03 2023-01-03 GhLPL2基因在提高棉花黄萎病抗病性中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116042697A true CN116042697A (zh) 2023-05-02
CN116042697B CN116042697B (zh) 2024-02-27

Family

ID=86113024

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310001792.3A Active CN116042697B (zh) 2023-01-03 2023-01-03 GhLPL2基因在提高棉花黄萎病抗病性中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116042697B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998030083A1 (en) * 1997-01-10 1998-07-16 The Regents Of The University Of California Rg nucleic acids for conferring disease resistance to plants
CN109402147A (zh) * 2018-11-02 2019-03-01 南京农业大学 抗棉花黄萎病的基因GbCYP86A1-1及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998030083A1 (en) * 1997-01-10 1998-07-16 The Regents Of The University Of California Rg nucleic acids for conferring disease resistance to plants
CN109402147A (zh) * 2018-11-02 2019-03-01 南京农业大学 抗棉花黄萎病的基因GbCYP86A1-1及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"PREDICTED: Gossypium hirsutum caffeoylshikimate esterase (LOC107949563), transcript variant X2, mRNA", GENBANK, pages 1 - 2 *
"PREDICTED: Gossypium hirsutum caffeoylshikimate esterase (LOC107951875), mRNA，Sequence ID: XM_016887044.2", GENBANK, pages 1 - 2 *
王育川: "OsLPL2 的功能初探及一个拟南芥 topp4-1 恢", 中国优秀硕士学位林文全文数据库, pages 006 - 172 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116042697B (zh) 2024-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hardham et al. Phytophthora cinnamomi
Liu et al. A pectin methylesterase inhibitor enhances resistance to Verticillium wilt
Zhang et al. The Verticillium dahliae SnodProt1-like protein VdCP1 contributes to virulence and triggers the plant immune system
Hwang et al. The pepper mannose-binding lectin gene CaMBL1 is required to regulate cell death and defense responses to microbial pathogens
Loehrer et al. Characterization of nonhost resistance of Arabidopsis to the Asian soybean rust
Savidor et al. The Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis–tomato interactome reveals the perception of pathogen by the host and suggests mechanisms of infection
Bienert et al. A pleiotropic drug resistance transporter in Nicotiana tabacum is involved in defense against the herbivore Manduca sexta
Hu et al. An effector, BxSapB1, induces cell death and contributes to virulence in the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus
Zhang et al. lncRNA7 and lncRNA2 modulate cell wall defense genes to regulate cotton resistance to Verticillium wilt
EP2438172B1 (en) Constructs expressing chimeric receptors and use thereof for the controlled activation of defence response to pathogens in plants
Chen et al. A secreted fungal subtilase interferes with rice immunity via degradation of SUPPRESSOR OF G2 ALLELE OF skp1
Gorzolka et al. Lysophosphatidylcholine 17: 1 from the leaf surface of the wild potato species Solanum bulbocastanum inhibits Phytophthora infestans
Guo et al. Fosp9, a novel secreted protein, is essential for the full virulence of Fusarium oxysporum f. sp. cubense on Banana (Musa spp.)
Hou et al. Small holes, big impact: stomata in plant-pathogen-climate epic trifecta
CN116042697B (zh) GhLPL2基因在提高棉花黄萎病抗病性中的应用
Woo et al. Manipulation of two α‐endo‐β‐1, 4‐glucanase genes, AtCel 6 and GmCel 7, reduces susceptibility to H eterodera glycines in soybean roots
Abraham et al. Microscopic, biochemical, and molecular comparisons of moderately resistant and susceptible Populus genotypes inoculated with Sphaerulina musiva
Wang et al. Cotton peroxisome‐localized lysophospholipase counteracts the toxic effects of Verticillium dahliae NLP1 and confers wilt resistance
Dang et al. Cleavage of PrePL by Lon promotes growth and pathogenesis in Magnaporthe oryzae
Liang et al. PGPBS, a mitogen-activated protein kinase kinase, is required for vegetative differentiation, cell wall integrity, and pathogenicity of the barley leaf stripe fungus Pyrenophora graminea
Zhang et al. Characterization of cmcp Gene as a Pathogenicity Factor of Ceratocystis manginecans
KR101202135B1 (ko) 병저항성 관련 고추 파타틴 유사 포스포라이페이즈 유전자 ＣａＰＬＰ１ 및 이를 이용한 식물병 저항성 탐색 및 형질전환 식물체
Zhang et al. LysM protein BdLM1 of Botryosphaeria dothidea plays an important role in full virulence and inhibits plant immunity by binding chitin and protecting hyphae from hydrolysis
Mu et al. An effector of Erysiphe necator translocates to chloroplasts and plasma membrane to suppress host immunity in grapevine
Tian et al. Transcriptional plasticity of schizotrophic Sclerotinia sclerotiorum responds to symptomatic rapeseed and endophytic wheat hosts

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant