CN116042530A - 一种构建car-t细胞用纳米操纵子及其制备方法和应用 - Google Patents

一种构建car-t细胞用纳米操纵子及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116042530A
CN116042530A CN202310068340.7A CN202310068340A CN116042530A CN 116042530 A CN116042530 A CN 116042530A CN 202310068340 A CN202310068340 A CN 202310068340A CN 116042530 A CN116042530 A CN 116042530A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
car
protein
membrane fusion
constructing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310068340.7A
Other languages
English (en)
Inventor
许从飞
赵贵
王均
张玥
鲁紫东
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China University of Technology SCUT
Original Assignee
South China University of Technology SCUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China University of Technology SCUT filed Critical South China University of Technology SCUT
Priority to CN202310068340.7A priority Critical patent/CN116042530A/zh
Publication of CN116042530A publication Critical patent/CN116042530A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6075—Viral proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本申请公开了一种构建CAR‑T细胞用纳米操纵子及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。本申请构建CAR‑T细胞用纳米操纵子包括纳米囊泡，所述纳米囊泡携载有CAR蛋白和靶向T细胞的膜融合蛋白，该纳米操纵子可以利用膜融合的方式，使所述CAR蛋白通过携载有靶向T细胞的膜融合蛋白的纳米囊泡递送至T细胞，从而能够在体内或体外直接构建出具有杀伤肿瘤活性的CAR‑T细胞，一方面减少肿瘤治疗的等待时间并降低治疗所需的指标要求，另一方面有效减少CAR‑T细胞疗法中产生的副作用，实现对病人负担的减轻。

Description

一种构建CAR-T细胞用纳米操纵子及其制备方法和应用
技术领域
本申请属于生物医药技术领域，尤其涉及一种构建CAR-T细胞用纳米操纵子及其制备方法和应用。
背景技术
嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法是一种免疫细胞疗法，已经在血液肿瘤的治疗中表现出卓越治疗结果，并且能够显著降低患者治疗的成本与时间，被称为细胞疗法的下一代革命。
但是，CAR-T细胞疗法作为一种个性化治疗方案，现有治疗中普遍需要对每个病人进行重复分离T细胞、转导CAR基因、活化扩增以及回输给病人等多个步骤，治疗周期长，并且对医护人员和医疗场所的要求很高，导致治疗费用十分高昂；同时，现有的CAR-T细胞疗法也会导致(如细胞因子释放综合症等)副作用，威胁病人的生命健康安全。
发明内容
本申请的目的在于提供一种构建CAR-T细胞用纳米操纵子及其制备方法和应用，旨在解决现有CAR-T细胞疗法的治疗费用高、周期长以及副作用明显的技术问题。
为了实现上述目的，本申请的技术方案是：
本申请的第一方面提供一种构建CAR-T细胞用纳米操纵子，该构建CAR-T细胞用纳米操纵子包括纳米囊泡，所述纳米囊泡携载有CAR蛋白和靶向T细胞的膜融合蛋白。
在第一方面优选的实现方式中，所述靶向T细胞的膜融合蛋白包括膜融合蛋白和T细胞表面的标志性蛋白分子抗体序列；
所述T细胞表面的标志性蛋白分子抗体序列连接于所述膜融合蛋白的N端。
在第一方面优选的实现方式中，所述膜融合蛋白包括p14TF蛋白，以及麻疹病毒的F蛋白和H蛋白；
其中，所述麻疹病毒的H蛋白引入有Y481A突变和R533A突变。
在第一方面优选的实现方式中，所述麻疹病毒的H蛋白与F蛋白序列通过T2A连接肽连接。
在第一方面优选的实现方式中，所述T细胞表面的标志性蛋白分子为CD3e分子。
在第一方面优选的实现方式中，所述T细胞表面的标志性蛋白分子抗体序列为scFv序列。
在第一方面优选的实现方式中，所述CAR蛋白为αCD19-CAR蛋白。
本申请的第二方面提供第一方面所述构建CAR-T细胞用纳米操纵子的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
S101：分别构建可表达靶向T细胞的膜融合蛋白以及可表达αCD19-CAR质粒；
S102：构建能够同时表达靶向T细胞的膜融合蛋白和αCD19-CAR的工程细胞；
S103：利用步骤S102中构建的工程细胞产生携载靶向T细胞的膜融合蛋白与αCD19-CAR的纳米囊泡，即得所述构建CAR-T细胞用纳米操纵子。
在第二方面优选的实现方式中，所述构建可表达靶向T细胞的膜融合蛋白的方法包括：
从NCBI查找到膜融合蛋白和抗体序列，并对所述膜融合蛋白和抗体序列依次进行突变、连接、添加标签序列、合成以及验证设计蛋白的促膜融合效果。
在第二方面优选的实现方式中，所述构建可表达αCD19-CAR质粒的方法包括：
从NCBI查找2C11抗体轻链和重链序列、CD8a序列、CD28序列和CD3ζ序列后，依次进行连接，添加标签序列以及合成。
在第二方面优选的实现方式中，所述添加标签序列是在αCD19-CAR序列CD8a跨膜序列前添加Myctag序列。
在第二方面优选的实现方式中，所述构建能够同时表达靶向T细胞的膜融合蛋白和αCD19-CAR的工程细胞的方法包括：
构建慢病毒载体质粒，包装并收集慢病毒颗粒、感染细胞，药筛得到抗性细胞。
在第二方面优选的实现方式中，所述纳米囊泡的制备方法包括：
将工程化细胞消化为单细胞悬液并用PBS清洗；
用含有脱氧胆酸钠、PMSF的PBS溶液处理所述单细胞，并持续震荡，室温20min；
4℃的温度下6000g离心10min，收集上清并过0.45μm滤膜；4℃的温度下100000g离心4h；
弃去上清，用PBS重悬，得到纳米囊泡，即为构建CAR-T细胞用纳米操纵子。
在第二方面优选的实现方式中，所述脱氧胆酸钠的浓度为0.04w/v％。
在第二方面优选的实现方式中，所述获得纳米操纵子的平均粒径为104.1-109.4nm。
本申请的第三方面提供第一方面所述构建CAR-T细胞用纳米操纵子在制备治疗肿瘤药剂中的应用。
与现有技术相比，本申请的优点或有益效果至少包括：
本申请第一方面提供的构建CAR-T细胞用纳米操纵子通过所含的纳米囊泡携载CAR蛋白和靶向T细胞的膜融合蛋白，从而可以利用膜融合的方式，使所述CAR蛋白通过携载有靶向T细胞的膜融合蛋白的纳米囊泡递送至T细胞，最终实现体内和体外均能直接构建出具有杀伤肿瘤活性的CAR-T细胞，具体而言：
第一方面，本申请纳米操纵子可以通过静脉注射的方式在体内快速、简便地产生能够杀伤肿瘤活性的CAR-T细胞，不再需要对每个病人进行重复分离T细胞、转导CAR基因、活化扩增以及回输给病人等体外操作，使得治疗周期大幅减少、治疗所需的指标要求明显降低，有利于实现治疗费用的明显降低；
第二方面，本申请纳米操纵子通过纳米囊泡携载并递送CAR蛋白，而不是核酸，因而可以构建出短期存在的CAR-T细胞，能够有效避免CAR-T细胞持续性存在所导致的如细胞因子释放综合症等副作用；
第三方面，本申请纳米操纵子在-80℃的温度下稳定性能高，因而可以长期保存，有利于减少等待时间，可以快速减轻病人负担；同时，本申请可以通过结合免疫检查点抗体疗法，有利于实现纳米操纵子有效抑制B细胞淋巴瘤生长。
基于此，本申请提供的构建CAR-T细胞用纳米操纵子可以用于体内和体外构建CAR-T细胞，不再局限于体外构建CAR-T细胞，从而为CAR-T细胞的快速制备提供了一种新思路，也为CAR-T细胞疗法的推广应用提供了新方法。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的靶向T细胞的膜融合蛋白示意图；
图2为本申请实施例提供的αCD19-CAR蛋白示意图；
图3为本申请实施例提供的靶向T细胞的p14TF膜融合蛋白的RAW264.7细胞系共表达的荧光显微图，其中，图3A为靶向T细胞的p14TF膜融合蛋白的RAW264.7细胞系共表达的荧光蛋白表达情况；图3B为靶向T细胞的p14TF膜融合蛋白的RAW264.7细胞系的明场形态；
图4为本申请实施例提供的靶向T细胞的MVTF膜融合蛋白的RAW264.7细胞系的荧光显微图，其中，图4A为靶向T细胞的MVTF膜融合蛋白的RAW264.7细胞系共表达的荧光蛋白表达情况；图4B为靶向T细胞的MVTF膜融合蛋白的RAW264.7细胞系的明场形态；
图5为本申请实施例提供的瞬转靶向T细胞膜融合蛋白的HEK293T细胞与T细胞膜发生融合的检测结果；
图6为本申请实施例提供的能够稳定表达靶向T细胞的膜融合蛋白的RAW264.7细胞系与T细胞膜发生融合的检测结果；
图7为本申请实施例提供的纳米操纵子的制备流程图；
图8为本申请实施例提供的纳米操纵子的粒径分布图；
图9为本申请实施例提供的纳米操纵子的TEM图；
图10为本申请实施例提供的WB检测纳米操纵子携载靶向T的细胞膜融合蛋白表达的检测结果；
图11为本申请实施例提供的WB检测纳米操纵子携载αCD19-CAR蛋白表达的检测结果；
图12为本申请实施例提供的靶向T细胞的膜融合蛋白促进纳米操纵子与T细胞发生膜融合的检测结果；
图13为本申请实施例制备的纳米操纵子与T细胞的融合效率检测结果；
图14为本申请实施例制备的纳米操纵子在不同保存温度下的稳定性检测结果；
图15为本申请实施例制备的纳米操纵子在体外构建CAR-T细胞的效率检测结果；
图16为本申请实施例制备的纳米操纵子构建的CAR-T细胞的体外杀伤效率检测结果，其中，图16A为纳米操纵子构建的aCD19CAR-T细胞对A20细胞的细胞毒性的检测结果；图16B为纳米操纵子构建的aCD19CAR-T细胞对B16-F10细胞的细胞毒性的检测结果；图16C为纳米操纵子构建的aCD19CAR-T细胞对CT26细胞的细胞毒性的检测结果；
图17为本申请实施例制备的纳米操纵子在体内构建CAR-T细胞效率的检测结果，其中，图17A为血液中检测到CAR-T细胞比例；图17B为脾脏中检测到CAR-T细胞比例；
图18为本申请实施例制备的纳米操纵子用于治疗B细胞淋巴瘤的治疗结果，其中，图18A为治疗实验中不同治疗组的肿瘤生长情况；图18B为治疗实验中不同治疗组的肿瘤生长情况；
图19为本申请实施例提供的通过纳米操纵子治疗B细胞淋巴瘤后体内炎性细胞因子表达的检测结果，其中，图19A为通过纳米操纵子治疗B细胞淋巴瘤后体内白细胞介素1β表达的检测结果；图19B为通过纳米操纵子治疗B细胞淋巴瘤后体内白细胞介素6表达的检测结果；图19C为通过纳米操纵子治疗B细胞淋巴瘤后体内粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子表达的检测结果；
图20为本申请实施例提供的αOX40促进纳米操纵子构建CAR-T细胞的杀伤效率的检测结果；
图21为本申请实施例提供的纳米操纵子联合αOX40用于治疗B细胞淋巴瘤的实验结果，其中，图21A为治疗实验中各组小鼠肿瘤生长情况；图21B图为治疗实验中各组小鼠体重变化情况。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
在本实施例以下描述中，术语“和/或”用于描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，单独存在B和同时存在A和B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
在本实施例以下描述中，术语“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a，b或c中的至少一项(个)”，或，“a，b和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a，b，c，a-b(即a和b)，a-c，b-c，或a-b-c，其中a，b，c分别可以是单个，也可以是多个。
本领域技术人员应当理解，在本申请实施例以下描述中，序号的先后并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的术语“纳米操纵子”包括聚合物纳米颗粒、磁性纳米颗粒、贵金属纳米颗粒、半导体纳米颗粒、复合纳米颗粒、凝胶纳米颗粒(蛋白纳米颗粒和核酸纳米颗粒)和其他用于生物医学领域的纳米颗粒。其中，纳米颗粒可选自天然存在的或者合成的。本申请的纳米操纵子具体是指携带靶向T细胞膜融合蛋白与αCD19-CAR的纳米囊泡。
第一方面，本申请实施例提供一种构建CAR-T细胞用纳米操纵子。本申请实施例的构建CAR-T细胞用纳米操纵子包括纳米囊泡，所述纳米囊泡携载有CAR蛋白和靶向T细胞的膜融合蛋白。
其中，本申请实施例的纳米操纵子通过所含的纳米囊泡携载CAR蛋白和靶向T细胞的膜融合蛋白，从而可以利用膜融合的方式，使CAR蛋白通过携载有靶向T细胞的膜融合蛋白的纳米囊泡递送至T细胞，最终实现体内和体外均能直接构建出能够杀伤肿瘤活性的CAR-T细胞。具体而言：
(1)本申请实施例的纳米操纵子可以通过静脉注射的方式在体内快速、简便地产生能够杀伤肿瘤活性的CAR-T细胞，不再需要对每个病人进行重复分离T细胞、转导CAR基因、活化扩增以及回输给病人等体外操作，使治疗周期大幅减少、治疗所需的指标要求明显降低，从而有利于实现治疗费用的明显降低；
(2)本申请实施例的纳米操纵子通过纳米囊泡携载并递送CAR蛋白，而不是核酸，因而可以构建出短期存在的CAR-T细胞，能够有效避免CAR-T细胞持续性存在所导致的细胞因子释放综合症等副作用；
(3)本申请实施例的纳米操纵子在-80℃的温度下稳定性能高，因而可以长期保存，有利于减少肿瘤治疗的等待时间，可以快速减轻病人负担；同时，本申请可以通过结合免疫检查点抗体疗法，实现纳米操纵子有效抑制B细胞淋巴瘤生长；
(4)本申请实施例的纳米操纵子为胞外囊泡，胞外囊泡是一种细胞来源的膜结构颗粒，具有低免疫原性，生物相容性好的优点。因此，可以在临床试验中用于治疗肿瘤、糖尿病、炎症反应等多种疾病，应用价值极高；并且胞外囊泡可以作为细胞间信号传递的载体，用于携载蛋白、核酸和小分子等，具有循环中稳定等多种优势。
在具体实施例中，所述靶向T细胞的膜融合蛋白通过膜融合蛋白和T细胞表面的标志性蛋白分子抗体序列组成；
其中，所述T细胞表面的标志性蛋白分子抗体序列连接于所述膜融合蛋白N端。
在具体实施例中，所述膜融合蛋白优选包括p14TF蛋白，以及麻疹病毒的F蛋白和H蛋白；
其中，所述麻疹病毒的H蛋白引入有Y481A突变和R533A突变。
需要说明的是，本申请实施例中的p14TF蛋白是将p14FAST蛋白进行改造，形成的靶向T细胞的p14蛋白(p14TF)；同时，本申请实施例中的麻疹病毒的F蛋白和H蛋白是将麻疹病毒的相关融合蛋白(MVTF)进行改造，形成的靶向T细胞的MVTF(包括F蛋白和H蛋白)。其中，所述的蛋白改造通过本领域公知的基因改造技术实施，本申请实施例不作特别的限制。
当然，本申请实施例中的膜融合蛋白还可以是原核细胞的人类免疫缺陷病毒、流感病毒HA的膜融合蛋白，以及真核细胞中的线虫细胞中的EFF-1融合蛋白，Hapless2/Germcell-specific1(HAP2/GCS1)、合胞素-1、Myomaker等融合蛋白，只要是膜融合蛋白即可，本申请实施例不作特别的限制。
在具体实施例中，所述麻疹病毒的H蛋白与F蛋白序列优选通过T2A连接肽连接。
在具体实施例中，所述T细胞表面的标志性蛋白分子优选为CD3e分子。
在具体实施例中，所述T细胞表面的标志性蛋白分子抗体序列优选为scFv序列。
需要说明的是，所述scFv序列既可以是人源、鼠源、兔源等细胞系表面特异性蛋白分子，也可以利用本领域公知的其它膜融合蛋白，只要能用于识别细胞即可。
在具体实施例中，所述CAR蛋白优选为αCD19-CAR蛋白。
需要说明的的是，该αCD19-CAR蛋白由1D3单克隆抗体的轻链和重链可变区αCD19scFv、鼠CD8α铰链区、鼠CD8跨膜区、胞内CD28共刺激信号域和胞内CD3ζ结构串联构成，并且在αCD19-scFv和鼠CD8α铰链区之间加入有Myc tag序列以用于后续检测。其中，所述CAR靶点可以为CD22、CD20、BCMA、CD20、CD138、CD33、CD123等，当然也可以用本领域公知的其他靶点。
第二方面，本申请实施例提供第一方面所述构建CAR-T细胞用纳米操纵子的制备方法，具体包括包括以下步骤：
S101：分别构建可表达靶向T细胞的膜融合蛋白以及可表达αCD19-CAR的质粒；
S102：构建能够同时表达靶向T细胞的膜融合蛋白和αCD19-CAR的工程细胞；
S103：利用步骤S102中构建的工程细胞产生携载靶向T细胞的膜融合蛋白与αCD19-CAR的纳米囊泡，即得所述用于体内构建CAR-T细胞的纳米操纵子。
在具体实施例中，所述构建可表达靶向T细胞的膜融合蛋白的方法优选包括：
从NCBI查找到膜融合蛋白和抗体序列，并对膜融合蛋白和抗体序列依次进行突变、连接、添加标签序列、合成以及验证设计蛋白的促膜融合效果。具体而言：
从NCBI上查找到麻疹病毒的H蛋白和F蛋白，以及p14FAST蛋白的基因序列，并对H蛋白进行Y481A突变和R533A突变(mutHprotein)，致使其失去原有识别CD46和CD150的能力。同时，从NCBI上查找到T细胞表面的标志性蛋白CD3e分子抗体2C11克隆的scFv序列，并将anti-CD3scFv序列通过linker分别连接到p14蛋白与突变的H蛋白序列，以及通过2A连接肽将H蛋白与F蛋白序列连接。最终得到p14TF和MVTF两种靶向T细胞的膜融合蛋白序列。
在具体实施例中，所述构建可表达αCD19-CA质粒的方法包括：
从NCBI查找2C11抗体轻链和重链序列、CD8a序列、CD28序列和CD3ζ序列后，依次进行连接，添加标签序列以及合成。具体而言：
从NCBI上查找到1D3单克隆抗体的轻链和重链、鼠CD8α铰链区、鼠CD8跨膜区、胞内CD28共刺激信号域和胞内CD3ζ结构序列，然后将1D3单克隆抗体轻重链用(GGGGS)3序列连接构成αCD19-scFv，并与其它结构串联构成αCD19-CAR。其中，在αCD19-scFv和鼠CD8α铰链区之间加入有Myctag序列。
在具体实施例中，所述添加标签序列为优选在αCD19-CAR序列CD8a跨膜序列前添加Myctag序列。其中，所述Myctag序列还可以为本领域公知的其他标签序列，只要能用于检测即可，本申请实施例不作特别的限制。
在具体实施例中，所述构建能够同时表达靶向T细胞的膜融合蛋白和αCD19-CAR的工程细胞的方法优选包括：
构建慢病毒载体质粒、包装并收集慢病毒颗粒、感染细胞，药筛得到抗性细胞。具体而言：
构建慢病毒载体质粒，将慢病毒载体质粒、包膜质粒(pMD2.0)和包装质粒(psPAX2)共转染HEK293T细胞，包装得到慢病毒颗粒；然后将收集的慢病毒感染RAW264.7细胞，进一步药筛后得到能够稳定表达靶向T细胞膜融合蛋白和αCD19-CAR的RAW264.7细胞系。当然，也可以用本领域其他公知的构建稳定表达细胞系的方法，只要能构建稳定表达细胞系即可。
需要说明的是，用于包装慢病毒颗粒的细胞还可以为本领域公知的其他细胞，只要能包装慢病毒颗粒即可；所述构建细胞系的被感染细胞可以为本领域公知的常规细胞，只要能被感染分泌囊泡即可；所述药筛筛选具有抗性基因片段的质粒的抗性基因可以为嘌呤霉素，博来霉素等，也可以用本领域药筛其他常规抗性基因的方法，只要能构建稳定表达细胞系即可。
在具体实施例中，所述纳米囊泡的制备方法包括：
将工程化细胞消化为单细胞悬液并用PBS清洗；
用含有脱氧胆酸钠、PMSF的PBS溶液处理所述的单细胞，持续震荡，室温20min；
4℃的温度下6000g离心10min，收集上清并过0.45μm滤膜；4℃的温度下100000g离心4h；
弃去上清，用PBS重悬，得到纳米囊泡，即为构建CAR-T细胞用纳米操纵子。
在具体实施例中，所述脱氧胆酸钠的浓度优选为0.04w/v％。
在具体实施例中，所述纳米囊泡的平均粒径优选为104.1-109.4nm。
第三方面，本申请实施例提供第一方面所述构建CAR-T细胞用纳米操纵子在制备治疗肿瘤药剂中的应用。基于本申请实施例纳米操纵子能够在体内和体外直接构建成可以短期存在并能够杀伤肿瘤活性的CAR-T细胞的特性，本申请实施例的纳米操纵子应用于肿瘤治疗时，不仅能够有效降低肿瘤的治疗费用和治疗周期，而且不会引发细胞因子释放综合症等副作用；另外，基于本申请实施例的纳米操纵子可以长期保存，可以随时用于肿瘤的治疗，大大减轻了患者负担。
以下结合具体实施例对本申请作进一步详细的说明。
实施例中所用原料及其来源包括：
0.25％的胰蛋白酶、细胞培养基、胎牛血清：美国Gibco公司；
青霉素-链霉素混合溶液：美国Introgen公司；
RIPA细胞裂解液：上海碧云天生物技术有限公司；
牛血清白蛋白(BSA)：上海生工生物工程有限公司；
低熔点琼脂糖：广州擎科生物科技有限公司；
Gelred：广州擎科生物科技有限公司；
二甲亚砜(DMSO)：上海沪试实验室器材股份有限公司；
4％多聚甲醛：合肥Biosharp公司；
DAPI：上海生工生物工程股份有限公司；
N,N'-亚甲基双丙烯酰胺：上海生工生物工程有限公司；
Tris：美国Sigma-Aldrich公司；
浓盐酸：上海国药集团化学试剂有限公学司；
过硫酸铵(Ammoniumpersulfate，APS)：美国，Sigma-Aldrich公司；
丙烯酰胺：上海生工生物工程有限公司；
TEMED(N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine)：美国Sigma-Aldrich公司；甘油、溴酚蓝：上海生工生物工程有限公司；
Tween-20：美国Sigma-Aldrich公司；
胰蛋白胨(Tryptone)：上海生工生物工程有限公司；
酵母提取物(Yeastextract)：上海生工生物工程有限公司；
BCA蛋白浓度测定试剂盒：美国Thermo公司；
ECL显色系统WesternBlot底物试剂盒：美国Pierce公司；
TritonX-100：上海生工生物工程有限公司。
实施例中所用仪器型号及其来源：12色流式细胞仪：美国BD公司，FACSCelesta；
动态光散射仪：英国Malvern公司，ZetasizerNanoZSE；
微量分光光度计：美国ThermoFisherScientific公司，Nanodropone；
PCR仪：美国ThermoFisherScientific公司，2720ThermalCycler；
超纯水处理装置：美国Merck公司，MilliporeMilli-QDirect；
激光共聚焦扫描显微镜：德国卡尔蔡司公司，LSM880withAiryscan；
小型高速离心机：德国Eppendorf公司，Microfuge20R；
二氧化碳细胞培养箱：美国Thermo公司，3111；
电泳仪：中国上海天能科技有限公司，EPS-300；
垂直电泳槽：中国上海天能科技有限公司，VE-180；
全自动轮转式切片机：德国Leica公司，RM2255；
酶标仪：美国BioTek公司，800TS；
倒置荧光显微镜：日本Nikon公司，TS2；
pH计：瑞士MettlerToledo公司，FE28-Standard；
石蜡包埋机：德国Leica公司，Arcadia；
全密闭自动脱水机：德国Leica公司，ASP200S；
数字病理扫描系统：德国Leica公司，AperioCS2；
超净工作台：苏净安泰，SW-CJ-1FD；
超低温冰箱：美国Thermo公司，995；
-25℃立式低温保存箱：中科美菱，DW-LY270；
电子天平：梅特勒，ME204E。
实施例1
本实施例提供一种构建CAR-T细胞用纳米操纵子的制备方法，具体包括以下步骤：
S101：分别构建可表达靶向T细胞的膜融合蛋白以及可表达αCD19-CAR的质粒。
S101.1-构建可表达靶向T细胞的膜融合蛋白，具体包括：
首先从NCBI上查找p14FAST蛋白，以及麻疹病毒的H蛋白和F蛋白的基因序列，并对H蛋白进行Y481A和R533A两个突变(mutHprotein)，致使其失去原有识别CD46和CD150的能力；其次从NCBI上找到T细胞表面的标志性蛋白CD3e分子抗体2C11克隆的scFv序列，并将anti-CD3scFv序列连接分别到突变的H蛋白与p14蛋白序列的N端以实现靶向膜融合功能；再次通过2A自剪切肽将H蛋白与F蛋白序列连接以实现两种蛋白的共表达；最后将靶向多肽序列替换为靶向T细胞的scFv序列以实现对T细胞的靶向膜融合，即得设计好的靶向T细胞的膜融合蛋白序列，包括p14TF和MVTF两种靶向T细胞的膜融合蛋白序列，该靶向T细胞的膜融合蛋白序列为图1所示。其中，图1示出了靶向T细胞的膜融合蛋白示意图。
需要说明的是，我们将设计好的靶向T细胞的膜融合蛋白序列交给生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成，并将两段序列分别用CBG启动子(chickenβ-actinpromoter)启动表达，得到包含p14TF蛋白基因序列和包含MVTF蛋白基因序列；
S101.2-构建可表达αCD19-CAR的质粒，具体包括：
从NCBI上查找到1D3单克隆抗体的轻链和重链，以及鼠CD8α铰链区、鼠CD8跨膜区、胞内CD28共刺激信号域和胞内CD3ζ结构序列，并将1D3单克隆抗体的轻链和重链通过(GGGGS)3序列连接构成αCD19-scFv，然后与其它结构串联构成αCD19-CAR。最后，在αCD19scFv和鼠CD8α铰链区之间加入Myctag序列，得到设计好的αCD19-CAR蛋白序列，该αCD19-CAR蛋白序列为图2所示。其中，图2示出了αCD19-CAR蛋白示意图。
需要说明的是，我们将设计好的αCD19-CAR蛋白序列交给生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成，并使用CBG启动子启动表达。
S102：构建能够同时表达靶向T细胞的膜融合蛋白和αCD19-CAR的工程细胞。
S102.1-构建能够同时表达p14蛋白、MVFP两种T细胞膜融合蛋白以及αCD19-CAR蛋白的慢病毒载体质粒，具体包括：
将合成的包含p14TF蛋白基因序列通过NheI/BamHI双酶切，得到p14TF蛋白序列；NheI/BamHI双酶切慢病毒载体pCDH；将线性pCDH载体与p14TF蛋白序列用T4连接酶连接，室温30min，随后转化入DH5α感受态细胞，过夜培养后，挑取阳性单克隆扩增并保存。测序验证其序列，正确的质粒命名为pCDH-EF1-p14TF；
将合成的包含MVTF蛋白序列通过AgeI/EcoRI双酶切，得到MVTF序列；AgeI/EcoRI双酶切已构建的慢病毒载体pCDH-EF1-p14TF；将线性pCDH-EF1-p14TF载体与MVTF蛋白序列用T4连接酶连接，室温30min，随后转化入DH5α感受态细胞，过夜培养后，挑取阳性单克隆扩增并保存。测序验证其序列，正确的质粒命名为pCDH-EF1-MVTF。
S102.2-构建可表达靶向T细胞的膜融合蛋白以及可表达αCD19-CAR蛋白的工程细胞系，具体包括：
将慢病毒载体质粒、包膜质粒(pMD2.0)和包装质粒(psPAX2)共转染HEK293T细胞，包装得到慢病毒颗粒；然后将收集的慢病毒感染RAW264.7细胞，进一步药筛后得到能够稳定表达靶向T细胞膜融合蛋白的RAW264.7细胞系，对该能够稳定表达靶向T细胞膜融合蛋白的RAW264.7细胞系进行荧光显微表征，其结果为图3至图4所示。其中，图3A示出了靶向T细胞的p14TF膜融合蛋白的RAW264.7细胞系共表达的荧光蛋白表达情况(标签蛋白为红色荧光蛋白)；图3B示出了靶向T细胞的p14TF膜融合蛋白的RAW264.7细胞系的明场形态；图4A示出了靶向T细胞的MVTF膜融合蛋白的RAW264.7细胞系共表达的荧光蛋白表达情况；图4B示出了靶向T细胞的MVTF膜融合蛋白的RAW264.7细胞系的明场形态。最后，利用可表达αCD19-CAR的慢病毒感染，通过药筛后得到同时稳定表达靶向T细胞膜融合蛋白与αCD19-CAR的RAW264.7细胞。
S102.3-瞬转表达靶向T细胞的膜融合蛋白的HEK293T细胞与T细胞发生膜融合的检测，具体包括：
将2×105个HEK293T细胞种板于24孔板中，隔夜培养后，使用Lipofectamine3000向HEK293T细胞分别转染p14TF和MVTF两种表达质粒500ng，8h后，更换培养基，继续培养12h。加入小鼠脾脏分选得到的T细胞共培养48h。利用APCαCD3抗体标记T细胞，以及利用DAPI标记细胞核，并用激光共聚焦显微镜观察HEK293T细胞与T细胞发生膜融合以形成多胞体细胞，结果为图5所示。其中，图5示出了瞬转靶向T细胞的膜融合蛋白的HEK293T细胞与T细胞发生膜融合的检测结果。
根据图5可以看出，瞬转靶向T细胞的膜融合蛋白的HEK293T细胞能够与T细胞发生膜融合。
S102.4-检测构建的可表达T细胞的膜融合蛋白的RAW264.7细胞系与T细胞发生融合，具体包括：
取2×105个构建的可稳定表达靶向T细胞膜融合蛋白的RAW264.7细胞种板于24孔板中，隔夜培养后与小鼠脾脏分选得到的T细胞共培养48h，用APCαCD3抗体标记T细胞、用FITCαCD11b抗体标记RAW264.7细胞、用DAPI标记细胞核，用激光共聚焦显微镜观察可稳定表达靶向T细胞膜融合蛋白的RAW264.7细胞系与T细胞发生膜融合以形成多胞体细胞，结果为图5所示。其中，图6示出了可稳定表达靶向T细胞膜融合蛋白的RAW264.7细胞与T细胞发生膜融合的检测结果。
根据图6可以看出，可稳定表达靶向T细胞膜融合蛋白的RAW264.7细胞系能够与T细胞发生膜融合。
S103：制备纳米操纵子(FuNV)
请参阅图7所示，纳米操纵子的制备方法具体包括：弃去细胞原有的培养基后，利用预冷的PBS清洗细胞，弃去多余PBS，利用1mL的0.25％TE浸润细胞，弃去多余的TE，37℃的细胞培养箱中消化1min，利用含有10％的FBS的DMEM培养基终止消化，并将细胞吹打为单细胞悬液，4℃的温度下600rpm离心5min；弃上清，用预冷的PBS重悬细胞，计数细胞数目，4℃条件下600rpm离心5min，弃上清，用含有0.04％(w/v)脱氧胆酸钠、1mM的PMSF的PBS将细胞重悬，并持续震荡，室温下放置20min，4℃的温度下6000g离心10min，收集上清并经过0.45μm滤膜，将收集的液体超高速离心，4℃的温度下100000g离心4h，小心弃去上清，用PBS重悬，得到纳米囊泡，即为构建CAR-T细胞用纳米操纵子。
本实施例还提供上述构建CAR-T细胞用纳米操纵子的表征，具体而言：
1)本实施例对制备成的纳米操纵子(FuNV)进行了表征，具体包括：
将纳米操纵子(FuNV)用PBS稀释至浓度为1mg/mL，用动态光散射仪(Dynamiclightscattering，DLS)进行粒径分布表征以及用透射电镜进行颗粒表征，其结果为图8至图9所示。其中，图8示出了纳米操纵子的粒径分布图；图9示出了纳米操纵子的TEM图；
根据图8可以看出，纳米操纵子粒径约为104.1nm，粒径分布均一；
根据图9可以看出，纳米操纵子是一个膜结构的球状颗粒，其粒径约为90nm左右。
2)本实施例通过蛋白质免疫印迹(WB)检测纳米操纵子上携载有靶向T细胞膜融合蛋白和αCD19CAR蛋白，具体包括：
将制备成的纳米操纵子(FuNV)通过RIPA裂解液重悬后，室温下持续震荡1min，冰上放置5min，重复4次，完全裂解纳米操纵子，得到含有纳米操纵子蛋白的溶液。对于利用表达靶向T细胞膜融合蛋白的细胞制备的纳米操纵子，在WB中通过ProteinL检测靶向T细胞膜融合蛋白表达；对于利用表达αCD19-CAR细胞制备的纳米操纵子，在WB中用αMyctag抗体检测αCD19-CAR表达，检测结果为图10至图11所示。WB检测中，内参蛋白为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。其中，图10示出了WB检测纳米操纵子携载靶向T的细胞膜融合蛋白表达的检测结果；图11示出了WB检测纳米操纵子携载αCD19-CAR蛋白表达的检测结果；
根据图10至图11可以看出，本申请实施例制备的纳米操纵子能够有效携载靶向T细胞的膜融合蛋白和αCD19-CAR蛋白。
3)纳米操纵子(FuNV)与T细胞膜融合效率检测
取40μg的FuNV和NV并使用膜染料DiI标记，然后与小鼠脾脏分选得到的T细胞共孵育10h。使用PBS清洗T细胞后，用APCanti-CD3抗体标记T细胞，用激光共聚焦显微镜能观察DiI在T细胞表面的分布情况，其结果为图10所示。其中，图12示出了靶向T细胞的膜融合蛋白促进纳米操纵子与T细胞发生膜融合的检测结果。
根据图12可以看出，在FuNV组，用激光共聚焦显微镜能够观察到DiI分布在T细胞表面，而NV组则没有观察到显著的T细胞表面有DiI分子，说明靶向T细胞的膜融合蛋白能够促进纳米操纵子与T细胞的膜融合。
进一步地，用流式细胞仪检测FuNV和T细胞的膜融合效率，其结果为图13所示。其中，图13示出了纳米操纵子与T细胞的融合效率检测结果。
根据图13可以看出，FuNV相较于NV组有显著地膜融合，约为40％和60％。
3)检测FuNV保存的稳定性
将制备好的FuNV分别放置于4℃、-20℃和-80℃保存，并在0h、12h、24h、48h、1周和4周等时间点取样检测FuNV粒径，通过粒径变化判断FuNV的稳定性，检测结果为图14所示。其中，图14示出了纳米操纵子在不同保存温度下的稳定性检测结果。
根据图14可以看出，在4℃和-20℃保存的FuNV在长期存放后，粒径出现明显变化，而在-80℃长期存放则没有观察到粒径的明显变化。因此，-80℃是FuNV适合保存温度条件。
实施例2
本实施例提供构建CAR-T细胞用纳米操纵子的相关应用，具体包括：
2.1FuNVCAR体外制备CAR-T细胞
使用来自共表达靶向T细胞膜融合蛋白和αCD19-CAR蛋白的RAW264.7细胞产生纳米囊泡(FuNVCAR)40μg，与小鼠脾脏分选的T细胞共孵育10h，之后清洗T细胞并持续培养。用AF647αMyc-tag抗体染色，并通过流式细胞仪检测FuNVCAR在体外构建CAR-T细胞的效率，结果如图15所示。其中，图15示出了纳米操纵子在体外构建CAR-T细胞的效率检测结果。
根据图15可以看出，共孵育后再培养24h，能检测到p14TF-FuNVCAR制备的CAR-T细胞比例为30.2％，而MVTF-FuNVCAR制备的CAR-T细胞比例为36.7％。随着培养时间增加CAR-T细胞比例逐渐减低，在72h，CAR-T细胞比例已经低于5％。证明通过靶向T细胞的膜融合蛋白能够将CAR蛋白通过膜融合的方式递送至T细胞表面。
2.2FuNVCAR制备CAR-T细胞的体外杀伤效率检测
将小鼠脾脏分离的T细胞与FuNVCAR孵育产生αCD19CAR-T细胞，并将这些αCD19CAR-T细胞分别与Hoechst33342染色的小鼠B淋巴瘤A20细胞、小鼠黑色素瘤B16-F10细胞和小鼠结直肠癌CT26细胞共培养(T细胞与肿瘤细胞比例为10:1)48h。用PBS清洗细胞3次，检测肿瘤细胞中Hoechst33342荧光值表示CAR-T细胞的杀伤效率。
计算公式：cytotoxicity％＝[F(PBS)–F(Treat)]/F(PBS)×100％。
检测结果为图16所示。其中，图16示出了纳米操纵子构建的CAR-T细胞的体外杀伤效率检测结果，具体而言：图16A示出了纳米操纵子构建的aCD19CAR-T细胞对A20细胞的细胞毒性的检测结果；图16B示出了纳米操纵子构建的aCD19CAR-T细胞对B16-F10细胞的细胞毒性的检测结果；图16C示出了纳米操纵子构建的aCD19CAR-T细胞对CT26细胞的细胞毒性的检测结果。
根据图16可以看出，由FuNVCAR产生的αCD19-CART细胞对A20细胞有约30％的杀伤效果，显著高于未处理的T细胞，但是对非靶细胞B16-F10和CT26则没有显著的杀伤增强效果。证明纳米操纵子制备的CAR-T细胞具有杀伤特异性。
2.3FuNVCAR体内产生CAR-T细胞效率
通过尾静脉注射FuNVCAR(4.5mg/kg)，在24h后牺牲小鼠，收集小鼠血液和脾脏，并处理为单细胞悬液，通过AF647αMyctag抗体标记CAR分子，用流式细胞仪检测小鼠血液和脾脏中CAR-T细胞比例，检测结果为图15所示。其中，图17示出了纳米操纵子在体内构建CAR-T细胞效率的检测结果，具体而言：图17A示出了血液中检测到CAR-T细胞比例；图17B示出了脾脏中检测到CAR-T细胞比例。
根据图17可以看出，通过单次尾静脉注射FuNVCAR，在血液和脾脏中能检测到产生1.31％到2.07％的CAR-T细胞。该实验结果证明通过尾静脉注射纳米操纵子可以在体内产生CAR-T细胞。
2.4FuNVCAR用于小鼠B淋巴瘤治疗
我们构建了小鼠B细胞淋巴瘤A20细胞皮下瘤模型。将荷瘤小鼠随机分成4组，每组5只，分别尾静脉注射300μL的PBS、NV、p14TF-FuNVCAR和MVTF-FuNVCAR(纳米操纵子的注射剂量为4.5mg/kg)。每两天给药一次，一共给药5次。在治疗过程中，每天都用游标卡尺测量肿瘤大小，并检测小鼠体重变化。
肿瘤体积按照下面公式计算：肿瘤体积(mm3)＝0.5×长×宽2。
检测结果为图18所示。其中，图18示出了纳米操纵子用于治疗B细胞淋巴瘤的治疗结果，具体而言：图18A示出了治疗实验中不同治疗组的肿瘤生长情况；图18B示出了治疗实验中不同治疗组的肿瘤生长情况。
根据图18可以看出，PBS和NV组，肿瘤生长迅速，而p14TF-FuNVCAR和MVTF-FuNVCAR实验组中肿瘤生长受到了显著抑制。同时，没有观察到治疗组小鼠体重相较于PBS组出现显著变化，说明FuNVCAR对小鼠的毒性较低。
2.5FuNVCAR细胞因子释放综合症检测
细胞因子释放综合症是CAR-T细胞疗法严重副作用之一。为检测治疗实验中，是否会产生CRS，我们用ELISA检测了实验结束后小鼠血浆中CRS相关的细胞因子含量，检测结果为图19所示。其中，图19示出了通过纳米操纵子治疗B细胞淋巴瘤后体内炎性细胞因子表达的检测结果，具体而言：图19A示出了通过纳米操纵子治疗B细胞淋巴瘤后体内白细胞介素1β表达的检测结果；图19B示出了通过纳米操纵子治疗B细胞淋巴瘤后体内白细胞介素6表达的检测结果；图19C示出了通过纳米操纵子治疗B细胞淋巴瘤后体内粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子表达的检测结果。
根据图19可以看出，从小鼠血浆中炎性细胞因子IL-1β、IL-6和GM-CSF的含量分析，治疗组小鼠相较于PBS组小鼠，CRS相关的细胞因子表达量没有增加，说明通过FuNVCAR在体内产生CAR-T细胞在有效抑制肿瘤生长的同时，并不会引起大量细胞因子产生的CRS，也说明该方法安全性较高。
2.6FuNVCAR联合免疫检查点抗体用于小鼠B淋巴瘤治疗
与现有的CAR-T细胞疗法相比，体内直接产生CAR-T细胞的制备方法不经过活化的过程，杀伤肿瘤能力有限。故将FuNVCAR联合免疫检查点疗法抗OX40抗体(αOX40)用于小鼠B淋巴瘤治疗。
在细胞水平的肿瘤细胞杀伤实验中，在纳米操纵子制备的αCD19-CAR-T细胞与A20细胞共培养实验中添加αOX40(10μg/mL)，共培养48h后，检测添加αOX40纳米操纵子构建CAR-T细胞的杀伤效率，其结果为图18所示。其中，图20示出了αOX40促进纳米操纵子构建CAR-T细胞的杀伤效率的检测结果；
根据图20可以看出，αCD19CAR-T细胞对A20细胞的杀伤效果显著增强，
动物水平抗肿瘤治疗实验中，将A20B细胞淋巴瘤荷瘤小鼠平均分成6组，每组5只，分别尾静脉注射300μL的PBS、p14TF-FuNVCAR、MVTF-FuNVCAR、αOX40、p14TF-FuNVCAR+αOX40和MVTF-FuNVCAR+αOX40(其中纳米操纵子的注射剂量为4.5mg/kg，αOX40为腹腔注射50μg)。每两天给药一次，一共给药5次。在治疗过程中，每天都用游标卡尺测量肿瘤大小，并检测小鼠体重变化。
肿瘤体积按照下面公式计算：肿瘤体积(mm3)＝0.5×长×宽2。
检测结果为图21所示。其中，图21示出了纳米操纵子联合αOX40用于治疗B细胞淋巴瘤的实验结果，具体而言：图21A示出了治疗实验中各组肿瘤生长情况；图21B图示出了治疗实验中各组小鼠体重变化情况。
根据图21可以看出，单独使用αOX40或纳米操纵子都能对肿瘤生长有抑制作用。纳米操纵子联合αOX40能显著增强对肿瘤的抑制效果。在整个治疗过程中，各组小鼠体重均未发生明显变化，说明纳米操纵子联合αOX40疗法对小鼠没有造成严重的毒性。
本说明书中的各个实施方式采用递进的方式描述，各个实施方式之间相同或相似的部分可互相参见，每个实施方式重点说明的都是与其他实施方式的不同之处。
以上实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对本申请限制；尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，本领域普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请技术方案的范围。

Claims (16)

1.一种构建CAR-T细胞用纳米操纵子，其特征在于，包括纳米囊泡，所述纳米囊泡携载有CAR蛋白和靶向T细胞的膜融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的构建CAR-T细胞用纳米操纵子，其特征在于，所述靶向T细胞的膜融合蛋白包括膜融合蛋白和T细胞表面的标志性蛋白分子抗体序列；
所述T细胞表面的标志性蛋白分子抗体序列连接于所述膜融合蛋白的N端。
3.根据权利要求2所述的构建CAR-T细胞用纳米操纵子，其特征在于，所述膜融合蛋白包括p14TF蛋白，以及麻疹病毒的F蛋白和H蛋白；
其中，所述麻疹病毒的H蛋白引入有Y481A突变和R533A突变。
4.根据权利要求3所述的构建CAR-T细胞用纳米操纵子，其特征在于，所述麻疹病毒的H蛋白与F蛋白序列通过T2A连接肽连接。
5.根据权利要求2所述的构建CAR-T细胞用纳米操纵子，其特征在于，所述T细胞表面的标志性蛋白分子为CD3e分子。
6.根据权利要求2所述的构建CAR-T细胞用纳米操纵子，其特征在于，所述T细胞表面的标志性蛋白分子抗体序列为scFv序列。
7.根据权利要求1-6任一所述的构建CAR-T细胞用纳米操纵子，其特征在于，所述CAR蛋白为αCD19-CAR蛋白。
8.一种根据权利要求1-7任一所述的构建CAR-T细胞用纳米操纵子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S101：分别构建可表达靶向T细胞的膜融合蛋白以及可表达αCD19-CAR的质粒；
S102：构建能够同时表达靶向T细胞的膜融合蛋白和αCD19-CAR的工程细胞；
S103：利用步骤S102中构建的工程细胞产生携载靶向T细胞的膜融合蛋白与αCD19-CAR的纳米囊泡，即得所述构建CAR-T细胞用纳米操纵子。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述构建可表达靶向T细胞的膜融合蛋白的方法包括：
从NCBI查找到膜融合蛋白和抗体序列，并对所述膜融合蛋白和抗体序列依次进行突变、连接、添加标签序列、合成以及验证设计蛋白的促膜融合效果。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述构建αCD19-CAR质粒的方法包括：
从NCBI查找2C11抗体轻链和重链序列、CD8a序列、CD28序列和CD3ζ序列后，依次进行连接，添加标签序列以及合成。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述添加标签序列是在αCD19-CAR序列中的CD8a跨膜序列前添加Myctag序列。
12.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述构建能够同时表达靶向T细胞的膜融合蛋白和αCD19-CAR的工程细胞的方法包括：
构建慢病毒载体质粒、包装并收集慢病毒颗粒、感染细胞，药筛得到抗性细胞。
13.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述纳米囊泡的制备方法包括：
将工程化细胞消化为单细胞悬液并用PBS清洗；
用含有脱氧胆酸钠、PMSF的PBS溶液处理所述单细胞，并持续震荡，室温20min；
4℃的温度下6000g离心10min，收集上清并过0.45μm滤膜；4℃的温度下100000g离心4h；
弃去上清，并用PBS重悬，得到纳米囊泡，即为构建CAR-T细胞用纳米操纵子。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述脱氧胆酸钠的浓度为0.04w/v％。
15.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述纳米操纵子的平均粒径为104.1-109.4nm。
16.一种根据权利要求1-7任一所述构建CAR-T细胞用纳米操纵子在制备治疗肿瘤药剂中的应用。
CN202310068340.7A 2023-02-06 2023-02-06 一种构建car-t细胞用纳米操纵子及其制备方法和应用 Pending CN116042530A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310068340.7A CN116042530A (zh) 2023-02-06 2023-02-06 一种构建car-t细胞用纳米操纵子及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310068340.7A CN116042530A (zh) 2023-02-06 2023-02-06 一种构建car-t细胞用纳米操纵子及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116042530A true CN116042530A (zh) 2023-05-02

Family

ID=86131177

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310068340.7A Pending CN116042530A (zh) 2023-02-06 2023-02-06 一种构建car-t细胞用纳米操纵子及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116042530A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Moffett et al. Hit-and-run programming of therapeutic cytoreagents using mRNA nanocarriers
JP6630074B2 (ja) 新規に単離された細胞の治療組成物の操作および送達
EP2589377B1 (en) Microvesicles derived from cell protoplast, and use thereof
Corrado et al. Exosomes as intercellular signaling organelles involved in health and disease: basic science and clinical applications
WO2019128952A1 (zh) 携带嵌合抗原受体的免疫细胞外泌体的制备方法及其应用
Hagiwara et al. A paradigm shift for extracellular vesicles as small RNA carriers: from cellular waste elimination to therapeutic applications
Michels et al. Precision medicine: In vivo CAR therapy as a showcase for receptor-targeted vector platforms
CN106619515A (zh) 脂质体组合物及其用途
Yang et al. Enhanced cytotoxic T lymphocytes recruitment targeting tumor vasculatures by endoglin aptamer and IP-10 plasmid presenting liposome-based nanocarriers
KR20200104282A (ko) 조직에서 코딩 리보핵산의 표적화된 전달, 발현 및 조절을 위한 조성물 및 방법
Cheng et al. Engineering of MSC-derived exosomes: a promising cell-free therapy for osteoarthritis
Ding et al. Genetically engineered nanovesicles mobilize synergistic antitumor immunity by ADAR1 silence and PDL1 blockade
CN105950662B (zh) 一种靶向cd22的复制缺陷性重组慢病毒car-t转基因载体及其构建方法和应用
US20240083976A1 (en) Serum albumin-based fusion protein, and nano-assembly, preparation method therefor and application thereof
CN115120572B (zh) 一种基因工程化细胞膜涂层脂质体纳米囊泡及其制备与应用
CN116042530A (zh) 一种构建car-t细胞用纳米操纵子及其制备方法和应用
Li et al. Advanced Generation Therapeutics: Biomimetic Nanodelivery System for Tumor Immunotherapy
CN115029320A (zh) 用于肿瘤放疗增敏的工程化外泌体、制备方法、应用
Zhu et al. Injectable Supramolecular Hydrogels for In Situ Programming of Car‐T Cells toward Solid Tumor Immunotherapy
CN115838432B (zh) 一种靶向调控抗原特异性t细胞的融合蛋白及应用
Xiong et al. Aptamer-based immune drug systems (AptIDCs) potentiating cancer immunotherapy
Zhu et al. Tumor-microenvironment Responsive Targeted Exosome-like Nanovesicles From Dunaliella Salina for Enhancing Gene/immune Combination Therapy
CN112481299A (zh) 用于调节PD-1/PD-L1通路的RNAi表达质粒
Shou et al. 3WJ RNA Nanoparticles-Aptamer Functionalized Exosomes From M2 Macrophages Target BMSCs to Promote the Healing of Bone Fractures
US20220347213A1 (en) Recombinant CD1-Restricted T Cells And Methods

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination