CN116036379A - 一种3d打印血管化脂肪再生支架及应用 - Google Patents

一种3d打印血管化脂肪再生支架及应用 Download PDF

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Abstract

一种3D打印血管化脂肪再生支架及应用，其将可打印的生物相容性墨水，硅酸盐生物陶瓷粉末和脂肪相关细胞，通过3D生物打印技术制成具有生物活性的血管化脂肪再生支架。本发明的复合支架其孔径和孔隙率可控、生物相容性好、具有优异的脂肪再生活性、成血管活性、可作为针对脂肪，乳房缺损的相关疾病的修复。

Description

一种3D打印血管化脂肪再生支架及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种3D打印血管化脂肪再生支架及应用。
背景技术
脂肪组织工程(ATE)作为一种策略，正在受到越来越多的关注，它可以模仿天然脂肪组织的物理化学特性，构建一种自体的、患者特异性的结构。在许多临床情况下都需要恢复脂肪组织，例如乳腺癌后的乳房切除术，这通常会导致乳腺组织缺失，并给女性患者带来严重的心理和生理负担。尽管目前的策略，包括脂肪填充、自体组织瓣移植和硅胶假体植入，已广泛应用于乳房重建，但它们有许多缺点和局限性，如脂肪的不可控吸收、自体组织皮瓣的来源限制和硅胶假肢的包膜挛缩。所有这些缺点都增加了延迟脂肪组织再生和乳房修复失败的风险。此外，由于乳房重建特别个性化，由于缺乏精确的形状控制，在这些策略治疗后通常需要进行额外的乳房整形手术。因此，迫切需要开发具有高活性的脂肪组织再生和精确结构控制能力的创新治疗策略。
近年来，越来越多的证据表明，生物活性离子在调节包括细胞分化在内的细胞行为中起着重要作用。一些研究表明，锌促进大鼠脂肪细胞的脂肪生成，并在体外和体内刺激3T3-L1成纤维细胞和脂肪细胞中葡萄糖转化为脂质，表明某些生物活性离子确实可以作为刺激物促进脂肪生成分化。
目前，3D打印支架越来越被认为是实现脂肪组织修复的一个有希望的平台。此外，体内植入后支架中支撑基质的降解通常与其治疗效果相关。生物相容性墨水因其优异的生物相容性、可生物降解、无细胞毒性，已被广泛加工成3D打印支架，用于组织再生应用。
发明内容
为了解决现有技术存在的技术缺陷，本发明提供了一种3D打印血管化脂肪再生支架及应用，用于血管化组织重建。把生物活性陶瓷混合生物相容性墨水中，通过挤出式3D打印机打印出交错角度的支架。通过在体外实验筛选出最适浓度，最后体内分析了复合支架的脂肪、血管的促进作用。
本发明采用的技术解决方案是：一种3D打印血管化脂肪再生支架,所述的血管化脂肪再生支架为含硅酸盐的生物陶瓷材料与生物墨水以及脂肪相关细胞通过3D打印得到的。
所述的血管化脂肪再生支架为含硅酸盐的生物陶瓷材料与生物墨水混合得到复合材料再通过3D打印制成复合支架，再在复合支架上接种脂肪相关细胞得到的。
所述的血管化脂肪再生支架为含硅酸盐的生物陶瓷材料与生物墨水混合得到复合材料，再与脂肪相关细胞混合后通过3D打印得到的。
所述的含硅酸盐的生物陶瓷材料为生物玻璃、硅酸钙、硅酸二钙、硅酸三钙、硅酸锶、硅酸镁、硅酸铜、硅酸锌、镁黄长石、锌黄长石、铜硅钙石中的一种或多种。
所述的生物墨水为海藻酸、明胶、甲基丙烯酸酯化明胶、壳聚糖、透明质酸、胶原、聚己内酯、聚乳酸中的一种或多种。
所述的脂肪相关细胞包括脂肪前体细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞、脂肪干细胞中的一种或多种。
所述的含硅酸盐的生物陶瓷材料在3D打印血管化脂肪再生支架中的质量比为0.1%-10%。
所述的3D打印血管化脂肪再生支架上具有互穿聚合物网络的交联结构，所述的互穿聚合物网络的交联结构中具有2-3种不同尺寸的孔隙结构。
所述的不同尺寸的孔隙结构为空隙尺寸和堆积夹角不同的孔隙结构。以利于细胞和诱导培养液充分接触，空隙的直径一种或多种可以。线条堆积夹角一种或多种。采用3D打印制成的生物相容性支架中空隙尺寸和堆积夹角可以根据细胞尺寸而调整，本发明所用的尺寸均能够负载住脂肪细胞，进而发挥其生理作用。
生物相容性复合支架是由硅酸盐陶瓷粉末溶解到生物相容性墨水中，在20℃的条件下，以线条交错堆叠进行3D打印。
一种3D打印血管化脂肪再生支架在制备促进脂肪组织再生材料上的应用。
本发明的一个优选的实施方案中以生物相容性墨水复合生物陶瓷粉作为支架材料。复合支架包含小鼠前体脂肪细胞，将其混合后3D打印复合支架，用于血管化脂肪再生。
（1）对正常的雌性裸鼠腹腔全身麻醉；
（2）建立皮下埋植模型：在每只小鼠的背部皮下植入两个支架，每一侧各1个，在皮肤和肌肉筋膜之间钝性剥离形成一个口袋，放入支架，然后用缝合线缝合伤口；
（3）三周时取出支架，对支架进行外观拍照，验证脂肪再生的效果。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种3D打印血管化脂肪再生支架及应用，其将可打印的生物相容性墨水，硅酸盐生物陶瓷粉末和脂肪相关细胞，通过3D生物打印技术制成具有生物活性的血管化脂肪再生支架。本发明的复合支架其孔径和孔隙率可控、生物相容性好、具有优异的脂肪再生活性、成血管活性、可作为针对脂肪，乳房缺损的相关疾病的修复。
附图说明
图1为3D打印复合支架的流程示意图。
图2为3D打印掺杂不同浓度的CaSiO3的支架光镜图和扫描电镜图：A、光镜图；B1-B4、扫描电镜图；C、3D打印乳房支架图。
图3为支架的体外成脂：A、3D打印掺杂不同浓度的CaSiO3的支架对3T3-L1的增值效果；B、支架种细胞和不种细胞的一个油红染色光镜图及显微镜图；C、油红染色定量分析图。
图4为支架的体外成血管：A、3D打印掺杂不同浓度的CaSiO3的支架对HUVECs的增值效果；B、血管生成实验；C、血管生成的定量图。
图5为支架的体内实验：a、3D打印掺杂不同浓度的CaSiO3的支架体内成脂成血管的光镜图；b、脂肪高度的定量图；c、脂肪面积的定量图。
图6为生物3D打印宏观图及显微镜下的细胞数。
图7为细胞增殖cck-8的验证。
图8为生物3D打印支架活死细胞染色。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：生物墨水的制备
通过将不同重量浓度（0、0.2、0.4、0.8w%）的CaSiO3粉末在含有光引发剂（0.05g）的GelMA溶液（1g GelMA，10ml去离子水）中远离光混合来制备3D打印GelMA/CS复合支架的生物油墨。
实施例2：3D打印复合支架的设计和制备
（1）把之前配好的墨水装入5ml的注射器里。3D支架模型的长度，宽度，厚度由BioMakerV2软件进行设计,分别是20mm，20mm，2mm，线条的设计是0°、45°、90°交错打印。然后使用3D打印机（类型：SUNP BIOMAKER PRO）通过光固化打印技术打印支架。针的直径为0.34mm，针的打印速度设定5mm/s，挤出速度设定为1 mm3/s，光固化的时间为15s。打印后，用8mm的打孔器打孔若干。支架在冰箱的冷冻室中预冷冻−20℃ 12 h，然后在−80℃，最后在真空环境中干燥12 h。
（2）将传代培养至2-3代的小鼠前体脂肪细胞以浓度10x104细胞/mL种在GleMA/CaSiO3复合水凝胶支架上，得到含脂肪细胞的生物相容性支架。或者：
传代培养至2-3代的小鼠前体脂肪细胞以浓度100x104细胞/mL与GleMA/ CaSiO3复合水凝胶支架材料混合，通过3D打印的方式打印，得到含脂肪细胞的生物相容性支架。
实施例3：诱导培养液（A），（B）的配置
诱导培养液（A）的成分：高糖DMEM（Gibco，美国）、10%FBS、1%青霉素-链霉素、0.5×10−3m IBMX（Sigma-Aldrich，美国），10µg mL−1胰岛素（Sigma-Aldrich，美国），100×10−6m吲哚美辛（Sigma-Aldrich，美国），1×10−6 m地塞米松（Sigma-Aldrich，美国）组成。
]诱导培养液（B）的成分：高糖DMEM、10%FBS、1%青霉素-链霉素、10µg mL-1胰岛素组成的成脂分化B。
实施例4：复合支架的制备
诱导液培养液（A），（B）0.22um过滤灭菌后在37℃，5%CO2培养箱内平衡2-4小时，把含脂肪细胞的生物相容性支架在诱导液（A）中培养3天，然后换诱导培养液（B）培养1天。A B代表分化周期。2个周期后，用诱导培养液（B）处理细胞至14天，以充分发育脂肪细胞表型。
实施例5：皮下埋植模型
购买的6周龄雌性裸鼠，在腹腔注射水合氯醛进行全身麻醉，在每只小鼠的背部皮下植入两个支架，每一侧各1个，在皮肤和肌肉筋膜之间钝性剥离形成一个口袋，放入支架，然后用缝合线缝合伤口。三周时取出支架，对支架进行外观拍照，验证脂肪再生的效果。如图5所示。
实施例6：生物3D打印（载细胞形式）
通过将不同重量浓度（0、0.2、0.4、0.8w%）的CaSiO3粉末溶解在含有光引发剂（0.05g）的GelMA溶液（1g GelMA，10ml基础培养基）中，处理约100x104细胞/mL的细胞悬液加入含CaSiO3的GleMA溶液中，同时加入10% FBS，1% P/S远离光源来制备3D打印GelMA/CS复合支架的生物油墨，如图6所示。最终通过cck-8和活死细胞染色对生物3D打印支架（载细胞形式）进行验证，发现细胞拥有良好的增殖和存活率，图7，图8所示。
各位技术人员须知：虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述，但是本发明的发明思想并不仅限于此发明，任何运用本发明思想的改装，都将纳入本专利专利权保护范围内。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种3D打印血管化脂肪再生支架,其特征在于，所述的血管化脂肪再生支架为含硅酸盐的生物陶瓷材料与生物墨水以及脂肪相关细胞通过3D打印得到的。
2.根据权利要求1所述的一种3D打印血管化脂肪再生支架，其特征在于,所述的血管化脂肪再生支架为含硅酸盐的生物陶瓷材料与生物墨水混合得到复合材料再通过3D打印制成复合支架，再在复合支架上接种脂肪相关细胞得到的。
3.根据权利要求1所述的一种3D打印血管化脂肪再生支架，其特征在于,所述的血管化脂肪再生支架为含硅酸盐的生物陶瓷材料与生物墨水混合得到复合材料，再与脂肪相关细胞混合后通过3D打印得到的。
4.根据权利要求1所述的一种3D打印血管化脂肪再生支架，其特征在于,所述的含硅酸盐的生物陶瓷材料为生物玻璃、硅酸钙、硅酸二钙、硅酸三钙、硅酸锶、硅酸镁、硅酸铜、硅酸锌、镁黄长石、锌黄长石、铜硅钙石中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的一种3D打印血管化脂肪再生支架，其特征在于,所述的生物墨水为海藻酸、明胶、甲基丙烯酸酯化明胶、壳聚糖、透明质酸、胶原、聚己内酯、聚乳酸中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的一种3D打印血管化脂肪再生支架，其特征在于,所述的脂肪相关细胞包括脂肪前体细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞、脂肪干细胞中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的一种3D打印血管化脂肪再生支架，其特征在于,所述的含硅酸盐的生物陶瓷材料在3D打印血管化脂肪再生支架中的质量比为0.1％-10％。
8.根据权利要求1所述的一种3D打印血管化脂肪再生支架，其特征在于,所述的3D打印血管化脂肪再生支架上具有互穿聚合物网络的交联结构，所述的互穿聚合物网络的交联结构中具有2-3种不同尺寸的孔隙结构。
9.根据权利要求8所述的一种3D打印血管化脂肪再生支架，其特征在于,所述的不同尺寸的孔隙结构为空隙尺寸和堆积夹角不同的孔隙结构。
10.一种权利要求1所述的3D打印血管化脂肪再生支架在制备促进脂肪组织再生材料上的应用。
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