CN116027020A - 一种dna纳米结构捕获探针侧流层析试纸条的制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种DNA纳米结构捕获探针侧流层析试纸条的制备及其应用,属于分子生物检测领域,包含以下步骤:1)胶体金纳米粒子的合成与修饰,2)四面体纳米结构探针的制备,3)试纸条的制备,该试纸条包含样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。该试纸条生物传感器在外泌体microRNA‑150‑5p的实际检测中表现出较高的灵敏度和巨大的应用潜力。因此,所发现验证的DNA纳米结构探针提供了一种在试纸平台上构建生物传感界面的通用方法,可应用与核酸标志物检测及细胞、外泌体、蛋白和小分子等非核酸标志物检测,具有优良的应用现场分析或床旁检测前景。所构建比率计试纸条为外泌体microRNA检测提供了一种POCT型检测新方法。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物传感技术领域,具体为一种DNA纳米结构捕获探针侧流层析试纸条的制备及其应用。
背景技术
侧流层析试纸条(Lateral flow test strips,LFTS)是一种重要的即时传感检测(point-of-care testing,POCT)平台。由于其便携性、可靠性、易用性、快速检测时间和成本效益的优越性,试纸条式传感器在当地诊所、家庭诊断、区域机场和偏远地区显示出巨大的潜力,供这些地区由未经培训的人员在仪器资源有限的情况下使用。除了最著名的家庭妊娠试验外,LFTS还被广泛用作肿瘤的快速检测、细菌、病毒和毒素等。特别是,LFTS作为目前最有前途的现场即时形式,在针对具有高度传染性的SARS-CoV 2病毒的快速诊断方面显示巨大应用价值。在这些传感策略中,常用的LFTS测定形式是基于抗体-抗原反应的夹心和竞争性测定,称为侧流免疫测定(lateral flow immunoassay,LFIA)。然而,在LFIA中使用抗体作为传感元件通常存在一些限制,包括生产成本高,生产时间长和热稳定性差。此外,针对非免疫原性或毒性靶标的抗体生产很困难。最近,研究人员试图采用基于核酸的传感策略作为替代方案。这种适配体(通过指数富集程序对配体的系统进化选择的独特核苷酸)代替抗体,用于检测非核酸靶标。同时,LFTS中已采用多种核酸扩增策略来灵检测与人类和环境健康有关的肿瘤和病原体的核酸和非核酸靶标。测试中使用的寡核苷酸具有高重现性、高稳定性和低生产成本的特点,并且易于用官能团修饰或定制,包括分裂、删除、取代、融合和伸长,从而在很大程度上解决了抗体依赖性侧流免疫测定中存在的局限性。在基于核酸的LFTS中,合成的寡核苷酸通常被设计为测试线和质控线上的条形码,用于识别捕获偶联物、生物识别元件或扩增元件。然而,条形码捕获探针需要提前与蛋白质分子连接形成蛋白-核酸复合物,以避免其随着样品流过而自我移动。即使用作识别或扩增元件,寡核苷酸也通常需要用至少一种功能分子修饰,以与固定在传感界面区的抗体或链霉亲和素发生反应。考虑识别捕获步骤时对,LFTS传感界面构建对抗体或其他蛋白分子的依赖性使得其应用不太实用或用户不友好性。从理论上讲,LFTS的多分析物检测能力受到在传感界面区作为捕获分子的抗体种类的限制。
DNA纳米技术是一种纳米级的自组装技术,使用DNA分子作为构建块和DNA可编程性,结合降低成本和提高DNA合成质量,使我们能够合理设计和精确控制核酸分子电路、机器和纳米结构。在DNA电路中,催化发夹组装(CHA)电路是一种有吸引力的等温扩增方法,用于体外诊断中目标靶标的无酶、高效和扩增检测,RNA成像(青等人,2021;Li等人,2022)或活细胞中其他核酸适体识别的分子的传感检测。通过引入触发序列,CHA电路通过一系列链位移反应进行发夹结构连续打开和组装的程序化过程,从而在短时间内实现基于CHA的等温信号放大。DNA四面体(DNAtetrahedron,DT)是由四个单链DNA组装的最简单的DNA多面体之一,最初由Turberfield及其同事报道。这种立体结构表现出卓越的特性,包括出色的寻址性、可控性、货物装载能力、生物相容性和稳定性。目前其已应用于电化学平台,用于检测核酸、蛋白质、小分子和细胞。进一步,DT已扩展到包括荧光检测在内的各种生物传感策略,电化学发光,晶体管传感器,光电化学生物传感器,细胞内成像,细胞膜监测,亚细胞蛋白分布的多重分析。
然而,DNA四面体(DNAtetrahedron,DT)尚未被提出和探索开发应用在侧流层析试纸条生物传感界面构建。侧流层析试纸条(LFTS)作为极其简便而有应用价值的快速诊断技术,本发明首次在侧流层析试纸条检测平台设计并构建DNA四面体纳米结构探针传感界面,并通过实验研究探索和证实一种DNA纳米结构探针传感界面构建新方法。该DNA纳米结构探针方法解决了侧流层析试纸条寡核苷酸传感界面构建中对抗体或链霉亲和素等蛋白分子的依赖性,极大的提高了基于核酸策略试纸条的应用简便性和应用拓展性。通过程序化设计或化学修饰等策略可构建多种DNA纳米结构探针传感界面,以实现核酸标志物及细胞、蛋白质和小分子等多种非核酸靶标特异检测。进一步,结合不同核酸放大策略,在DNA纳米结构探针传感界面可实现核酸标志物和非核酸标志物的超灵敏检测。
外泌体为平均直径为30-150nm的囊泡结构,为液体活检的重要生物标志物。外泌体microRNA(exo-miRNA)作为外泌体中的一种核酸成分可能提供多组分子诊断信息。我们首次提出了侧流层析试纸条硝酸纤维素膜上构建基于DNA纳米结构探针传感界面,以固定流过的功能化纳米金颗粒(AuNPs),并通过将DNA四面体纳米结构探针传感界面与CHA等温放大技术联用,开发了一种比率计试纸条用于来灵敏检测exo-miRNA。通过利用DT特性的优点,如空间可控性、稳定性、探针负载能力和探针对核酸酶介导降解的保护能力,纳米结构探针易于与设计的链霉亲和素化的胶体金(SA-AuNPs)发生超链接反应,在测试区和质控区形成红线。DNA纳米结构探针解决了核酸捕获探针随样品自移动的问题。CHA等温放大技术在exo-miRNA检测中增强了可视化信号。比率计试纸传感器使我们能够用肉眼读取exo-miRNA的浓度或使用试纸条分析器高灵敏度地定量exo-miRNA。
发明内容
本发明的目的在于克服上述背景技术困难,提供一种DNA纳米结构捕获探针侧流层析试纸条的制备及其应用。
为达到上述目的,采用的技术方案为:
一种基于DNA纳米结构捕获探针侧流层析试纸条的制备方法,其特征是,包含以下步骤:
1)胶体金纳米粒子的合成与修饰
通过柠檬酸盐还原HAuCl4溶液,制备合成球形胶体金纳米粒子AuNPs,将AuNPs与K2CO3溶液与链霉亲和素混合,浓度分别为0.5mM和2μg/mL;然后将混合物在混合器上摇动60min,在室温下加入终质量浓度为0.1%的牛血清白蛋白作为封闭剂封闭20min;再将混合物以12000rpm离心15min收集红色沉淀,即得到链霉亲和素修饰的胶体金纳米粒子SA-AuNPs;
2)四面体纳米结构探针的制备
针对DNA四面体四条链进行捕获探针的核酸编码设计,使捕获探针区与发夹探针H1上的部分区域序列互补;在95℃下将用于形成四面体纳米结构探针的四条链进行等摩尔量混合于缓冲液20mm Tris,50mm MgCl2,pH 8.0,然后冷却至4℃;
3)试纸条的制备
该层流层析试纸条由四个部分组成:样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫;四个组件都安装在一个共同的背衬层上;将玻璃纤维制成的样品垫浸泡在含有20mM Tris-HCl、0.5%吐温-20、质量浓度2.0%的蔗糖和150mM NaCl pH 7.3的缓冲液中;然后,将样品垫在37℃下干燥2小时;通过将5μL链霉亲和素标记的胶体金溶液SA-AuNPs分配到玻璃纤维垫上来制备金标垫,将垫子在35℃下干燥1小时然后在4℃下储存;
构建DNA四面体纳米探针传感界面,使用移液器将1μL四面体捕获探针作为点滴在测试区域,然后将膜在37℃下干燥1小时,再将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组装在具有1-2mm重叠位置的塑料胶背衬上,再将组装好的板切成3毫米宽的试纸条,即可。
进一步,所述步骤3)中,构建DNA四面体纳米探针传感界面,包含测试区和质控区检测线,由HM3035 XYZ平台分配器执行,分别以2μL/cm的速度分配2μM DNA四面体纳米结构探针或2μM生物素化四面体纳米结构探针,测试区和质控区之间的距离约为5mm。
以及上述基于DNA捕获探针的侧流层析试纸条用于外泌体microRNA的可视化检测的应用。
本发明基于DNA四面体纳米结构探针和催化发夹自组装,提出了一种新型的比率计试纸条传感器。该传感器在测试线中增加了红色可视化信号强度,在质控线中减少了红色可视化信号。DNA四面体已被广泛用于探索各种生物传感器,用于体外诊断以及细胞和细胞表面的原位检测。目前,DNA纳米结构探针尚未用于侧向层析试纸中,而侧流层析试纸是临床中实际检测不同目标物种的非常重要的快速传感检测平台。本研究首先提出了一种利用DNA四面体纳米结构探针在试纸条传感检测区制备传感检测界面的新方法,解决了核酸探针须与蛋白质分子连接形成大分子复合物的制备难题。由于采用了CHA电路和比率策略,在100fM至10nM的宽线性范围内实现了54.75fM的最低检测限。该试纸条生物传感器在外泌体microRNA-150-5p的实际检测中表现出较高的灵敏度和巨大的应用潜力。因此,所发现验证的DNA纳米结构探针提供了一种在试纸平台上构建生物传感界面的通用方法,可应用与核酸标志物检测及细胞、外泌体、蛋白和小分子等非核酸标志物检测,具有优良的应用现场分析或床旁检测前景。所构建比率计试纸条为外泌体microRNA检测提供了一种POCT型检测新方法。
附图说明
图1为本发明基于DNA四面体纳米结构探针的侧向层流试纸的可行性。
图2是本发明通过改变不同的实验条件对基于四面体纳米结构捕获探针的侧向层流试纸进行深入研究。
图3本发明中AuNPs的制备和修饰的表征。
图4为本发明基于四面体纳米结构探针和CHA电路的外泌体microRNA-150-5p比率计试纸条传感器的可行性研究。
图5为本发明试纸的灵敏度分析。
图6为本发明试纸的特异性分析。
图7为本发明中HK-2细胞中外泌体mocroRNA-150-5p的检测。
图8为本发明实时荧光定量PCR测定从HK-2细胞外泌体中提取总RNA的miRNA-150-5p。
图9为本发明基于DNA四面体纳米结构捕获探针的侧流层析试纸条设计策略。
图10为本发明基于四面体纳米结构捕获探针和催化发夹组装电路检测外泌体microRNA-150-5p的比率计试纸条传感器示意图。
具体实施方式
下面结合本发明的具体实施例,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部。基于本发明中的实施例,本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
我们设计并构建基于DNA四面体纳米结构捕获探针的侧流层析试纸条传感界面,通过实验发现和证实该传感界面能够有效捕获流经传感界面区的胶体金(AuNPs)。侧流层析试纸条传感界面通常需要固定抗原或抗体等蛋白分子用于对应抗体或抗原的检测,而针对基于核酸策略的侧流层析试纸条通常需将核酸探针预先与抗体或链霉亲和素等蛋白分子连接形成大分子的蛋白-核酸复合物以构建试纸条传感界面,用于核酸分子识别捕获以实现检测。本发明发现将核酸探针编码设计于DNA四面体纳米结构以作为生物探针识别捕获核酸靶分子或非核酸的靶分子,解决了核酸探针须与蛋白分子预先连接形成蛋白-核酸复合物构建侧流层析试纸条传感界面检测中对蛋白分子的依赖性问题,从而开发了一种新型的基于DNA纳米结构探针的侧流层析试纸条传感界面构建方法。DNA纳米结构探针可以编程设计核酸序列以识别捕获核酸靶标,DNA纳米结构探针亦可以编程设计适体等功能核酸分子以识别蛋白、细胞、外泌体和小分子物质等,DNA纳米结构探针亦可以通过核酸分子的化学修饰连接小分子化学物质以识别捕获更多核酸和非核酸靶标,通过不同的拓展设计从而为基于DNA纳米结构探针的侧流层析试纸条传感界面构建提供一种新方法。进一步,利用DNA四面体纳米结构探针传感界面和催化发夹结构自组装(catalytic hairpin assembly,CHA)用于检测外泌体microRNA(exo-miRNA)。DNA四面体纳米结构探针是利用核酸条形码序列设计或者直接利用生物素修饰,以分别作为试纸的测试区和质控区传感界面构建,以实现分子识别捕获和靶分子检测。CHA催化发夹结构自组装系统由两个底物发夹探针组成,可通过外泌体microRNA触发的可编程组装反应形成稳定的双链体。形成的双链体不仅通过互补序列与DNA四面体纳米结构探针杂交,而且还通过生物素与链霉亲和素修饰的胶体金(SA-AuNPs)结合。通过这些识别捕获程序,由于SA-AuNPs的固定于DNA纳米结构探针传感界面区域,该测试区域将显示一条红线。剩余的SA-AuNPs被质控区的生物素化DNA四面体传感界面捕获。由于条形码四面体探针和生物素化四面体探针同时消耗SA-AuNPs,检测线信号上升会导致质控线上信号下降,从而形成比率计试纸条。使用基于DNA四面体纳米结构探针传感界面的策略解决在传感界面区域的捕获探针随样品流移动的问题,比率计试纸条显示出54.75fM最低检测限和高选择性。基于DNA纳米结构探针的试纸条有望成为未经培训的人员最方便的生物传感平台之一,从而为快速准确地诊断外泌体microRNA等核酸生物标志物或分核酸生物标志物的检测提供可靠的方法。
1.1材料和试剂
柠檬酸三钠(C6H5Na3O7)、HAuCl4·3H2O、吐温-20和三-(羟甲基)氨基甲烷(Tris)是从上海生工生物科技有限公司订购。链霉亲和素购自索莱宝(Solarbio)科技有限公司。磷钨酸水合物购自Adamas-beta。样品垫、金标垫、吸收垫和背衬层购自上海杰一公司,硝酸纤维素膜购自密理博(Millipore)。表1中列出的所有寡核苷酸均由擎科生物科技有限公司合成纯化。购自上海金标公司的HM3035 XYZ平台用于制备测试线和控制线。颜色强度由苏州合迈精密仪器有限公司的GIC-H1便携式胶体金免疫分析仪测量。DNA四面体的原子力显微镜(Atomic Force Microscope,AFM)图像由德国Bruker Dension Icon扫描。透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)图像使用在300kV下运行的JEOL-1400Plus获取。纳米粒子跟踪分析(NTA)使用ZetaView PMX 110(德国Meerbusch的Particle Metrix)进行。琼脂糖凝胶电泳(Agarose Gel Electrophoresis,AGE)在电泳分析仪(中国六一仪器公司)上进行,然后在Bio-rad ChemDoc XRS(Bio-Rad,美国)上进行成像。其它试剂和化学品为分析级。
表1.这项研究中使用的寡核苷酸信息
1.2胶体金纳米粒子的合成与修饰
根据以前的文献,通过柠檬酸盐还原HAuCl4溶液以制备合成球形胶体金纳米粒子(AuNPs)。将AuNPs与K2CO3溶液与链霉亲和素混合,分别达到0.5mM和2μg/mL的浓度。然后将混合物在混合器上摇动60min,然后在室温下加入终浓度为0.1%(w/v)的牛血清白蛋白作为封闭剂封闭20min。随后,将混合物以12000rpm离心15min以收集红色沉淀,即链霉亲和素修饰的胶体金纳米粒子(SA-AuNPs)。最后,利用TEM图像和紫外-可见光谱对AuNPs的合成和修饰进行了表征。
1.3四面体纳米结构探针的制备
针对DNA四面体四条链进行捕获探针的核酸编码设计,使捕获探针区与发夹探针(H1)上的部分区域序列互补。在95℃下将用于形成四面体纳米结构探针的四条链进行等摩尔量混合于缓冲液(20mm Tris,50mm MgCl2,pH 8.0),然后冷却至4℃。将形成的四面体纳米结构探针储存在4℃以备将来使用。
1.4琼脂糖凝胶电泳
为了验证DNA四面体纳米结构探针和CHA电路的组装,采用2%琼脂糖凝胶电泳进行分析。在100V下在1×TBE缓冲液(90mM三硼酸和1mM EDTA,pH 8.0)中进行约35min电泳。接下来,通过Bio-rad ChemDoc XRS成像系统(Bio-Rad,美国)在紫外光下拍摄凝胶。
1.5原子力显微镜(AFM)成像
为了成像,将10μL的DNA样品沉积在抛光的硅晶片上10min,后用30μL水洗涤,然后在37℃下干燥。AFM图像使用德国Bruker Dension Icon扫描获取。
1.6比率计侧流层析试纸条生物传感器的制备
该层流层析试纸条由四个部分组成:样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。所有这些组件都安装在一个共同的背衬层上。将玻璃纤维制成的样品垫浸泡在含有20mMTris-HCl、0.5%吐温-20、2.0%(w/v)蔗糖和150mM NaCl的缓冲液(pH 7.3)中。然后,将样品垫在37℃下干燥2小时,并在室温下储存在干燥器中以备将来使用。通过将5μL链霉亲和素标记的胶体金溶液(SA-AuNPs)分配到玻璃纤维垫上来制备金标垫。将垫子在35℃下干燥1小时并储存在4℃。采用两种方法构建DNA四面体纳米探针传感界面。第一中方法,使用移液器将1μL四面体捕获探针作为点滴在测试区域。第二种方法,由HM3035 XYZ平台分配器执行,用于测试区和质控区作检测线制备。通过分别以2μL/cm的速度分配2μM DNA条形码四面体纳米结构探针或2μM生物素化四面体纳米结构探针来制备硝酸纤维素膜上的测试区和质控区。测试区和质控区之间的距离约为5mm。然后将膜在37℃下干燥1小时。随后,将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组装在具有1-2mm重叠位置的塑料胶背衬上,以确保样品流的迁移。最后,将组装好的板切成3毫米宽的碎片。将试纸条产品储存在室温下带有干燥剂的塑料盒中。
1.7比率计侧流层析试纸条传感器的分析程序
在检测之前,将H1和H2的发夹探针分别加热至95℃时长5min,然后逐渐冷却至25℃。接下来,将不同浓度的靶miRNA-150-5p与TaNK缓冲液(20mM,pH 7.5,140mM NaCl,5mMKCl)中的H1(50nM)和H2(50nM)的发夹探针混合物混合。然后在37℃孵育50min以触发CHA反应。然后将CHA溶液(总体积,50μL)转移到试纸条的样品垫上进行分析。等待10min后,胶体金(SA-AuNPs)在测试区和质控区的积累导致明显的红色条带。通过肉眼观察试纸测试区的颜色,实现了microRNA的可视化检测。用便携式胶体金免疫分析仪定量试纸条检测区和质控区红色条带的信号强度。
1.8外泌体分离和外泌体RNA提取
HK-2细胞在含有1%链霉素和青霉素以及10%FBS的DMEM中在37℃的5%CO2培养箱中孵育。当细胞达到培养瓶80-90%时,将细胞转移到无血清培养基中,再孵育48小时,然后收集细胞培养上清液。根据差异超速离心方法收集上清液。在4℃条件下以800g离心5min,在4℃条件下以2000g离心10min以除去细胞碎片。用0.22μm过滤器过滤后,然后将上清液在4℃条件下以174900g离心90min以获得沉淀外泌体。将沉积物外泌体用40mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)重悬,并在4℃条件下以174 900g再次离心90min。最后,除去上清液,并将外泌体重悬于PBS中待进一步研究。为了对HK-2外泌体进行TEM表征,将稀释的样品直接吸附在碳涂层铜网格上,然后用2%磷钨酸溶液进行负染后透射电镜表征。同时,在Zetaview和相应的软件ZetaView(版本8.05.14SP7)上利用纳米粒子跟踪分析(NTA)测试了外泌体的流体动力学半径和浓度。通过MagIso DNA/RNA分离试剂盒(西安天隆)提取外泌体总RNA。将总RNA分成两个等分试样,分别通过qRT-PCR和比率计层楼层析试纸条测量。
结果和讨论
2.1基于四面体捕获探头的条带传感器的设计原理
由于DNA四面体纳米结构具有可控性、载货量和机械稳定性等优异性能,我们提出了四面体作为探针的三维立体支架,并将组装好的负载探针的四面体纳米结构探针固定在传感区,以探索一种新型的基于DNA纳米结构探针传感界面的侧流层析试纸条。方案1示意说明了基于DNA四面体纳米探针的侧流层析试纸条传感器的原理。四面体支架序列基础上,A、B、C、D四条链的每条链的3'末端设计和修饰了生物素。将单链DNA作为探针以20μM的高浓度滴在硝酸纤维素膜上以制备传感界面。此外,利用链A、B、C、D组装四面体纳米结构探针,然后在硝酸纤维素膜上制备纳米结构探针传感界面。为了测试这些不同探针的识别捕获能力,设计并制备了链霉亲和素功能化的金纳米颗粒(SA-AuNPs)。假设当功能性AuNPs通过传感区时,探针将通过生物素-链霉亲和素反应与AuNPs结合。几分钟后,由于AuNP的聚集,将观察到一条红线。由于单链捕获探针在样品流过时即使与AuNPs发生反应也会移动,因此预测AuNPs的聚集现象很少发生,因此在传感检测区无红线显示。相反,假设四面体纳米探针可能在传感检测区上产生与单链探针不同现象。该假设基于一个金纳米颗粒修饰有大量的链霉亲和素,一个链霉亲和素与四个生物素发生结合反应,在一个四面体四个顶点上负载一个生物素分子可与链霉亲和素反应。在这种情况下,高分子量的三维SA-AuNPs/四面体纳米结构复合物可以通过生物素-链霉亲和素反应快速聚集。这种聚合过程被称为“超链接反应”。结果,样品溶液流过侧流层析试纸条上所构建的DNA纳米结构探针感应区时在该位置显示出一条深红检测线。
如图9,是基于DNA四面体纳米结构捕获探针的侧流层析试纸条设计策略。
2.2基于DNA四面体纳米结构探针的侧向层流试纸条的可行性
为了评估基于DNA四面体纳米结构捕获探针的侧流层析试纸的可行性,实验进行了单链捕获探针和四面体捕获探针的比较分析。如图1a所示,在链A、B、C和D的分别单独存在情况下,即使在20μM(非常高的探针浓度)下,传感检测区域中亦没有红色条带或只有几乎可以忽略不计的红色条带。这些结果表明,单链捕获探针在与功能性纳米金颗粒(SA-AuNPs)反应后难以停留并聚集在传感检测区。令人惊讶的是,存在2μM四面体捕获探针的情况下,观察到一条明显的红线。肉眼读出的信号表明,锚定在DNA四面体顶点上的生物素与涂覆在AuNPs上的链霉亲和素反应产生巨大的AuNPs/四面体纳米结构复合物,该复合物聚集在传感区,未随着样品流动向前移动。试纸条信号以强度值的形式记录在图中1b。此外,通过凝胶电泳和原子力显微镜探究验证了四面体纳米结构的组装。如图1c所示,通道1、2、3和4中的条带分别代表链A、B、C和D,设置为位置控制。泳道5中的条带是链B和链C的混合组装,其与泳道2和3中的条带相比迁移速度较慢,泳道6中的条带是链B、C和D的混合组装,迁移速度比泳道5中的迁移速率慢。泳道7的条带是链A、B、C和D的混合组装,迁移最慢。连续变慢迁移速率表明形成了更大的DNA杂交体,DNA四面体纳米结构探针如预期的那样成功组装。为了揭示组装好的DNA四面体纳米结构探针,我们进一步应用原子力显微镜(AFM)对DNA复合物进行成像。在AFM图像中,均匀大小的单个DNA纳米结构颗粒随机分布(图1d)。DNA颗粒类似于预期的四面体形状。因此,构建的DNA四面体纳米结构探针可以应用于侧流层析试纸上,这是首次探索发现和成功验证,这有望为基于纳米结构探针的侧流层析试纸上实现各种靶标分子的检测提供一种潜在的方法。
如图1,是本发明基于DNA四面体纳米结构探针的侧向层流试纸的可行性.(a)通过使用单链A、B、C、D和DNA四面体纳米结构探针作为捕获探针来评估测定识别捕获能力,从而改变条带传感器的颜色。(b)各种捕获探针试纸条的相应信号强度。(c)DNA四面体纳米结构探针组装的电泳验证。(d)DNA四面体纳米结构探针的AFM图像。
为了进一步探究基于四面体纳米结构探针的侧流层析试纸的原理并实现最佳的传感系统,我们测试了不同的实验条件。图2a显示了红色检测线随一个四面体上的生物素数变化而改变。当试纸条a中的一个四面体上的生物素为零时(图2a),没有红线可观察到,在没有捕获分子的情况下证明四面体对链霉亲和素标记的纳米金(SA-AuNPs)的迁移没有影响,并且没有产生不需要的非特异性红色条带。当在四面体顶点上加载生物素时,随着条带b-e顶点上生物素分子数量的增加,出现一条红线,且红色检测线变得深而清晰(图2a)。无生物素四面体与含生物素的对比数据验证了红色检测线的出现原理是由于四面体纳米结构探针特异捕获AuNPs,使其聚集在传感检测区。增强的条带信号可归因于生物素数量的增加。当一个四面体上加载更多生物素时,四面体纳米结构探针和链霉亲和素标记的纳米金(SA-AuNPs)形成较大复合物的聚集。基于这些结果,具有四个捕获探针的功能化的四面体在生物传感中具有第一优先级。图2b中的凝胶结果对应于图图2a中使用的生物素化四面体。不同生物素化四面体组装过程与图1c中的生物素化四面体相似,组装中使用的序列列于表S1中。结果发现,这些条带随着连续组装显示更短的电泳距离,证明了如预期的那样构建了加载不同生物素数的DNA四面体。进一步,生物素化四面体的浓度也进行优化。如图2c所示,读出信号从0.5至4.0μM的四面体浓度连续增加下变得清晰,并在2.0μM的浓度下接近平台。因此,在侧流层析试纸检测平台上开发外泌体microRNA检测方法的后续实验中,选择2.0μM四面体纳米结构捕获探针作为最佳浓度用于测试区和质控对照区传感界面构建。
如图2,通过改变不同的实验条件对基于四面体纳米结构捕获探针的侧向层流试纸进行深入研究。(a)由单个四面体设计加载0、1、2、3和4个生物素所构建传感界面试纸条的红色检测线条显示在a、b、c、d和e。(b)通过凝胶电泳表征试纸条传感器中使用的不同四面体纳米结构组装。(c)由四面体纳米结构探针的浓度为0、0.5、1、2、3和4μM的试纸条对应红色检测线如a、b、c、d、e和f所示。(d)对应于不同浓度的四面体纳米结构探针浓度为0、0.5、1、2、3至4μM的试纸条信号强度如a、b、c、d、e和f所示。
除四面体纳米结构探针所构建传感界面外,实验对AuNPs的制备和修饰进行了表征,研究了功能化胶体金报告系统(SA-AuNPs),如表征图3所示。图3a中的透射电子显微镜照片显示,球形纳米金(AuNPs)具有优异的分散性和均匀的尺寸,直径约为30nm。如图3b所示,由于局部表面等离子体共振(local surface plasmon resonance,LSPR)效应,AuNPs溶液呈深红色(管a),并且在520nm处存在最大吸收峰(光谱a)。两种结果都证实了AuNPs的成功制备。然而,在加入高浓度NaCl溶液后,深红色溶液变为蓝色,然后变为无色(管b),520nm处的吸收峰消失(光谱b),表明AuNPs在高浓度盐环境下聚集。用链霉亲和素修饰后,链霉亲和素标记的纳米金(SA-AuNPs)溶液在管c中的颜色和光谱c中的吸收峰没有变化。在管d和光谱d中观察到即使在0.5M NaCl溶液中SA-AuNPs溶液颜色和吸收峰均为改变。这些结果的原因是,在高盐条件下,受其外修饰链霉亲和素保护,SA-AuNPs呈分散状态,不发生聚集,表明修饰步骤成功。另外,图2c中SA-AuNPs通过链霉亲和素-生物素反应被生物素化四面体纳米结构探针捕获呈现红色检测线,该结果亦证明链霉亲和素修饰纳米金的步骤成功。
如图3.AuNPs的制备和修饰的表征。(a)制备纳米金(AuNPs)的TEM表征。(b)通过颜色和吸收峰的变化表征AuNPs的修饰步骤(管a和光谱a是加入盐溶液前的AuNPs,管b和光谱b是高盐条件下的AuNPs;管c和光谱c是链霉亲和素修饰的纳米金(SA-AuNPs),管d和光谱d是高盐条件下的SA-AuNPs溶液。
2.3用于检测外泌体microRNA的比率计试纸条感器的检测原理
方案2显示了用于检测外泌体microRNA的比率计试纸条传感器的检测原理。该传感器由两个主要组件组成:(i)四面体纳米结构捕获探针和(ii)催化发夹组装(CHA)电路。四面体纳米结构捕获探针(DT)设计中使得链A、B、C、D不存在复杂二级结构。然后,设计了两种四面体纳米结构捕获探针,包括tDT)和cDT,分别作为测试区和控制区的纳米结构捕获探针。通过在每条链的5'端编程设计一段序列,在四个顶点处用四个伸出的捕获探针构建tDT。类似地,通过在每条链的3'端添加四个生物素基团,在四个顶点处用四个生物素基团构建cDT。在CHA电路中,设计了两个具有茎环结构的发夹探头,分别称为H1和H2。H1在其5'端编程了一个序列,该序列与tDT顶点上的捕获序列互补。H2在其5'末端用生物素标记。在没有靶microRNA-150-5p的情况下,H1和H2在缓冲液中稳定共存,因为它们之间的互补序列在茎部区域被封闭阻断。在靶microRNA-150-5p存在下,两个发夹探针相继解链并形成双链杂交体。一方面,tDT通过H1和tDT之间的互补序列捕获H1/H2杂交体。另一方面,它通过H2上标记的生物素进一步捕获链霉亲和素标记的纳米金(SA-AuNPs),形成三明治状结构。显然,H1/H2杂交体将AuNPs和tDT作为桥梁聚集在一起,当样品溶液流过测试区域时,导致AuNPs聚集,从而可以观察到一条红线。具体来说,H1首先被microRNA-150打开,在茎上释放其序列。H1的释放茎序列被指定为通过脚趾进行链置换结合H2,释放microRNA-150并生成H/H2复合物。反过来,释放的靶microRNA-150启动了下一轮杂交/置换反应,形成CHA回路。经过多轮CHA反应后,形成了大量的H/H2杂交体,通过锚定在顶点上的生物素被cDT捕获测试线上链霉亲和素标记的AuNPs,显示一条红线作为检测线。随着microRNA-150的增加,形成了更多的H1/H2桥,导致更深的红线。由于链霉亲和素标记的AuNPs在测试线上被捕获,因此在质控对照区上生物素化四面体纳米结构探针捕获较少的链霉亲和素标记的AuNPs。因此,测试线上的递增信号和控制线上的递减信号(T/C的比率)形成比率计试纸条传感器。
如图10,是本发明基于四面体纳米结构捕获探针和催化发夹组装电路检测外泌体microRNA-150-5p的比率计试纸条传感器示意图。
2.4比例试纸检测外泌体microRNA-150-5p的可行性
四面体捕获探针和CHA电路是比率计试纸条传感器的两个主要组成部分,因此通过凝胶电泳和AFM进行相关的表征分析。图4a中的凝胶图像反映了tDT的组装过程。泳道1和2中的条带分别是链B和C,3、4和5中的条带是链B和C,链B、C和D,链B、C、D和A的杂交体。随着tDT的连续组装,电泳条带的迁移距离逐渐缩短,表明已经按照设计形成了更大的杂交体。从泳道5中最慢的迁移速率可以得出结论,tDT已成功构建。图4b中的AFM图像从大小和形貌进一步表明了tDT的四面体纳米结构。同时,为了测试CHA电路是否按照设计工作,进行了凝胶电泳。如图4c所示,泳道1和2中的条带分别为H1和H2。当将microRNA-150添加到H1中时,在泳道3中观察到具有缓慢迁移的条带,代表microRNA-150与H1杂交形成具有高分子量的microRNA-150/H1复合物。此时,H1的发夹结构被打开,其在茎上的支持结合位点暴露在延伸的单链中。泳道4中的条带代表将H2添加到microRNA-150和H1的混合物中,迁移距离最短。产生这一结果的原因是H1上新暴露的单链结构域通过支撑结构域杂交到发夹H2,触发microRNA从H1的置换脱离并形成分子量更大的产物双链H1/H2复合物。泳道5是含有H1和H2的反应体系,显示了对应于H1和H2的两个独立条带,表明没有靶microRNA时,H1和H2共存。这些结果表明,催化发夹结构组装(CHA)按设计进行。最后,在试纸上考察了比率计试纸条传感器检测外泌体microRNA-150-5p的可行性,结果如图4d所示。在单独存在H1或H2的情况下,在条带a和b中仅观察到一条红色质控对照线。在H1和H2同时存在的情况下,在条带d中也只观察到一条红色质控线,证明了H1和H2在反应溶液中的稳定共存,避免了非特异性信号的产生。将microRNA-150-5p加入H1和H2的溶液中,导致分别对应于测试区和质控对照区的条带c中出现两条红线。测试线的出现归因于由microRNA-150触发的H1/H2复合物的产生,该复合物像桥梁一样将链霉亲和素标记的AuNPs连接到四面体纳米结构捕获探针上。当图4c中的测试线信号强度增加导致质控对照线信号减小,形成测试线信号增加和质控线信号下降的比率计试纸条传感器。因此,CHA电路由靶microRNA-150-5p特异启动,并按预期设计构建基于DNA四面体纳米结构探针传感界面的比率计试纸条传感器,以用于检测外泌体microRNA-150-5p。
如图4.基于四面体纳米结构探针和CHA电路的外泌体microRNA-150-5p比率计试纸条传感器的可行性研究。(a)通过凝胶电泳表征四面体纳米结构捕获探针的组装。(b)通过AFM图像表征四面体纳米结构探针。(c)通过凝胶电泳表征CHA电路。(d)比率计试纸条传感器的靶标响应。
2.5比率计侧流层析试纸条传感器的灵敏度分析
在最佳条件下,评估了比率计侧流层析试纸条传感器的分析性能。随着靶标miRNA-150-5p浓度的增加,测试线的红色信号强度逐渐增强,而质控对照线的红色信号强度则逐度减弱(图5a)。T/C强度之比与miRNA-150浓度的对数在0.1pM至10nM范围呈线性关系(图5b)。线性方程为I=0.26lg c+3.54,相关系数为0.99076。按照信噪比=3原则,最低检测限(limit of detection,LOD)为54.75fM。比率计侧流层析试纸条传感器具有较宽的动态范围、低的检测限和短的测定时间,从而未miRNA-150-5p的快速检测提供床旁检测新方法。
如图5,灵敏度分析,(a)10-13、10-12、10-11、10-10、10-9和10-8M不同浓度的miRNA-150-5p对应的侧流层析试纸结果及测试线和质控对照线的相应红色信号度。(b)强度比(T/C)与miRNA-150-5p浓度对数之间的线性关系。
2.6比率计侧流层析试纸条传感器的特异性分析
特异性是评估分析物检测中比率式试纸传感器的另一个重要因素。选择单碱基错配miRNA(SM miR-150-5p)、双碱基错配miRNA、随机miRNA和miR-21-5p4种miRNA序列来测试其特异性。如图6所示,与miR-150-5p(带b)相比,存SM miR-150-5p(条带c)对应的T/C比率信号强度要弱得多。此外,与完全匹配的靶标miR-150-5p相比,双碱基错配靶标(条带d)、随机microRNA(条带e)和miR-21-5p(条带f)产生的T/C比率信号强度极低,等同于空白信号(条带a)。检测结果表明,所构建的比率计试纸条生物传感器具有良好的特异分辨microRNA-150-5p同源序列能力,具备单碱基错配区分的性能。
如图6特异性分析,(a)不同microRNA-150-5p模拟同源序列在100pM浓度下的试纸条结果以及测试线和质控对照线的相应红色可视化信号强度。(b)对应于microRNA-150-5p模拟同源序列的T/C比率信号的强度。
2.7外泌体mocroRNA-150-5p的实际样本测定
为了验证所构建比率计试纸条传感器在实际样本中的分析性能,我们量化测定HK-2细胞释放的外泌体中的靶miR150-5p。相关结果如图7所示。TEM图像显示HK-2外泌体呈分散生物纳米颗粒,直径为90-120nm(图7a)。纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle trackinganalysis,NTA)显示收集的外泌体浓度为3.0×106颗粒/mL(图7b),并展示了以113nm为中心的HK-2外泌体的尺寸分布。接下来,我们采用比率计试纸条来检测从HK-2外泌体中提取的总RNA中的microRNA-150-5p。同时,所构建比率计试纸条方法与qPCR结果作为参考进行对比分析。如图7c所示,外泌体miR150-5p的浓度计算在1.43pM,与实时荧光PCR测量的1.72pM数据吻合良好(图8)。因此,基于DNA纳米结构探针传感界面的比率计试纸条在外泌体miR150-5p实际检测中具有很高的应用潜力。如图7为HK-2细胞中外泌体mocroRNA-150-5p的检测,(a)HK-2外泌体的透射电镜图像。(b)通过纳米颗粒跟踪分析获得的HK-2外泌体的浓度和尺寸分布。(c)所构建比率计试纸传感器检测外泌体中提取总RNA中的mocroRNA-150-5p实(a)和荧光PCR(b)。
如图8,实时荧光定量PCR测定从HK-2细胞外泌体中提取总RNA的miRNA-150-5p。(a)miRNA-150-5p标准品产生的PCR扩增曲线(a-e、10-13、10-12、10-11、10-10和10-9M)和从HK-2细胞提取外泌体总RNA中的miRNA-150-5p的PCR扩增曲线(f)。(b)由miRNA-150-5p标准品所建立的线性方程。
结论
综上,本发明基于DNA四面体纳米结构探针和催化发夹自组装,提出了一种新型的比率计试纸条传感器。该传感器在测试线中增加了红色可视化信号强度,在质控线中减少了红色可视化信号。DNA四面体已被广泛用于探索各种生物传感器,用于体外诊断以及细胞和细胞表面的原位检测。目前,DNA纳米结构探针尚未用于侧向层析试纸中,而侧流层析试纸是临床中实际检测不同目标物种的非常重要的快速传感检测平台。本研究首先提出了一种利用DNA四面体纳米结构探针在试纸条传感检测区制备传感检测界面的新方法,解决了核酸探针须与蛋白质分子连接形成大分子复合物的制备难题。由于采用了CHA电路和比率策略,在100fM至10nM的宽线性范围内实现了54.75fM的最低检测限。该试纸条生物传感器在外泌体microRNA-150-5p的实际检测中表现出较高的灵敏度和巨大的应用潜力。因此,所发现验证的DNA纳米结构探针提供了一种在试纸平台上构建生物传感界面的通用方法,可应用与核酸标志物检测及细胞、外泌体、蛋白和小分子等非核酸标志物检测,具有优良的应用现场分析或床旁检测前景。所构建比率计试纸条为外泌体microRNA检测提供了一种POCT型检测新方法。
对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节,而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外,应当理解,虽然本说明书按照实施方式加以描述,但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案,说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见,本领域技术人员应当将说明书作为一个整体,各实施例中的技术方案也可以经适当组合,形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (3)
1.一种基于DNA纳米结构捕获探针侧流层析试纸条的制备方法,其特征是,包含以下步骤:
1)胶体金纳米粒子的合成与修饰
通过柠檬酸盐还原HAuCl4溶液,制备合成球形胶体金纳米粒子AuNPs,将AuNPs与K2CO3溶液与链霉亲和素混合,浓度分别为0.5 mM和2 μg/mL;然后将混合物在混合器上摇动60min,在室温下加入终质量浓度为0.1%的牛血清白蛋白作为封闭剂封闭20 min;再将混合物以12000rpm离心15 min收集红色沉淀,即得到链霉亲和素修饰的胶体金纳米粒子SA-AuNPs;
2)四面体纳米结构探针的制备
针对DNA四面体四条链进行捕获探针的核酸编码设计,使捕获探针区与发夹探针H1上的部分区域序列互补;在95 ℃下将用于形成四面体纳米结构探针的四条链进行等摩尔量混合于缓冲液 20 mm Tris,50 mm MgCl2,pH 8.0,然后冷却至4 ℃;
3)试纸条的制备
该层流层析试纸条由四个部分组成:样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫;四个组件都安装在一个共同的背衬层上;将玻璃纤维制成的样品垫浸泡在含有20 mM Tris-HCl、0.5%吐温-20、质量浓度2.0%的蔗糖和150 mM NaCl pH 7.3的缓冲液中;然后,将样品垫在37℃下干燥2小时;通过将 5 μL 链霉亲和素标记的胶体金溶液SA-AuNPs分配到玻璃纤维垫上来制备金标垫,将垫子在35 ℃下干燥1小时然后在4℃下储存;
构建DNA四面体纳米探针传感界面,使用移液器将 1 μL 四面体捕获探针作为点滴在测试区域,然后将膜在37℃下干燥1小时,再将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组装在具有1-2 mm重叠位置的塑料胶背衬上,再将组装好的板切成 3 毫米宽的试纸条,即可。
2.根据权利要求1所述的基于DNA纳米结构捕获探针侧流层析试纸条的制备方法,其特征是:所述步骤3)中,构建DNA四面体纳米探针传感界面,包含测试区和质控区检测线,由HM3035 XYZ平台分配器执行,分别以2 μL/cm的速度分配2 μM DNA四面体纳米结构探针或2μM生物素化四面体纳米结构探针,测试区和质控区之间的距离约为5 mm。
3.一种如权利要求1所述基于DNA纳米结构捕获探针侧流层析试纸条的制备方法制备的试纸的应用,其特征是:该试纸用于外泌体microRNA的可视化检测。
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