CN116024307A - 一种含组织位置信息的单细胞文库构建方法及测序方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含组织位置信息的单细胞文库构建方法及测序方法，包括以下步骤：S10、提供芯片，所述芯片具有多个位点，每一位点上具有已知碱基序列的核酸分子，所述核酸分子含有位置信息；S20、将待测组织的切片与所述芯片接触，以使所述芯片中的具有已知碱基序列的核酸分子与所述待测的组织切片的细胞结合，得到结合组织切片；S30、将结合组织切片解离制备成单细胞悬液；S40、通过高通量单细胞建库测序平台对单细胞悬液构建文库，得转录组文库与空间标签文库；S50、对转录组文库与空间标签文库进行测序，得到含组织位置信息的单细胞文库。本发明可以在单细胞水平上分析遗传信息的同时还可以测到该单细胞的空间位置信息。

Description

一种含组织位置信息的单细胞文库构建方法及测序方法

技术领域

本发明涉及基因测序和组织细胞样本分析技术领域，特别涉及一种含组织位置信息的单细胞文库构建方法及测序方法。

背景技术

众所周知复杂的生命机体由许多性质特异的细胞组成，在特定的状态下每个细胞表达的核酸和蛋白的种类与数量都有所不同，所以在单细胞水平上检测核酸和蛋白指标以及所处的细胞微环境对生物医学研究有重要意义。

目前包括高通量单细胞转录组在内的单细胞研究技术只能在单细胞水平上分析其核酸信息及部分蛋白信息，但对于单个细胞在组织中所处的空间位置所知甚少。为了在组织水平上深入了解核酸信息，科学家开发了各种空间组学技术，包括FISSEQ、Slide-seq、10× Visium、HDST、SeqFish、MerFish、STARmap等。这些技术根据实现方式不同大致可分为原位杂交、原位捕获和原位测序三种类型，其中原位杂交（SeqFish和MerFish）与原位测序（FISSEQ和STARMAP）技术都依赖于感兴趣的基因设计探针实现，原位捕获技术（Slide-seq、10× Visium和HDST）能够针对全部转录组进行无假设的实验，因此在科学研究中应用较广，商业化价值较大。但是原位捕获技术的原理是在组织位置层面分析RNA信息,然后再利用软件根据每条RNA的位置信息模拟所归属的细胞，而非在组织单细胞的真实物理水平上进行直接分析。尤其是考虑到原位捕获时RNA随机扩散以及切片中存在多层细胞的情况会导致RNA的真实细胞定位严重失真，开发一种能够同时检测单细胞所在组织空间位置信息和单细胞核酸的单细胞技术迫在眉睫。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种含组织位置信息的单细胞文库构建方法，旨在提供一种对组织中单个细胞进行位置和遗传信息共分析的建库方法，该方法可以在真实单细胞水平上分析遗传信息（如转录组、ATAC、甲基化等）的同时还可以测到该单细胞的空间位置信息。

为实现上述目的，本发明提出一种含组织位置信息的单细胞文库构建方法，包括以下步骤：

S10、提供芯片，所述芯片具有多个位点，每一位点上具有已知碱基序列的核酸分子，所述核酸分子含有位置信息；

S20、将待测组织的切片与所述芯片接触，以使所述芯片中的具有已知碱基序列的核酸分子与所述待测的组织切片的细胞结合，得到结合组织切片；

S30、将结合组织切片解离制备成单细胞悬液；

S40、通过高通量单细胞建库测序平台对单细胞悬液构建文库，得转录组文库与空间标签文库；

S50、对转录组文库与空间标签文库进行测序，得到含组织位置信息的单细胞文库。

可选地，步骤S10中：

不同位点上具有不同已知碱基序列核酸分子，同一位点上具有相同已知碱基序列的核酸分子；和/或，

位点之间的间距为100nm~1mm。

可选地，步骤S10中：

所述芯片可以是平面芯片，具有位置信息的核酸分子簇独立的相对均匀的分布在芯片表面；和/或，

所述芯片具有微孔，所述微孔中具有介质，具有位置信息的核酸分子分布在芯片微孔中的介质上或偶联在芯片表面；和/或，

所述芯片具有微孔，所述微孔中具有介质，所述芯片微孔中的介质包括：聚合物微珠、磁性微珠及水凝胶微珠的任意一种；和/或，

芯片的材质包括玻璃、ITO玻璃、聚合物、ITO聚合物以及硅片中的任意一种。

可选地，步骤S10中：

具有位置信息的核酸分子偶联有与细胞中特定物质结合的分子。

可选地，所述与细胞中特定物质结合的分子包括凝集素，所述细胞中特定物质为糖蛋白；或，

所述与细胞中特定物质结合的分子包括抗体，所述细胞中特定物质为β2-微球蛋白；或，

所述与细胞中特定物质结合的分子包括脂类分子，所述细胞中特定物质为脂质双分子层；或，

所述与细胞中特定物质结合的分子包括核酸，所述细胞中特定物质为mRNA。

可选地，在步骤S10和S20之间，还包括：

使用醛类固定液、酸类固定液、醇类固定液及DSP交联剂中的任意一种固定剂对待测组织的切片的细胞进行浸泡处理；和/或，

使用醇类或表面活性剂对待测组织的切片的细胞进行浸泡处理。

可选地，步骤S10中，芯片由以下步骤制得：

S01、合成多种具有不同位置标签序列的核酸分子；

S02、将合成的核酸分子与芯片对应位置相互接触，使得合成的核酸分子固定到芯片对应位置，得到含有位置信息的核酸分子的芯片。

可选地，步骤S01中：

所述核酸分子包括固定序列-条件性可断裂位点-位置标签-细胞结合分子，其中所述条件性可断裂位点包括：双硫修饰、dU修饰、RNA碱基修饰、dI修饰、DSpacer修饰、AP位点修饰、光断裂PC linker以及限制性内切酶识别序列中的任意一种；和/或，

所述核酸分子包括5’偶联集团和分子标签序列，其中，所述5’偶联集团包括化学交联剂、Biotin、亲和素及链霉亲和素中的任意一种。

可选地，步骤S01中：

所述核酸分子包括5’偶联集团和分子标签序列，其中，所述5’偶联集团包括化学交联剂、Biotin、亲和素及链霉亲和素中的任意一种，其中，所述化学交联剂包括胱胺、戊二醛、二甲基亚磺酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺交联剂BS3、甲醛、碳二亚胺、SMCC、磺基-SMCC、乙烯基硅烷、N ,N '-二烯丙基酒石酸二酰胺、N ,N '-双丙烯酰基胱胺中的任意一种。

可选地，步骤S02中：

所述合成的核酸分子固定到芯片对应位置的固定方法包括原位接触法和随机固定法中的任意一种。

本发明还提出了一种测序方法，包括以下步骤：

采用所述的含组织位置信息的单细胞文库构建方法构建单细胞文库，获得转录组文库与空间标签文库；

对获得的转录组文库与空间标签文库进行测序，得单细胞转录组数据和空间标签文库数据；

根据已知碱基序列中的核酸分子的位置信息和遗传信息对应到待测组织，得到待测组织单细胞的位置信息和遗传信息。

其中，所述含组织位置信息的单细胞文库构建方法包括以下步骤：

S10、提供芯片，所述芯片具有多个位点，每一位点上具有已知碱基序列的核酸分子，所述核酸分子含有位置信息；

S20、将待测组织的切片与所述芯片接触，以使所述芯片中的具有已知碱基序列的核酸分子与所述待测的组织切片的细胞结合，得到结合组织切片；

S30、将结合组织切片解离制备成单细胞悬液；

S40、通过高通量单细胞建库测序平台对单细胞悬液构建文库，得转录组文库与空间标签文库；

S50、对转录组文库与空间标签文库进行测序，得到含组织位置信息的单细胞文库。

本发明提供了一种含组织位置信息的单细胞文库构建方法，通过具有位置信息的核酸芯片与待测组织切片接触，可以将位置信息释放到组织细胞中，从而在后续解离组织细胞的过程中，使得组织信息的位置信息被读取，从而可以在单细胞水平上分析遗传信息的同时还可以测到该单细胞的空间位置信息。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为本发明一实施例中使用可与组织中细胞结合分子是非核酸分子时的含位置信息的单细胞测序原理示意图；

图2为本发明一实施例中使用可与组织中细胞结合分子是核酸时的含位置信息的单细胞测序原理示意图；

图3为本发明一实施例中使用的平面和具有微孔结构的空间核酸芯片结构示意图；

图4为本发明一实施例中核酸芯片上的具有空间位置信息的核酸分子结构示意图；

图5为本发明一实施例中使用原位接触法构建空间核酸芯片原理示意图；

图6为本发明一实施例中使用使用介质连接位置信息后随机固定法构建空间核酸芯片原理示意图；

图7为本发明一实施例的含空间标签单细胞文库结构图；

图8为本发明一实施例的空间标签文库质控图；

图9为本发明一实施例的含空间标签单细胞文库质控图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

众所周知复杂的生命机体由许多性质特异的细胞组成，在特定的状态下每个细胞表达的核酸和蛋白的种类与数量都有所不同，所以在单细胞水平上检测核酸和蛋白指标以及所处的细胞微环境对生物医学研究有重要意义。

目前包括高通量单细胞转录组在内的单细胞研究技术只能在单细胞水平上分析其核酸信息及部分蛋白信息，但对于单个细胞在组织中所处的空间位置所知甚少。为了在组织水平上深入了解核酸信息，科学家开发了各种空间组学技术，包括FISSEQ、Slide-seq、10× Visium、HDST、SeqFish、MerFish、STARmap等。这些技术根据实现方式不同大致可分为原位杂交、原位捕获和原位测序三种类型，其中原位杂交（SeqFish和MerFish）与原位测序（FISSEQ和STARMAP）技术都依赖于感兴趣的基因设计探针实现，原位捕获技术（Slide-seq、10× Visium和HDST）能够针对全部转录组进行无假设的实验，因此在科学研究中应用较广，商业化价值较大。但是原位捕获技术的原理是在组织位置层面分析RNA信息,然后再利用软件根据每条RNA的位置信息模拟所归属的细胞，而非在组织单细胞的真实物理水平上进行直接分析。尤其是考虑到原位捕获时RNA随机扩散以及切片中存在多层细胞的情况会导致RNA的真实细胞定位严重失真，开发一种能够同时检测单细胞所在组织空间位置信息和单细胞核酸的单细胞技术迫在眉睫。

鉴于此，本发明提供了一种含组织位置信息的单细胞文库构建方法，如图1和图2所示，旨在提供一种对组织中单个细胞进行位置和遗传信息共分析的建库方法。

本发明所提供的一种含组织位置信息的单细胞文库构建方法的第一实施例中，包括以下步骤：

S10、提供芯片，所述芯片具有多个位点，每一位点上具有已知碱基序列的核酸分子，所述核酸分子含有位置信息；

S20、将待测组织的切片与所述芯片接触，以使所述芯片中的具有已知碱基序列的核酸分子与所述待测的组织切片的细胞结合，得到结合组织切片；

S30、将结合组织切片解离制备成单细胞悬液；

S40、通过高通量单细胞建库测序平台对单细胞悬液构建文库，得转录组文库与空间标签文库；

S50、对转录组文库与空间标签文库进行测序，得到含组织位置信息的单细胞文库。

本发明的技术方案中，通过具有位置信息的核酸芯片与待测组织切片接触，可以将位置信息释放到组织细胞中，从而在后续解离组织细胞的过程中，使得组织信息的位置信息被读取，从而可以在单细胞水平上分析遗传信息的同时还可以测到该单细胞的空间位置信息。

进一步地，步骤S10中，不同位点上具有不同已知碱基序列核酸分子，同一位点上具有相同已知碱基序列的核酸分子。这样便于在后续的过程中快速准确确定待测组织细胞的位置信息。

进一步地，步骤S10中，位点之间的间距为100nm~1mm。具体的可以在1um~100um之间，更具体的可以在5~50um之间，优选的可以在5~10um之间。这样便于使得每个待测组织细胞均能结合到位置信息的核酸分子。

进一步地，如图3所示，步骤S10中，所述芯片为平面，具有位置信息的核酸分子以相对独立的成簇方式固定在芯片表面。这样设置，可以使得芯片上的核酸分子跟好地与待测组织细胞接触，便于结合。

进一步地，如图3所示，步骤S10中，所述芯片具有微孔，所述微孔中具有介质，具有位置信息的核酸分子分布在芯片微孔中的介质上或偶联在芯片表面。这样设置，便于核酸分子分布在芯片上，又能便于与待测组织中的细胞结合。

进一步地，步骤S10中，所述芯片具有微孔，所述微孔中具有介质，所述芯片微孔中的介质包括：聚合物微珠、磁性微珠及水凝胶微珠的任意一种，通过微珠设计，便于介质落孔到位点上。介质可以是可裂解的也可以是不能裂解的。

进一步地，步骤S10中，芯片的材质包括玻璃、ITO玻璃、聚合物、ITO聚合物以及硅片中的任意一种，可根据需要选择不同的材质。

进一步地，步骤S10中，具有位置信息的核酸分子偶联有与细胞中特定物质结合的分子。便于具有位置信息的核酸分子结合到待测组织的细胞中。

在本发明的一些实施例中，步骤S10中，所述与细胞中特定物质结合的分子包括凝集素，所述细胞中特定物质为糖蛋白，通过凝集素与糖蛋白特异性结合从而将芯片上的位置信息核酸结合到待测组织细胞中，使得待测组织细胞的位置被标记。

在本发明的一些实施例中，步骤S10中，所述与细胞中特定物质结合的分子包括抗体，所述细胞中特定物质为β2-微球蛋白，通过抗体与β2-微球蛋白类的细胞共有的抗原特异性结合，从而将芯片上的位置信息核酸结合到待测组织细胞中，使得待测组织细胞的位置被标记。

在本发明的一些实施例中，步骤S10中，所述与细胞中特定物质结合的分子包括脂类分子，所述细胞中特定物质为脂质双分子层，通过脂类分子与脂质双分子层特异性结合，从而将芯片上的位置信息核酸结合到待测组织细胞中，使得待测组织细胞的位置被标记。

在本发明的一些实施例中，步骤S10中，所述与细胞中特定物质结合的分子包括核酸，所述细胞中特定物质为mRNA。通过核酸如oligo-dT可以与所有mRNA的polyA尾巴进行杂交结合，从而将芯片上的位置信息核酸结合到待测组织细胞中，使得待测组织细胞的位置被标记。

进一步地，在步骤S10和S20之间，还包括：使用醛类固定液、酸类固定液、醇类固定液及DSP交联剂中的任意一种固定剂对待测组织的切片的细胞进行浸泡处理，使得细胞固定不移动，更加有效的使核酸分子结合至临近待测组织的细胞。

进一步地，在步骤S10和S20之间，还包括：对待测组织的切片的细胞进行透化处理，透化处理的方法包括使用醇类或表面活性剂对待测组织的切片的细胞进行浸泡处理。透化处理破坏细胞膜或核膜的完整性，更加有效的使核酸分子结合至临近待测组织的细胞。

需要说明的是，如果可与细胞结合的是核酸分子oligo-dT，步骤S20中还可以进一步进行逆转录反应以增加位置信息与细胞的结合稳定性。

此外，步骤S30中，解离组织切片制备为单细胞悬液，解离过程中不破坏含有位置信息的核酸与细胞之间的结合关系。

使用高通量单细胞建库测序平台对单细胞悬液构建文库。含有位置信息的核酸分子的不同结构和组织固定方案需要使用不同原理的单细胞建库平台，如表1所示举例了在使用二硫双(琥珀酰亚胺丙酸酯)DSP固定组织时不同核酸结构对应的单细胞建库平台。单细胞建库平台按照原理不同分为3’单细胞转录组和5’单细胞转录组，当空间位置核酸分子末尾是polyA尾巴时（位置标签结构-1）可以使用成熟的3’建库试剂盒，如SeekOne® 3’单细胞转录组试剂或10× Genomics 3’单细胞试剂与BiolegendHashTagTM实验流程方案分别得到空间标签文库和单细胞3’转录组文库；当空间位置核酸分子末尾是能够与5’试剂中模板转换序列互补配对的CCCATATAAGAAA碱基序列时（位置标签结构-2），可以使用成熟的5’建库试剂盒，如SeekOne® 5’单细胞转录组试剂或10× Genomics 5’单细胞试剂V2与BiolegendTotalSeqTM -C实验流程方案分别得到空间标签文库和单细胞5’转录组文库；当空间位置核酸分子末尾是oligo-dT30而非其它细胞结合分子时（位置标签结构-3），可以使用成熟的5’建库试剂盒直接构建5’单细胞文库，如SeekOne® 5’单细胞转录组试剂或10×Genomics 5’单细胞试剂V2，只需在cDNA扩增步骤额外加入Rd2 SeqPrimer扩增引物并且分选出300-800bp的cDNA扩增产物进一步index PCR即可得到额外的空间标签文库。

进一步地，步骤S10中，芯片由以下步骤制得：

S01、合成多种具有不同位置标签序列的核酸分子；

S02、将合成的核酸分子与芯片对应位置相互接触，使得合成的核酸分子固定到芯片对应位置，得到含有位置信息的核酸分子的芯片。

先合成具有不同位置标签序列的核酸分子再将具有不同位置标签序列的核酸分子与芯片对应位置相互接触可以使得芯片的位点上的位置信息是清楚的，便于对待测组织的细胞的位置信息进行追踪。

进一步地，如图4所示，步骤S01中，所述核酸分子包括固定序列-条件性可断裂位点-位置标签-细胞结合分子，其中所述条件性可断裂位点包括：双硫修饰、dU修饰、RNA碱基修饰、dI修饰、DSpacer修饰、AP位点修饰、光断裂PC linker以及限制性内切酶识别序列中的任意一种，如此设置，可以便于断裂。

进一步地，步骤S01中，所述核酸分子包括5’偶联集团和分子标签序列，其中，所述5’偶联集团包括化学交联剂、Biotin、亲和素及链霉亲和素中的任意一种。5’偶联集团可以和芯片基质或者芯片微孔中的介质表面进行反应从而固定其上。

进一步地，步骤S01中，所述核酸分子包括5’偶联集团和分子标签序列，其中，所述5’偶联集团包括化学交联剂、Biotin、亲和素及链霉亲和素中的任意一种，其中，所述化学交联剂包括胱胺、戊二醛、二甲基亚磺酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺交联剂BS3、甲醛、碳二亚胺、SMCC、磺基-SMCC、乙烯基硅烷、N ,N '-二烯丙基酒石酸二酰胺、N ,N '-双丙烯酰基胱胺中的任意一种。

需要说明的是，步骤S01中，位置标签可以一次性合成后直接偶联在芯片或者微孔介质上，也可以采用split-pool方案分段式偶联到芯片或者微孔介质上；能与细胞中物质相互结合的分子可以直接合成在位置标签的3’端，也可以在制成空间位置核酸芯片后再与位置标签序列的3’端连接，连接方式可以是如上提到的化学交联剂，也可以是生物素、亲和素以及酶介导的生物连接。具有位置信息的核酸分子中可以加入本领域内熟知的核酸修饰，包括但不限于氨基、磷酸、炔基、叠氮、巯基、双硫、烯烃、生物素、偶氮苯、甲基、spacer、光裂解集团、dI、dU、LNA、XNA、核糖核酸碱基和双脱氧核糖核酸碱基等中的一种或多种。

进一步地，步骤S02中：所述合成的核酸分子固定到芯片对应位置的固定方法包括原位接触法和随机固定法中的任意一种。具体地，具有位置信息的核酸分子与芯片相互接触可以有两种方案：原位接触法（图5）和使用介质连接位置信息后随机固定法（图6）。如图5所示，原位接触法包括使用喷墨设备将已知位置序列的核酸分子与芯片基质的不同位置接触并连接，核酸分子可以在芯片表面或者微孔中一次或者多次连接从而制成具有特定芯片位置与核酸位置序列相对应的核酸芯片。芯片的相同位置连接上具有相同位置标签的核酸分子，不同位置连接上具有不同位置标签的核酸分子；核酸分子可以和芯片基质表面直接偶联，也可以与芯片微孔中的介质相连；喷墨设备可以采用压电陶瓷仪器jetlab4，也可以采用多通道喷墨设备Mercurymicroarrayer。如图6所示，使用介质连接位置信息后随机固定法是首先制备具有不同位置信息的介质，然后将介质随机与芯片的不同位置接触从而获得位置芯片。该介质可以是磁珠或者水凝胶等聚合物微球，同一个微球上偶联有相同的位置信息分子，不同的微球上偶联有不同的位置信息分子；位置信息与微球的结合可以是一步结合，也可以是多步连接；可以是先合成后连接，也可以直接将位置信息分子合成在介质上；具有位置信息的介质与芯片随机接触形成核酸芯片后需要解码后明确对应位置上的介质对应的具体位置核酸序列。随机固定法还包括核酸单分子随机固定后成簇技术。

需要说明的是，所述核酸分子的位置标签结构可以是Rd2 seqPrimer-位置标签-dA30-binding group（BG），采用3’单细胞建库法，具体序列为：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnNNNNNNNNAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-ConA。也可以是Rd2 seqPrimer-位置标签-TSO-binding group，采用5’单细胞建库，具体序列为：CGGAGATGTGTATAAGAGACAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnNNNNNNNNCCCATATAAGAAA-ConA。也可以是固定核酸序列-位置标签-dT30（binding group），采用5’单细胞建库，具体序列为：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT。或是固定核酸序列-位置标签-dT30（bindinggroup），采用5’单细胞建库，具体序列为：CTCTTTTTTTTUCGTCCGTCGTTGCTCGjjjjjjjjACTGGTGAjjjjjjjjGGTAGTGACAjjjjjjjjNNNNNNNNAGACGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT。

本发明还提出了一种测序方法，包括以下步骤：

采用所述的含组织位置信息的单细胞文库构建方法构建单细胞文库，获得转录组文库与空间标签文库；

对获得的转录组文库与空间标签文库进行测序，得单细胞转录组数据和空间标签文库数据；

根据已知碱基序列中的核酸分子的位置信息和遗传信息对应到待测组织，得到待测组织单细胞的位置信息和遗传信息。

具体地，测序时，分别对得到的转录组文库与空间标签文库进行测序，测序可以选用illumina测序仪或者华大测序仪以及所有能够兼容测序接头的测序平台；更进一步的，本专业的普通技术人员都可以根据不同的测序平台的要求修改空间位置标签前面的引物序列以适用于不同测序平台，这些改动均不影响本专利的技术保护范围。

具体地，数据分析时，首先根据所有细胞标签测到的UMI数量可以得到预估的细胞数及相对应的细胞标签，进一步根据每个细胞标签对应的特异性的RNA表达情况确定该细胞的类型及生理状态；其次从空间标签文库数据中分析得到所有细胞标签对应的空间位置标签信息，每个测到的细胞标签可以至少对应1种空间位置标签，根据空间位置标签能够将该细胞对应到芯片的原始位置上；如果测到的细胞标签对应多种空间位置标签，需要对所有位置标签的UMI进行计数排列后去卷积确定真实位置。

本发明所提供的测序方法具有所述含组织位置信息的单细胞文库构建方法的所有技术方案，因而具有所述含组织位置信息的单细胞文库构建方法的所有的有益效果，本发明在此不再一一赘述。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1 制备空间核酸芯片

1.1制备核酸标记磁珠，采用常规方法进行制备；

1.2本步骤采取“分散-合并-分散”的技术方法实现多种核酸标记的空间标签微珠（以下简称SBB，Spatial BarcodedBeads）的制备，具体制备方案可参考专利CN114096678 A与专利CN202080065556.2。磁珠采用5um直径的PS羧基磁珠，SBB序列上含有dU修饰，可在USER酶作用下断裂形成具有5’P结构的核酸分子。具体序列如下：

5’NH2-CTCTTTTTTTT-U-CGTCCGTCGTTGCTCGjjjjjjjjACTGGTGAjjjjjjjjGGTAGTGACAjjjjjjjjNNNNNNNNAGACGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’；

1.3SBB芯片落孔

1.3.1制备微孔芯片：定制微孔直径和深度均为7.5um、孔壁厚度为2.5um的玻璃微孔芯片，芯片规格与载玻片一致（长宽75mm×25mm），微孔区域位于玻片中心，长宽为10mm×10mm，共有100万个微孔；

1.3.2取1000万步骤1.1制作的SBB悬浮于50uL酒精中均匀铺设在芯片上的微孔区域，静置10min后放置于水平摇床上孵育30min；

1.3.3将芯片放置于磁铁上，用1×PBS轻轻洗去未落孔磁珠；镜检微珠落孔率需≥95%，否则重新执行步骤1.2.2和1.2.3；

1.3.4置于60℃烘箱中干燥30min后4℃冰箱中保存备用。

1.4核酸序列解码

使用2004年发表在期刊Genome Research上文章DecodingRandomly Ordered DNAArrays中介绍的荧光探针杂交法进行解码，得到芯片中所有微孔中微珠表面偶联的空间位置的核酸序列。

1.5偶联能与细胞糖蛋白结合的刀豆凝集素

1.5.1用SolulinkProtein-Oligonucleotide Conjugation Kit或类似功能的试剂盒将刀豆凝集素ConA蛋白与序列为5’P -tccactaccttctcctcctac-NH2-3’核酸偶联，形成核酸-蛋白偶联复合物；

1.5.2取出步骤1.3中解码完成的芯片，使用T4 连接酶将复合物5’P-tccactaccttctcctcctac-ConA连接到芯片上的空间位置核酸分子3’，反应体系如表1：

表1 偶联能与细胞糖蛋白结合的刀豆凝集素的反应体系

组分	体积/样本
		T4 Ligation Buffer	20 μL
T4 DNA Ligase	5 μL
		5’P -tccactaccttctcctcctac-ConA	5 μL
反向序列：GTAGGAGGAGAAGGTAGTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCGTCT	5 μL
		Nuclease-free Water	65 μL
Total	100 μL

1.5.3芯片清洗后保存备用。

实施例2 空间标记WGA芯片针对DSP固定组织的单细胞转录组建库

2.1取小鼠肝脏组织使用1×DSP冰上固定30min后OCT包埋；

2.2按40um厚度切片并贴于实施例1中制备好的WGA芯片上；

2.3使用含有1%TritonX-100的PBS处理30min以透化组织；

2.4按照NEB使用说明书配置100uL USER酶反应液并滴加在组织，37℃反应30min以释放空间标记WGA并就近结合至组织细胞上以实现空间标记，注意控制环境湿度防止反应溶液干燥；

2.5使用1×PBST轻柔洗涤芯片3次以去除未结合的游离WGA；

2.6使用SeekMate® 组织解离试剂A盒将空间标记后的切片解离为单细胞悬液，注意离心时尽量减少细胞损失；

2.7按照SeekOne® DD单细胞3’转录组试剂盒对步骤2.4中解离得到的细胞进行油包水逆转录并破油纯化cDNA产物；

2.8按照表2配制扩增mix。

将扩增体系加入至SeekOne®DD单细胞3' 转录组试剂盒操作说明书纯化后的23mL cDNA产物中，吹打混匀10次，瞬时离心；然后按照SeekOne® DD单细胞3' 转录组试剂盒操作说明书Step 2-2进行PCR；注意在标准试剂体系外需要额外添加固定浓度的空间引物；

表2 扩增mix

组分	体积
		2×PCR M aster Mix	25 mL
cDNA Primers	2 mL
		空间引物 (2.5mM)  引物序列：CGTCCGTCGTTGCTCG	0.4  mL
Total	27.4 mL

2.9PCR产物纯化

吸取30 μL（0.6×）的DNA分选磁珠加入cDNA扩增产物中，吹打10次混匀或振荡混匀后瞬时离心；将混匀好的产物室温静置5 min后，置于磁力架上吸附至溶液澄清，将全部上清转移至一个新的0.2mL PCR管中，室温保存；A. 去除上清后的磁珠纯化得到的产物用于3’转录组文库构建；B. 吸取40 μL上清至一个新的0.2 mL PCR管中，上清纯化得到的产物用于样本标签文库构建。

2.9-A磁珠纯化（用于3’转录组文库构建）

2.9-A.1保持在磁力架上加入200 μL 80%乙醇，约30 sec后小心去除上清；重复此步骤一次；

2.9-A.2瞬时离心，用10 μL移液器去除所有残留的上清；

2.9-A.3室温静置使乙醇完全挥发（磁珠呈现暗哑色，约3-5min），加入40.5μLNuclease-free Water充分悬浮磁珠，室温静置2 min；

2.9-A.4置于磁力架上吸附至溶液澄清，转移上清40 μL至新的0.2 mL PCR管中。

2.9-B上清纯化（用于混样标签文库构建）

2.9-B.1振荡混匀DNA分选磁珠，吸取35 μL（2×）的DNA分选磁珠加入上清中，吹打10次混匀或振荡混匀后瞬时离心；

2.9-B.2将混匀好的产物室温静置5 min后，置于磁力架上吸附至溶液澄清，去除上清；

2.9-B.3保持在磁力架上加入200 μL 80%乙醇，约30 sec后小心去除上清；重复此步骤一次；

2.9-B.4瞬时离心，用10 μL移液器去除所有残留的上清；

2.9-B.5室温静置使乙醇完全挥发（磁珠呈现暗哑色，约3-5min），加入20.5μLNuclease-free Water充分悬浮磁珠，室温静置2 min；

2.9-B.6置于磁力架上吸附至溶液澄清，转移上清20 μL至新的0.2 mL PCR管中。

2.103’转录组文库构建

步骤2.9-A纯化得到的cDNA产物按照SeekOne® DD单细胞3' 转录组试剂盒操作说明书Step 3文库构建进行3’转录组文库构建。

2.11样本标签文库构建

2.11.1样本标签文库扩增

使用步骤2.9-B纯化得到的DNA产物进行混样标签文库构建，按照表3配制样本Index PCR Mix，向扩增体系中加入约1-2 ng 步骤4-2B纯化得到的DNA产物，吹打混匀10次，瞬时离心。

表3 样本IndexPCR Mix

组分	体积
		2×PCR Master Mix	25 μL
N5	1 μL
		N7	1 μL
ddH2O	To 50 μL

其中，样本标签文库不能与其3’转录组文库使用同一组N5和N7。

2.11.2按表4设置PCR程序并运行。

表4 PCR程序参数

2.11.3样本标签文库纯化

吸取60 μL（1.2×）的DNA分选磁珠加入PCR产物中，吹打10次混匀或振荡混匀后瞬时离心；

将混匀好的产物室温静置5 min后，置于磁力架上吸附至溶液澄清，去除上清；

保持在磁力架上加入200μL 80%乙醇，约30sec后小心去除上清；重复此步骤一次；

瞬时离心，用10 μL移液器去除所有残留的上清；

室温静置使乙醇完全挥发（磁珠呈现暗哑色，约3-5min），加入30.5μL Nuclease-free Water充分悬浮磁珠，室温静置2 min；

置于磁力架上吸附至溶液澄清，转移上清30 μL至新的0.2 mL PCR管中。

2.11.4样本标签文库质控

如图8所示，合格的文库主峰大小介于200-350bp（Agilent 4200TapeStation），测定文库浓度>1ng/μL（Qubit 4.0测量）。

2.11.5高通量测序

转录组文库与样本标签文库以4:1比例进行混合，Illumina 测序平台和华大测序平台进行高通量测序，测序量≥50,000reads/cell。

实施例3 空间标记核酸芯片针对甲醛固定组织的单细胞转录组建库

3.1取小鼠肝脏组织使用4%多聚甲醛常温固定24小时后OCT包埋；

3.2按40um厚度切片并贴于实施例1.3中制备好的核酸芯片上；

3.3使用含有1% TritonX-100的PBS处理30min以透化组织切片；

3.4按照NEB使用说明书配置100uL USER酶反应液并滴加在组织，37℃反应30min以释放空间标记并就近结合至组织细胞mRNA的polyA尾巴上以实现空间标记，注意控制环境湿度防止反应溶液干燥；

3.5使用1×PBST轻柔洗涤芯片3次以去除未结合的游离空间标记核酸；

3.6按照表5使用SeekOne® DD单细胞3’转录组试剂盒中组分配置逆转录体系：

表5 逆转录体系

试剂	体积/样本
		RT Buffer	20.8 μL
Indicator	8.0 μL
		RT Enzyme	5.2 μL
ddH2O	44.4 μL
		Reducing  Buffer	1.6 μL
Total	80μL

3.7将配置好的逆转录体系滴加在组织切片上，42℃反应30min，注意控制环境湿度防止反应溶液干燥；

3.8使用SeekMate® 组织解离试剂A盒将空间标记后的切片解离为单细胞悬液，注意离心时尽量减少细胞损失；

3.9按照发明专利CN202210874581.6中实施例1步骤二中的油包水试剂与方法对步骤3.8中得到的单细胞进行油包水内的连接，此时细胞标签连接在了空间位置标签的5’端；

3.10破乳并解交联

3.113.10.1油包水内连接反应结束后，向上述PCR管中加入100μLDemulsionAgent 试剂，室温静置2 min，瞬时离心；

3.10.2从PCR管底部缓慢吸取120 μL 透明油相丢弃，不要吸到上层水相；此时连接后的固定细胞存在于上层水相中；

3.10.3将上层水相溶液转移至1.5ml离心管，4℃条件下1000g离心5min，小心去除上层上清；重新加入1ml 含有0.1% (v/v)Tritonx-100的1xPBS溶液，重复4℃条件下1000g离心5min后完全去除上清；

3.10.4向管中加入蛋白酶K和2%（v/v）SDS，55度反应1h进行解交联反应；

3.10.5反应结束后，向管中加入1倍体积的 DNA clean beads进行纯化，30.5μL双蒸水洗脱；

3.10.6转移30uL上清液至新的0.2mL 离心管中。

3.11模板转换

按照表6使用SeekOne® DD单细胞3’转录组试剂盒中组分配置模板转换体系：

表6 模板转换体系

试剂	体积/样本
		RT Buffer	20.9μL
Indicator	8.0 μL
		RT Enzyme	5.2 μL
ddH2O	12.3 μL
		TSO	2.0 μL
Reducing  Buffer	1.6 μL
		Total	50 μL

3.12将配置好的模板转换体系加入3.10.6中的纯化产物中，42℃反应90min后85℃失活5min；

3.131× 分选磁珠纯化，23.5μL双蒸水洗脱

3.14纯化得到的cDNA产物按照SeekOne® DD单细胞3' 转录组试剂盒操作说明书进行cDNA扩增、纯化并进行3’转录组文库构建。最终得到文库如下图9所示，文库片段主峰为458bp，无杂带。

3.15高通量测序

构建得到的文库结构如图7所示，以PE150策略在Illumina 测序平台和华大测序平台进行高通量测序。

综上所述，本发明提供一种含组织位置信息的单细胞文库构建方法，通过具有位置信息的核酸芯片与待测组织切片接触，可以将位置信息释放到组织细胞中，从而在后续解离组织细胞的过程中，使得组织信息的位置信息被读取，从而可以在单细胞水平上分析遗传信息的同时还可以测到该单细胞的空间位置信息。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (11)

1.一种含组织位置信息的单细胞文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S10、提供芯片，所述芯片具有多个位点，每一位点上具有已知碱基序列的核酸分子，所述核酸分子含有位置信息；

S20、将待测组织的切片与所述芯片接触，以使所述芯片中的具有已知碱基序列的核酸分子与所述待测的组织切片的细胞结合，得到结合组织切片；

S30、将结合组织切片解离制备成单细胞悬液；

S40、通过高通量单细胞建库测序平台对单细胞悬液构建文库，得转录组文库与空间标签文库；

S50、对转录组文库与空间标签文库进行测序，得到含组织位置信息的单细胞文库。

2.如权利要求1所述的含组织位置信息的单细胞文库构建方法，其特征在于，步骤S10中：

不同位点上具有不同已知碱基序列核酸分子，同一位点上具有相同已知碱基序列的核酸分子；和/或，

位点之间的间距为100nm~1mm。

3.如权利要求1所述的含组织位置信息的单细胞文库构建方法，其特征在于，步骤S10中：

所述芯片为平面，具有位置信息的核酸分子以相对独立的成簇方式固定在芯片表面；和/或，

所述芯片具有微孔，所述微孔中具有介质，具有位置信息的核酸分子分布在芯片微孔中的介质上或偶联在芯片表面；和/或，

所述芯片具有微孔，所述微孔中具有介质，所述芯片微孔中的介质包括：聚合物微珠、磁性微珠及水凝胶微珠的任意一种；和/或，

芯片的材质包括玻璃、ITO玻璃、聚合物、ITO聚合物以及硅片中的任意一种。

4.如权利要求1所述的含组织位置信息的单细胞文库构建方法，其特征在于，步骤S10中：

具有位置信息的核酸分子偶联有与细胞中特定物质结合的分子。

5.如权利要求4所述的含组织位置信息的单细胞文库构建方法，其特征在于，所述与细胞中特定物质结合的分子包括凝集素，所述细胞中特定物质为糖蛋白；或，

所述与细胞中特定物质结合的分子包括抗体，所述细胞中特定物质为β2-微球蛋白；或，

所述与细胞中特定物质结合的分子包括脂类分子，所述细胞中特定物质为脂质双分子层；或，

所述与细胞中特定物质结合的分子包括核酸，所述细胞中特定物质为mRNA。

6.如权利要求1所述的含组织位置信息的单细胞文库构建方法，其特征在于，在步骤S10和S20之间，还包括：

使用醛类固定液、酸类固定液、醇类固定液及DSP交联剂中的任意一种固定剂对待测组织的切片的细胞进行浸泡处理；和/或，

使用醇类或表面活性剂对待测组织的切片的细胞进行浸泡处理。

7.如权利要求1所述的含组织位置信息的单细胞文库构建方法，其特征在于，步骤S10中，芯片由以下步骤制得：

S01、合成多种具有不同位置标签序列的核酸分子；

S02、将合成的核酸分子与芯片对应位置相互接触，使得合成的核酸分子固定到芯片对应位置，得到含有位置信息的核酸分子的芯片。

8.如权利要求7所述的含组织位置信息的单细胞文库构建方法，其特征在于，步骤S01中：

所述核酸分子包括固定序列-条件性可断裂位点-位置标签-细胞结合分子，其中所述条件性可断裂位点包括：双硫修饰、dU修饰、RNA碱基修饰、dI修饰、DSpacer修饰、AP位点修饰、光断裂PC linker以及限制性内切酶识别序列中的任意一种；和/或，

所述核酸分子包括5’偶联集团和分子标签序列，其中，所述5’偶联集团包括化学交联剂、Biotin、亲和素及链霉亲和素中的任意一种。

9.如权利要求7所述的含组织位置信息的单细胞文库构建方法，其特征在于，步骤S01中：

所述核酸分子包括5’偶联集团和分子标签序列，其中，所述5’偶联集团包括化学交联剂、Biotin、亲和素及链霉亲和素中的任意一种，其中，所述化学交联剂包括胱胺、戊二醛、二甲基亚磺酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺交联剂BS3、甲醛、碳二亚胺、SMCC、磺基-SMCC、乙烯基硅烷、N ,N '-二烯丙基酒石酸二酰胺、N ,N '-双丙烯酰基胱胺中的任意一种。

10.如权利要求7所述的含组织位置信息的单细胞文库构建方法，其特征在于，步骤S02中：

所述合成的核酸分子固定到芯片对应位置的固定方法包括原位接触法和随机固定法中的任意一种。

11.一种测序方法，其特征在于，包括以下步骤：

采用如权利要求1至10任意一项所述的含组织位置信息的单细胞文库构建方法构建单细胞文库，获得转录组文库与空间标签文库；

对获得的转录组文库与空间标签文库进行测序，得单细胞转录组数据和空间标签文库数据；

根据已知碱基序列中的核酸分子的位置信息和遗传信息对应到待测组织，得到待测组织单细胞的位置信息和遗传信息。

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