CN116019840A - 用于长新冠的益生菌组合物 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了用于治疗长新冠症状或降低发展这些症状的风险的组合物和方法。

Description

用于长新冠的益生菌组合物
相关申请
本申请要求2021年10月27日提交的美国临时专利申请第63/272,608号的优先权，将所述美国临时专利申请的内容在此出于所有目的通过引用以其整体并入。
发明背景
近年来，病毒感染和细菌感染在全世界变得越来越普遍，并呈现严重的公共健康威胁。例如，由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的呼吸疾病，2019冠状病毒病(COVID-19)全球大流行，已经影响全世界超过43500万人(包括近600万人死亡)，并且由于缺乏官方批准的治疗以及缺乏经彻底测试证明安全且有效的疫苗而加剧。目前正在积极地研究和开发几种有希望的治疗剂，用于COVID-19治疗的预防用途或治疗用途，以预防或改善其对患病患者的损害作用，同时实验疫苗广泛地分发给一般人群。
因此，迫切需要一种新的有意义的方法以通过预防或治疗从疾病中康复的患者(包括成人和儿童)中的长新冠或新冠肺炎长期综合后遗症(PACS)的症状来补充治疗和疫苗接种工作，从而实现减轻或消除长期持续的临床症状及其相关影响。本研究的目的是鉴定有潜力可提供预防或治疗PACS的有益效果的肠道微生物物种，以及鉴定可在处于活跃期的COVID患者中被监测以指示个体将来发展PACS症状的可能性，并可相应地以预防方式给予治疗的肠道微生物物种。直接补充这些有益的肠道微生物物种是在减少或消除诸如COVID-19的感染性疾病的长期不良影响的工作中实现这些目标的潜在有效的手段。本申请通过鉴定有益的肠道微生物以允许配制新的组合物和应用新的方法来有效解决在COVID康复者中长期持续的临床症状，以及通过鉴定可用作指示具有增加的发展PACS的风险的COVID患者的标志物的肠道微生物以允许预防性治疗这些患者来防止长新冠症状的发作来满足这种和其它相关的需要。
发明内容
本申请的发明人在他们的研究中发现某些肠道微生物物种及其代谢产物可以帮助预防和治疗已经被诊断为COVID-19的患者，包括已经从疾病中康复的那些患者(例如，已经具有至少一份SARS-COV2(引起感染的病毒)阴性试验报告)中长新冠或新冠肺炎长期综合后遗症(PACS)的症状，从而在促进患者从疾病中完全康复和消除由这种致病菌引起的潜在遗留不良影响方面提供了重要的效用。这样鉴定的微生物现在用于提供作为COVID-19治疗和长期管理的组成部分的新方法和组合物。
在第一方面，本申请提供了可用于治疗受试者中的PACS的用途的组合物，其包含有效量的(1)选自表1以及长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、韦氏布劳特氏菌(Blautia wexlerae)和假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)的一种或多种有益细菌物种；以及(2)生理学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述组合物还包含选自表3的一种或多种有益细菌物种。在一些实施方案中，所述组合物包含总共约106至约1012个菌落形成单位(CFU)的有益细菌物种。在一些实施方案中，所述组合物不包含可检测量的表4中的任何细菌物种，包括韦格斯卡多维亚菌(Scardovia wiggsiae)和解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)。在一些实施方案中，所述组合物包含有效量的以下一种或多种不同的有益细菌物种：长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌、假小链双歧杆菌、普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)和Fusicatenibacter saccharivorans。在一些实施方案中，所述组合物包含有效量的以下一种或多种不同的产丁酸盐细菌物种：食葡糖罗斯拜瑞氏菌(Roseburia inulinivorans)、普氏栖粪杆菌和人罗斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)。在一些实施方案中，所述组合物基本上由有效量的(1)选自表1以及长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌和假小链双歧杆菌的一种或多种有益细菌物种；(2)一种或多种生理学上可接受的赋形剂组成。在一些实施方案中，所述组合物被配制用于口服摄取，如呈食品或饮料物品的形式。在一些实施方案中，所述组合物被配制用于直接递送到受试者的胃肠道。任选地，所述组合物还可以包含已知增强免疫力，例如，有效抑制感染因子，如SARS-CoV-2，以及降低疾病严重程度的一种或多种试剂(例如，伊维菌素、羟氯喹、锌、维生素C、维生素D、槲皮素、褪黑激素、氟伏沙明或氟西汀、普克鲁胺(proxalutamide)、阿奇霉素、多西环素或其任意组合)。
在第二方面，本申请提供了通过向受试者施用有效量的上文和本文所述的组合物用于治疗或预防所述受试者中的PACS的方法。在一些实施方案中，所述受试者已经出现了PACS。在一些实施方案中，所述受试者已被诊断为COVID但尚未出现PACS。在一些实施方案中，施用步骤包括向受试者施用包含一种或多种有益细菌物种的一种组合物。在一些实施方案中，施用步骤包括向受试者施用两种或更多种组合物，其各自包含一种或多种有益细菌物种。在一些实施方案中，施用步骤包括口服摄取组合物，其可以在食物摄取之前或与食物摄取一起，或在食物摄取后不久(例如，进餐或小吃)。在一些实施方案中，施用步骤包括直接递送到受试者的胃肠道。例如，使用被称为肠道微生物移植(FMT)的技术，其中由含有所需量的有益细菌物种的经处理的合适供体粪便材料制成的组合物可用于将细菌引入COVID或PACS患者的胃肠道。任选地，所述方法还包括以含有有益细菌的相同组合物施用至受试者，所述组合物还可以包括已知增强免疫力，例如，有效抑制感染因子，如SARS-CoV-2，以及降低疾病严重程度的一种或多种试剂(例如，伊维菌素、羟氯喹、锌、维生素C、维生素D、槲皮素、褪黑激素、氟伏沙明或氟西汀、普克鲁胺、阿奇霉素、多西环素或其任意组合)。
在相关方面，本申请提供了组合物在治疗或预防受试者中的PACS的新用途。所述组合物包含有效量的(1)选自表1以及长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌和假小链双歧杆菌的一种或多种有益细菌物种；以及(2)生理学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述组合物还包含选自表3的一种或多种有益细菌物种。在一些实施方案中，所述组合物包含总共约106至约1012个菌落形成单位(CFU)的有益细菌物种。在一些实施方案中，所述组合物不包含可检测量的表4中的任何细菌物种，包括韦格斯卡多维亚菌和解木聚糖拟杆菌。在一些实施方案中，所述组合物包含有效量的以下一种或多种不同的有益细菌物种：长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌、假小链双歧杆菌、普氏栖粪杆菌和Fusicatenibacter saccharivorans。在一些实施方案中，所述组合物包含有效量的以下一种或多种不同的产丁酸盐细菌物种：食葡糖罗斯拜瑞氏菌、普氏栖粪杆菌和人罗斯拜瑞氏菌。在一些实施方案中，所述组合物基本上由有效量的(1)选自表1以及长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌和假小链双歧杆菌的一种或多种有益细菌物种；(2)一种或多种生理学上可接受的赋形剂组成。在一些实施方案中，所述组合物被配制用于口服摄取，如呈食品或饮料物品的形式。在一些实施方案中，所述组合物被配制用于直接沉积到受试者的胃肠道。任选地，所述组合物还可以包含已知增强免疫力，例如，有效抑制感染因子，如SARS-CoV-2，以及降低疾病严重程度的一种或多种试剂(例如，伊维菌素、羟氯喹、锌、维生素C、维生素D、槲皮素、褪黑激素、氟伏沙明或氟西汀、普克鲁胺、阿奇霉素、多西环素或其任意组合)。
在第三方面，本申请提供了用于治疗或预防受试者中的PACS的试剂盒。所述试剂盒包括多个容器，其各自含有包含有效量的选自表1以及长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌和假小链双歧杆菌的一种或多种有益细菌物种的不同组合物。在一些实施方案中，所述试剂盒包括多个容器，其各自含有包含有效量的一种或多种不同的有益细菌物种的不同组合物，所述有益细菌物种选自：长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌、假小链双歧杆菌、普氏栖粪杆菌和Fusicatenibacter saccharivorans。在一些实施方案中，所述试剂盒包括多个容器，其各自含有包含有效量的以下一种或多种不同的产丁酸盐细菌物种的不同组合物：食葡糖罗斯拜瑞氏菌、普氏栖粪杆菌和人罗斯拜瑞氏菌。在一些实施方案中，所述组合物呈粉剂、液体、糊剂、霜剂、片剂或胶囊的形式。所述试剂盒还可以包括一个或多个另外的容器，其各自含有已知有效抑制感染因子如SARS-CoV-2和/或降低疾病严重程度或促进患者从COVID-19康复的一种或多种试剂(例如，伊维菌素、维生素C、维生素D、槲皮素、褪黑激素、锌、阿奇霉素、多西环素、羟氯喹、氟伏沙明或氟西汀、普克鲁胺或其任何组合)。此外，试剂盒中可包括用户说明手册，以正确使用试剂盒，提供诸如合适治疗受试者和时间、给药等信息。
在第四方面，本申请提供了用于评估受试者中PACS风险的方法。所述方法包括以下这些步骤：(1)在来自所述受试者的粪便样品中测定表2中列出的一种或多种细菌物种的水平或相对丰度；(2)在来自包含最终会或不会发展PACS的COVID-19患者的参考群组初始诊断COVID-19时(如COVID-19首次阳性检测报告时或入院时)获得的粪便样品中测定相同细菌物种的水平或相对丰度；(3)使用从步骤(2)获得的数据通过随机森林模型生成决策树，并将来自步骤(1)的一种或多种细菌物种的水平或相对丰度沿着所述决策树运行以生成评分；以及(4)将评分大于0.5的受试者确定为具有增加的PACS风险，并且将评分不大于0.5的受试者确定为不具有增加的PACS风险。在一些实施方案中，步骤(1)和(2)中的每一个都包括宏基因组测序。在一些实施方案中，步骤(1)和(2)中的每一个都包括聚合酶链式反应(PCR)，例如定量PCR(qPCR)。在一些实施方案中，细菌物种包括以下的一种或多种：长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌、假小链双歧杆菌、普氏栖粪杆菌和Fusicatenibactersaccharivorans。
在第五方面，本申请提供了用于评估受试者中的PACS的风险的试剂盒，其包含用于测定表2中列出的一种或多种细菌物种的水平或相对丰度的试剂。在一些实施方案中，所述细菌物种包括以下的一种或多种：长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌、假小链双歧杆菌、普氏栖粪杆菌和Fusicatenibacter saccharivorans。
附图简述
图1：在6个月时具有和没有PACS的COVID-19患者中的肠道微生物群组成。图1A：在6个月时具有和没有PACS的COVID-19患者的肠道微生物群组成的主坐标分析。图1B：细菌多样性和丰富度。图1C：具有和没有PACS的患者的肠道微生物群组成的分析。图1D：在6个月时具有PACS的患者的肠道微生物群中判别分类群的线性判别分析效应大小(LEfSe)分析。
图2：在清除病毒后影响患者的随访粪便中肠道微生物群的因素。图2A：通过PERMANOVA检验确定的受试者元数据对肠道微生物组成的效应大小。图2B：通过PERMANOVA检验确定的肠道微生物群组成与PACS的不同亚组之间的总体关联。图2C：6个月时细菌物种与不同种类的PACS的关联。
图3：在病毒清除后的新冠肺炎长期综合后遗症(PACS)。图3A：急性COVID-19后3个月和6个月时30种症状的比例。图3B：与PACS发展相关的因素的多变量分析。中心点表示平均值，方框表示上四分位距和下四分位距。
图4：COVID-19患者中的PACS比例。图4A：在3个月和6个月随访时106名患者中的COVID-19严重程度在不同亚组的PACS比例。图4B：在3个月和6个月随访时具有粪便样品的68名患者中的COVID-19严重程度在不同亚组的PACS比例。
图5：住院患者和在阴性SARS-CoV-2后他们的随访粪便以及非COVID-19个体中肠道微生物群的组成差异。图5A：与非COVID-19受试者相比，在阴性SARS-CoV-2之前和之后，对患有COVID-19的患者的肠道微生物组成的主坐标分析。图5B：多样性和丰富度。图5C：在病毒清除后1个月和6个月时COVID-19患者的肠道微生物群的分析。图5D：前5个门和前10个微生物属的平均相对丰度。图5E：在来自住院患者以及在阴性SARS-CoV-2后的1个月和长于6个月内他们的随访的粪便中检测到的前5个门和前10个微生物属。
图6：使用抗生素的住院患者和对于鼻咽拭子中病毒RNA的阴性RT-qPCR后他们的随访粪便以及非COVID-19个体的肠道微生物群的组成差异。图6A：与非COVID-19受试者相比，在针对SARS-CoV-2的RT-qPCR呈阴性之前和之后，有使用抗生素的COVID-19患者的肠道微生物群组成的主坐标分析。图6B：与非COVID-19受试者相比，在针对SARS-CoV-2的RT-qPCR呈阴性后6个月，使用或未用抗生素的COVID-19患者的肠道微生物群组成的主坐标分析。
图7：在病毒清除后不同时间点随访样品的肠道微生物群的组成差异。图7A：在1个月和6个月的随访样品中差异最大的前7个门。图7B：在1个月和6个月的随访样品中差异最大的前10个属的。图7C：在1个月和6个月的随访样品中差异最大的前20个物种。图7D：在针对SARS-CoV-2的RT-qPCR呈阴性后1个月、6个月和9个月时COVID-19患者的肠道微生物群组成的主坐标分析。图7E：在1个月、6个月和9个月时COVID-19患者中肠道微生物群的多样性和丰富度。图7F：在1个月、6个月和9个月时COVID-19患者中肠道微生物群的分析。
图8：在68名具有连续粪便样品的患者中病毒清除后的新冠肺炎长期综合后遗症(PACS)。图8A：在急性COVID-19后6个月时前16种症状的发病率。图8B：与PACS发展相关的因素的多变量分析。中心点表示平均值，方框表示上四分位距和下四分位距。
图9：在基线和病毒清除后不同时间点的随访样品的肠道微生物群的组成差异。图9A：与非COVID-19受试者相比，在针对SARS-CoV-2的RT-qPCR呈阴性之前和之后具有或没有PACS的COVID-19患者的肠道微生物群组成的主坐标分析。图9B：与非COVID-19受试者相比，在基线时COVID-19患者中肠道微生物群的多样性和丰富度分析。图9C：与非COVID-19受试者相比，在6个月随访时COVID-19患者中肠道微生物群的多样性和丰富度分析。图9D：在具有或没有PACS的COVID-19患者中从基线至病毒清除后6个月随访中肠道微生物群组成变化。图9E：在基线时具有PACS的康复患者的肠道微生物组的Lefse分析。
图10：与肠道细菌组成相关的六分钟步行距离(6MWD)。图10A：具有或没有PACS的COVID-19患者中的6MWD。图10B：在6个月随访时COVID-19患者中的细菌物种与6MWD的关联(来自MaAsLin的线性混合模型)。
图11：在6个月时具有或没有任何持续性症状的COVID-19患者入院时的肠道微生物群组成。图11A：在清除SARS-CoV-2后6个月时具有或没有任何持续性症状的COVID-19患者的肠道微生物群组成的主坐标分析。图11B：在住院期间确认针对SARS-CoV-2的阳性RT-qPCR后第一粪便样品的肠道微生物群组成。图11C：如通过MaAsLin和多变量线性模型测定的COVID-19康复患者的持续性症状与基线微生物特征之间的关联(P<0.05)。图11D：肠道微生物组与PACS发展之间关联的示意图。
定义
如本文所用，术语“SARS-CoV-2或严重急性呼吸综合征冠状病毒2”是指引起冠状病毒疾病2019(COVID-19)的病毒。它也被称为“COVID-19病毒”。
术语“新冠肺炎长期综合后遗症(PACS)”或“长新冠”用于描述这样的医学病况，其中已经从COVID康复的患者(如在至少2周之前(例如，至少3周或4周之前)由阴性PCR报告所指示的)仍持续且稳定地表现出疾病的一种或多种症状而没有任何显著进展。所述症状可包括呼吸症状(咳嗽、痰、鼻塞/流鼻涕、气促)，神经精神症状(头痛、头晕、味觉丧失、嗅觉丧失、焦虑、注意力集中困难、睡眠困难、悲伤、记忆力差、视力模糊)，胃肠症状(恶心、腹泻、腹痛、上腹痛)，皮肤病学症状(脱发)或肌肉骨骼症状(关节痛、肌肉痛)以及疲劳。
本文所用的术语“抑制(inhibiting)”或“抑制(inhibition)”是指对目标生物过程，例如目标基因的RNA/蛋白表达、目标蛋白的生物活性、细胞信号转导、细胞增殖、有机体尤其是微生物的存在/水平、任何可测量的生物标志物、生物参数或受试者中的症状等的任何可检测的负面影响。通常，抑制反映为当与对照相比时，目标过程(例如，受试者的体重，或血糖/胆固醇水平，或受试者中的任何可测量的症状或生物标志物，例如受试者中的致病性感染因子的感染率)，或者以上提及的下游参数中的任一个的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的减少。“抑制”还包括100％的减少，即目标生物过程或信号的完全消除、预防或废除。其它相关术语，例如“阻抑(suppressing)”、“阻抑(suppression)”、“减少(reducing)”和“减少(reduction)”在本公开内容中以类似的方式用于指不同水平的减少(例如，与对照水平相比至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的减少)，直至完全清除目标生物过程或信号。另一方面，术语，例如“激活(activate)”、“激活(activating)”、“激活(activation)”、“增加(increase)”、“增加(increasing)”、“促进(promote)”、“促进(promoting)”、“提高(enhance)”、“提高(enhancing)”或“提高(enhancement)”在本公开内容中用于涵盖目标过程、信号或参数的不同水平的正变化(例如，与对照水平相比至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更大，例如3倍、5倍、8倍、10倍、20倍的增加)。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括针对疾病或病况的存在或者以后发展此类疾病或病况的风险采取的治疗性和预防性措施。其涵盖用于缓解持续存在的症状、抑制或减缓疾病进展、延迟症状发作或消除或减少由此类疾病或病况引起的副作用的治疗性或预防性措施。在本上下文中的预防措施及其变化不需要100％消除事件的发生；相反，它们是指阻抑或降低这种发生的可能性或严重性或者延迟这种发生。
术语疾病的“严重程度”是指疾病进展以对患有该疾病的患者的福祉和健康造成有害影响的水平和程度，例如短期和长期的身体、精神和心理障碍，直到并且包括患者的死亡。疾病的严重程度可以反映在必需的治疗和维持措施的性质和数量、患者康复所需的持续时间、可能康复的程度、患者完全康复的百分比、需要长期护理的患者的百分比和死亡率中。
接受本申请的组合物或治疗方法的“患者”或“受试者”是已经被诊断患有COVID-19(例如，具有针对SARS-COV2的阳性核酸和/或抗体测试结果)并且需要被治疗以解决PACS症状或预防这种症状发作的任何年龄、性别和种族背景的人，包括成人和青少年。通常，接受根据本申请的方法的治疗以预防或治疗长新冠症状的患者或受试者不再另外需要相同治疗剂的治疗。例如，如果受试者正在接受根据所要求保护的方法的共生组合物，则该受试者不患有已知由相同治疗剂治疗的任何疾病。尽管患者可以是任何年龄，但在一些情况下，患者是至少20岁、30岁、40岁、45岁、50岁、55岁、60岁、65岁、70岁、75岁、80岁或85岁；在一些情况下，患者可以是20至30岁、30至40岁、40至45岁、或50至65岁、或65至85岁。“儿童”受试者是18岁以下的受试者，例如，约5-17岁、9岁或10-17岁、或12-17岁，包括小于约12个月，例如，小于约10个月、8个月、6个月、4个月或2个月的“婴儿”，而“成人”受试者是18岁以上的受试者。
本文所用的术语“有效量”是指产生预期(例如，治疗性或预防性)效果的施用物质的量。所述效果包括预防、校正或抑制特定疾病/病况的症状和相关并发症进展至任何可检测的程度，例如疾病的发生率、感染率、病毒或细菌感染的一种或多种症状和相关病症(例如COVID-19)。确切的量将取决于治疗的目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见，例如，Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1卷-第3卷,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；以及Pickar,Dosage Calculations(1999))。
术语“约”在提及给定值使用时表示涵盖该值的±10％的范围。
“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”赋形剂是这样的物质，其不是生物学上有害的或在其他方面不合需要的，即赋形剂可以与生物活性剂一起施用至个体而不引起任何不合需要的生物效应。赋形剂也不会以有害的方式与包含它的组合物的任何组分相互作用。
术语“赋形剂”是指可存在于本申请组合物的最终剂型中的任何基本上的辅助物质。例如，术语“赋形剂”包括媒介物、粘合剂、崩解剂、填充剂(稀释剂)、润滑剂、助流剂(流动增强剂)、压缩助剂、着色剂、甜味剂、防腐剂、悬浮剂/分散剂、成膜剂/包衣剂、调味剂和印刷用油墨。
当在描述含有一种活性成分或多种活性成分的组合物的上下文中使用时，术语“基本上由....组成”是指以下事实：所述组合物不含有具有活性成分的任何类似或相关生物活性或者能够增强或阻抑活性的其它成分，而一种或多种非活性成分，例如生理学上或药学上可接受的赋形剂可存在于组合物中。例如，有效治疗受试者中的PACS的基本上由活性剂(例如，表1中的一种或多种细菌物种)组成的组合物是这样的组合物，其不含有可以对同一目标过程(例如，PACS症状中的任一种)具有任何可检测的积极或消极作用，或者可以增加或降低接受受试者中的相关症状的任何可测量程度的任何其它试剂。
发明详述
I.引言
本申请描述了用于预防或治疗受试者中的PACS症状的特定细菌物种及其组合(例如，表1和表3中列出的有益细菌物种加上长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌和假小链双歧杆菌)，尤其是当受试者是患有COVID-19但从COVID-19康复的成人或儿童时。本申请的实际应用包括开发和制造可以单独服用或添加到食品或饮料中的例如呈粉剂、片剂、胶囊或液体形式的商业食品或保健品以及适用于粪便微生物群移植(FMT)的任何其它制剂。
II.药物组合物和施用
本申请提供了包含有效量的表1和表3中列出的加上长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌和假小链双歧杆菌的一种或多种有益细菌物种的药物组合物，其用于治疗COVID-19患者以降低发展PACS症状的风险或改善症状(如果已经存在的话)。本申请的药物组合物适用于多种药物递送系统。用于本申请的合适制剂可见于Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,PA,第17版(1985)。关于药物递送方法的回顾，参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)。
本申请的药物组合物可以通过各种途径施用，例如经由口服摄取的全身施用或使用直肠栓剂的局部递送。对于表1和表3中列出的所有有益细菌物种加上长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌和假小链双歧杆菌的组合，施用药物组合物的优选途径是以约106至约1012CFU的日剂量口服施用。当向受试者施用多种细菌物种时，它们可以在一种单一组合物中或在多种组合物中施用。适当的剂量可以以单一日剂量或以适当的间隔提供的分剂量，例如以每天两个、三个、四个或更多个亚剂量施用。随着相关症状的持续存在，施用的持续时间范围可以是约1周至约8周，例如约2周至约4周，或持续更长的时间(例如，长达6个月)。
为了制备含有在本公开内容中鉴定的有益细菌的药物组合物，使用一种或多种惰性和药学上可接受的载体。药物载体可以是固体或液体。固体形式制剂包括，例如，粉剂、片剂、可分散颗粒、胶囊、扁囊剂和栓剂。固体载体可以是一种或多种还可以充当稀释剂、调味剂、增溶剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂或片剂崩解剂的物质；它也可以是封装材料。
在粉剂中，载体通常是细碎的固体，其与细碎的活性组分，例如，表1和表3中列出的有益细菌物种中的任何一种或多种加上长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌和假小链双歧杆菌混合。在片剂中，将活性成分与具有所需结合特性的载体以合适的比例混合，并压制成所需的形状和大小。
为了制备栓剂形式的药物组合物，首先将低熔点蜡，如脂肪酸甘油酯和可可脂的混合物熔化，并通过例如搅拌将活性成分分散在其中。然后将熔融的均匀混合物倒入合适尺寸的模具中并使其冷却和固化。
粉剂和片剂优选含有约5％至约100％重量的活性成分(例如，表1和表3中列出的加上长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌和假小链双歧杆菌的一种或多种有益细菌物种)。合适的载体包括，例如，碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、乳糖、糖、果胶、糊精、淀粉、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。
药物组合物可以包括活性成分，例如，表1和表3中列出的加上长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌和假小链双歧杆菌的一种或多种有益细菌物种，以及封装材料作为载体的制剂，提供胶囊，其中活性成分(具有或没有其它载体)被载体包围，使得载体从而与活性成分结合。以类似的方式，也可以包括小药囊。片剂、粉剂、小药囊和胶囊可用作适于口服施用的固体剂型。
液体药物组合物包括，例如，适于口服施用或局部递送的溶液、悬浮液和适于口服施用的乳液。活性组分(例如，表1和表3中列出的加上长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌和假小链双歧杆菌的一种或多种有益细菌物种)的无菌水溶液或活性组分在包含水、缓冲水、盐水、PBS、乙醇或丙二醇在内的溶剂中的无菌溶液是适于口服施用或局部递送(例如通过直肠栓剂)的液体或半液体组合物的实例。所述组合物可以含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、洗涤剂等。
无菌溶液可以通过将活性组分(例如，表1和表3中列出的加上长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌和假小链双歧杆菌的一种或多种有益细菌物种)溶解在所需的溶剂系统中，然后使所得溶液通过膜滤器以对其进行灭菌，或者可选地通过在无菌条件下将无菌活性组分溶解在预先灭菌的溶剂中来制备。可以将所得水溶液包装以原样使用或冻干，在施用前将冻干制剂与无菌水性载体组合。制剂的pH通常为3至11，更优选5至9，最优选7至8。
组合物的单次或多次施用可以由治疗医师选择剂量水平和模式来进行。在任何情况下，药物制剂应提供足以有效增强疫苗功效和/或减少或消除疫苗的不良副作用的量的活性剂。
药物组合物中细菌的不同组合可以根据表1选择以靶向特定类别的症状。例如，Agathobaculum butyriciproducens、假小链双歧杆菌、人罗斯拜瑞氏菌、Anaerostipeshadrus、小类杆菌CAG:357、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)可用于预防或缓解疲劳；Agathobaculum butyriciproducens、假小链双歧杆菌、人罗斯拜瑞氏菌、Asaccharobactercelatus可用于预防或缓解胃肠道症状；Agathobaculum butyriciproducens、人罗斯拜瑞氏菌、Anaerostipes hadrus、伴生粪球菌(Coprococcus comes)可用于预防或缓解神经症状；Agathobaculum butyriciproducens、假小链双歧杆菌、人罗斯拜瑞氏菌、Anaerostipeshadrus、腐烂别样杆菌(Alistipes putredinis)可用于预防或缓解呼吸症状；Agathobaculum butyriciproducens、Anaerostipes hadrus、真杆菌CAG:274、产甲酸多尔氏菌(Dorea formicigenerans)可用于预防或缓解肌肉骨骼症状；以及Agathobaculumbutyriciproducens、人罗斯拜瑞氏菌、直肠真杆菌、甲酸芽殖菌(Gemmiger formicilis)、凸腹真杆菌(Eubacterium ventriosum)、产甲酸多尔氏菌可用于预防或缓解脱发。
III.另外的治疗剂
出于治疗或预防COVID-19康复患者中的PACS症状的目的，另外已知的一种或多种治疗剂可以与活性剂，例如表1和表3中列出的加上长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌和假小链双歧杆菌的一种或多种有益细菌物种，组合用于本申请的实践中。在此类应用中，一种或多种先前已知的有效预防剂/治疗剂可以与有效量的活性剂一起在单一组合物中或者分别在两种或更多种不同组合物中同时施用至患者。
例如，已知有效用于预防或治疗COVID-19的药物和补充剂包括伊维菌素、维生素C、维生素D、褪黑激素、槲皮素、锌、羟氯喹、氟伏沙明/氟西汀、普克鲁胺、多西环素和阿奇霉素。它们可以与本申请的活性剂(例如表1和表3中列出的有益细菌物种中的任何一种或多种加上长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌和假小链双歧杆菌)组合使用，以促进患有SARS-COV2感染的患者安全和完全康复，降低潜在的疾病严重程度(包括发病率和死亡率)，并确保消除疾病的任何残留的长期不良影响。特别地，锌、羟氯喹和阿奇霉素的组合以及伊维菌素、氟伏沙明或氟西汀、普克鲁胺、多西环素、维生素C、维生素D、褪黑激素、槲皮素和锌的组合在COVID预防和治疗中都显示出高功效。因此，这些已知的药物/补充剂或营养组合可以与表1和表3中列出的加上长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌和假小链双歧杆菌的一种或多种有益细菌物种的活性成分一起用于本申请的方法中。
IV.试剂盒
本申请还提供了根据本文公开的方法治疗和预防从COVID-19康复的患者中的PACS症状的试剂盒。所述试剂盒通常包括多个容器，每个容器含有组合物，所述组合物包含表1和表3中列出的加上长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌和假小链双歧杆菌的一种或多种有益细菌物种。此外，已知治疗上有效预防和/或治疗疾病，包括改善疾病的症状和减轻疾病的严重程度，以及促进从疾病中恢复的另外的药剂或药物(例如在最后一节中描述的那些或相关技术领域中已知的那些)可以包括在试剂盒中。试剂盒的多个容器可以各自含有不同的活性剂/药物或者两种或更多种活性剂或药物的不同组合。试剂盒还可以包括提供关于如何分配药物组合物的说明的信息材料，包括对可以治疗的患者类型(例如，已经诊断为COVID-19，现在处于康复的过程中，并且因此试图消除疾病的残留症状或降低此类症状变为持续存在和连续不断的风险的人类患者、成人或儿童)、施用的剂量、频率和方式等的描述。
V.风险评估和治疗
本申请的发明人还发现某些细菌物种的水平改变可指示COVID患者随后发展PACS症状的前景或可能性，因此可提供预防性治疗的基础：他们揭示了当使用某些指定的数学工具适当计算时可以分析某些细菌物种(例如表2所示的一种或多种物种)的水平或相对丰度以指示个体患者随后发展PACS症状的风险或可能性。
例如，当分析从正在测试的COVID患者中取出的粪便样品时，例如通过PCR，尤其是定量PCR来确定表2中细菌物种在样品中的水平或相对丰度。同时，包括COVID-19患者的参考群组，其中一些COVID-19患者将最终发展PACS，而其它COVID-19患者将不发展PACS，相同细菌物种的水平或相对丰度，通过与从这些COVID-19患者中初始诊断COVID-19时取自各个COVID患者的粪便样品中存在细菌物种的相同方法测定。然后使用从参考群组获得的数据通过随机森林模型生成决策树，并且来自被测试的个体患者的一种或多种细菌物种的水平或相对丰度沿着决策树运行以生成评分。当患者的评分大于0.5时，该患者被认为具有增加的发展PACS的风险。相反，当患者的评分不大于0.5时，认为该患者没有增加的PACS的风险。
一旦进行PACS风险评估，例如，已经被诊断为患有COVID-19(例如，基于针对SARS-COV2的阳性PCR或抗体测试)并且已经处于从疾病中恢复的过程的个体被认为以后具有增加的发展PACS的风险，可以采取适当的治疗步骤作为实现预防PACS症状发作或降低其严重程度或完全消除它们的目标的措施。例如，可以通过FMT或通过经由口服或局部递送的替代施用方法给予患者包含有效量的表1和表3中列出的加上长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌和假小链双歧杆菌的一种或多种有益细菌物种的组合物，使得患者胃肠道中的细菌谱将被修改为有利于预防、减轻、消除或逆转PACS症状的结果的细菌谱。
实施例
以下实施例仅通过示例方式而非通过限制性方式被提供。本领域技术人员将容易地认识到可改变或修改以产生基本上相同或类似结果的各种非关键参数。
背景
2019冠状病毒病(COVID-19)在急性感染过程中的临床特点得到了很好地描述，但对COVID-19的长期并发症知之甚少。以COVID-19发作后超过4周的长期并发症和/或持续性症状为特点的急性COVID-19后综合征(PACS)越来越多地被认识到1-3。多达四分之三的患者在康复后六个月描述了至少一种症状，并且通常报道了包括疲劳、肌无力和睡眠困难在内的多系统症状4。
PACS发展的潜在原因在很大程度上是不清楚的。免疫和炎性反应的扰动、急性病毒感染引起的细胞损伤或危重疾病后的后遗症可导致COVID-19感染后的长期症状5。由于胃肠道是体内最大的免疫器官，因此对由驻留微生物诱导的COVID-19感染的异常免疫应答可能影响恢复过程。新出现的证据支持肠道菌群失调在COVID-19感染的严重程度中的潜在作用6。本申请的发明人在此研究了肠道微生物群组成是否影响以及在多大程度上影响具有不同严重程度的COVID-19感染的康复患者的持续性症状的风险。
补充有益细菌以降低PACS的风险或缓解PACS的症状
在6个月时检查肠道微生物组组成和与不同症状的关联。基于置换多变量方差分析(PERMANOVA)，消化道组成与住院期间的药物治疗或疾病严重程度无关(图2A，表14)。PACS的症状分为呼吸症状(咳嗽、痰、鼻塞/流鼻涕、气短)，神经精神症状(头痛、头晕、味觉丧失、嗅觉丧失、焦虑、注意力集中困难、睡眠困难、悲伤、记忆力差、视力模糊)，胃肠症状(恶心、腹泻、腹痛、上腹痛)，皮肤病学症状(脱发)、肌肉骨骼症状(关节痛、肌肉痛)和疲劳。使用线性模型的多变量关联(MaAsLin)来测试具有不同类别症状的单个细菌分类群的关联。不同的症状与不同的肠道微生物组模式相关(图2B，表15)。
总共81种细菌物种与不同类别的PACS相关，并且许多细菌物种与多于两种类别的持续性症状相关(图2C，表16)。在6个月时，具有持续呼吸症状的患者的肠道微生物组组成与许多机会致病菌正相关，所述机会致病菌包括咽峡炎链球菌群(Streptococcusanginosus group)、前庭链球菌(Streptococcus vestibularis)、格氏链球菌(Streptococcus gordonii)和双孢梭菌(Clostridium disporicum)，而与机会性感染相关的医院致病菌(包括无害芽孢杆菌(Clostridium innocuum)和内氏放线菌(Actinomycesnaeslundii))的丰度与神经精神症状和疲劳相关。与非COVID-19对照相比，产丁酸盐的物种，例如食葡糖罗斯拜瑞氏菌、普氏栖粪杆菌和人罗斯拜瑞氏菌在6个月时持续脱发的患者(n＝23)中显著减少(P<0.05，表16)。此外，已知对宿主免疫有益的多种细菌物种(包括假小链双歧杆菌、普氏栖粪杆菌、食葡糖罗斯拜瑞氏菌和人罗斯拜瑞氏菌)的相对丰度在6个月时显示出与PACS的最大负相关性(图2C，表16，表17)。
发现非常少的患者进入重症监护病房或需要机械通气，但许多患者发展PACS，表明持续性症状不太可能是病危后综合征的结果。已知具有免疫调节功能的几种共生体(包括双歧杆菌属、罗斯拜瑞氏菌属和粪杆菌属)的丧失尤其与康复的COVID-19患者中的持续性症状相关。后两种细菌是重要的短链酸(SCFA)生产者和维持免疫稳态的主要参与者。SCFA已经显示出改变趋化性和吞噬作用，诱导活性氧物质，改变细胞增殖和功能，并具有抗微生物作用和抗炎作用。
因此，提供了通过补充表1和表3中列出的这些有益细菌来预防和缓解这些症状的方法。由于这些症状也可以在包括没有COVID-19病史的人在内的任何人中出现，因此这种方法可以应用于涉及这些症状的任何人。
预测PACS风险的机器学习模型
在表2中列出的物种，优选长双歧杆菌(NCBI:txid216816)、韦氏布劳特氏菌(NCBI:txid418240)、假小链双歧杆菌(NCBI:txid28026)、普氏栖粪杆菌(NCBI:txid853)、Fusicatenibacter saccharivorans(NCBI:txid1150298)，可以以不同的组合使用以建立风险评估模型来确定一个人在针对COVID-19测试呈阳性后是否处于COVID-19的PACS的风险中。
为了确定受试者中PACS的风险，将进行以下步骤：
(1)通过在初始诊断COVID-19时(例如在入院时)在具有和没有PACS的COVID-19患者的群组中测定选自表12的物种的相对丰度，获得一组训练数据；
(2)测定正在测试PACS风险的受试者中这些物种的相对丰度；
(3)使用随机森林模型将受试者中这些物种的相对丰度与训练数据进行比较；
(4)将由随机森林根据训练数据生成决策树。相对丰度将沿着决策树运行并生成风险评分。如果模型中至少50％的树(可能性>0.5)认为受试者是具有PACS的COVID-19患者，则被测试的受试者被认为具有增加的PACS风险。如果模型中少于50％的树(可能性<0.5)认为受试者是不具有PACS的COVID-19患者，则被测试的受试者被认为不具有增加的PACS风险。
补充有益细菌以提高功能能力
6分钟步行试验(6MWT)经常用于测定患者的功能能力4。先前的工作已经显示，具有较低微生物群丰富度的康复期后患者具有受损的肺功能6，然而，COVID-19后6分钟步行距离减少的原因仍然未知。在6个月随访时已经提供了粪便样品的68名COVID-19患者中，其中52名患者在6个月时进行了6分钟步行试验评估。在具有PACS的患者中6分钟的中值步行距离显著低于没有PACS的患者(平均464米对比382米，P<0.001，图10A)。所述步行距离与肠道微生物组的几种短链脂肪酸(SCFA)和丁酸盐的生产者(包括假小链双歧杆菌7、食葡糖罗斯拜瑞氏菌8和卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)9)呈正相关，意味着清除病毒后人与肠道-肺-微生物组轴之间的有益共生关系。因此，补充这些SCFA和丁酸盐的生产者(假小链双歧杆菌、食葡糖罗斯拜瑞氏菌和卵形拟杆菌)可以提高功能能力。
还观察到步行距离与致病菌物种(例如，无害芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌(Clostridium bolteae))显著负相关，这可赋予致病性或与不同群体中的疾病风险相关(P<0.05，图10B)。减少图10B中列出的细菌也可以提高功能能力。
补充有益细菌以预防或缓解总体PACS
在具有PACS的患者中检测到的肠道细菌物种中，在基线和随访样品中，28种细菌物种减少，14种细菌物种富集(图9D，9E，表11，表12)。在6个月时，与非COVID-19对照相比，具有PACS的患者显示出显著较低水平的产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens)、普氏栖粪杆菌、卵形布劳特氏菌(Blautia obeum)和较高水平的活泼瘤胃球菌(Ruminococcus_gnavus)、普通拟杆菌(Bacteroides_vulgatus)(P<0.05，线性判别分析效应大小>2，LefSe)(图1D，表12)。没有PACS的受试者在入院时仅有22种细菌物种改变，其到6个月时完全恢复(图9D，表13)。
发现细菌物种例如小克里斯滕森氏菌(Christensenella minuta)、细枝真杆菌(Eubacterium ramulus)、青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)在6个月时发展PACS的患者的基线样品中被耗尽(P<0.05，LefSe>2，图9E，表11)。在入院时总共13种细菌物种(包括韦氏布劳特氏菌和长双歧杆菌)与6个月时的PACS呈负相关，表明这些物种在从SARS-CoV-2感染的康复中具有推定的保护作用(图11B，图11C)；而放线菌S6_Spd3、约翰森放线菌(Actinomyces_johnsonii)和极小奇异菌(Atopobium_parvulum)与PACS呈正相关。发现细菌物种例如活泼瘤胃球菌、无害芽孢杆菌、Erysipelatous ramosum的重叠，其从基线到随访保持改变并表现出与几种PACS症状的关联(图11D)，这进一步暗示了COVID-19患者中改变的肠道微生物组与康复过程之间的联系。这些发现共同表明在入院时个体的肠道微生物组结构可能影响受试者对COVID-19的长期并发症的易感性。
组合物包含选自表3或图9E(灰色，非COVID-19对照)、表11(组别＝非COVID-19对照)、图1D(橙色，非COVID-19对照)、表12(组别＝非COVID-19对照)、图11B(系数(coef)<0)的一种或多种有益细菌。这些细菌可以联合施用或作为单一益生菌施用以预防或缓解受试者中PACS的症状。优选地，所述细菌选自长双歧杆菌(NCBI:txid216816)、韦氏布劳特氏菌(NCBI:txid418240)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)(NCBI:txid1304)、Fusicatenibacter_saccharivorans(NCBI:txid 1150298)、厚壁菌门细菌CAG_83(NCBI:txid 1262992)、血孪生球菌(Gemella_sanguinis)(NCBI:txid 84135)、澳洲链球菌(Streptococcus_australis)(NCBI:txid 113107)、霍氏真杆菌(Eubacterium_hallii)(NCBI:txid411469)、普氏栖粪杆菌(NCBI:txid 853)、Anaerostipes_hadrus(NCBI:txid649756)。
方法
研究群体
该前瞻性群组研究在中国香港的三个地区医院(威尔斯亲王医院、基督教联合医院和仁济医院)进行。从2020年2月1日至2020年8月31日招募所有确诊为COVID-19的患者，如通过在鼻咽拭子、鼻拭子、深喉唾液、痰、气管吸出物或粪便中的逆转录酶聚合酶链式反应试验为阳性SARS-CoV-2所证明的。根据当地政府的政策，所有确诊COVID-19的患者都必须住院。如果患者符合以下标准中的任一个，则可以出院：至少相隔24小时采取的两个相同类型的临床样本(即呼吸道或粪便)通过RT-PCR测试SARS-CoV-2核酸呈阴性或SARS-CoV-2抗体测试呈阳性。如果患者在随访前无法联系到，拒绝参加研究或死亡，则将其排除在外。从香港医院管理局临床管理系统的电子病历中提取包括人口统计资料、临床和实验室数据在内的数据。COVID-19感染的严重程度被分类为(1)轻度(如果没有肺炎的影像学证据)；(2)中度(如果肺炎与发热和呼吸道症状一起存在)；(3)重度(如果呼吸速率≥30/min，当呼吸环境空气时氧饱和度≤93％，或PaO2/FiO2≤300mmHg(1mmHg＝0.133kPa))；或(4)危重(如果存在需要机械通气的呼吸衰竭、休克或需要重症监护的器官衰竭)12。从入院开始，在出院后1个月和6个月连续收集粪便样品。住院患者的粪便样品由医院工作人员收集，而出院患者在出院后1个月和6个月的随访当天提供粪便，或者在家中自采样并在收集24小时内快递到医院。将所有样品都收集在含有保护介质(cat.63700,Norgen Biotek Corp,Ontario Canada)的收集管中并立即储存在-80℃直至处理。先前已经显示，使用该保护介质收集的粪便产生的肠道微生物群组成的数据与从立即储存在-80℃的样品中获得的数据是相当的13。在疾病发作后3个月和6个月评估COVID后30种最常见的报告症状14,15的存在(表19)。新冠肺炎长期综合后遗症(PACS)被定义为在SARS-CoV-2清除后4周无法用替代诊断解释的至少一种持续性症状。在出院后6个月对COVID-19康复患者的子集进行6分钟步行距离试验(6MWT)，其是一种简单的功能评估，用于评估有氧能力和耐力。6MWT距离数据与肠道微生物群分析相关。在COVID-19大流行之前(2019年至2020年)通过广告从社区以及从威尔斯亲王医院的内窥镜检查中心具有正常结肠镜检查(肠道准备前收集的粪便)的受试者中招募对照。选择具有类似并存病和标准饮食模式的年龄和性别匹配的对照，用于比较具有和没有COVID-19感染的受试者之间的肠道微生物群组成。对照的人口统计资料和并存病列于表8中。非COVID-19对照的排除标准是(1)在最近3个月内使用过泻药或止泻药；(2)最近的饮食变化(例如，变成素食主义者/纯素食者)；(3)已知的复合感染或败血症；(4)已知的严重器官衰竭的病史(包括失代偿期肝硬化、恶性疾病、肾衰竭、癫痫、活动性严重感染、获得性免疫缺陷综合征)；(5)最近6个月的肠道手术(不包括结肠镜检查/与肛周疾病相关的手术)；(6)回肠造口/造口的存在；以及(7)当前怀孕。鉴于已知饮食影响肠道微生物组，在住院期间记录所有COVID-19患者的饮食记录。每日标准化膳食由各医院的医院餐饮服务部提供，膳食成分和模式与香港华人通常食用的习惯性饮食一致。出院后，建议COVID-19患者继续采用与香港华人食用的每日习惯性饮食一致的多样化和标准化中国饮食。根据赫尔辛基宣言进行研究。所有患者都提供了书面知情同意书。该研究由联合的香港中文大学-新界东联网临床研究伦理委员会(the Joint Chinese University of Hong Kong–NewTerritories East Cluster Clinical Research Ethics Committee)批准(CREC参考号：2020.076)。
粪便DNA提取和测序
详细方法描述在Zuo等人的文献中16。简而言之，使用Maxwell RSC PureFood GMOand Authentication Kit和Maxwell RSC Instrument核酸提取平台(Promega,Wisconsin,USA)根据制造商的说明从0.1g匀浆化的粪便样品中提取DNA。使用Nextera DNA FlexLibrary Prep Kit(Illumina,California,USA)从提取的DNA制备测序文库，并在香港中文大学的肠道微生物群研究中心的Illumina NovaSeq 6000系统(2×150 bp)上测序。针对该研究生成的原始序列数据可在BioProject登记号PRJNA714459的序列读取档案(SequenceRead Archive)中获得。
生物信息学
使用Trimmomatic V.39对原始序列数据进行质量过滤，以去除适配子和低质量序列，并通过Kneaddata(V.0.7.2https://bitbucket.org/biobakery/kneaddata/wiki/Home)对人类基因组(参考：hg38)进行净化。在此之后，使用MetaPhlAn3，版本3.0.5从质量过滤的正向读取中推断微生物群组成分布。GNU Parallel17用于并行分析工作以加速数据处理。
统计分析和推断肠道微生物群组成
连续变量以中值(四分位距)表示，而分类变量以数字(百分比)表示。使用卡方或费希尔精确检验(对于分类参数而言)和曼-惠特尼检验(对于连续参数而言)分析亚组之间的定性和定量差异，视情况而定。使用Logistic回归估计具有95％置信区间(CI)的优势比和调整的优势比(aOR)以检查与PACS发展相关的临床参数。将按物种计数的站点和相对丰度表输入R V.3.5.1中进行统计分析。主坐标分析(PCoA)用于基于样品的物种水平组成分布来可视化样品的聚类。使用置换多变量方差分析(PERMANOVA)评估肠道群落组成与患者参数之间的关联。使用线性判别分析效应大小(LEfSe)和通过在Huttenhower Lab Galaxy实例(网站：huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)中实施的线性模型(MaAsLin)统计框架的多变量分析来鉴定特定微生物物种与患者参数的关联。在vegan R包V.2.5–7中实施PCoA、PERMANOVA和Procrustes分析。
基于随机森林的机器学习方法
执行随机森林以使用入院时的肠道微生物组组成建立PACS的预测模型。机器学习模型分析了通过MetaPhlAn3，版本3.0.5推断的微生物组分类学物种水平的相对丰度。机器学习实验使用随机森林，因为该算法已经被证明优于微生物组数据的其他学习工具18。对于该模型的实施，使用了scikit-learn实现19。使用2,000个估计器树(estimator trees)的集合和香农熵来评价在树的每个节点处分裂的质量。如别处所示，将每片叶子的最小样品数和每棵树的特征数的两个超参数分别设置为5％和30％。经由10倍交叉验证使精确度最大化来优化所有方法的超参数。
本申请中引用的所有专利、专利申请和其它出版物,包括GenBank登录号和等同物，出于所有目的通过引用整体并入。
表1：用于预防和缓解不同类别的症状的有益细菌列表
Figure BDA0003906798950000241
“1”表示细菌可用于预防和减轻相应类别的症状。
表2：按重要性降序构建风险评估模型的细菌物种
Figure BDA0003906798950000242
Figure BDA0003906798950000251
表3：用于预防或缓解PACS症状的有益细菌物种
Figure BDA0003906798950000252
Figure BDA0003906798950000261
上述组合物通常不包含可检测量的表4中的任何细菌物种。
表4：用于预防或缓解PACS症状的组合物中应最小化的不利细菌物种
Figure BDA0003906798950000262
Figure BDA0003906798950000271
表5：106名COVID-19康复患者的临床特点
Figure BDA0003906798950000272
Figure BDA0003906798950000281
IQR：四分位距；CXR：胸部X光片
表6：与PACS发展相关的因素的单变量分析和多变量分析
Figure BDA0003906798950000282
表7：从68名COVID-19患者收集的粪便样品的收集时间和标签名称
Figure BDA0003906798950000283
Figure BDA0003906798950000291
表8：COVID-19和非COVID-19群组的特点
Figure BDA0003906798950000292
Figure BDA0003906798950000301
*p＝0.796
缩写：NA，没有
表9：与非COVID-19对照相比，COVID-19患者在活动性感染期间和疾病消退后肠道微生物群组成的PERMANOVA
Figure BDA0003906798950000302
表10：来自病毒清除后的COVID-19患者的1个月随访至6个月随访之间在门、属和种水平上的肠道微生物群组成差异。
Figure BDA0003906798950000303
Figure BDA0003906798950000311
表11：与非COVID-19对照相比，来自具有PACS的COVID-19患者的基线样品的微生物群落的LEfSe分析
Figure BDA0003906798950000312
Figure BDA0003906798950000321
表12：与非COVID-19对照相比，来自具有PACS的COVID-19患者的6个月随访的微生物群落的LEfSe分析。
Figure BDA0003906798950000331
Figure BDA0003906798950000341
表13：与非COVID-19对照相比，来自没有PACS的患者的基线样品的微生物群落的LEfSe分析。
Figure BDA0003906798950000342
Figure BDA0003906798950000351
表14：利用多因素PERMANOVA(Adonis)检验对6个月随访的肠道微生物组群落的显著性和相对贡献的因素
Figure BDA0003906798950000352
表15：6个月随访的不同PACS亚组与肠道微生物组群落的关联的多因素PERMANOVA(Adonis)检验
特点 SumsOfSqs MeanSqs F.Model R2 p_值 p.adjust
胃肠 0.6247 0.62466 2.2083 0.06856 0.006 0.0072
呼吸 0.7862 0.78624 2.699 0.06176 0.002 0.004
疲劳 0.776 0.77605 2.5627 0.05751 0.001 0.003
肌肉骨骼 0.6622 0.66217 2.252 0.05737 0.004 0.006
脱发 0.5152 0.51515 1.8087 0.04914 0.013 0.013
神经 0.7493 0.74931 2.54 0.04414 0.001 0.003
表16：使用MaAsLin分析在6个月随访时不同PACS亚组与肠道微生物群组成之间的关联
Figure BDA0003906798950000353
Figure BDA0003906798950000361
Figure BDA0003906798950000371
1＝显著相关
0＝不显著相关
表17：与不同COVID后的后遗症正相关的细菌物种(P<0.05，来自MaAsLin的线性混合模型)
Figure BDA0003906798950000372
Figure BDA0003906798950000381
Figure BDA0003906798950000391
Figure BDA0003906798950000401
表18：在6个月时与急性COVID-19后综合征相关的基线细菌物种
物种# 门 平均相对丰度(％) 关联群组
长双歧杆菌 放线菌门 5.00 无症状
假小链双歧杆菌 放线菌门 4.68 无症状
韦氏布劳特氏菌 厚壁菌门 4.67 无症状
普氏栖粪杆菌 厚壁菌门 4.51 无症状
Fusicatenibacter_saccharivorans 厚壁菌门 4.43 无症状
Anaerostipes_hadrus 厚壁菌门 4.30 无症状
霍氏真杆菌 厚壁菌门 4.29 无症状
食葡糖罗斯拜瑞氏菌 厚壁菌门 4.16 无症状
Dorea_longicatena 厚壁菌门 4.13 无症状
伴生粪球菌 厚壁菌门 3.94 无症状
厚壁菌门细菌CAG_83 厚壁菌门 3.94 无症状
唾液链球菌 厚壁菌门 3.85 无症状
Agathobaculum_butyriciproducens 厚壁菌门 3.82 无症状
粪罗斯拜瑞氏菌 厚壁菌门 3.76 无症状
肠道塞利单胞菌 厚壁菌门 3.44 无症状
细枝真杆菌 厚壁菌门 3.19 无症状
双孢梭菌 厚壁菌门 2.50 无症状
内氏放线菌 厚壁菌门 2.28 无症状
丝状霍尔德曼氏菌 厚壁菌门 2.05 无症状
粪考拉杆菌 厚壁菌门 3.77 PACS#
*在任一群组中，平均相对丰度>1％
#PACS：急性COVID-19后综合征
#按线性判别分析效应大小报告的对数判别分析评分排序
表19：用于症状评估的调查问卷
症状 3个月 6个月
发烧
发冷
咳嗽
痰液产生
咽喉痛
鼻塞或流鼻涕
疲劳
关节痛
肌肉痛
呼吸短促
头痛
头晕
恶心
呕吐
腹泻
味觉丧失
嗅觉丧失
腹痛
上腹部痛
注意力集中困难
不能锻炼
睡眠困难
焦虑
悲伤
记忆问题
胸痛
心悸
盗汗
脱发
视力模糊
任何其它症状  
参考文献
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Claims (30)

1.用于治疗受试者中的新冠肺炎长期综合后遗症(PACS)的组合物，其包含有效量的(1)选自表1以及长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、韦氏布劳特氏菌(Blautiawexlerae)和假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)的一种或多种有益细菌物种；以及(2)生理学上可接受的赋形剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其还包含选自表3的一种或多种有益细菌物种。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其包含总共约106至约1012个菌落形成单位(CFU)的有益细菌物种。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其不包含可检测量的表4中的任何细菌物种。
5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其包含有效量的以下一种或多种不同的有益细菌物种：长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌、假小链双歧杆菌、普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)和Fusicatenibacter saccharivorans。
6.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其包含有效量的
(i)Agathobaculum butyriciproducens、假小链双歧杆菌、人罗斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)、Anaerostipes hadrus、小类杆菌CAG:357和直肠真杆菌(Eubacterium rectale)；
(ii)Agathobaculum butyriciproducens、假小链双歧杆菌、人罗斯拜瑞氏菌和Asaccharobacter celatus；
(iii)Agathobaculum butyriciproducens、人罗斯拜瑞氏菌、Anaerostipes hadrus和伴生粪球菌(Coprococcus comes)；
(iv)Agathobaculum butyriciproducens、假小链双歧杆菌、人罗斯拜瑞氏菌、Anaerostipes hadrus和腐烂别样杆菌(Alistipes putredinis)；
(v)Agathobaculum butyriciproducens、Anaerostipes hadrus、真杆菌CAG:274和产甲酸多尔氏菌(Dorea formicigenerans)；或
(vi)Agathobaculum butyriciproducens、人罗斯拜瑞氏菌、直肠真杆菌、甲酸芽殖菌(Gemmiger formicilis)、凸腹真杆菌(Eubacterium ventriosum)和产甲酸多尔氏菌。
7.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其包含有效量的以下一种或多种不同的产丁酸盐细菌物种：食葡糖罗斯拜瑞氏菌(Roseburia inulinivorans)、普氏栖粪杆菌和人罗斯拜瑞氏菌。
8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其基本上由有效量的
(1)一种或多种有益细菌物种；(2)一种或多种生理学上可接受的赋形剂组成。
9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其被配制用于口服摄取。
10.如权利要求9所述的组合物，其呈食品或饮料物品的形式。
11.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其被配制用于直接沉积到所述受试者的胃肠道。
12.权利要求1-11中任一项所述的组合物在制备用于治疗或预防受试者中的PACS的药物中的用途。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述受试者已经发展了PACS或尚未发展PACS。
14.如权利要求12或13所述的用途，其中向所述受试者施用包含有益细菌物种的一种组合物。
15.如权利要求12-14中任一项所述的用途，其中向所述受试者施用两种或更多种组合物，所述组合物中的每一种包含一种或多种所述有益细菌物种。
16.如权利要求12-15中任一项所述的用途，其中通过口服摄取施用所述组合物。
17.如权利要求12-15中任一项所述的用途，其中所述组合物直接沉积到所述受试者的胃肠道。
18.如权利要求12-17中任一项所述的用途，其中施用以下细菌物种的组合：
(i)Agathobaculum butyriciproducens、假小链双歧杆菌、人罗斯拜瑞氏菌、Anaerostipes hadrus、小类杆菌CAG:357、直肠真杆菌、产气柯林斯菌(Collinsellaaerofaciens)、甲酸芽殖菌、厚壁菌门细菌(Firmicutes bacterium)CAG:83、伴生粪球菌、普氏栖粪杆菌、真杆菌CAG:274、Ruthenibacterium lactatiformans、柔嫩梭菌(Clostridium leptum)、腐烂别样杆菌、凸腹真杆菌、颤杆菌克57_20(Oscillibactersp.57_20)、Fusicatenibacter saccharivorans、厌氧丁酸菌(Anaerobutyricum hallii)和产甲酸多尔氏菌的一种或多种不同的有益细菌物种，用于预防或缓解疲劳；
(ii)Agathobaculum butyriciproducens、假小链双歧杆菌、人罗斯拜瑞氏菌、产气柯林斯菌、甲酸芽殖菌、普氏栖粪杆菌、柔嫩梭菌、颤杆菌克57_20、Adlercreutziaequolifaciens subsp.celatus、产液阿德勒克罗伊茨菌(Adlercreutzia equolifaciens)和扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)的一种或多种不同的有益细菌物种，用于预防或缓解胃肠症状；
(iii)Agathobaculum butyriciproducens、人罗斯拜瑞氏菌、Anaerostipes hadrus、小类杆菌CAG:357、直肠真杆菌、甲酸芽殖菌、厚壁菌门细菌CAG:83、伴生粪球菌、普氏栖粪杆菌、真杆菌CAG:274、Ruthenibacterium lactatiformans、凸腹真杆菌、颤杆菌克57_20、Adlercreutzia equolifaciens subsp.celatus、产液阿德勒克罗伊茨菌、Ruminococcusbicirculans、肠道巴恩斯氏菌(Barnesiella intestinihominis)、细枝真杆菌(Eubacterium ramulus)和小牛乳球菌(Lactococcus petauri)的一种或多种不同的有益细菌物种，用于预防或缓解神经症状；
(iv)Agathobaculum butyriciproducens、假小链双歧杆菌、人罗斯拜瑞氏菌、Anaerostipes hadrus、小类杆菌CAG:357、直肠真杆菌、产气柯林斯菌、甲酸芽殖菌、厚壁菌门细菌CAG:83、普氏栖粪杆菌、真杆菌CAG:274、Ruthenibacterium lactatiformans、柔嫩梭菌、腐烂别样杆菌、凸腹真杆菌、颤杆菌克57_20和产液阿德勒克罗伊茨菌的一种或多种不同的有益细菌物种，用于预防或缓解呼吸症状；
(v)Agathobaculum butyriciproducens、人罗斯拜瑞氏菌、Anaerostipes hadrus、小类杆菌CAG:357、直肠真杆菌、甲酸芽殖菌、普氏栖粪杆菌、真杆菌CAG:274、腐烂别样杆菌、凸腹真杆菌、颤杆菌克57_20、产甲酸多尔氏菌、Adlercreutzia equolifacienssubsp.celatus、产液阿德勒克罗伊茨菌、食葡糖罗斯拜瑞氏菌和酸奶瘤胃球菌(Ruminococcus lactaris)的一种或多种不同的有益细菌物种，用于预防或缓解肌肉骨骼症状；或者
(vi)Agathobaculum butyriciproducens、人罗斯拜瑞氏菌、Anaerostipes hadrus、小类杆菌CAG:357、直肠真杆菌、甲酸芽殖菌、普氏栖粪杆菌、凸腹真杆菌、产甲酸多尔氏菌、食葡糖罗斯拜瑞氏菌和酸奶瘤胃球菌的一种或多种不同的有益细菌物种，用于预防或缓解脱发。
19.用于治疗或预防受试者的PACS的试剂盒，其包含多种组合物，所述组合物各自包含有效量的选自表1和表3以及长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌和假小链双歧杆菌的一种或多种有益细菌物种。
20.如权利要求19所述的试剂盒，其包含多种组合物，所述组合物各自包含有效量的一种或多种不同的有益细菌物种，所述有益细菌物种选自长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌、假小链双歧杆菌、普氏栖粪杆菌和Fusicatenibacter saccharivorans。
21.如权利要求19所述的试剂盒，其包含多种组合物，所述组合物各自包含有效量的以下组合中的任一种：
(i)Agathobaculum butyriciproducens、假小链双歧杆菌、人罗斯拜瑞氏菌、Anaerostipes hadrus、小类杆菌CAG:357和直肠真杆菌；
(ii)Agathobaculum butyriciproducens、假小链双歧杆菌、人罗斯拜瑞氏菌和Asaccharobacter celatus；
(iii)Agathobaculum butyriciproducens、人罗斯拜瑞氏菌、Anaerostipes hadrus和伴生粪球菌；
(iv)Agathobaculum butyriciproducens、假小链双歧杆菌、人罗斯拜瑞氏菌、Anaerostipes hadrus和腐烂别样杆菌；
(v)Agathobaculum butyriciproducens、Anaerostipes hadrus、真杆菌CAG:274和产甲酸多尔氏菌；或者
(vi)Agathobaculum butyriciproducens、人罗斯拜瑞氏菌、直肠真杆菌、甲酸芽殖菌、凸腹真杆菌和产甲酸多尔氏菌。
22.如权利要求19所述的试剂盒，其包含多种组合物，所述组合物各自包含有效量的以下一种或多种不同的产丁酸盐细菌物种：食葡糖罗斯拜瑞氏菌、普氏栖粪杆菌和人罗斯拜瑞氏菌。
23.如权利要求19-22中任一项所述的试剂盒，其中所述组合物呈粉剂、液体、糊剂、霜剂、片剂或胶囊的形式。
24.用于评估受试者中的PACS的风险的方法，其包括：
(1)在来自所述受试者的粪便样品中测定表2中列出的一种或多种细菌物种的水平或相对丰度；
(2)在来自包含具有和没有PACS的COVID-19患者的参考群组在初始诊断COVID-19时的粪便样品中测定相同细菌物种的水平或相对丰度；
(3)使用从步骤(2)获得的数据通过随机森林模型生成决策树，并将来自步骤(1)的一种或多种细菌物种的水平或相对丰度沿着所述决策树运行以生成评分；以及
(4)将评分大于0.5的受试者确定为具有增加的PACS风险，并且将评分不大于0.5的受试者确定为不具有增加的PACS风险。
25.如权利要求24所述的方法，其中步骤(1)和(2)中的每一个都包括宏基因组测序。
26.如权利要求24所述的方法，其中步骤(1)和(2)中的每一个都包括聚合酶链式反应(PCR)。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述PCR是定量PCR(qPCR)。
28.如权利要求24-27中任一项所述的方法，其中所述细菌物种包括以下的一种或多种：长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌、假小链双歧杆菌、普氏栖粪杆菌和Fusicatenibactersaccharivorans。
29.用于评估受试者中的PACS的风险的试剂盒，其包含用于测定表2中列出的一种或多种细菌物种的水平或相对丰度的试剂。
30.如权利要求29所述的试剂盒，其中所述细菌物种包括以下的一种或多种：长双歧杆菌、韦氏布劳特氏菌、假小链双歧杆菌、普氏栖粪杆菌和Fusicatenibactersaccharivorans。
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