CN116019054A - 一种食蟹猴nash模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及动物疾病模型构建技术领域，具体涉及一种食蟹猴NASH模型的构建方法，构建方法根据饲养标准对食蟹猴通过诱导饲料进行饲养，其中，诱导饲料为动物油和高胆固醇的混合物，对食用诱导饲料后的食蟹猴进行NASH症状检测，确认食蟹猴NASH模型构建成功，通过本发明食蟹猴NASH模型的构建方法，相比使用兔子、小鼠、仓鼠等，不仅模型更与人类特征最接近，而且饲养周期适宜，方便在不同饲养周期随时检测，从而了解NASH相关的各项数值变化情况，更容易对NASH的进展进行研究。
Description
技术领域
本发明涉及动物疾病模型构建技术领域，具体涉及一种食蟹猴NASH模型的构建方法。
背景技术
非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，简称NAFLD)是全球第一大慢性肝病，其中从单纯的脂肪肝进展为非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis，简称NASH)是疾病进展、发展为肝细胞癌的关键步骤。当前对NASH疾病进展的特征认识还不够，针对NASH的药物研发除了经常遇到的靶点雷同的问题外，还面临着更多方面的挑战。
最大的挑战来源于药效模型种类很多，使用不同模型进行药效学实验造成在项目之间很难直观的相互比较，对项目质量评价带来很多模糊的空间，且各模型仅能在一定程度上模拟NASH的症状，但NASH模型背后的机理可能与人类特征相差十万八千里。
目前临床前药效的评价动物模型大多采用大鼠和小鼠的模型，从种属及基因等维度上，鼠和人的相近程度远远低于非人灵长类，进而鼠NASH模型的进展与人类特征相差甚远，导致研究鼠NASH的病理特诊与临床上人类NASH的病变特征相差较大，还有部分通过低剂量的酒精在非人灵长类上进行NASH造模，成模周期长，通常需三年之久。
发明内容
本发明的目的在于提供一种食蟹猴NASH模型的构建方法，以解决上述背景技术中提到的技术问题。
为了实现上述目的，本发明公开了一种食蟹猴NASH模型的构建方法，该构建方法包括：根据饲养标准对食蟹猴通过诱导饲料进行饲养，其中，诱导饲料为动物油和高胆固醇的混合物，对食用诱导饲料后的食蟹猴进行NASH症状检测，确认食蟹猴NASH模型构建成功。
优选地，诱导饲料通过烤制而成。
可选地，诱导饲料的能量为4600-4900Kcal/kg。
优选地，诱导饲料的能量为4789.5Kcal/kg。
进一步地，诱导饲料的营养成分包括蛋白质、脂肪和碳水化合物。
可选地，饲养标准包括每只食蟹猴食用的诱导饲料的量为190-210g/天。
可选地，将190-210g的诱导饲料分两顿。
可选地，该方法中还通过辅食和水对食蟹猴进行饲养，其中，辅食包括蔬菜和水果。
优选地，食蟹猴的体重为2-2.5kg。
优选地，食蟹猴的年龄为1.5-2岁。
优选地，诱导饲料的食用周期为0-50周/只。
进一步地，该方法在通过诱导饲料对食蟹猴进行饲养前，确认食蟹猴无肝脏疾病。
可选地，NASH症状检测的方法包括体重、血液、磁共振成像、肝脏活检和计算机断层扫描中的一种或多种。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的食蟹猴NASH模型的构建方法根据饲养标准对食蟹猴通过诱导饲料进行饲养，其中，诱导饲料为动物油和高胆固醇的混合物，对食用诱导饲料后的食蟹猴进行NASH症状检测，确认食蟹猴NASH模型构建成功，通过本发明食蟹猴NASH模型的构建方法，相比使用兔子、小鼠、仓鼠等，不仅模型更与人类特征最接近，而且饲养周期适宜，方便在不同饲养周期随时检测，从而了解NASH相关的各项数值变化情况，更容易对NASH的进展进行研究。
附图说明
图1为本发明一实施例的正常组和模型组的血液检测中肝功能指标变化趋势图。
图2为本发明一实施例的正常组和模型组的磁共振成像示意图。
图3为本发明一实施例的PDFF变化趋势图。
图4为本发明一实施例的正常组和模型组计算机断层扫描成像示意图。
图5为本发明一实施例的CT变化趋势图。
图6为本发明一实施例的模型组HE染色示意图。
图7为本发明一实施例的模型组天狼星红染色示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面通过结合附图和具体实施例对本发明方案进行详细阐述。应当理解，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
1、动物信息
如下表1所示：
表1动物信息
| 种属品系 | 食蟹猴 |
| 健康状况 | 无肝脏疾病、非SPF级 |
| 数量 | 15只 |
| 体重 | 2-2.5kg |
| 年龄 | 1.5-2岁 |
2、诱导饲料营养成分
诱导饲料为动物油和高胆固醇的混合物，其动物油如猪油，混合物经烤制再形成诱导饲料，其中，诱导饲料的能量为4789.5Kcal/kg，诱导饲料的营养成分包括蛋白质、脂肪和碳水化合物，如下表2所示：
表2诱导饲料营养成分
3、建模动物饲养管理
上述实验用15只食蟹猴编号为01、02、…、15，根据饲养标准对15只食蟹猴通过上述诱导饲料进行饲养。
环境：为食蟹猴提供动物房，动物房的室温控制在18-26℃、湿度控制在40-70％，每只食蟹猴独用一个不锈钢笼具，笼具规格的长×宽×高为90×90×90cm，且动物房和笼具每天清洗1次，笼具每两周更换一次，动物房的地面和墙面每2周消毒1次。
饲养标准：除试验需要禁食外，食蟹猴每日自由饮水，每只食蟹猴食用的诱导饲料的量为200g，并将200g诱导饲料分为上午和下午两顿投喂，在下午还可通过辅食和水对食蟹猴进行饲养，其辅食可以是适量的新鲜蔬菜或水果，共计诱导饲料的食用周期为50周/只，另外，还可定时对食蟹猴摄入的诱导饲料的量进行监控，如每24小时称量诱导饲料的剩余量。
4、NASH症状检测
对食用诱导饲料后的食蟹猴进行NASH症状检测，NASH症状检测的方法使用体重、血液、磁共振成像、肝脏活检和计算机断层扫描，以监控建模过程。
检测方法1、体重
需对每只食蟹猴每周检测一次。
检测方法2、血液
需对每只食蟹猴每周检测一次，利用奥林巴斯AU640设备对食蟹猴血液生化中的肝功能指标进行检测，即对谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-c)和低密度脂蛋白(LDL-c)进行检测，以判断NASH进展。
检查方法3、磁共振成像
需对每只食蟹猴每三个月检测一次，利用磁共振进行肝脏脂肪密度(PDFF)检测，该方法是一种无创检测技术，可以随时对食蟹猴进行检测确认NASH症状的进展，初步了解整个肝脏的脂肪含量和分布情况。
检测方法4、肝脏活检
需对每只食蟹猴在超声波引导下每四周检测一次，与检测方法3不同，肝脏活检是一种有创的检测技术，根据检测方法1反应的肝脏情况，再通过肝脏活检可以更加深入的了解肝脏组织的形态学的改变。
检测方法5、计算机断层扫描
需对每只食蟹猴每三个月检测一次，计算机断层扫描结果可以直观的反应肝脏的致密度，NASH早期扫描的致密度较低，随着NASH的进展，如肝脏组织中纤维化的产生，NASH后期扫描的致密度升高。
5、建模检测数据
参与试验的15只食蟹猴中，结合血液、磁共振成像、计算机断层扫描和肝脏活检的检测结果，可观察在不同饲养周期时的NASH进展，最终确认通过本发明方法构建的食蟹猴NASH模型均构建成功。
另外，为了与建模用15只食蟹猴形成对比，每次检测还对照了10只健康的食蟹猴作为正常组。
1)血液检测：对通过本发明方法饲养的15只食蟹猴作为模型组，进行肝功能指标检测，且将未进行NASH模型构建的10只食蟹猴作为正常组，对比在第0、10、16、30、50周时模型组和正常组肝功能指标变化情况，检测得到的模型组(图中标记为：model)和正常组(图中标记为：sham)的肝功能指标中ALT平均值、AST平均值、TG平均值、TC平均值、HDL-c平均值、LDL-c平均值如图1所示。
结论：由图1中各项平均值(平均值已加减标准误)可见，在第10周开始，模型组的肝功能的各项指标均显著高于正常组，到第50周时，通过本发明方法构建的食蟹猴NASH模型构建成功。
2)磁共振成像检测：对通过本发明方法饲养的15只食蟹猴作为模型组，进行PDFF检测，且将未进行NASH模型构建的10只食蟹猴作为正常组，对比在第24周时模型组和正常组PDFF变化情况，检测得到的正常组(图中标记为：naive)和模型组(图中标记为：week 24)成像参照图2所示，相应的根据图2中脂肪的密度计算得出的PDFF平均值如图3所示。
结论：由图3中PDFF平均值(平均值已加减标准误)可见在24周时模型组与正常组相比PDFF显著性增高，且相比正常组，模型组在24周时PDFF增加了23％，而正常组并无明显增加，此时模型组处于NASH进展期，通过本发明方法构建的食蟹猴NASH模型构建成功。
3)计算机断层扫描检测：对通过本发明方法饲养的15只食蟹猴作为模型组，进行CT值检测，且将未进行NASH模型构建的10只食蟹猴作为正常组，对比在第24周时模型组和正常组CT变化情况，检测得到的正常组(图中标记为：naive)和模型组(图中标记为：model-24wks)成像参照图4所示，相应的根据图4中CT扫描图计算得到的CT平均值如图5所示。
结论：由图4中CT平均值(平均值已加减标准误)可见，在第24周时，与正常组相比模型组肝脏硬度降低，此时模型组处于NASH进展期，通过本发明方法构建的食蟹猴NASH模型构建成功。
4)肝脏活检检测：对通过本发明方法饲养的15只食蟹猴作为模型组，进行肝脏活检检测，对比第10、16、30、50周(图中标记为week-10、week-16、week-30、week-50)的肝脏活检变化情况，通过HE染色和天狼星红染色成像分别参照附图6和7所示。
结论：通过图6看到，各时间段均可见大量的脂肪沉积在肝组织中，在第10周时已出现肝细胞气球样变的发生，随着饲养时间越久，可见到有少量炎细胞浸润产生，通过图7看到，在第10周时，肝细胞索之间已有极少量的纤维化产生，随着饲养时间越久，纤维化的生成变多，且在第50周时已经可以明显看到玫红色阳性染色的较远纤维沉积，通过本发明方法构建的食蟹猴NASH模型构建成功。
通过本发明食蟹猴NASH模型的构建方法，相比使用兔子、小鼠、仓鼠等，不仅模型更与人类特征最接近，而且饲养周期适宜，方便在不同饲养周期随时检测，从而了解NASH相关的各项数值变化情况，更容易对NASH的进展进行研究。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用于限制发明，凡在本发明的设计构思之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种食蟹猴NASH模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
根据饲养标准对所述食蟹猴通过诱导饲料进行饲养，其中，所述诱导饲料为动物油和高胆固醇的混合物；
对食用所述诱导饲料后的所述食蟹猴进行NASH症状检测，确认食蟹猴NASH模型构建成功。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述诱导饲料的能量为4600-4900Kcal/kg。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述诱导饲料的营养成分包括蛋白质、脂肪和碳水化合物。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述饲养标准包括每只所述食蟹猴食用的所述诱导饲料的量为190-210g/天。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，将190-210g的所述诱导饲料分两顿。
6.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，还通过辅食和水对所述食蟹猴进行饲养，其中，所述辅食包括蔬菜和水果。
7.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述食蟹猴的体重为2-2.5kg。
8.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述食蟹猴的年龄为1.5-2岁。
9.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述诱导饲料的食用周期为0-50周/只。
10.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述NASH症状检测的方法包括体重、血液、磁共振成像、肝脏活检和计算机断层扫描中的一种或多种。
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2022
- 2022-12-30 CN CN202211735756.1A patent/CN116019054A/zh active Pending
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