CN116004451A - 一种复合颗粒型微生物菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种复合颗粒型微生物菌剂及其应用，属于微生物学及其农业应用技术领域。本发明采用贝莱斯芽孢杆菌GUMT319、枯草芽孢杆菌GUMT323和暹罗芽孢杆菌GUWM35三株不同种芽孢杆菌进行混合配用，并利用单因素法和响应曲面法优化三菌株及复合菌剂的发酵条件和造粒工艺，优化后得到活菌含量在10¹⁴CFU/g以上的颗粒剂，大大提高了活菌含量，同时对环境污染程度低，工序简单，操作简便，且成本可控制在1000元/100Kg左右。田间防效试验表明，该复合颗粒型微生物菌剂对烟草黑胫病和烟草青枯病防治效果均在80％以上，对烟草生产意义重大。

Description

一种复合颗粒型微生物菌剂及其应用

技术领域

本发明属于微生物学及其农业应用技术领域，尤其涉及一种复合颗粒型微生物菌剂及其应用。

背景技术

近年来，化学农药的大量使用，造成3R问题(抗药性，农药残留和有害生物再猖獗)突出。特别是随着人们生活水平的提高，对农产品的品质要求越来越高，高毒的化学农药在农业生产中的应用也越来越受到限制。因此人们迫切需要一种绿色，安全，高效的防治植物病虫害的方式，而生物防治将是解决这一问题的重要途径。

芽孢杆菌(Bacillus sp.)是一种革兰氏阳性细菌。因其在生长过程中可以产生一系列能够抑制真菌和细菌生长的代谢物，又能够产生抗逆性强(如耐热、耐旱、抗紫外线等)的芽孢，成为了理想的生防菌筛选对象。国内外已有多种登记注册并商品化生产应用的芽孢杆菌生防菌剂杀菌剂产品，但是现阶段包含芽孢杆菌成分的杀菌剂产品存在一下特点：1、成分单一，多为单一芽孢杆菌，复合芽孢杆菌杀菌剂产品未见登记；2、菌含量最多为1000亿CFU/g；3、应用最多为枯草芽孢杆菌，相对较单一；4、登记产品多以可湿性粉剂，其药效低，加工及使用过程中粉尘较大，易污染环境，对制剂生产操作人员或农药使用人员的健康有潜在威胁等问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种复合颗粒型微生物菌剂及其应用。本发明采用贝莱斯芽孢杆菌GUMT319、枯草芽孢杆菌GUMT323和暹罗芽孢杆菌GUWM35三株不同种芽孢杆菌进行混合配用，并利用单因素法和响应曲面法优化三菌株及复合菌剂的发酵条件和造粒工艺，优化后得到活菌含量在10¹⁴CFU/g以上的颗粒剂，大大提高了活菌含量，同时对环境污染程度低，工序简单，操作简便，且成本可控制在1000元/100Kg左右。防效试验表明，该复合颗粒型微生物菌剂对烟草黑胫病和烟草青枯病防治效果均在80％以上，对烟草生产意义重大。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明提供了一种复合颗粒型微生物菌剂，由贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)GUMT319、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GUMT323和暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)GUWM35组成；所述贝莱斯芽孢杆菌GUMT319的保藏编号为CCTCC NO：M 2018872，所述枯草芽孢杆菌GUMT323的保藏编号为CCTCC NO：M 2018873，所述暹罗芽孢杆菌GUWM35的保藏编号为CGMCC NO.24078。

优选的，所述复合颗粒型微生物菌剂中贝莱斯芽孢杆菌GUMT319、枯草芽孢杆菌GUMT323和暹罗芽孢杆菌GUWM35按照质量比(0.8～1.2):(0.8～1.2):(0.8～1.2)混合制得。

优选的，所述复合颗粒型微生物菌剂中贝莱斯芽孢杆菌GUMT319、枯草芽孢杆菌GUMT323和暹罗芽孢杆菌GUWM35按照质量比1:1:1混合制得。

优选的，所述复合颗粒型微生物菌剂制备过程中：使用的培养基配方为：豆粕8～9g/L、花生粕11～13g/L、麦麸12～13g/L、MgSO₄·7H₂O 0.4～0.6％、K₂HPO₄ 0.8～1.2％、NaH₂PO₄ 0.8～1.2％和ZnCl₂ 5～7mg/L；摇瓶培养条件为：35～39℃、接种量为5～7％、转速180～220rpm、装瓶量140～160mL/250mL、初始pH为6.5～7.5；发酵罐培养条件为：温度为35～39℃、通气量为2～3m³/h、装量为2～3L、接种量为0.6～1.0％；造粒配方为：十二烷基磺酸钠含量5～7％、羧甲基纤维素钠4～6％、可溶性淀粉2～4％和聚乙二醇6000 3～5％，高岭土80～85％；造粒条件为：最适造粒条件为母粒添加量为0.5～1.5％，颗粒直径大小为0.8～1.2cm，干燥温度为55～65℃，干燥时间为20～30h。

优选的，所述复合颗粒型微生物菌剂制备过程中：使用的培养基配方为：豆粕8.93g/L、花生粕12.85g/L、麦麸12.86g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5％、K₂HPO₄ 1％、NaH₂PO₄ 1％和ZnCl₂ 6mg/L；摇瓶培养条件为：37℃、接种量为6％、转速200rpm、装瓶量150mL/250mL、初始pH为7.0；发酵罐培养条件为：温度为37℃、通气量为2.5m³/h、装量为3.0L、接种量为0.8％；造粒配方为：十二烷基磺酸钠含量6％、羧甲基纤维素钠5％、可溶性淀粉3％和聚乙二醇6000 4％，高岭土82％；造粒条件为：最适造粒条件为母粒添加量为1％，颗粒直径大小为1cm，干燥温度为60℃，干燥时间为24h。

优选的，所述复合颗粒型微生物菌剂中有效活菌数≥10¹⁴CFU/mL。

优选的，所述复合颗粒型微生物菌剂中有效活菌数为2.35±0.16×10¹⁴CFU/mL。

本发明还提供了一种含有所述复合颗粒型微生物菌剂的产品。

本发明还提供了一种所述复合颗粒型微生物菌剂或所述产品在烟草黑胫病防治中的应用。

本发明还提供了一种所述复合颗粒型微生物菌剂或所述产品在烟草青枯病防治中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

(1)本发明通过单因素法和响应曲面法优化发现：贝莱斯芽孢杆菌GUMT319、枯草芽孢杆菌GUMT323和暹罗芽孢杆菌GUWM35复合菌剂培养基配方最优配比为豆粕8.93g/L、花生粕12.85g/L、麦麸12.86g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5％、K₂HPO₄ 1％、NaH₂PO₄ 1％和ZnCl₂ 6mg/L；最适摇瓶培养条件为温度为37℃、接种量为6％、转速200rpm、装瓶量150mL/250mL、初始pH为7.0；最适5L发酵罐培养条件为温度为37℃、通气量为2.5m³/h、装量为3.0L、接种量为0.8％；最适造粒配方为十二烷基磺酸钠含量6％、羧甲基纤维素钠5％、可溶性淀粉3％和聚乙二醇6000 4％，高岭土82％；最适造粒条件为母粒添加量为1％，颗粒直径大小为1cm，干燥温度为60℃，干燥时间为24h。复合菌剂颗粒剂此时活菌含量为2.35±0.16×10¹⁴CFU/mL、润湿时间为21.98±0.69s、崩解时间为80.99±0.49s、悬浮率为84.20±0.96％、pH为6.64±0.12。

(2)本发明通过盆栽实验发现，三种单菌剂颗粒剂和复合菌剂颗粒剂均对烟草黑胫病表现出良好的防治效果，其中复合菌剂颗粒剂防治效果显著优于其他处理，达到80.07％；且能显著提高烟草的株高、最大叶长叶宽，促生效果也十分显著。

(3)在大田实验中，本发明的复合菌剂颗粒剂对烟草黑胫病和烟草青枯病均表现出良好的防治效果，田间相对防效均达到了80％以上，显著高于生产上常用防治药剂防效，且能显著提高烟草株高、茎围和最大叶长叶宽。通过调查经济性状，结果显示经本发明复合菌剂颗粒剂处理的烟草亩产量提高了13.00％，亩产值提高了22.59％，上等烟率提高了4.00％。

保藏证明说明：

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)GUMT319：

保藏机构：中国典型培养物保藏中心；

保藏编号：CCTCC NO：M 2018872；

保藏日期：2018年12月07日；

保藏地址：中国.武汉.武汉大学；

分类学命名：贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GUMT323：

保藏机构：中国典型培养物保藏中心；

保藏编号：CCTCC NO：M 2018873；

保藏日期：2018年12月07日；

保藏地址：中国.武汉.武汉大学；

分类学命名：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)GUWM35：

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏编号：CGMCC NO.24078；

保藏日期：2021年12月09日；

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

分类学命名：暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)。

附图说明

图1为本发明实施例1中碳氮源、无机盐的筛选及优化过程图，其中A为基础培养基筛选；B为GUMT319、GUMT319和GUWM35三菌株不同配比筛选；C为不同碳源筛选；D为不同氮源筛选；E为不同无机盐筛选；F为不同无机盐对芽孢杆菌产孢率影响；G为不同ZnCl₂对芽孢杆菌产孢率影响；H为GUMT319、GUMT319、GUWM35和复合菌株3D曲面响应图；

图2为本发明实施例1中摇瓶发酵条件的筛选及优化过程图，其中A为不同接种量对芽孢杆菌活菌数影响；B为不同培养温度对芽孢杆菌活菌数影响；C为不同转速对芽孢杆菌活菌数影响；D为不同装瓶量对芽孢杆菌活菌数影响；E为不同初始pH对芽孢杆菌活菌数影响；F为GUMT319、GUMT319、GUWM35和复合菌株3D曲面响应图；

图3为本发明实施例1中发酵罐培养条件的筛选过程图，其中A为不同接种量对芽孢杆菌活菌数影响；B为不同培养温度对芽孢杆菌活菌数影响；C为不同通气量对芽孢杆菌活菌数影响；D为不同装瓶量对芽孢杆菌活菌数影响；

图4为本发明实施例1中助剂用量的筛选过程图，其中A为润湿剂含量筛选；B为分散剂含量筛选润湿时间测定；C为分散剂含量筛选悬浮率测定；D为崩解剂含量筛选；E为粘结剂含量筛选；F为颗粒剂贮藏期活菌数含量测定；

图5～图8为本发明实施例1中分别根据芽孢数量、润湿性、悬浮率和崩解性筛选不同造粒条件的数据；

图9为本发明实施例1中烟草黑胫病室内盆栽试验的防病效果图，其中A为空白对照；B为GUMT319颗粒剂处理；C为GUMT323颗粒剂处理；D为GUWM35颗粒剂处理；E为复合菌剂处理；F为58％钾霜灵·锰锌WP处理；G为枯草芽孢杆菌WP处理。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。以下实施例中使用的试剂、试剂盒和仪器均可由市售获得，实施例中使用的方法如无特别说明，与常规使用的方法一致。

下面结合实施例，对本发明的技术方案进行进一步详细阐述。

实施例1三种单菌剂颗粒剂和复合菌剂颗粒剂的筛选制备

1实验材料

1.1供试菌株

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)GUMT319、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)GUMT323和暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)GUWM35均由贵州大学农学院植物病理学教研室保存并提供。

1.2供试培养基

营养琼脂培养基(NA)：牛肉膏0.6g，蛋白胨2g，NaCl 1g，琼脂3g，蒸馏水200mL；

蛋白胨酵母培养基(LB)：蛋白胨2g，酵母浸粉1g，氯化钠2g，琼脂3g，蒸馏水200mL；

细菌基础培养基(CM)：葡萄糖1g，(NH₄)2SO₄ 0.4g，柠檬酸钠0.2g，MgSO₄·7H₂O0.04g，K₂HPO₄ 0.8g，KH₂PO₄ 1.2g，琼脂3g，蒸馏水200mL；

牛肉膏酵母葡萄糖培养基(NYBD)：牛肉浸膏1.6g，酵母浸粉1g，葡萄糖2g，琼脂3g，蒸馏水200mL；

蛋白胨酵母蔗糖培养基(YSP)：蛋白胨2g，酵母浸粉1g，蔗糖4g，琼脂3g，蒸馏水200mL；

所有培养基均121℃灭菌15min。

1.3供试药剂

高岭土、硅藻土、碳酸钙、膨润土、壳聚糖、十二烷基磺酸钠、拉开粉、木质素磺酸钠、三聚磷酸钠、羧甲基纤维素钠、可溶性淀粉、羧甲基纤维素钠、CaCl₂、(NH₄)₂SO₄、聚乙二醇10000、聚乙二醇6000和聚乙二醇4000。

2实验方法

2.1培养基筛选及优化

2.1.1三菌株不同配比实验

将GUMT319、GUMT323和GUWM35按照不同配比进行混合，并按照1％的接种量接种于LB培养基中，摇培12h进行稀释涂布，以获得三菌株最适配比。

2.1.2不同培养基对芽孢杆菌活菌数的影响

挑取纯化后的GUMT319、GUMT323和GUWM35单菌落接种于LB液体培养基，37℃摇床200rpm培养12-16h，OD值为0.8～1.2，获得菌悬液。取1mL的菌悬液分别接种于100mL的YSP、NA、NYBD、CM和LB培养基中。在37℃，200rpm的摇床里振荡培养6、12和18h，采用稀释平板图布法测定不同培养基下三株芽孢杆菌的活菌数，从而判定不同培养基对三株芽孢杆菌生物量的影响。

2.1.3不同碳源对芽孢杆菌活菌数的影响

以LB培养基为基础培养基，分别用可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、玉米粉、花生粕、豆粕、麦麸和土豆淀粉5g/L替换LB中的酵母提取物，测定不同碳源三株芽孢杆菌的活菌数，以此明确不同碳源对三株芽孢杆菌生物量的影响。

2.1.4不同氮源对芽孢杆菌活菌数的影响

以LB培养基为基础培养基，分别用氯化铵，硝酸钠、尿素、酵母膏、花生粕、豆粕和麦麸按照10g/L的浓度替换LB中的胰蛋白胨，测定不同氮源三株芽孢杆菌的活菌数，以此明确不同氮源对三株芽孢杆菌生物量的影响。

2.1.5不同无机盐对芽孢杆菌活菌数的影响

以LB培养基为基础培养基，分别用MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄、NaH₂PO₄、CaCO₃、K₂HPO₄、ZnCl₂、Na₂HPO₄、MnCl₂、MgCl₂按照10g/L的浓度替换LB中的NaCl，测定不同无机盐对三株芽孢杆菌活菌数，以明确不同无机盐对三株芽孢杆菌生物量的影响。

2.1.6培养基配方优化

本实验利用Design-Expert8.05软件设计PB实验，对基础发酵培养基中的花生粕、豆粕、麦麸、MgSO₄·7H₂O、K₂HPO₄和NaH₂PO₄等6个组分进行筛选，每个变量分别设定高(+1)和低(-1)两个水平，共进行12次实验以确定每个因素的影响因子，因素水平见表1。

表1 Plackett-Burman试验因素水平及编码

根据Plackett-Burman试验结果，确定豆粕、麦麸和花生粕是影响芽孢杆菌活菌数的显著因子，因此，将这3个因子作为Box-Behnken设计所要考查的变量，因子水平及编码见表2。

表2 Box-Behnken设计试验因素及其编码

最后根据PB实验及最陡爬坡实验结果，设计Box-Behnken实验并对其结果进行响应面分析，进而确定最佳培养条件，最后依据回归方程绘制响应面立体分析图。根据响应面分析结果推测最优培养基配方并验证。

2.1.7生长速率测定

比较培养基优化前后生长速率差异，采用平板计数法测定芽孢杆菌的生长速率，挑取单菌落接种于LB液体培养基的试管中，于37℃、200rpm过夜摇培得到母液，按1：100的接种量接入含有50mL LB液体培养基的500mL三角瓶中，37℃、200rpm恒温摇床培养，每隔1h取出菌液进行稀释涂布计数。

2.2培养条件筛选及优化

2.2.1不同发酵时间对芽孢杆菌活菌数的影响

以优化后的培养基上为基础培养基，测定三株芽孢杆菌生长速率变化趋势，以明确最适培养时间。

2.2.2不同pH对芽孢杆菌活菌数的影响

以优化后的培养基为基础培养基，调节初始pH为1-11，设置梯度为1，测定不同pH对三株芽孢杆菌活菌数和芽孢数，以此明确不同pH对三株芽孢杆菌生物量的影响。

2.2.3不同接种量对芽孢杆菌活菌数的影响

以优化后的培养基为基础培养基，设置不同接种量为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5％，测定不同接种量对三株芽孢杆菌活菌数和芽孢数，以此明确不同pH对三株芽孢杆菌生物量的影响。

2.2.4不同装瓶量对芽孢杆菌活菌数的影响

以优化后的培养基为基础培养基，在250mL三角瓶中，设置不同装瓶量50、75、100、125、150、175、200mL，测定不同装瓶量对三株芽孢杆菌活菌数和芽孢数，以此明确不同装瓶量对三株芽孢杆菌生物量的影响。

2.2.5不同培养温度对芽孢杆菌活菌数的影响

以优化后的培养基为基础培养基，设置不同温度25、28、31、34、37、40℃，测定不同培养温度对三株芽孢杆菌活菌数和芽孢数，以此明确不同培养温度对芽孢杆菌生物量的影响。

2.2.6不同转速对芽孢杆菌活菌数的影响

以优化后的培养基为基础培养基，设置不同转速120、140、160、180、200、220、240rpm，测定不同转速对三株芽孢杆菌活菌数和芽孢数，以此明确不同转速对芽孢杆菌生物量的影响。

2.2.7培养条件优化

本实验利用Design-Expert 8.05软件设计PB实验，对培养条件中的初始pH、温度、转速、接种量和装瓶量等5个组分进行筛选，每个变量分别设定高(+1)和低(-1)两个水平，共进行12次实验以确定每个因素的影响因子，因素水平见表3。

表3 Plackett-Burman试验因素水平及编码

由Plackett-Burman试验结果，确定转速、温度和接种量是影响芽孢杆菌活菌数的显著因子，因此，将这3个因子作为Box-Behnken设计所要考查的变量，因子水平及编码见表4。

表4 Box-Behnken设计试验因素及其编码

最后根据PB实验及最陡爬坡实验结果，设计Box-Behnken实验并对其结果进行响应面分析，进而确定最佳培养条件，最后依据回归方程绘制响应面立体分析图。根据响应面分析结果推测最优培养基配方并验证。

2.2.8优化前后生长速率测定

同2.1.7。

2.3 5L发酵罐培养条件优化

2.3.1初始接种量对芽孢杆菌活菌数影响

以2.1优化后的培养基为发酵培养基，设置不同接种量0.05、0.10、0.15、0.20、0.40、0.8和1.6％，测定不同接种量对三株芽孢杆菌活菌数和芽孢数，以此明确不同pH对三株芽孢杆菌生物量的影响。

2.3.2不同温度对芽孢杆菌活菌数影响

以2.1优化后的培养基为发酵培养基，设置不同培养温度25、27、29、31、33、35、37、39和41℃，测定不同培养温度对三株芽孢杆菌活菌数和芽孢数，以此明确不同pH对三株芽孢杆菌生物量的影响。

2.3.3不同装瓶量对芽孢杆菌活菌影响

以2.1优化后的培养基为基础培养基，在5L发酵罐中，设置不同装瓶量0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5和4L，测定不同装瓶量对三株芽孢杆菌活菌数和芽孢数，以此明确不同装瓶量对三株芽孢杆菌生物量的影响。

2.3.4不同通气量对芽孢杆菌活菌数影响

以2.1优化后的培养基为基础培养基，设置不同通氧量0.5、1.0、2.4、2.0、2.5和3.0m³/h，测定不同通气量对三株芽孢杆菌活菌数和芽孢数，以此明确不同通气量对三株芽孢杆菌生物量的影响。

2.4复合芽孢杆菌颗粒剂配方筛选及优化

2.4.1载体、润湿剂、分散剂、粘结剂、崩解剂对芽孢杆菌活菌数影响

分别将载体、润湿剂、分散剂、粘结剂、崩解剂以500ppm的浓度与LB培养基混合，灭菌后取1mL含菌量为1.0x10¹⁴ CFU/mL，滴入100mL含有，上述混合LB培养基的250mL三角瓶中，重复4次，12h后进行稀释涂布测定活菌数。

2.4.2润湿剂筛选.

采用直接配方重复试验法，即将己筛选好的原药，载体配制成一定规格母粉，然后加入润湿剂的用量分别为2％、4％、6％、8％。加工制成样品，测定样品的润湿性用润湿时间表示，根据润湿时间长短筛选适合的润湿剂。

润湿时间采用刻度量筒实验法(GB/T5451-2001)，加500mL 342mg/L硬水于500mL量筒内，称量1.0g样品快速倒入量筒内，静止不动，然后立即用秒表记录99％样品沉入量筒底部的时间。

2.4.3分散剂筛选

当润湿剂基本选定后，按照直接配方重复试验法进一步选择分散剂。将已筛选好的原药，载体，润湿剂，配制成一定规格母粉，然后加入分散剂的比例分别为4％、5％、6％、7％，采用量筒混合法，目测其分散稳定性，方法如下：加入100mL去离子于100mL具塞量筒中，称2g样品加入量筒，颠倒10次每次约2s，记录30min、60min时的沉淀物，60min后颠倒10次，使完全再分散，静置24h，24h后颠倒量筒，记录使沉淀物再分散而颠倒的次数，颠倒次数小于10次者通常认为合格。制剂的悬浮率参照GB/T14825-2006农药悬浮率测定方法。

试样悬浮率＝1.11x(m-w)/m

其中：m-配制悬浮液所取试样中有效成分质量，g

w-留在量筒底部25mL悬浮液中有效成分质量，g

2.4.4崩解剂筛选

当分散剂基本选定后，按照直接配方重复试验法进一步选择崩解剂。将己筛选好的原药，载体，润湿剂，分散剂配制成一定规格母粉，然后加入不同种类和剂量的崩解剂。崩解剂测定采用刻度量筒试验法，向含有90mL蒸馏水的100mL具塞量筒中于25℃下加入0.5g样品颗粒，之后夹住量筒中部，塞住筒口，以8r/min的速度绕中心旋转，直到样品在水中完全崩解。小于3min为合格。

2.4.5粘结剂筛选

把筛选好的载体、分散剂、润湿剂、崩解剂和菌液混合加入不同种类和剂量的粘结剂，再根据样品的崩解时间和成粒比例来选出最适合的粘结剂。

2.5造粒条件筛选

2.5.1母粒含量筛选

把筛选好的载体、分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂与菌液混合后，按照质量比分别加入1、2、3、4、5和6％，再根据样品的含菌量、润湿时间、悬浮率和崩解性筛选出合适的母粒含量。

2.5.2颗粒大小筛选

将样品制成直径大小不同的颗粒，设置直径大小分别为0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75和2.0cm，再根据样品的含菌量、润湿时间、悬浮率和崩解性筛选出合适的颗粒大小含量。

2.5.3干燥温度筛选

将样品放置于不同温度下进行干燥12h，设置温度梯度为40、45、50、55、60、65和70℃，再根据样品的含菌量、润湿时间、悬浮率和崩解性筛选出合适的干燥温度。

2.5.4干燥时间筛选

将样品放置于60℃下，在12、18、24、30、36、42和48h下测定样品的含菌量、润湿时间、悬浮率和崩解性筛选出合适的干燥时间。

2.6复合芽孢杆菌颗粒剂质量检测

2.6.1含菌量测定

取1g复合芽孢杆菌颗粒剂加入99mL无菌水，磁力搅拌30min，采用平板菌落计数法测定溶液中细菌数，计算样品中细菌总数。

每毫升细菌数＝(平板上菌落数x稀释倍数)/平板上的菌液量(mL)

1g样品中细菌＝(1mL细菌数x溶液体积)样品重量

2.6.2润湿性测定

参照刻度量筒试验验法测润湿时间：于500mL量筒内加500mL 342mg/L硬水，取样1.0g于量筒中，不搅动，立即用秒表记录时间，当99％样品沉入量筒底部时停止计时，小于1min为合格。

2.6.3悬浮率测定

参照GB/T14825-2006：取样于200mL装有50mL标准硬水的烧杯中，用手匀速绕动2min后放入同温度水浴锅4min，然后用标准硬水将其洗入具塞250mL量筒中，加水至刻度处，盖上塞子，1min内上下颠倒30次后静置放置30min，用吸管洗出225mL水分，将量筒底部25mL的悬浮液转移到培养皿内烘干称量残留物，悬浮率大于80％为符合标准。按照如下公式计算悬浮率。

试样悬浮率＝1.11x(m-w)/m

其中：m-配制悬浮液所取试样中有效成分质量，g

w-留在量筒底部25mL悬浮液中有效成分质量，g。

2.6.4崩解性测定

参照刻度量筒混合法：室温下取样0.5g于100mL具塞量筒中，放入90mL蒸馏水，以筒中部为中心绕动，记录颗粒在水中完全崩解时间，小于3min为合格。

2.6.5pH测定

参照GB/T1603-1993：取样1.0g溶解液于含有100mL蒸馏水的烧杯中，测定前先校正pH仪器，将玻璃电极和饱和汞电极冲洗千净，放入待测液中，测定pH，重复3次，取平均值。

2.6.6水分测定

参照GB/T1600-2001共沸蒸馏法：取适样加入100mL甲苯，加热至仪器内部无冷凝水，接收器中水的体积不在增加，停止加热，测量接受器内水的体积，小于2％视为合格。

含水量公式如下：含水量＝(接受器内水的体积x100)/样品质量

2.6.7贮藏期测定

将复合芽孢杆菌颗粒剂在室温下放置360d，每隔30d测定萌发率和含菌量。

3试验结果

3.1三菌株不同配比的实验结果、培养基配方筛选及优化结果如图1所示。

结果表明：三种菌的最优混合质量比为1:1:1。

GUMT319培养基配方最优配比为豆粕8.43g/L、花生粕12.34g/L、麦麸13.37g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5％、K₂HPO₄ 1％、NaH₂PO₄ 1％和ZnCl₂ 6mg/L；

GUMT323培养基配方最优配比为豆粕8.73g/L、花生粕12.58g/L、麦麸13.68g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5％、K₂HPO₄ 1％、NaH₂PO₄ 1％和ZnCl₂ 6mg/L；

GUWM35培养基配方最优配比为豆粕8.43g/L、花生粕11.83g/L、麦麸14.73g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5％、K₂HPO₄ 1％、NaH₂PO₄ 1％和ZnCl₂ 6mg/L；

复合菌剂培养基配方最优配比为豆粕8.93g/L、花生粕12.85g/L、麦麸12.86g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5％、K₂HPO₄ 1％、NaH₂PO₄ 1％和ZnCl₂ 6mg/L。

优化后活菌数提高了1-2个数量级，最高达到了10¹⁵CFU/mL。

3.2摇瓶培养条件筛选结果如图2所示。

结果表明：最适摇瓶培养条件为温度为37℃、接种量为6％、转速200rpm、装瓶量150mL/250mL、初始pH为7.0。优化后活菌数提高了0.5-1个数量级，最高达到了10¹⁴CFU/mL。

3.3 5L发酵罐培养条件筛选结果如图3所示。

结果表明：最适5L发酵罐培养条件为温度为37℃、通气量为2.5m³/h、装量为3.0L、接种量为0.8％。优化后活菌数提高了0.5-1个数量级，培养48h时达到了10¹⁵CFU/mL。

3.4造粒配方筛选及优化结果如表5和图4所示。

表5载体及助剂对芽孢杆菌活菌数的影响

通过筛选确定载体高岭土，润湿剂十二烷基磺酸钠，分散剂羧甲基纤维素钠，崩解剂可溶性淀粉，粘结剂聚乙二醇6000等试验组比其它试验组对芽孢杆菌的活菌数抑制较低。最适造粒配方为十二烷基磺酸钠含量6％、羧甲基纤维素钠5％、可溶性淀粉3％和聚乙二醇60004％，高岭土82％，芽孢杆菌发酵液活菌数含量10¹⁴CFU/mL。

3.5造粒工艺筛选结果如图5至图8所示。

结果表明：最适造粒条件为母粒添加量为1％，颗粒直径大小为1cm，干燥温度为60℃，干燥时间为24h。

3.6颗粒剂质量检测结果如表6所示。

表6四种芽孢杆菌颗粒剂质量检测

结果表明：通过检验GUMT319颗粒剂此时活菌含量为1.66±0.23×10¹⁴CFU/mL、润湿时间为22.64±0.69s、崩解时间为80.03±0.50s、悬浮率为83.48±0.49％、pH为6.68±0.16；

GUMT323颗粒剂此时活菌含量为2.40±0.33×10¹⁴CFU/mL、润湿时间为22.47±0.58s、崩解时间为79.31±0.67s、悬浮率为82.87±0.30％、pH为6.72±0.10；

GUWM35颗粒剂此时活菌含量为2.75±0.52×10¹⁴CFU/mL、润湿时间为22.15±0.45s、崩解时间为81.73±0.61s、悬浮率为83.92±0.70％、pH为6.49±0.03；

复合菌剂颗粒剂此时活菌含量为2.35±0.16×10¹⁴CFU/mL、润湿时间为21.98±0.69s、崩解时间为80.99±0.49s、悬浮率为84.20±0.96％、pH为6.64±0.12。

4种芽孢杆菌颗粒剂能达到10¹⁴CFU/g，质量检验均达到国家标准。

实施例2防效测定

1盆栽防效测定

烟苗培育：将育苗基质高温灭菌后装入育苗盆，均匀播种K326，保持基质湿润，置于温室(温度25℃，光暗比2:1，相对湿度60％)培养，1个月后于幼苗4片时进行移栽。

菌液制备及灌根：烟株移栽7d后用100x GUMT319、GUMT323、GUWM35及复合芽孢杆菌颗粒剂灌根处理，每株20mL。

烟草疫霉菌接种(菌谷法)：将在PDA平板上培养7d的烟草疫霉菌转入菌谷培养基，置于28℃恒温箱，黑暗培养15d，待菌丝长满菌谷培养基后备用。灌根5d后接种烟草疫霉菌，将长满烟草疫霉菌的菌谷穴施法接种至距烟株主根3cm左右土壤中，接种量为0.5g/株，并立即覆土保湿。

发病情况调查：接种烟草疫霉菌后实时观察烟株生长状况并调查发病情况(参照标准GB/T23222—2008)。共设置7个处理：GUMT319、GUMT323、GUWM35及复合芽孢杆菌颗粒剂稀释100倍液、商品微生物颗粒剂枯草芽孢杆菌WP、商品化学农药58％钾霜灵·锰锌WP、CK，每处理10株，3次重复。发病率、病情指数以及防效计算公式如下：

发病率(％)＝(发病株数/调查总株数)×100％；

病情指数＝[∑(各级发病株数×该病级值)]/(总株数×最高级值)×100；

相对防效(％)＝(空白对照病情指数-处理病情指数)/空白对照病情指数×100％

2田间防效测定

田间防效测定于2022年3月-8月分别在广西贺州市富川县福利镇和贵州省安顺市西秀区杨武镇进行。采用随机区组设计，设置4个处理：复合菌株颗粒剂、1％中生菌素WP、58％钾霜灵·锰锌WP、CK，每处理3个重复，一共12个小区，小区间设保护行，每个小区100株。复合芽孢杆菌颗粒剂施用方式为100倍液稀释后在移栽后和团棵期各灌溉一次。计算烟草黑胫病和烟草青枯病发病率，病情指数和防病效果，计算公式参照盆栽试验。记录农艺性状和经济性状。

3防效测定

3.1室内防效测定结果如表7和图9所示。

表7四种芽孢杆菌颗粒剂对烟草黑胫病的室内盆栽防病效果及对烟草促生效果测定

结果表明：通过盆栽实验，四种颗粒剂均对烟草黑胫病表现出良好的防治效果，其中复合芽孢杆菌菌剂防治效果显著优于其他处理，达到80.07％，优于生产上常用防治药剂防效；且能显著提高烟草的株高、最大叶长叶宽，促生效果也优于枯草芽孢菌WP。

3.2田间防效测定结果如表8至表9所示。

表8复合芽孢杆菌颗粒剂对烟草黑胫病和烟草青枯病的大田试验防病效果测定

表9复合芽孢杆菌颗粒剂对烟草经济性状调查

结果表明：在大田实验中复合菌剂对烟草黑胫病和烟草青枯病均表现出良好的防治效果，对烟草黑胫病的相对防效分别为80.85％和82.07％，对烟草青枯病的相对防效分别为81.31％和80.76％，显著高于生产上常用防治药剂防效，且能显著提高烟草株高、茎围和最大叶长叶宽。通过调查经济性状，结果显示复合芽孢杆菌菌剂处理亩产量提高了13.00％，亩产值提高了22.59％，上等烟率提高了4.00％。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种复合颗粒型微生物菌剂，其特征在于，由贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)GUMT319、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GUMT323和暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)GUWM35组成；

所述贝莱斯芽孢杆菌GUMT319的保藏编号为CCTCC NO：M 2018872，所述枯草芽孢杆菌GUMT323的保藏编号为CCTCC NO：M 2018873，所述暹罗芽孢杆菌GUWM35的保藏编号为CGMCCNO.24078。

2.如权利要求1所述的复合颗粒型微生物菌剂，其特征在于，所述复合颗粒型微生物菌剂中贝莱斯芽孢杆菌GUMT319、枯草芽孢杆菌GUMT323和暹罗芽孢杆菌GUWM35按照质量比(0.8～1.2):(0.8～1.2):(0.8～1.2)混合制得。

3.如权利要求2所述的复合颗粒型微生物菌剂，其特征在于，所述复合颗粒型微生物菌剂中贝莱斯芽孢杆菌GUMT319、枯草芽孢杆菌GUMT323和暹罗芽孢杆菌GUWM35按照质量比1:1:1混合制得。

4.如权利要求3所述的复合颗粒型微生物菌剂，其特征在于，其制备过程中：

使用的培养基配方为：豆粕8～9g/L、花生粕11～13g/L、麦麸12～13g/L、MgSO₄·7H₂O0.4～0.6％、K₂HPO₄ 0.8～1.2％、NaH₂PO₄ 0.8～1.2％和ZnCl₂ 5～7mg/L；

摇瓶培养条件为：35～39℃、接种量为5～7％、转速180～220rpm、装瓶量140～160mL/250mL、初始pH为6.5～7.5；

发酵罐培养条件为：温度为35～39℃、通气量为2～3m³/h、装量为2～3L、接种量为0.6～1.0％；

造粒配方为：十二烷基磺酸钠含量5～7％、羧甲基纤维素钠4～6％、可溶性淀粉2～4％和聚乙二醇6000 3～5％，高岭土80～85％；

造粒条件为：最适造粒条件为母粒添加量为0.5～1.5％，颗粒直径大小为0.8～1.2cm，干燥温度为55～65℃，干燥时间为20～30h。

5.如权利要求4所述的复合颗粒型微生物菌剂，其特征在于，其制备过程中：

使用的培养基配方为：豆粕8.93g/L、花生粕12.85g/L、麦麸12.86g/L、MgSO₄·7H₂O0.5％、K₂HPO₄ 1％、NaH₂PO₄ 1％和ZnCl₂ 6mg/L；

摇瓶培养条件为：37℃、接种量为6％、转速200rpm、装瓶量150mL/250mL、初始pH为7.0；

发酵罐培养条件为：温度为37℃、通气量为2.5m³/h、装量为3.0L、接种量为0.8％；

造粒配方为：十二烷基磺酸钠含量6％、羧甲基纤维素钠5％、可溶性淀粉3％和聚乙二醇6000 4％，高岭土82％；

造粒条件为：最适造粒条件为母粒添加量为1％，颗粒直径大小为1cm，干燥温度为60℃，干燥时间为24h。

6.如权利要求5所述的复合颗粒型微生物菌剂，其特征在于，所述复合颗粒型微生物菌剂中有效活菌数≥10¹⁴CFU/mL。

7.如权利要求6所述的复合颗粒型微生物菌剂，其特征在于，所述复合颗粒型微生物菌剂中有效活菌数为2.35±0.16×10¹⁴CFU/mL。

8.含有权利要求1～7任一所述的复合颗粒型微生物菌剂的产品。

9.权利要求1～7任一所述的复合颗粒型微生物菌剂或权利要求8所述的产品在烟草黑胫病防治中的应用。

10.权利要求1～7任一所述的复合颗粒型微生物菌剂或权利要求8所述的产品在烟草青枯病防治中的应用。

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