CN115998842A - 一种逆转肝星形细胞激活的仿生纳米药物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请属于仿生纳米药物制备技术领域,具体涉及一种逆转肝星形细胞激活的仿生纳米药物及其应用的专利申请。该仿生纳米药物通过:以血管内皮细胞HUVEC膜制备仿生纳米载体HNPs、修饰改造B7‑33、装载构建多肽仿生纳米药物等步骤制备获得。本申请中,发明人通过选择构建具有靶向性的仿生纳米载体和对B7‑33多肽改造基础上,基于受体配体亲和力技术原理,在实现高效转载药物分子基础上,较好实现了定向靶向肝脏的药物递送效果。初步实验结果表明,在将多肽B7‑33定向靶向递送至肝脏后,逆转了HSCs激活后所介导纤维化,进而逆转了胰腺癌肝转移前微环境调节作用,可为抑制胰腺癌肝转移进而改善胰腺癌的防治效果奠定技术基础。
Description
技术领域
本申请属于仿生纳米药物制备技术领域,具体涉及一种逆转肝星形细胞激活的仿生纳米药物及其应用的专利申请。
背景技术
肿瘤防治中,现有治疗方案大多仅针对肿瘤细胞本身,而肿瘤细胞(癌细胞)的转移则是影响肿瘤防治效果的重要影响因素。研究认为,肿瘤转移的关键步骤是循环肿瘤细胞在次要或远处器官成功定植,但此步骤受到远处器官局部微环境的影响。为此,肿瘤细胞可通过分泌细胞因子和细胞外囊泡等方式改变远处器官的局部微环境(即转移前微环境),为肿瘤细胞在远端转移器官的定植和生长做“准备”。基于此特点,针对转移前微环境的深入研究,是改善相关肿瘤(癌)防治的重要突破点之一。
研究表明,肝转移是胰腺癌患者死亡的主要原因之一。在此过程中,肝星形细胞(hepatic stellate cells,HSCs)的激活对于转移前微环境形成的初始阶段有着重要的作用。其通过分泌大量细胞外基质(extracellular matrix,ECM),包括胶原蛋白I和纤连蛋白等成分,介导肝纤维化,调控转移前微环境以促进肿瘤细胞的粘附和定植。也即,HSCs被激活后所介导的肝纤维化对于胰腺癌肝转移的发展形成至关重要。基于这一特点,靶向抑制HSCs的激活即有可能抑制胰腺癌肝转移发生,从而为相关肿瘤(癌)的防治奠定一定基础。
现有技术中,松弛素作为一种肽类激素,临床上多被用于治疗急性心力衰竭的肽类激素,而对其作用机理研究认为,其具有较强的抗纤维化作用,其主要机制为:松弛素与可与松弛素受体1结合,进而抑制促纤维化因子(如:TGF-β)诱导的Smad2/3磷酸化,最终可以抑制胶原的沉积及相关诱导基质的降解。由于肝星形细胞表面表达有松弛素受体1,因此,部分研究表明,松弛素可抑制肝星形细胞激活后所介导的纤维化过程。但由于松弛素的分子结构中富含二硫键,使得其人工合成制备工艺复杂、制备成本较高,因此一定程度上限定了其实际的临床推广应用。
需要说明的是,多肽B7-33作为一种仅有B链结构的松弛素类似物,其具有与松弛素类似的抗纤维化作用,而鉴于其具有易于合成、易于修饰、免疫原性低等特点,因此有望替代松弛素的临床应用。但由于多肽B7-33静脉给药的半衰期仅为数分钟,因此,如何增加B7-33的体内半衰期且保留其最大生物利用度是改善多肽B7-33应用效果的最大技术挑战之一。此外,由于B7-33全身性给药的靶部位递送效率极低,因此,如何改善B7-33应用过程中的靶向性,也是改善提高B7-33应用效果的关键。
近年来,以生物膜为代表的仿生纳米载体技术的快速发展,因具有天然的体内长循环和良好的生物相容性等特点,为改善相关药物分子的递送效果提供了一种新的技术思路。同时,随着生物肽改造来改善其半衰期和生物利用度技术的成熟,因此,将相关治疗性多肽药物分子与纳米仿生载体技术相结合,设计一种靶向能力强、递送效率高的体内递送系统,对于改善相关疾病的防治效果具有积极的技术意义。
发明内容
基于血管内皮细胞(HUVEC)制备仿生纳米载体和对B7-33的修饰改造,本申请目的在于提供一种可以逆转肝星形细胞激活的仿生纳米药物,从而可为胰腺癌肝转移的防治奠定一定技术基础,进而可为改善和提高胰腺癌的防治效果奠定基础,同时也可为其他肿瘤(癌)的防治提供一定借鉴和参考。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一种逆转肝星形细胞激活的仿生纳米药物,其通过如下步骤制备获得:
(一)制备仿生纳米载体
以血管内皮细胞(HUVEC)膜制备仿生纳米载体HNPs,
所述血管内皮细胞膜,可采用经典的细胞膜提取方法制备获得,具体操作而言,参考如下:
(1)梯度离心提取获得细胞膜
将预先培养长满培养皿的血管内皮细胞中的培养液倒掉,PBS轻洗3遍后(最后一遍清洗时保留1ml的PBS),刮下细胞,1000r离心5min;
弃上清,向细胞沉淀中加IB-1(2ml)重悬,转入玻璃匀浆器中研磨40下左右(冰上操作);
将研磨后的细胞液,4℃、3000g离心5min,留上清;
将上清再4℃、10000g离心10min,留上清;
将上清加到超离管中,加IB-1补满,4℃、10000g离心2h,留沉淀(直接进行后续操作或-80°C保存备用)。
所述IB-1(isolation buffer,需要现配现用),为:SB + 0.5%BSA +0.5mmolEGTA,配制时:先将0.5g BSA溶解于100ml的SB溶液中,再加入500ul 100mmol EGTA(pH7.4),和加入1%蛋白酶抑制剂;
所述蛋白抑制剂,DMSO配制,各物料浓度为:200mM AEBSF、30μM Aprotinin、13mMBestatin、1.4mM E64和1mM Leupeptin;
所述SB(提前一天配制),为:225mmol甘露醇 + 75mmol蔗糖+ 30mmol Tris-HCl(pH 7.4);配制时:先将20.5g甘露醇和13g蔗糖溶解于400ml ddH2O中,再加入15ml Tris-HCl中,4°C放置30min,调pH=7.4,最后用ddH2O定容至500ml。
(2)使用挤出器挤成细胞膜仿生型纳米载体HNPs
将步骤(1)中离心所得血管内皮细胞置于细胞超声破碎仪中,超声功率100w超声处理3min(超声5s,暂停5s),随后,采用Avanti Mini Extruder (Avanti Polar Lipids)挤出器进行挤出操作:
首先,利用0.8 μm 聚碳酸酯 (PC) 膜,对超声处理后血管内皮细胞膜进行上下挤出10次;
随后,依次使用0.4 μm和0.1 μm的PC膜分别进行上下挤出10次处理;
最后,制备成平均粒径100nm左右的均一性纳米颗粒(仿生纳米载体HNPs)备用;
(二)B7-33的修饰改造
将RGD序列与B7-33偶联修饰(RGD-B7-33);
所述多肽B7-33,氨基酸序列如SEQ ID No.1所示,具体为:VIKLSGRELVRAQIAISGMSTWSKRSL;
修饰改造后的B7-33(RGD-B7-33)的氨基酸序列为:VIKLSGRELVRAQIAISGMSTWSKRSL-GG-c(RGDfK);
所述RGDfK即为:Arg-Gly-Asp-Phe-Lys;
(三)装载构建多肽仿生纳米药物
基于受体(HUVEC细胞膜表面Integrin αv(β3))和配体(RGD)的亲和性,实现治疗性多肽B7-33(RGD-B7-33)在仿生纳米载体上的高效装载,构建获得多肽仿生纳米药物(B7-33-HNPs);具体操作而言:
将步骤(二)的B7-33(RGD-B7-33)与步骤(一)制备所得仿生纳米载体HNPs在4℃孵育12 h,即可制备获得仿生纳米药物B7-33-HNPs;
孵育时,RGD-B7-33与HNPs的比例参考为1.5%(即:1.5gRGD、98.5gHNPs)。
所述逆转肝星形细胞激活的仿生纳米药物在制备胰腺癌防治药剂中的应用,通过抗纤维化方式用于预防或逆转胰腺癌(肿瘤)细胞向肝脏组织的转移。
现有技术中,尽管已知肝星形细胞(HSCs)激活后介导的纤维化对于胰腺癌肝转移前微环境的调节具有重要作用,但如何将相关治疗性药物(例如B7-33)靶向递送至肝脏、以及能否逆转HSCs激活后介导的纤维化过程仍然是不清楚的。为此,本申请中,发明人通过选择构建具有靶向性的仿生纳米载体和对B7-33多肽改造基础上,基于受体配体亲和力技术原理,在实现高效转载药物分子基础上,较好实现了定向靶向肝脏的药物递送效果。
初步实验结果表明,在将多肽B7-33定向靶向递送至肝脏后,逆转了HSCs激活后所介导纤维化,进而逆转了胰腺癌肝转移前微环境调节作用,可为抑制胰腺癌肝转移进而改善胰腺癌的防治效果奠定良好的技术基础。
附图说明
图1为所制备B7-33-HNPs 纳米药物的表征结果;其中:
A为红细胞膜 RNPs、B7-33-RNPs、HNPs 和 B7-33-HNPs 的 TEM 图像;比例尺:100nm;
B为纯化 HUVEC 膜、HNPs 和 RNPs 中蛋白质整合素 αv(β3)的蛋白质印迹分析;红细胞膜用作阴性对照;
C为RNPs、B7-33-RNPs、HNPs 和 B7-33-HNPs(n = 3)的尺寸分布结果;
D为 RNPs、B7-33-RNPs、HNPs 和 B7-33-HNPs(n = 3)的zeta 电位结果;
E为磁珠结合 FITC 标记的 B7-33-RGD 和 RNPs 或 HNPs 复合物的示意图;
F为磁珠结合 FITC 标记的 B7-33-RGD 和 RNPs 或 HNPs 复合物的流式细胞术结果(n = 6),用于检测评估B7-33-RGD 与 HNPs 或 RNPs 的结合情况;图中,RNPs 和HNPs 是指珠子结合的过滤 RNPs 或 HNPs 滞留物,用作阴性对照;B7-33-RNPs 和 B7-33-HNPs 是指珠子结合的过滤 FITC 标记的 B7-33-RGD 和 RNPs 或 HNPs 复合物滞留物;
图2为使用电喷雾电离质谱 (ESI-MS)对RGD-B7-33 和 RGD-B7-33-FITC 的分子量检测结果;其中:
A为RGD-B7-33检测结果,可以看出:峰大小与 RGD-B7-33(理论值:3,687.30;实测值:3,686.50)的预测分子量一致;
B为RGD-B7-33-FITC检测结果,可以看出:峰大小与 RGD-B7-33-FITC(理论值:4,204.48;实测值:4,203.60)的预测分子量一致;
图3为B7-33-HNPs 的体外细胞实验结果,用于检测评估B7-33-HNPs 与 LX-2 细胞 (HSCs) 的细胞膜结合情况;实验中,RGD-B7-33、RNPs、HNPs、B7-33-RNPs 或 B7-33-HNPs 与细胞一起孵育 4 小时,HNPs 用 Cy5.5 标记,RGD-B7-33 用 FITC 标记;比例尺:10μm;
图4为 B7-33-HNPs 对 TGF-β 介导的 HSCs 激活的影响情况;其中:
A为用指定制剂处理 48 小时后,LX-2 中 α-SMA、胶原蛋白 I 和纤连蛋白的免疫荧光 (IF) 染色结果,比例尺:10 μm;
B为蛋白质印迹结果,用于表明对TGF-β 活化 48 小时后LX-2 中 α-SMA、胶原蛋白 I 和纤连蛋白的蛋白质表达的抑制情况;蛋白质水平标准化为 GAPDH;
C为磷酸化蛋白检测结果,用于表明对TGF-β 活化 1 小时后 LX-2 中 Smad2 或Smad3 磷酸化的抑制作用情况;蛋白质水平标准化为 SMAD2 和 SMAD3;
D为使用 Image J 软件对标准化后α-SMA、I 型胶原蛋白和纤连蛋白表达的定量分析结果;
E为使用 Image J 软件对标准化后pSMAD2 和 pSMAD3 蛋白表达的定量分析结果;
图5 为纳米药物B7-33-HNPs 的体内药代动力学和生物分布情况;其中:
A为静脉注射游离 B7-33-RGD 和 B7-33-HNPs(FITC 标记的 B7-33-RGD)后指定时间点小鼠血液的荧光图像;
B为在给药后的几个时间点量化荧光强度;可以看出,RGD-B7-33 肽的清除时间通过装饰在 HNPs 上得到了显著延长;
C为胰腺癌肝转移模型小鼠主要器官在注射 B7-33-HNPs-cy5.5、C7-33-HNPs-cy5.5 和 HNPs-cy5.5 后 24 小时的离体荧光图像;
D为器官荧光强度的半定量分析;
E为注射24 小时后 B7-33-HNPs-cy5.5、C7-33-HNPs-cy5.5 和 HNPs-cy5.5 在肝转移生态位中的分布情况,彩色视图下,肝星状细胞用α-SMA(绿色)染色,细胞核用DAPI(蓝色)染色;比例尺,50 µm;
图6为各处理组主要脏器器官的 H&E 染色病理切片评价情况,比例尺,100 μm;
图7为肝肾功能生化指标;其中:
A为血清肝功能中的ALT(丙氨酸氨基转移酶)指标的生化检查结果;
B为血清肝功能中的AST(天冬氨酸转氨酶)指标的生化检查结果;
C为血清中肾功能中TBIL(总胆红素)指标的生化检查结果;
D为血清中肾功能中CR(尿肌酐)指标的生化检查结果;
E为血清中肾功能中BUN(血尿素氮)指标的生化检查结果;
图8为处理24 小时后 C57BL/6 小鼠对 B7-33-HNPs 的免疫反应情况;其中:
A为血清中IL-2浓度情况;
B为血清中IFN-γ浓度情况;
C为血清中IL-6 浓度情况;
图9为肝转移小鼠模型中纤维化转移前生态位的形成情况;其中:
A为在转移前阶段接种 Pan02 细胞后不同天数 (d0-d7) 的肝转移性和非转移性肿瘤小鼠中 α-SMA 和纤连蛋白表达的 H&E 和免疫荧光染色结果;彩色视图下,白色圆圈用于勾勒出转移性小生境;图中比例尺:100 µm;
B为α-SMA蛋白标准化水平的定量分析;
C为纤连蛋白(fibronectin)标准化水平的定量分析;
图10为B7-33 制剂对小鼠中肝转移的预防效果;其中:
A为PC (胰腺癌)肝转移模型和制剂给药时间点的示意图;
B为用 PBS、HNPs、C7-33-HNPs、RGD-B7-33、RGD-B7-33+RNPs和B7-33-HNPs 治疗的开始(第 3 天)和终点(第 17 天)接种 PC 细胞的小鼠的体内发光图像;
C为治疗后第 17 天,每组中的 H&E 染色肝切片情况;彩色视图下,用白色虚线勾勒出的深紫色区域表示转移性结节;图中比例尺,500 μm;
D为各处理组总发光的生长曲线 (n = 6);
E为各处理组肝脏中转移结节的面积;
F为各处理组小鼠的治疗后肝脏重量;
图11为胰腺癌肝转移模型中活化HSC的逆转和纤维化减少情况;其中:
A为用胶原三色染色和 α-SMA 和纤连蛋白和胶原 I 免疫组织化学染色在体内肝转移壁龛中的组织学研究;图中比例尺,50 μm;
B为使用 Image J 软件对标准化后α-SMA、胶原蛋白、I 型胶原蛋白和纤连蛋白水平的定量分析结果;
上述各附图中,涉及数据处理及统计时,数据均为平均值 ±标准偏差(SD)结果,同时,*P < 0.05,**p < 0.01,***p < 0.001。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前,就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
生物材料:
血液,由郑州大学第一附属医院体检科采集提供(均为自愿者,签署有知情同意书,且经郑州大学第一附属医院伦理委员批准,批准号:#No. KY-398)
肝星形细胞LX-2,生物医学研究中常用实验细胞类型,获得自湘雅医学院(中国,长沙));
C57BL/6 小鼠(6-8周,雄性,20g左右), 生物医学研究中常用实验小鼠品系,可由公开渠道获得;
胰腺癌pan02细胞,生物医学研究中常用实验细胞株系,本申请相关试验中所用细胞株系购自美国典型培养物保藏中心(美国弗吉尼亚州马纳萨斯);
部分实验试剂及设备:
EDTA、Hepes-NaOH 和蛋白酶抑制剂混合物等,Sigma-Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)公司产品;
Matrigel 基质,Corning (Chicago, IL, USA) 公司产品;
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 和胎牛血清 (FBS) 等,HyClone (LoganCity, UT, USA) 公司产品;
Cell Counting Kit-8 (CCK-8), Dojindo Molecular Technologies (Tokyo,Japan) 公司产品;
SMAD2 (D43B4) XP Rabbit mAb(产品号 #5339S)、SMAD3 (C67H9) Rabbit mAb(产品号 #9513)、Phospho-SMAD2 (Ser465/Ser467) (E8F3R) Rabbit mAb(产品号 #18338)和 Phospho-SMAD3 (Ser423) /425) (C25A9) 兔单克隆抗体(产品号 #9520S)等,CST(波士顿,马萨诸塞州,美国)公司产品;
针对 GAPDH(目录号 #10494-1-AP)、纤连蛋白(目录号 #15613-1-AP)和 I 型胶原蛋白(目录号 #14695-1-AP)的兔多克隆抗体,Proteintech(芝加哥,伊利诺伊州,美国)公司产品;
重组小鼠 TGF-β 蛋白(货号 #7666-MB-005)和小鼠松弛素 R1 抗体(货号 #MAB8898),R&D Systems(明尼阿波利斯,明尼苏达州,美国)公司产品;
抗钠钾 ATP 酶(产品目录 #ab76020)、α-SMA(产品目录 #ab5694)、整合素 alphaV(产品目录 #ab179475)、整合素 3(产品目录 #ab119992), Abcam(英国剑桥)公司产品;
二抗 Alexa Fluor®488 缀合的山羊抗兔 IgG (H + L)(货号 #A-11034),Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA, USA)公司产品;
直径 4 μm 的含醛/硫酸盐的乳胶珠(批次 #2198595),Invitrogen (Waltham,MA, USA)公司产品;
100 kDa 渗滤管 (UFC510096),Millipore (Burlington, MA, USA)公司产品。
实施例1
前期研究工作中,发明人认为血小板来源的仿生纳米药物可通过EPR效应(实体瘤的高通透性和滞留效应,enhanced permeability and retention effect)将药物递送至肿瘤微环境,进一步通过受体配体介导的相互作用将药物靶向递送至肿瘤细胞,从而提高药物的抗肿瘤效果。因此,类似地,利用肿瘤转移前微环境与正常组织之间的差异,设计合成一种纳米药物是有可能实现抗肿瘤药物的靶向递送,进而可为预防(甚至逆转)肿瘤转移奠定基础。
基于上述技术构思,结合发明人长期对多肽药物改造经验,同时创新性利用受体、配体原理,发明人尝试性进行了药物装载实验,制备获得了一种新的仿生纳米药物B7-33-HNPs。下面就该纳米药物的制备过程简介如下。
(一)制备仿生纳米载体
以血管内皮细胞(HUVEC)的细胞膜制备仿生纳米载体HNPs,具体操作参考如下。
首先,采用经典的细胞膜提取方法提取血管内皮细胞膜,具体操作而言:
(1)梯度离心提取获得细胞膜
将预先培养长满培养皿的血管内皮细胞中的培养液倒掉,PBS轻洗3遍后(最后一遍清洗时保留1ml的PBS),刮下细胞,1000r离心5min;
弃上清,向细胞沉淀中加IB-1(2ml)重悬,转入玻璃匀浆器中研磨40下左右(冰上操作);
将研磨后的细胞液,4℃、3000g离心5min,留上清;
将上清再4℃、10000g离心10min,留上清;
将上清加到超离管中,加IB-1补满,4℃、10000g离心2h,留沉淀(直接进行后续操作或-80°C保存备用)。
所述IB-1(isolation buffer,需要现配现用),为:SB + 0.5%BSA +0.5mmolEGTA,配制时:先将0.5g BSA溶解于100ml的SB溶液中,再加入500ul 100mmol EGTA(pH7.4),和加入1%蛋白酶抑制剂;
所述SB(提前一天配制),为:225mmol甘露醇 + 75mmol蔗糖+ 30mmol Tris-HCl(pH 7.4);配制时:先将20.5g甘露醇和13g蔗糖溶解于400ml ddH2O中,再加入15ml Tris-HCl中,4°C放置30min,调pH=7.4,最后用ddH2O定容至500ml。
(2)使用挤出器挤成细胞膜仿生型纳米载体HNPs
将步骤(1)中离心所得血管内皮细胞膜置于细胞超声破碎仪中,超声功率100w超声处理3min(超声5s,暂停5s),随后,采用Avanti Mini Extruder (Avanti Polar Lipids)挤出器进行挤出操作:
首先,利用0.8 μm 聚碳酸酯 (PC) 膜,对超声处理后血管内皮细胞膜进行上下挤出10次;
随后,依次使用0.4 μm和0.1 μm的PC膜分别进行上下挤出10次处理;
最后,制备成平均粒径100nm左右的均一性纳米颗粒(仿生纳米载体HNPs)备用。
作为对照,发明人同时采用红细胞来源的红细胞膜制备了仿生型纳米载体RNPs,具体操作参考如下。
首先,采用低渗方法获得红细胞膜,具体操作而言:
将新鲜采集血样(全血)在4℃条件下,1000 × g离心处理5 分钟以去除血清和其他血细胞,保留沉淀(红细胞),并用PBS 洗涤(三次);
将上述沉淀重新悬浮在冰冷的低渗溶液 (0.25 × PBS) 中处理1 小时,4℃、20000 × g离心30分钟,保留沉淀(白色颗粒);
重新悬浮在PBS 中,37℃孵育1小时备用;
随后,参考前述操作,采用Avanti Mini Extruder (Avanti Polar Lipids)挤出器,依次通过0.4 μm、 0.22 μm PC膜进行挤出,以获得仿生型纳米载体RNPs。
针对所制备获得仿生型纳米载体(红细胞膜来源的纳米粒子 (RNPs) 作为阴性对照),发明人采用Western Blot方法,对所制备获得纳米载体的Integrin αv(β3)的表达情况进行了检测(Integrin αv、β3通常会在多种癌症的血管生成时表达增强,因此,将其作为肿瘤或者肿瘤细胞转移信号分子之一,同时,该分子也是本申请后续药物装载时的受体分子)。同时,利用透射电镜和马尔文粒度仪对纳米载体的结构形貌、尺寸和表面电位等性能参数进行了检测表征。
透射电子显微镜 (TEM)对HNPs和RNPs的表征结果如图1(图1A)所示,可以看出,其均呈球形结构。而RNPs 和 HNPs 的尺寸分布表现出分散良好的特征,并且具有几乎相同的流体动力学尺寸,其平均粒径约为 120 nm左右(图1C)。同时,进一步的zeta 电位情况也基本相当(图1D)。但进一步的蛋白质印迹(Western Blot)结果表明,整合素 αv(β3)仅在内皮细胞中的表达(图1B)。
(二)B7-33的修饰改造
所述多肽B7-33,氨基酸序列如SEQ ID No.1所示,具体为:VIKLSGRELVRAQIAISGMSTWSKRSL;
改造后的RGD-B7-33的氨基酸序列为:VIKLSGRELVRAQIAISGMSTWSKRSL-GG-c(RGDfK);
FITC标记后的RGD-B7-33-FITC的序列为:
VIKLSGRELVRAQIAISGMSTWSKRSL-K(FITC)-GG- c(RGDfK);
作为对照,FITC标记后的RGD-C7-33的序列为:
RLRSRVASGKSVILGLKSEQMSTAIWI-K(FITC)-GG-c(RGDfK)。
上述相关序列委托安徽国平药业股份有限公司(中国安徽)采用固相肽合成方法(SPPS)合成制备。
以RGD-B7-33的制备为例,具体合成操作过程可参考如下:
(1)首先,称量2-CTC resin 0.5 g,加入至多肽合成反应管中,加入5 ml DCM至反应管溶胀10 min;溶胀结束后,加入5 ml DMF洗涤3次,每次30 s;
(2)加入0.15 mmol Fmoc-ASP(OALL)-resin和0.5 mmol的DIEA,氮气鼓泡反应2 h进行缩合;
缩合结束后,将反应液抽走,加入5 ml DMF洗涤4次,每次30 s,第5次洗涤结束后抽干;
(3)加甲醇:DIEA:DCM (1:1:2)到上述抽干的固相反应管中,氮气鼓泡反应30 min进行封头,反应结束后,将反应液抽走,加入5 ml DMF洗涤5次,每次30 s;
(4)量取5 ml 20 %哌啶/DMF溶液加入到反应管中,氮气鼓泡反应20 min进行脱Fmoc;
将0.5 mmol Fmoc-GLY-OH和0.5 mmol的 HOBT加入固相反应管中,再加入0.5mmol DIC,氮气鼓泡反应1 h进行缩合;
(5)重复上述洗涤缩合步骤,加入Fmoc-ARG(PBF)-OH、Fmoc-LYS(DDE)-OH、Fmoc-D-PHE-OH进行合成,得到未环化的肽链RGDfK-resin;
随后,将0.03 mmol四三苯基膦钯催化剂溶解在DCM中,放入反应器脱出oall保护基,时间3 h;
(6)用DIC、HOBT 做缩合试剂,环化得到c(RGDfK(dde))-resin;
随后,用2 %水合肼DMF溶液脱出dde,得到c(RGDfK)-resin;
最后,重复洗涤缩合,依次偶联剩下的氨基酸,制备获得RGD-B7-33。
采用电喷雾电离质谱 (ESI-MS)技术对所制备获得相关化合物进行鉴定。部分结果如图2所示。结果表明,制备所得RGD-B7-33 分子量实测值为 3687.50(与理论值:3,687.30相符);制备所得RGD-B7-33-FITC分子量实测值为4203.60(与理论值:4204.48相符)。这一结果表明成功合成获得了相关合成物。
(三)装载构建多肽仿生纳米药物
基于受体(HUVEC细胞膜表面Integrin αv(β3))和配体(RGD)的亲和性,在将步骤(一)所制备纳米载体HNPs与步骤(二)所制备RGD-B7-33混合后,即可实现的治疗性多肽B7-33(RGD-B7-33)在仿生纳米载体上的高效装载,从而最终构建获得多肽仿生纳米药物(B7-33-HNPs)。具体操作时:
将RGD-B7-33(或RGD-C7-33)与内皮细胞膜仿生型纳米载体HNPs(或红细胞膜仿生型纳米载体RNPs)在4℃孵育12 h,即可制备获得仿生纳米药物B7-33-HNPs(或阴性对照B7-33-RNPs)和对照用仿生纳米药物C7-33-HNPs。
以RGD-B7-33-FITC在HNPs的装载为例,利用荧光分光光度计对不同比例情况下RGD-B7-33-FITC在纳米颗粒HNPs上的负载效率进行测定,结果如下表1所示。
表1,RGD-B7-33-FITC在纳米颗粒中的负载效率
。
通过上表数据可以看出,当RGD-B7-33与HNPs的比例为1.5%时(即:1.5gRGD-B7-33、98.5gHNPs),RGD具有较高的载药率(Drug loading efficiency)和包封率(Entrapmentefficiency),分别为1.26%和73.55%。进一步可以推导计算获得:每个单独的纳米囊泡上所负载的B7-33 分子的平均数量为13个左右。
对负载药物成分后的各材料进行进一步形态表征,具体结果简介如下。
(1)形态特征和电位情况
如前分析所述,未负载药物前RNPs和HNPs的形态均呈球形结构,而负载药物成分后,纳米颗粒直径和性状均未发生明显变化(图1A、图1C),这一结果表明相关药物的负载并未影响纳米颗粒的流体动力学性能。但是zeta电位结果表明,负载药物组分后,B7-33-HNPs的zeta 电位从未负载前HNPs 的-21.9 ± 3.1 mV 增加到-6.4 ±2.4 mV,推测认为这是由于药物分子RGD-B7-33 是高度极性残基增加的带正电荷的肽所导致的。而对照组中,RNPs在修饰负载RGD-B7-33前后的zeta电位仅略有变化。这也直接反映出RNPs与HNPs在理化性能方面具有一定明显区别。
(2)药物负载“牢固”性
参考前述操作,将 HNPs 与 RGD-B7-33-FITC 一起孵育后,通过连续渗滤方法去除未结合的 RGD-B7-33;随后,将滞留物(即负载FITC标记药物后的B7-33-HNPs)与含醛/硫酸盐的乳胶珠结合,并进行流式细胞术检测(相同操作,RNPs 或 HNPs 作为阴性对照)。
结果如图1(图1E、图1F)所示。可以看出,负载有RGD-B7-33的HNPs复合物具有更高的荧光信号。分析认为造成这种原因在于:RGD-B7-33通过受体-配体相互作用方式从而有效加载在 HNPs 上,因此可以较好确保检测结果。而RNPs 仅是通过静电吸附与 RGD-B7-33进行非特异性相互作用,因此导致负载有RGD-B7-33的RNPs 在过滤后仅具有比RNPs 稍亮的荧光信号。换言之,通过受体-配体左右方式较好确保了药物分子RGD-B7-33负载在HNPs上。
实施例2
在实施例1基础上,发明人对所制备纳米药物B7-33-HNPs进行了进一步体外细胞实验,具体试验过程及结果简介如下。
(一)体外对纳米药物在肝星形细胞作用部位的定位
为了研究 B7-33-HNPs 是否与 HSCs (肝星形细胞)结合,我们在体外将 B7-33-HNPs 与 LX-2 细胞一起孵育后进行检测。具体操作参考如下。
将对数生长期的肝星形细胞LX-2接种到共聚焦培养皿中培养过夜,加入促纤维化因子TGF-β 5 ng/ml刺激LX-2细胞48 h使其成激活状态;
再将等体积的RGD-B7-33、HNPs、RNPs、B7-33-RNPs和B7-33-HNPs(FITC标记RGD-B7-33,cy5.5标记HNPs)添加到培养皿中使得cy5.5的浓度为5 ng/ml。
作用不同时间后,进行激光共聚焦显微镜拍照(直观定性观察细胞表面结合的B7-33-HNPs)。
结果如图3所示。可以看出:FITC标记的 RGD-B7-33 在孵育 4 小时后有效地结合到 LX-2 细胞膜表面。
而由于细胞内吞作用,HNPs 或 RNPs处理组细胞内部则具有比B7-33-HNPs 处理组高得多的 Cy5.5 荧光强度。
另一方面,B7-33-HNPs处理组中,细胞膜上的 RGD-B7-33-FITC 和 HNPs-Cy5.5之间的重叠比 B7-33-RNPs 处理组更高。分析认为造成这种情况的主要原因在于:B7-33-RNPs处理组中,虽然由RNPs负载的RGD-B7-33也可吸附在细胞膜上,但如前研究分析所述,由于RNPs不能有效负载RGD-B7-33,因此,在内吞作用下导致了相关效果差异。
总体上,激光共聚焦显微镜的直观观察结果表明了,B7-33-HNPs可以通过B7-33与肝星形细胞表面的RXFP1(松弛素家族肽受体 1)结合而稳定吸附在细胞膜上,而这正是纳米药物逆转HSCs活化功能的先决条件。
(二)抑制肝星形细胞激活后介导的纤维化
为了明确B7-33-HNPs 对 HSCs 活化的影响,采用TGF-β刺激处理LX-2细胞,并观察纳米药物的作用效果。具体操作参考如下。
将对数生长期的肝星形细胞LX-2接种到6孔板中,将等体积PBS、HNPs、RNPs、B7-33、RGD-B7-33、B7-33-RNPs、C7-33-HNPs或B7-33-HNPs添加到孔板中(B7-33的浓度为20nmol/L),1 h后,再加入5ng/ml TGF-β刺激细胞,48 h后,采用细胞免疫荧光和WesternBlot技术观察肝星形细胞内a-SMA、Fibronectin(纤维粘连蛋白,纤连蛋白)和Collagen I(胶原蛋白)等蛋白的表达。
此外,利用同样的方法研究B7-33-HNPs对肝星形细胞纤维化相关信号通路的影响,具体而言,加入TGF-β刺激细胞1 h后,采用Western Blot检测肝星形细胞内Smad2/3磷酸化和NOS等蛋白的表达。
具体试验结果如图4所示。从免疫荧光 (IF) 染色图像(图4A)可以看出:与未处理的对照相比,B7-33-HNPs 处理组显着降低了 α-SMA(活化 HSCs 的标志物之一)等的水平。
而对微环境基质相关成分的检测,则主要用来评估B7-33-HNPs对ECM(细胞外基质)的调节能力,进而用于评估纳米药物能否用于肿瘤(癌)细胞的转移。具体结果而言:
与对照组相比,B7-33-HNPs 处理组中胶原蛋白和纤连蛋白表达量(含量)大幅减少(p < 0.05);而相关降低结果与B7-33一致(图4B、图4D)。这一结果表明,负载在纳米颗粒HNPs 上的 B7-33并不影响药物分子B7-33本身功能的发挥。而基于这一结果可以得出结论:B7-33-HNPs通过抑制α-SMA、纤连蛋白和胶原蛋白 I 的表达,从而通过抑制纤维化来对为环境基质成分进行调节。
为了进一步评估 B7-33-HNPs 是否通过抑制 TGF-β 的下游信号传导(例如Smad2 和 Smad3 的磷酸化)来发挥相关调节作用,发明人进一步检测了相关pSmad2(Smad2)、pSmad3(Smad3)的表达情况。结果表明:B7-33-HNPs或B7-33显著抑制降低了TGF诱导的 pSmad2/Smad2 和 pSmad3/Smad3比率(图4C、图4E)。这一结果表明,B7-33-HNPs (或B7-33)通过降低 Smad2 和 Smad3 磷酸化通路方式来抑制肝星形细胞的纤维化(即,B7-33-HNPs 通过抑制 pSmad2 和 pSmad3 通路来抑制 TGF-β 诱导的HSCs活化)。
实施例3
在实施例2基础上,发明人进行了进一步的动物实验,以对B7-33-HNPs的实际防治效果进行进一步准确评估。具体试验情况简介如下。
(一)药代动力学分析
向C57BL/6 小鼠静脉注射 RGD-B7-33-FITC 或 B7-33-HNPs
(FITC 偶联的 RGD-B7-33)(剂量:5mg/kg)。通过IVIS光谱成像系统分析不同时间从尾静脉收集的血液中FITC的荧光强度。
结果表明(图5A、图5B):RGD-B7-33处理组的荧光强度在10分钟内迅速消失至25%,也即,RGD-B7-33-FITC的循环半衰期仅为5分钟左右。而B7-33-HNPs 的荧光强度在 1 小时后仍保持在 50% 左右(也即,半衰期约为1小时)。
这一结果证明,新设计的B7-33-HNPs确实增强了纳米药物的体内稳定性,延长了肽 药物肽B7-33在循环中的半衰期。换言之,这一结果表明本申请所提供的B7-33-HNPs具有较好的血液循环稳定性和较低清除率。
(二)安全性评价
为了研究本项目设计的B7-33-HNPs是否满足生物安全性的要求,发明人采用正常小鼠来评价其免疫原性和安全性。具体实验而言:
首先静脉注射PBS、HNPs、B7-33、B7-33-RNPs、B7-33-HNPs,静脉注射一次后,于24h,取血进行炎性细胞因子(IFN γ、IL-6、IL-2)检测,研究B7-33-HNPs对小鼠机体免疫反应的影响;
同时,按照上述分组,隔天给药一次,给药5次后,进行小鼠体重、血常规及血生化水平(肝功能:天冬氨酸转氨酶,AST;丙氨酸氨基转移酶,ALT;肾功能:总胆红素,TBIL;尿肌酐,CR;血尿素氮,BUN)的监测,同时采用H&E染色观察B7-33-HNPs对心、肝、脾、肺和肾等主要脏器的毒性。
部分实验结果如图6、图7、图8所示。分析可以看出:各处理组之间的各项生理指标之间无明显差异,表明所提供的B7-33-HNPs具有较好的安全性。
(三)体内靶向性
具体试验而言:向荷瘤小鼠分别静脉注射HNPs-cy5.5、C7-33-HNPs(cy5.5标记)或B7-33-HNPs(cy5.5标记),并在注射 24 小时后对主要器官和肿瘤进行离体成像。
IVIS 光谱成像系统(图 5C、图5D)结果表明,采用HNPs作为载体的处理组,主要集中与肝脏器官,表现出较好的肝脏靶向性。同时,B7-33-HNPs处理组肝器官的总荧光强度又比C7-33-HNPs处理组、HNPs处理组高1.4倍和1.6倍(B7-33-HNPs:1511.35 ± 141.7,C7-33-HNPs:1079.00 ± 81.79 ,HNPs:942.40 ± 193.38)。
这一结果表明,在面临实际的肿瘤(癌)细胞时,由于B7-33与HNPs的组合,表现出更好的肝脏延迟效果(即,更好的肝脏靶向性)。
进一步对肝组织进行免疫组织荧光分析,研究B7-33-HNPs与转移前微环境肝星形细胞的共定位情况(图5E,FITC 用于对组织切片中的 α-SMA 进行染色):结果显示B7-33-HNPs 在肿瘤组织切片中的密集积累,红色荧光(Cy5.5标记的HNPs)重叠且更接近绿色荧光(α-SMA,α-SMA 表达升高是肝转移生态位的特征),这表明B7-33-HNPs 的肝转移灶靶向特性不仅得益于出色的血液循环特性,还得益于表面药物分子B7-33的靶向能力,使得可以调节基质成分并用于逆转 HSCs的激活。
实施例4
在上述实验结果基础上,发明人通过构建小鼠胰腺癌肝转移模型,对所制备B7-33-HNPs的防治效果进行了进一步研究和明确。具体试验过程及结果简介如下。
(一)小鼠胰腺癌肝转移模型构建
每只C57BL/6N小鼠脾内(接近肝脾静脉)注射胰腺癌1×106个pan02-luci细胞建立胰腺癌肝转移模型。
实验过程中,对小鼠体内肝转移前微环境情况进行检测分析,具体操作而言:
分别于建模第0、2、4、7、10天取出肝组织,通过免疫荧光和H&E染色观察肝星形细胞中a-SMA、Fibronectin和Collagen I等蛋白的表达情况,以及确定肉眼可见转移灶形成所需的时间,以评估小鼠胰腺癌肝转移模型是否成功构建以及转移前纤维化微环境的具体情况。
相关染色及蛋白表达结果如图9(图9A、图9B、图9C)所示,同时结合实际观察结果,可以评估判定:接种肿瘤一周后即可形成肉眼可见的转移灶,此时即可认定小鼠胰腺癌肝转移模型已经成功构建(后续模型即参考此时间进行构建)。
(二)纳米药物对胰腺癌肝转移过程中肿瘤(癌)细胞的抑制情况
肝脏是胰腺导管腺癌 (PDAC) 最常见的转移部位之一,而PDAC也是最常见的具有高转移潜力的胰腺癌类型。为了评估 B7-33-HNPs 对 Pan02 小鼠模型中肝转移灶形成过程中的抑制作用,参考前述胰腺癌肝转移模型构建过程,发明人进行了进一步的试验。具体操作参考如下。
参考前述操作,注射pan02-luci以建立胰腺癌肝转移模型。在构建胰腺癌肝转移模型第2天,分别静脉注射PBS、HNPs、RGD-B7-33、RGD-B7-33+RNPs、C7-33-HNPs、B7-33-HNPs,每组6只,隔天给药一次,给药6次(参考图10A时间点进行相关取样或操作)。
相关试验结果如图10所示。具体分析而言:
从IVIS光谱成像结果可以看出(图10B、图10D):RGD-B7-33、C7-33-HNPs、HNPs、RGD-B7-33+RNPs 处理组对于肿瘤(癌)细胞的转移生长均表现出一定的抑制效果。而RGD-B7-33 对于肿瘤(癌)细胞转移抑制作用效果较差原因,推测与其极短的半衰期和在转移部位(肝脏)的低积累相关。相比之下,B7-33-HNPs处理组则显著降低了肿瘤(癌)细胞肝转移的形成
另外,对肝脏器官的H&E染色及统计结果表明(图10C、图10E):B7-33-HNPs 治疗的组中,肿瘤(癌)细胞转移面积明显少于其他处理组。具体的肝转移生态位百分比的量化结果表明(图10E):PBS,41.10 ± 8.51;HNPs,33.74 ± 4.32;C7-33-HNP,31.97 ± 9.01;RGD-B7-33,22.54 ± 7.02; RGD-B7-33 + RNPs,24.51 ± 10.36;B7-33-HNPs,5.94 ±4.07;B7-33-HNPs 处理组的转移区域数量明显最低。
进一步的,肝脏重量统计结果表明(图10F):与 PBS 组相比,B7-33-HNPs处理组肝脏重量减少了 54.5%(同时,B7-33-HNPs治疗组的肝脏重量与健康、年龄匹配的无肿瘤小鼠相当),此结果也表明B7-33-HNPs的处理与最小的转移性肿瘤相关(即,由于对于肿瘤(癌)细胞转移的抑制作用,使得肝脏重量没有明显增加)。
总之,上述结果初步表明,通过对肿瘤(癌)细胞转移前微环境的调节,B7-33-HNPs在所有制剂中对肿瘤细胞的定植和转移形成具有最强的抑制活性。
(三)体内抑制胰腺癌肝转移的机制研究
由于胰腺癌细胞肝转移的形成与细胞的纤维化过程密切相关,因此,发明人对体内抗纤维化的机理进行了进一步探讨。具体实验过程简介如下。
实验过程中,按照各实验分组情况,隔天给药一次,给药6次后,在实验终点收集小鼠肝脏组织进行冰冻切片,丙酮固定后,进行a-SMA、Fibronectin和Collagen I等染色,研究B7-33-HNPs抑制肝转移前纤维化微环境的作用机制。
进一步地,B7-33-HNPs能明显逆转活化的 HSC(活化后的HSC可以调节肝脏微环境以支持转移性肿瘤细胞的定植和生长),明显降低活化HSC的a-SMA、Fibronectin和Collagen I蛋白的表达,即B7-33-HNPs 纳米粒子能明显抑制肝星状细胞的活化,进而显著抑制肝转移灶内的纤维化。
肝转移壁龛中的免疫组织化学 (IHC) 染色结果如图11(图11A)所示。分析可以看出:B7-33-HNPs 处理组显着降低了转移病灶中的胶原蛋白、α-SMA 和纤连蛋白含量,而这些蛋白是主要的 ECM(细胞外基质)蛋白(ECM蛋白直接与纤维化程度相关);
而结合相关统计结果(图11B),分析可以看出:与 RGD-B7-33 处理组相比,B7-33-HNPs的处理导致 ECM 支架蛋白表达明显降低,这也进一步表明我们设计的 B7-33-HNPs确实通过延长其半衰期、增强其在体内稳定性方式在血液(体液)循环中发挥了更好作用效果。
类似地,在 RGD-B7-33 + RNPs 处理组中,α-SMA 和胶原蛋白的表达也有相同的降低,而在 RGD-B7-33 处理组中则检测到纤连蛋白;HNPs 或 C7-33-HNPs 单独处理并不影响肝转移中 ECM 蛋白的表达。
基于上述结果,可以认定:与非 RGD-B7-33 治疗组(例如:C7-33-HNPs、HNPs)或对照组相比,B7-33-HNPs的应用能够显著降低肝转移微环境纤维化程度,也即,可以通过抗纤维化方式来可逆的抑制胰腺癌肿瘤(癌)细胞肝转移过程。
总体上,本申请中,发明人开发制备了一种靶向性纳米颗粒B7-33-HNPs,可以用来改变肝脏转移微环境并抑制转移的形成和进展。纳米颗粒制备过程中,高表达整合素αv(β3)的HNPs特异性携带经RGD肽修饰的抗纤维化肽B7-33,用于调节转移性微环境中的纤维化微环境,抑制播散性肿瘤细胞在肝脏中的定植和进展。 而HNPs 表面的 RGD-B7-33修饰使其对活化的 HSCs 具有显着的靶向作用,具有长循环和对转移性壁龛的出色靶向作用。实际实验效果表明,在体外和体内产生了对肝纤维化生态位纤维化的有效抑制,从而在小鼠胰腺癌(高肝转移)模型中以高效、优异的生物相容性抑制胰腺癌肝转移的进展。同时,B7-33-HNPs 在哺乳动物系统中具有低或没有细胞毒性。综上所述,该治疗策略对于胰腺癌肝转移的形成和进展进行全身治疗具有巨大潜力,未来可较好支持临床应用。
Claims (5)
1.一种逆转肝星形细胞激活的仿生纳米药物,其特征在于,该仿生纳米药物通过如下步骤制备获得:
(一)制备仿生纳米载体
以血管内皮细胞HUVEC膜制备仿生纳米载体HNPs,
(二)B7-33的修饰改造
将RGD序列与多肽B7-33偶联修饰;
所述多肽B7-33,氨基酸序列如SEQ ID No.1所示,具体为:VIKLSGRELVRAQIAISGMSTWSKRSL;
修饰改造后的B7-33的氨基酸序列为:VIKLSGRELVRAQIAISGMSTWSKRSL-GG-c(RGDfK);
(三)装载构建多肽仿生纳米药物
基于受体和配体的亲和性,实现多肽B7-33在仿生纳米载体HNPs上的高效装载,构建获得多肽仿生纳米药物B7-33-HNPs;具体操作而言:
将步骤(二)的修饰改造后的B7-33与步骤(一)制备所得仿生纳米载体HNPs混合孵育,即可制备获得仿生纳米药物B7-33-HNPs。
2.如权利要求1所述逆转肝星形细胞激活的仿生纳米药物,其特征在于,步骤(一)中,所述血管内皮细胞膜,采用细胞膜提取方法制备获得,具体操作为:
(1)梯度离心提取获得细胞膜
收集所培养的血管内皮细胞,用IB-1重悬后,匀浆研磨;
对研磨后的细胞液,4℃、3000g离心5min,留上清;
将上清再4℃、10000g离心10min,留上清;
将上清加到超离管中,补充IB-1后,4℃、10000g离心2h,留沉淀;
所述IB-1为:SB + 0.5%BSA + 0.5mmol EGTA;
所述SB为:225mmol甘露醇 + 75mmol蔗糖+ 30mmol pH=7.4的Tris-HCl;
(2)使用挤出器挤成细胞膜仿生型纳米载体HNPs
将步骤(1)中离心所得血管内皮细胞置于细胞超声破碎仪中,超声功率100w超声处理3min,随后,采用挤出器进行挤出操作:
首先,利用0.8 μm 聚碳酸酯PC 膜,对超声处理后血管内皮细胞进行上下挤出10次;
随后,依次使用0.4 μm和0.1 μm的聚碳酸酯PC膜分别进行上下挤出10次处理;
最后,制备成平均粒径100nm左右的均一性仿生纳米载体HNPs纳米颗粒备用。
3.如权利要求1所述逆转肝星形细胞激活的仿生纳米药物,其特征在于,步骤(三)中,孵育时,质量百分比计,修饰改造后B7-33的比例为1.5%。
4.如权利要求1所述逆转肝星形细胞激活的仿生纳米药物,其特征在于,步骤(三)中,孵育时,4℃孵育过夜。
5.权利要求1~4任一项所述逆转肝星形细胞激活的仿生纳米药物在制备胰腺癌防治药剂中的应用,其特征在于,通过抗纤维化方式用于预防或逆转胰腺癌细胞向肝脏组织的转移。
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