CN115998801A - 通心络在制备抑制铁死亡的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了通心络在制备抑制铁死亡的药物中的应用，经体外和体内实验证实，中成药通心络能够逆转CS和HFD诱导的小鼠铁死亡，能够逆转HPMECs中CSE和Hcy诱导的铁死亡。这些结果证明，铁死亡介导的氧化应激在屏障功能障碍中起着重要作用，而通心络可以抑制铁死亡，减少氧化应激，保护肺微血管屏障，从而对COPD合并AS具有显著的治疗作用。
Description
技术领域
本发明属于人用植物药技术领域，具体涉及中成药通心络的一种新的治疗用途。
背景技术
在铁死亡是一种铁依赖性的细胞程序性死亡方式，氧化应激被认为是铁死亡的主要原因。研究表明，铁死亡参与了许多疾病的病理生理过程，如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、动脉粥样硬化(AS)、肾损伤和肿瘤。谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPx4） 是一种脂质修复酶，是硒蛋白家族中唯一已被证明通过阻断活性氧（ ROS） 介导的脂质过氧化来抑制铁死亡的物质，常被用作铁死亡的重要分子标志物。铁死亡抑制蛋白 1（FSP1）是一种新型的铁死亡保护分子，是与 GPx4 和谷胱甘肽（GSH）协同抑制磷脂过氧化和铁死亡的独立因子。酰基辅酶A 合成酶长链家族成员 4 （ACSL4）是一种参与激活多不饱和脂肪酸 （PUFA）的酶。最近的一项研究报道，ACSL4 有助于铁死亡过程中脂质中间体的积累，是监测铁死亡的有用生物标志物。
慢性阻塞性肺疾病是肺部的一种慢性炎症性疾病，常伴随全身性炎症反应，而且多并发肺外合并症，其中最常见的是心血管疾病中的动脉粥样硬化，经常导致严重的心血管不良事件，严重威胁患者的健康状况。氧化应激被认为是COPD发生和发展的主要驱动因素，也是COPD合并心血管疾病发展的重要机制。
吸烟是导致COPD的主要危险因素，香烟烟雾（CS）是4500多种化学物质的复杂混合物，包括氧化物和细颗粒，会引起细胞和组织氧化应激，从而进一步导致炎症反应过度和不可逆的肺组织损伤。此外，这些氧化物和细颗粒可以穿过肺泡-毛细血管屏障，从肺泡转移到血管间隙，破坏肺微血管屏障并释放到全身循环，导致多个器官的氧化和炎症级联反应。
目前，使用 β-2 激动剂治疗 COPD 和使用β-受体阻滞剂治疗冠状动脉疾病（CAD）尚存在争议。能够有效治疗COPD并发AS的药物仍然缺乏。
通心络（TXL）是一种多功能中成药，目前多用于治疗心血管疾病和脑血管疾病，如动脉粥样硬化。
发明内容
本发明的目的是提供一种通心络的新的用途，用于抑制铁死亡的药物的制备。
为了实现上述目的，发明人提供了以下技术方案。
通心络在制备抑制铁死亡的药物中的应用。
上述应用中，所述铁死亡为香烟烟雾和/或高脂饮食诱导的细胞的铁死亡。
上述应用中，所述铁死亡为香烟烟雾和/或高脂饮食诱导的肺组织细胞的铁死亡。
上述应用中，所述抑制铁死亡是通过升高GPx4、FSP1蛋白的表达，同时降低ACSL4蛋白的表达实现的。
上述应用中，所述抑制铁死亡的药物能够减少氧化应激。
上述应用中，所述抑制铁死亡的药物能够保护肺微血管屏障。
上述应用中，所述抑制铁死亡的药物为用于治疗与铁死亡相关的疾病的药物。
上述应用中，所述抑制铁死亡的药物为用于治疗慢性阻塞性肺疾病合并动脉粥样硬化的药物。
本发明通过CS暴露和HFD喂养在小鼠中诱导COPD并发AS。小鼠被给予阿托伐他汀钙、通心络 20 周，评估了肺功能、肺病理、血清脂质水平、动脉粥样硬化斑块面积和肺组织屏障功能、氧化应激和铁死亡的指标。在体外实验中，人肺微血管内皮细胞（HPMECs）用通心络预处理 4 小时，然后与香烟烟雾提取物和同型半胱氨酸一起孵育 36 小时以诱导屏障功能障碍，然后在 HPMECs 中测量屏障功能、氧化应激和铁死亡的指标。
实验结果发现，CS 加重了 HFD 喂养小鼠的血脂异常、动脉斑块形成、肺功能下降、病理性肺损伤、屏障功能障碍、氧化/抗氧化失衡和铁死亡。
在本发明中，发明人通过实验证明了 CS会加重 HFD 诱导的小鼠肺组织铁死亡，主要表现为 GPX4 和 FSP1 表达降低和 ACSL4 表达升高。而通心络能够逆转 CS 和 HFD诱导的小鼠铁死亡。体外实验结果显示，CSE 会加重HPMECs 中 Hcy 诱导的铁死亡，而通心络能够逆转HPMECs 中 CSE 和 Hcy 诱导的铁死亡。这些结果证明，铁死亡介导的氧化应激在屏障功能障碍中起着重要作用，而通心络可以抑制铁死亡，减少氧化应激，保护肺微血管屏障，从而对 COPD 合并 AS 具有显著的治疗作用。
附图说明
图1为实施例1体外实验中得到的蛋白质印迹分析图。
图2为实施例1体外实验中GPx4蛋白分析结果的柱状对比图。
图3为实施例1体外实验中ACSL4蛋白分析结果的柱状对比图。
图4为实施例1体外实验中FSP1蛋白分析结果的柱状对比图。
图5为实施例1体外实验中各实验组GPx4 的 mRNA 表达结果的柱状对比图。
图6为实施例2体内实验中得到的蛋白质印迹分析图。
图7为实施例2体内实验中GPx4蛋白分析结果的柱状对比图。
图8为实施例2体内实验中ACSL4蛋白分析结果的柱状对比图。
图9为实施例2体内实验中FSP1蛋白分析结果的柱状对比图。
图10为实施例2体内实验中各实验组GPx4 的 mRNA 表达结果的柱状对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述内容做进一步详细的说明。
实施例1 体外实验
发明人通过体外细胞实验对通心络抑制铁死亡的作用进行了考察。
（一）通心络提取物的制备
取市售通心络胶囊的内容物，精确称取10g，溶解在无血清 Dulbecco 改良 Eagle培养基（DMEM，Gibco BRL，Gaithersburg，MD，USA）中，搅拌 1 小时，再超声处理 1 小时。之后，将所得混合物以 8000 rpm 离心 30 分钟，过滤（孔径为 0.22 μm），上清液中为溶解的通心络提取物。将未溶解的粉末干燥后精确称重，计算溶于培养基中的通心络提取物的重量，以此为基准，配制不同浓度的通心络提取物进行体外实验。
（二）香烟烟雾提取物（CSE）的制备
CSE 是在已公开的方法（Lv XJ, Du YW, Hao YQ, Su ZZ, Zhang L, Zhao LJ,Zhang J. RNA-binding motif protein 5 inhibits the proliferation of cigarettesmoke-transformed BEAS-2B cells through cell cycle arrest and apoptosis.Oncol Rep. 2016 Apr;35(4):2315-27. doi: 10.3892/or.2016.4551.）的基础上稍作修改制备得到的。本发明设计了注射器驱动装置，用于从点燃的香烟中吸入烟雾，然后将烟雾流推入浸入液氮的输液管中，计算提取的烟雾重量，再通过超声将提取的烟雾溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，过滤（0.22 μm），得到CSE，储存在 -80℃条件下， 以备后用。
（三）细胞培养
人肺微血管内皮细胞（HPMECs）购自 Yaji 生物技术有限公司（中国上海）。HPMECs 在 89% DMEM (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) 中培养，辅以 10% 胎牛血清 (FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) 和 1% 青霉素/链霉素/庆大霉素，在 37℃且含有5% 二氧化碳培养箱中。当细胞融合超过 80% 时，用 PBS 冲洗细胞，用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化，每 3 天以 1:3 的比例传代。
（四）细胞处理
HPMECs 随机分为 6 组，分别为：
①对照组：正常条件下培养的 HPMECs；
②同型半胱氨酸组 (Hcy组) ：HPMECs， 与含有 4 mmol Hcy 的培养基一起培养，以诱导屏障功能障碍的 HPMEC 模型；
③Hcy+CSE组： HPMECs，用含有 4 mmol Hcy 和 300 μg/ml CSE 的培养基培养，以建立屏障功能障碍的复合 HPMEC 模型；
④ Hcy+CSE+通心络低剂量组：HPMECs，加入通心络提取物（200μg/ml）培养4小时，并在与Hcy+CSE组相同的条件下培养36小时；
⑤ Hcy+CSE+通心络中剂量组：HPMECs，加入通心络提取物（400μg/ml）培养4小时，并在与Hcy+CSE组相同的条件下培养36小时；
⑥Hcy+CSE+通心络高剂量组：HPMECs，加入通心络提取物（600μg/ml）培养4小时，并在与Hcy+CSE组相同的条件下培养36小时。
（五）检测方法
采用蛋白质印迹分析方法和RT-PCR 测量每组中铁死亡相关蛋白和基因（包括GPx4、FSP1 和 ACSL4）的表达。
蛋白质印迹分析方法：用含有蛋白酶抑制剂 PMSF 的 RIPA 裂解缓冲液从HPMECs 中提取蛋白质。然后，使用BCA蛋白质测定试剂盒（Biyuntian，China）测定蛋白质浓度。样品中加入适量的5×蛋白上样缓冲液，100℃煮沸6-7分钟。冷却后，蛋白质在 4-20%SDS-PAGE 凝胶（GenScript Biotech Corporation，China）上分离，然后转移到硝酸纤维素膜（Life Sciences，Mexico）上。膜在 37℃ 下用 Odyssey® 封闭缓冲液（LI-COR，LincolnUSA）封闭 1 小时，并与一抗（VE-钙粘蛋白、β-连环蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPx4）、铁死亡抑制蛋白 1（ FSP1）、酰基辅酶 A 合成酶长链家族成员 4 (ACSL4)、β-肌动蛋白和微管蛋白，见表 1），在 4℃下过夜。用 TBST 洗涤 3 次（10 分钟/次）后，将膜与二抗（山羊抗小鼠 IgG H&L 和山羊抗兔 IgG H&L，见表 1）在 37℃ 下进一步孵育 1 小时。用 TBST 再洗涤 3 次后，用 Odyssey 成像仪（LI-COR，Lincoln USA）扫描膜。 β-肌动蛋白和微管蛋白用作内部参考。
实时聚合酶链反应 （PCR）：使用 TRIzol 试剂（Ambion，美国）从HPMECs细胞中提取总 RNA，并使用带有 gDNA 橡皮擦的 PrimeScriptTM RT 试剂盒（Takara Clontech，京都，日本）进行逆转录。使用 TB GreenTM Premix Ex TaqTM（Takara Clontech，Kyoto，Japan）在 Applied Biosystems 7900 Real-Time PCR 仪器（Bio-Rad，CA，USA）上一式三份地进行定量实时 PCR。引物均由赛维生物技术有限公司合成，以GAPDH基因为内参，引物序列见表2。
（六）结果
蛋白质印迹分析图如附图1所示，表3为蛋白质印迹分析结果。
附图2、附图3、附图4分别为各实验组GPx4 、ACSL4、FSP1蛋白质印迹分析结果的柱状对比图。数据显示为平均值±SEM。 #P<0.05，##P<0.01 vs 对照组； ** P<0.01 与 Hcy组相比； △P<0.05，△△P<0.01 vs Hcy+CSE组。
RT-PCR检测得到的GPx4 的 mRNA 表达结果如表4所示，附图5为各实验组GPx4 的mRNA 表达结果的柱状对比图。
实施例2 体内实验
发明人采用动物体内实验对通心络抑制铁死亡的作用进行了考察。
（一）动物
C57BL/6小鼠、ApoE-/-基因敲除小鼠，雄性，体重18-22 g，8 周龄，购自北京威通利华实验动物科技有限公司（中国北京）。
（二）实验分组
将小鼠随机分为5组，每组10只（n=10）。
①对照组（CON组）：C57BL/6小鼠仅暴露于环境空气中，喂食标准啮齿动物饲料（北京科奥协力饲料有限公司），并用 0.5% 羧甲基纤维素（CMC）钠溶液灌胃，持续20周。
②高脂肪饮食组 (HFD组) ：ApoE-/-小鼠暴露在环境空气中，喂食高脂饮食（HFD，D12079B，北京科奥协力饲料有限公司），并用0.5% CMC钠溶液灌胃，持续20周。
③ CS 高脂肪饮食组(CS+HFD组) ：ApoE-/-小鼠放置于玻璃盒中，暴露在 CS 环境中（每天两次，每天 1 小时，每周 5 天，总共 20 支香烟/天），喂食HFD，并用0.5% CMC钠溶液灌胃，持续20周。
④阿托伐他汀钙组（ATO 组）：ApoE-/-小鼠暴露在香烟烟雾以及HFD喂饲的同时，给予阿托伐他汀钙片（Pfizer，美国），0.01 g/kg/天，持续20周。
⑤通心络组（TXL 组）：ApoE-/-小鼠暴露在香烟烟雾以及HFD喂饲的同时，给予通心络胶囊（石家庄以岭药业）的内容物，0.75 g/kg/天，持续20周。
（三）检测方法
采用蛋白质印迹分析方法和RT-PCR 测量每组中铁死亡相关蛋白和基因（包括GPx4、FSP1 和 ACSL4）的表达。
检测采样为实验小鼠的肺组织，其它同实施例1中的检测方法。
（四）结果
体内动物实验各实验组的蛋白质印迹分析图如附图6所示，蛋白质印迹分析结果如表5所示。
附图7、附图8、附图9分别为各实验组GPx4、 ACSL4 、FSP1蛋白质印迹结果的柱状对比图。
由表5中结果可以看出，与对照组相比，HFD组中GPx4和FSP1蛋白表达显著降低（P＜0.01），ACSL4蛋白表达显著增加（P＜ 0.01）在，这种趋势在CS+HFD组中更为明显（P<0.01）。相比之下，ATO组、TXL组中的GPx4、FSP1蛋白表达显著升高，ACSL4蛋白表达显著降低（P<0.01，P<0.05）。以上结果表明，CS加重了HFD诱导的肺组织铁死亡，而TXL抑制了铁死亡，并且 TXL的作用要强于 ATO。
各实验组铁死亡相关基因GPx4 mRNA表达的qRT-PCR分析结果如表6所示，附图10为各实验组分析结果柱状对比图。
由表6中结果可以看出，GPx4的 mRNA表达显著升高，呈现出与 GPx4 蛋白表达相同的趋势（P<0.01）。
体内和体外实验结果表明，CS会加重HFD诱导的肺组织铁死亡，而通心络能够通过抑制铁死亡保护肺微血管屏障，减少氧化产物进入体循环，从而实现治疗慢性阻塞性肺疾病合并动脉粥样硬化的效果。
Claims (8)
1.通心络在制备抑制铁死亡的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述铁死亡为香烟烟雾和/或高脂饮食诱导的细胞的铁死亡。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述铁死亡为香烟烟雾和/或高脂饮食诱导的肺组织细胞的铁死亡。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制铁死亡是通过升高GPx4、FSP1蛋白的表达，同时降低ACSL4蛋白的表达实现的。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制铁死亡的药物能够减少氧化应激。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制铁死亡的药物能够保护肺微血管屏障。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制铁死亡的药物为用于治疗与铁死亡相关的疾病的药物。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制铁死亡的药物为用于治疗慢性阻塞性肺疾病合并动脉粥样硬化的药物。
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