CN115997014A - 抗呼吸道病毒的泛基因型药剂及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
提供了抑制样本中呼吸道病毒(即与呼吸系统疾病相关的病毒，例如甲型流感、乙型流感、RSV等)的方法。所述方法的方面包括使包含具有靶基序的病毒RNA(vRNA)样本与有效量的药剂接触，所述有效量的药剂特异性结合靶基序以抑制所述呼吸道病毒。还提供了治疗或预防受试者的呼吸道病毒感染的方法。还提供了在所述方法中找到用途的包含与靶vRNA区域互补的寡核苷酸序列的化合物和药物组合物。
Description
交叉引用
本申请是2020年2月14日提交的美国专利申请第16/792,103号的部分延续案；美国专利申请第16/792,103号是2018年8月31日提交的美国专利申请第16/081,818号的部分延续案，美国专利申请第16/081,818号是2017年3月1日提交的PCT/US2017/20241的371国家阶段申请，并要求2016年3月2日提交的美国临时专利申请第62/302,548号的权益，所有这些申请均以全文引用的方式并入本文。
本申请还要求于2020年3月20日提交的美国临时专利申请第62/992,659号的权益，该申请以全文引用的方式并入本文。
介绍
甲型流感病毒(IAV)是一种分段RNA病毒，可在全球范围内引起严重的发病率和死亡率。目前批准的所有IAV抗病毒药物都针对病毒蛋白，亚型有限，并且面临着对所有药物类别成员的抗病毒耐药性上升的挑战。
IAV基因组由八个单链负译病毒RNA(vRNA)节段组成，这些节段编码至少14种已知病毒蛋白。vRNA与核蛋白(NP)和由PB2、PB1和PA蛋白组成的异源三聚体聚合酶复合物一起形成完整的病毒核糖核蛋白(vRNP)。为了具有完全的传染性，IAV病毒粒子必须包含每个节段中的至少一个vRNP。每个vRNP与至少一个其他伴侣相互作用以形成超分子复合物，该复合物可能由推测用于指导包装过程的节段间RNA-RNA和/或蛋白质-RNA相互作用维持。
个体可以单独感染甲型流感病毒和/或感染其他呼吸道病毒，包括但不限于乙型流感病毒(IBV)、冠状病毒(Cov)、呼吸道合胞病毒(RSV)等。IBV是一种分段RNA病毒，其基因组由八个线性负译单链RNA节段组成
呼吸道合胞病毒(RSV)，也称为人呼吸道合胞病毒(hRSV)，是一种负译单链RNA病毒。感染RSV的患者发生呼吸衰竭的风险更高。它是一种非常常见的人类呼吸道病毒病原体。
冠状病毒(CoV)是包膜RNA病毒，通常会导致人类自限性呼吸道感染。然而，在过去20年中，出现了由新型冠状病毒引起的危及生命的疾病，例如2003年爆发的严重急性呼吸综合征(SARS)、2012年的中东呼吸综合征(MERS)以及最近爆发的2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。迫切需要新疗法来遏制当前和未来的疫情。
摘要
本公开的方面提供了设计用于破坏呼吸系统疾病相关病毒(例如IAV、IBV、RSV、冠状病毒等)的RNA结构元件的泛基因型组合物。本公开的方面提供了泛基因型组合物，其设计用于破坏基因组节段PB2的5′包装信号区内的IAV的RNA结构元件，称为包装茎环2(PSL2)。PSL2结构的破坏会显著抑制IAV。PSL2在所有测试的甲型流感亚型中都是保守的。
提供了抑制样本中甲型流感病毒的方法。所述方法的方面包括使包含具有PSL2基序的病毒RNA(vRNA)样本与有效量的药剂接触，所述有效量的药剂特异性结合PSL2基序以抑制所述甲型流感病毒。在某些情况下，vRNA从病毒粒子或细胞中分离出来。在某些情况下，vRNA存在于病毒粒子中。在某些情况下，vRNA存在于受感染的细胞中。还提供了治疗或预防受试者的甲型流感病毒感染的方法。还提供了用于筛选具有抑制细胞中甲型流感病毒能力的候选药剂的方法，所述方法包括：将样本与候选药剂接触；以及确定候选药剂是否特异性结合vRNA的PSL2基序。还提供了在所述方法中找到用途的包含与PB2 vRNA(或其互补链)区域互补的寡核苷酸序列的化合物和药物组合物。
提供了抑制样本中乙型流感病毒的方法。所述方法的方面包括使包含具有基序的病毒RNA(vRNA)样本与有效量的药剂接触，所述有效量的药剂特异性结合RNA基序以抑制所述乙型流感病毒。在某些情况下，vRNA从病毒粒子或细胞中分离出来。在某些情况下，vRNA存在于病毒粒子中。在某些情况下，vRNA存在于受感染的细胞中。还提供了治疗或预防受试者的乙型流感病毒感染的方法。还提供了用于筛选具有抑制细胞中乙型流感病毒能力的候选药剂的方法，所述方法包括：将样本与候选药剂接触；以及确定候选药剂是否特异性结合vRNA的RNA基序。还提供了在所述方法中找到用途的包含与IBV vRNA区域互补的寡核苷酸序列的化合物和药物组合物。
简要附图说明
本领域技术人员将理解，以下描述的附图仅用于说明目的。附图无意以任何方式限制本教导的范围。
图1A-图IF描述了野生型PB2的RNA二级结构(SEQ ID NO：1)和包装突变vRNAs，PB2m757(SEQ ID NO：2)、m745(SEQ ID NO：3)、1918疫情(H1N1)(SEQ ID NO：4)、高致病性禽流感(H5M＝N1)(SEQ ID NO：5)和2009猪流感(H1N1)(SEQ ID NO：6)。图1G说明了跨B型冠状病毒中保守的预测RNA二级结构。
图2，panel A和B，描述了全长PB2 vRNA的反应性。
图3A-图3E通过包装缺陷突变PB2m744b(SEQ ID NO：8)、PB2m745(SEQ ID NO：9)、PB2m55c(SEQ ID NO：10)和PB2m757(SEQ ID NO：11)。
图4描述了包含PSL2结构的核苷酸序列的保守性。
图5A-图5D描述了PSL2 RNA二级结构的二维突变和映射分析(图5C，SEQ ID NO：12)。
图6，panel A-B，描述了前文描述的PR8 PB2突变体的补偿性突变设计(panel A，SEQ ID NO：13)。
图7，panel A-D，描述了PR8 PB2 vRNA的单一高度保守密码子的同义突变(panelA，SEQ ID NOs：14-15；panel B，SEQ ID NOs：16-23起始端到终止端)。
图8描述了显示PB2包装突变体命名和相应突变位点的表格。
图9A-图9C描述了同义突变对PSL2结构PB2m731(SEQ ID NO：24)、PB2m751(SEQ IDNO：25)和PB2m748(SEQ ID NO：26)的影响。
图10，panel A-I，描述了PR8 PB2包装缺陷突变体中的补偿性突变对病毒包装和滴度的影响。
图11 panel A-D描述了PB2包装缺陷和补偿性突变体配偶体的多维化学映射(panel B，SEQ ID NO：27)。
图12，panel a-t描述了二维突变-映射-挽救分析。
图13描述了二维突变-映射-挽救突变体的引物序列设计。序列对应于SEQ IDNOs：28-43，起始端到终止端。
图14，panel A-B描述了包装缺陷病毒在体内被减毒。
图15，描述了靶向PSL2 RNA结构的锁核酸的抗病毒活性(panel A，SEQ ID NO：44)。
图16A-图16B描述了对LNA-RNA结合的分析。
图17，panel A-B显示了鼻内给药单剂量示例性化合物LNA9后小鼠随时间变化的存活百分比和体重减轻。
图18，panel A-D显示了流感病毒在药物压力下连续传代后对奥司他韦的易感性。
图19，panel A-C显示了流感病毒对示例性化合物LNA9的易感性，包括在药物压力下连续传代后的病毒和耐药病毒。
图20，设计用于破坏呼吸道病毒感染的miRNA定向LNA的抗病毒效应。在用0.3MOI完全复制的BSL3 SARS-CoV-2-nLuc报告病毒感染前12-24小时，用25nM miRNA定向LNA预处理Huh7细胞。感染后48小时，读取荧光素酶信号。结果显示为logio荧光素酶信号。样本一式两份，N＝2；对照品一式四份，N＝4。使用GraphPad Prism软件进行统计分析，并使用普通单因素方差分析及样本和加扰LNA(Scr.LNA)对照均值之间的Dunnett多重比较检验进行计算。包括阳性对照核苷类似物EIDD-2801(EIDD)作为阳性对照。
图21，在用0.3MOI完全复制的BSL3 SARS-CoV-2-nLuc报告病毒感染前12-24小时，用25nM LNA组合(每个LNA 12.5nM＝总共25nM)预处理Huh7细胞。感染后48小时，读取荧光素酶信号。结果显示为loglO荧光素酶信号。样本一式两份，N＝2；对照品一式四份，N＝4。使用GraphPad Prism软件进行统计分析，并使用普通单因素方差分析及样本和DMSO对照均值之间的Dunnett多重比较检验进行计算。包括阳性对照核苷类似物EIDD-2801(EIDD)作为阳性对照。
图22，LNA组合抗呼吸道病毒的体内效应。在感染SARS-Cov-2致死性接种物前5天，用溶媒、小分子A或LNA组合鼻内给药一次来处理人类ACE2转基因小鼠。感染后，每天通过临床评分监测动物，其中1＝无症状，较高的评分表明临床状态恶化。
图23，在用0.3MOI完全复制的BSL3 SARS-CoV-2-nLuc报告病毒感染前12-24小时，用50nM、25nM或5nM靶向CoV-2正链、靶向CoV-2负链或miRNA定向LNA预处理ACE2-A549细胞。感染后48小时，读取荧光素酶信号。
结果显示为log10荧光素酶信号。样本重复6次，N＝6。使用GraphPad Prism软件进行统计分析，并使用普通单因素方差分析及样本和加扰LNA(Scr.LNA)对照均值之间的Dunnett多重比较检验进行计算。包括阳性对照核苷类似物EIDD-2801(EIDD)作为阳性对照。
图24，(a-b)鼻内LNA预防性治疗对病毒感染小鼠存活的影响。Kaplan-Meier生存曲线。小鼠(n＝7只小鼠/组)鼻内给药单剂量LNA9、加扰LNA或溶媒(模拟处理)，然后给予野生型PR8病毒的致死性接种物：(a)在感染前3天(第-3天)或感染前1天(第-1天)给予20μgLNA；(b)用单剂量30μg LNA9或溶媒对照品预处理一周，(c)LNA9和新设计的LNA 14的靶位点，映射到PSL2结构，(d)在PR8 PB2 vRNA存在下，以100nM浓度对未处理的加扰LNA、LNA9和LNA14进行SHAPE分析的电泳图谱。用所示的1M7 SHAPE试剂标记，(e)在致死性PR8感染前一周(第-7天)用单剂量30μg LNA14或溶媒对照品鼻内预处理小鼠(n＝7只小鼠/组)的Kaplan-Meier生存曲线，(f-h)在PR8病毒感染前两周(第-14天)给予单剂量40μg LNA 14或溶媒LN.，(f)Kaplan-Meier生存曲线，(g)小鼠第0天体重百分比，(h)临床评分，(i-1)小鼠(n＝7)在以1LD100初次致死感染PR8病毒(e)的前一周给予单次40μg鼻内剂量的LNA14。初始感染后65天，来自(e)的幸存小鼠以及年龄匹配的未感染对照组(n＝7/组)在10LD100下进行第二次攻击。(i)负荷试验时间表，(j)小鼠第0天体重百分比，(k)临床评分。(1)Kaplan-Meier生存曲线，(m)用致死剂量的PR8野生型病毒感染小鼠(n＝10只/组)。感染后3天，通过静脉注射给予小鼠单剂量40μg LNA14、LNA9、加扰LNA或溶媒对照品。Kaplan-Meier生存曲线。
定义
在更详细地描述示例性实施例之前，阐述了以下定义，以说明和定义描述中所用术语的含义和范围。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。Singleton，et al.，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY，2D ED.，John Wiley and Sons，New York(1994)，and Hale&Markham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，N.Y.(1991)为技术人员提供了本文使用的诸多术语的一般含义。尽管如此，为了清楚和便于参考，下面定义了某些术语。
必须注意，本文和所附权利要求中使用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。例如，术语“a primer”是指一种或多种引物，即单一引物和多种引物。还应注意，权利要求可以被起草为排除任何可选要素。因此，本声明旨在作为在引用权利要求要素或使用“否定”限制时使用“solely”、“only”等排他性术语的先行基础。
本文所用的术语“有效量”是指产生某种预期的局部或全身效应的物质(例如，感兴趣的药剂)的量。感兴趣的活性剂的有效量取决于多种因素，包括但不限于受试者的体重和年龄、所治疗的病症、病症的严重程度、给药方式等，并且可以容易地确定，例如，使用诸如以下实验部分中提供的数据凭经验确定。
本文所用的术语“样本”指含有一种或多种感兴趣组分的材料或材料混合物，通常(但不一定)是流体形式，即水性形式。样本可以来自多种来源，例如来自生物样本或固体，例如从个体分离的组织或液体，包括但不限于，例如血浆、血清、脊髓液、精液、淋巴液、皮肤表面部分、呼吸道、肠道和泌尿生殖道、眼泪、唾液、乳汁、血细胞、肿瘤、器官，以及体外细胞培养成分的样本(包括但不限于细胞培养基中细胞生长产生的条件培养基、推定的病毒感染细胞、重组细胞和细胞组分)。样本中的组分在本文中称为“分析物”。在许多实施例中，样本是包含至少约102、5xl02、103、5xl03、104、5xl04、105、5xl05、106、5xl06、107、5xl07、108、109、1010、1011、1012或更多种分析物的复合样本。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，例如完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双体；线性抗体(Zapata et al.，ProteinEng.8(10)：1057-1062(1995))；单链抗体分子；纳米抗体，以及由抗体片段形成的多特异性和多功能抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段具有一个抗原结合位点和一个残留“Fc”片段，这个名称反映了易结晶能力。胃蛋白酶处理产生F(ab′)2片段，其具有两个抗原结合位点，且仍然能够交联抗原。
本文中可互换使用的术语“多肽”和“蛋白质”是指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括编码和非编码氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸，以及具有修饰肽骨架的多肽。术语“融合蛋白”或其语法等同物是指由多个多肽组分组成的蛋白质，这些多肽组分虽然通常在其天然状态下未连接，但通常通过键(例如肽键)由它们各自的氨基和羧基末端连接，从而形成单一的连续多肽。融合蛋白可以是两种、三种、甚至四种或更多种不同蛋白的组合。术语多肽包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有或不具有N-末端蛋氨酸残基的异源和同源前导序列的融合蛋白；免疫标记蛋白；具有可检测融合伴侣的融合蛋白，例如包括作为融合伴侣的荧光蛋白、P-半乳糖苷酶、萤光素酶的融合蛋白等等；诸如此类。此外，术语“蛋白质”还可以包括翻译后修饰，包括但不限于糖基化、磷酸化、甲基化和乙酰化。
通常，多肽可以是任何长度，例如大于2个氨基酸、大于4个氨基酸、大于约10个氨基酸、大于约20个氨基酸、大于约50个氨基酸、大于约100个氨基酸酸，大于约300个氨基酸，通常高达约500或1000或更多氨基酸。“肽”通常大于2个氨基酸、大于4个氨基酸、大于约10个氨基酸、大于约20个氨基酸，通常最多约50个氨基酸。在某些实施例中，肽的长度在5到30个氨基酸之间。
术语“特异性结合”是指药剂优先结合存在于不同分析物的均匀混合物中的特定靶标(例如，PSL2)的能力。在某些情况下，特异性结合相互作用将区分样本中的期望和不期望的分析物，通常超过约10至100倍或更多(例如，超过约1000倍)。特异性结合可以包括杂交、多肽-核酸相互作用或小分子-核酸相互作用。
“寡核苷酸”是指具有约2至约200个连续亚基的核糖和/或脱氧核糖核苷亚基聚合物。核苷亚基可以通过多种亚基间键连接，包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、膦酸烷基酯，例如甲基膦酸酯、P3′→N5′氨基磷酸酯、N3′→P5′氨基磷酸酯、N3′→P5′硫代氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯和硫代磷酸酯键。
在特定情况下，亚基间键具有手性原子。代表性的手性亚基间键包括但不限于膦酸烷基酯、二氨基磷酸酯和硫代磷酸酯。此外，“寡核苷酸”包括化学和生化修饰，如本领域技术人员所知的修饰，例如糖(例如，2′取代)、碱基(请参见下文“核苷”的定义)和/或3′和5′末端的修饰。在包含多个亚基间键的寡核苷酸部分的实施例中，每个键可以使用相同的化学物质形成，也可以使用键基化学物质的混合物形成。在包含多个亚基间键的寡核苷酸部分的实施例中，一种或多种键可以是手性的。具有手性原子的键可以制备为外消旋混合物，或制备为单独的对映异构体。术语“寡核苷酸”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸片段”、“核酸序列或片段”或“多核苷酸”可互换使用，也可以与基因、cDNA、DNA和由基因编码的RNA互换使用。
“双环核酸”或“桥接核酸”(BNA)是指修饰的RNA核苷酸，其中核糖部分被连接2′氧和4′碳的额外桥修饰，从而形成双环系统。BNA单体可以包含具有固定3′-内构象的五元、六元或七元桥结构。桥接核酸包括但不限于锁核酸(LNA)、亚乙基桥接核酸(ENA)和约束乙基(cEt)。“桥”是指连接两个桥头的原子链或价键，其中“桥头”是与三个或更多骨架原子(不包括氢)键合的环系统(例如核糖环系统)的任何骨架原子。在某些实施例中，BNA中的桥具有7-12个环成员和1-4个从氮、氧或硫中独立选择的杂原子。除非另有说明，BNA可选择性地被一个或多个取代基取代，例如，包括但不限于烷基、取代烷基、烷氧基、取代烷氧基、羟基、氨基和卤素。
“锁核酸”(LNA)是一种修饰的RNA核苷酸，其中核糖部分被连接2′氧和4′碳的额外桥修饰，从而形成双环系统。桥将核糖“锁”在3′-内构象中，这通常存在于A型双链体中。锁核酸也包括在术语“双环核酸”或“桥接核酸”(BNA)中。LNA核苷酸可以随时与任何方便的核苷酸或核苷酸类似物混合，例如寡核苷酸中的DNA或RNA残基。根据Watson-Crick碱基配对规则，LNA与DNA或RNA杂交。这种低聚物可以化学合成。通常，锁定的核糖构象增强了碱基堆积和骨架预组织，从而提高了寡核苷酸的杂交特性(解链温度)。在某些情况下，锁核酸可以是α-1-锁核酸(a-1-LNA)，一种在C2′、C3′和C4′位置具有反向立体化学的锁核酸(LNA)立体异构体类似物。
“亚乙基桥接核酸”(ENA)是指LNA修饰的RNA核苷酸，其中核糖部分被在2′氧和4′碳之间含有两个碳原子的额外桥修饰(例如，请参见Morita et al.，BioorganicMedicinal Chemistry，2003，11(10)，2211-2226)。亚乙基桥接核酸也包括在术语“双环核酸”或“桥接核酸”(BNA)中。
“约束乙基(cEt)”是指LNA修饰的RNA核苷酸，其中核糖部分被连接2′氧和4′碳的额外桥修饰，其中桥的碳原子包括甲基。在某些情况下，cEt是(S)约束乙基。在其他情况下，cEt是(R)约束乙基(例如，请参见Pallan et al.，Chem.Commun.(Camb).，2012，48(66)，8195-8197)。约束乙基核酸也包括在术语“双环核酸”或“桥接核酸”(BNA)中。
本文所用的术语“2′-修饰”或“2′-取代”是指在2′-位包含除H或OH之外的取代基的糖。2′-修饰的核苷酸包括具有2′取代基的部分，所述取代基选自烷基、烯丙基、氨基、叠氮基、氟代、硫代、O-烷基，例如O-甲基、O-烯丙基、OCF3、O-(CH2)2-O-CH3(例如，2′-O-甲氧基乙基(MOE))、O-(CH2)2SCH3，)-(CH2)2-ONR2和O-CH2C(O)-NR2，其中每个R独立地选自H、烷基和取代烷基。
本公开包括分离的或基本纯化的核酸、核酸分子和含有这些分子的组合物。在本公开的上下文中，“分离的”或“纯化的”DNA分子或RNA分子是指脱离其原生环境而存在的DNA分子或RNA分子，因此不是自然产物。分离的DNA分子或RNA分子可以以纯化形式存在，或可以存在于非原生环境中，例如转基因宿主细胞。例如，“分离的”或“纯化的”核酸分子或其生物活性部分，在通过重组技术生产时基本上不含其他细胞物质或培养基，或在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。在一个实施例中，“分离的”核酸不含该核酸来源的生物体基因组DNA中天然位于该核酸侧翼的序列(即，位于核酸5′和3′末端的序列)。例如，在各种实施例中，分离的核酸分子可以含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，所述核苷酸序列天然位于核酸所源自细胞的基因组DNA中核酸分子的侧翼。
本公开还包括所公开的核苷酸序列的片段和变体。“片段”或“部分”是指核苷酸序列的全长或小于全长。本公开的siRNA可以通过本领域已知的任何方法产生，例如，通过体外转录、重组或通过合成方式。在一个实例中，siRNA可以通过使用重组酶(例如T7 RNA聚合酶)和DNA寡核苷酸模板在体外生成。
“小干扰”或“短干扰RNA”或siRNA是靶向感兴趣基因的核苷酸的RNA双链体。“RNA双链体”是指由RNA分子的两个区域之间的互补配对形成的结构。siRNA“靶向”于某个基因，因为siRNA的双链体部分的核苷酸序列与靶向基因的核苷酸序列互补。在某些实施例中，siRNA双链体的长度小于30个核苷酸。在某些实施例中，双链体的长度可以是29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个核苷酸。在某些实施例中，双链体的长度为19-25个核苷酸。siRNA的RNA双链体部分可以是发夹结构的一部分。除了双链体部分，发夹结构可以包含位于形成双链体的两个序列之间的环部分。循环的长度可以不同。在某些实施例中，环的长度为5、6、7、8、9、10、11、12或13个核苷酸。发夹结构还可以包含3′或5′突出端部分。在某些实施例中，突出端是长度为0、1、2、3、4或5个核苷酸的3′或5′突出端。
术语“脂质”在本文中广泛使用，涵盖可溶于有机溶剂但微溶于水(如果有)的物质。术语脂质包括但不限于烃、油、脂肪(例如脂肪酸、甘油酯)、甾醇类、类固醇以及这些化合物的衍生物形式。首选脂质是脂肪酸及其衍生物、烃及其衍生物和甾醇类，例如胆固醇。本文所用的术语脂质还包括含有脂质和亲水性部分的两性化合物。脂肪酸通常在直链中含有偶数个碳原子(通常为12-24个碳)，可以是饱和的或不饱和的，并且可以含有或被修饰以包含各种取代基。为简单起见，术语“脂肪酸”还包括脂肪酸衍生物，例如通过共轭反应产生的脂肪酰胺，例如，具有修饰的寡核苷酸末端。
其他术语的定义可能会出现在整个说明书中。
详细说明
在描述各种实施例之前，应理解本公开的教导不限于所描述的特定实施例，并且因此当然可以变化。还应理解，本文使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不旨在限制，因为本教导的范围将仅由所附权利要求来限定。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，不应被解释为以任何方式限制所描述的可专利主题。尽管结合各种实施例描述了本教导，但本教导并不旨在局限于这些实施例。相反，本教导包括本领域技术人员将理解的各种替代、修饰和等同物。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管类似或等同于本文所述的任何方法和材料也可用于本教导的实践或测试，但现在描述了一些示例性方法和材料。
对任何出版物的引用是针对其在申请日之前的公开内容，不应被解释为承认本权利要求无权因在先发明而早于此类出版物。此外，所提供的公开日期可能不同于可以独立确认的实际公开日期。
如本领域技术人员在阅读本公开后将会明白的，本文描述和说明的每个单独的实施例具有分立的组分和特征，这些组分和特征可以容易地与任何其他几个实施例的特征分离或组合，而不背离本教导的范围或精神。任何列举的方法都可以按照所列举事件的顺序或逻辑上可能的任何其他顺序来执行。
本文提及的所有专利和出版物，包括在此类专利和出版物中公开的所有序列，均通过引用明确并入本文。
调节宿主微RNA的方法
宿主微RNA可以调节多种生理过程。在某些情况下，宿主微RNA可以调节甲型、乙型流感病毒、冠状病毒(包括SARS、SARS-Cov-2、MERS和其他呼吸道病毒)的适应性。在某些情况下，miRNA是微RNA 191(miR191)。
在某些情况下，miRNA可以是但不限于以下之一：miR-602；miR-6759；miR-6769；miR-4802；miR-942；miR-4462；miR-4696；miR-376c；miR-4433；miR-663；miR-10396；miR-4749；miR-6787；miR-4706；miR-3675；miR-6810；miR-6812；miR-663a、miR-381、miR-744、miR-4508、miR-4730、miR-6777、miR-10396、miR-4749、miR-6787、miR-4706、miR-3675、miR-6810、miR-3675、miR-6812、miR-6796。在某些情况下，miRNA可以直接与病毒粒子或受感染细胞中的甲型流感病毒RNA结合。在某些情况下，miRNA可以直接与病毒粒子或受感染细胞中的乙型流感病毒RNA结合。在某些情况下，miRNA可以直接与冠状病毒RNA结合，包括SARS-Cov；SARS-Cov2；病毒粒子或受感染细胞中的MERS。在某些情况下，miRNA可以直接与病毒粒子或受感染细胞中的呼吸道合胞病毒(RSV)RNA结合。在某些情况下，miRNA可以调节宿主细胞的过程，以其他方式调节病毒粒子或受感染细胞中甲型流感病毒RNA的水平。在某些情况下，miRNA可以调节宿主细胞的过程，以其他方式调节病毒粒子或受感染细胞中甲型流感病毒RNA的水平。在某些情况下，miRNA可以调节宿主细胞的过程，以其他方式调节病毒粒子或受感染细胞中乙型流感病毒RNA的水平。在某些情况下，miRNA可以调节宿主细胞的过程，以其他方式调节病毒粒子或受感染细胞中冠状病毒RNA的水平，包括SARS-Cov；SARS-Cov2；MERS病毒RNA。在某些情况下，miRNA可以调节宿主细胞的过程，以其他方式调节病毒粒子或受感染细胞中呼吸道合胞病毒(RSV)RNA的水平。在某些情况下，保守RNA二级结构包括miR191结合位点的存在。在某些情况下，本发明的药剂或组合物被设计为隔离用CoV转染的细胞中的miR191。
抑制甲型流感病毒的方法
如上所述，本公开的方面提供了泛基因型组合物，其设计用于破坏基因组节段PB2的5′包装信号区内的IAV的RNA结构元件，称为包装茎环2(PSL2)。所谓“泛基因型”是指在PSL2结构元素保守的多种不同类型的IAV中，组合物都有效。在某些情况下，所述组合物可以称为广谱。本文所用的术语“广谱”是指对两种或更多种不同病毒具有活性的单个部分的抗病毒活性，例如三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、八种或更多种，十种或更多种不同病毒。两种或更多种不同病毒可以选自不同的病毒亚组(例如甲型流感病毒1组或甲型流感病毒2组)，或者可以选自同一组(例如，两种或更多种H1、H2、H5、H6、H8和H9型甲型流感1组病毒，或者两种或更多种H3、H4、H7和H10型甲型流感2组病毒)。
PSL2结构的破坏会显著抑制IAV。PSL2在所有测试的甲型流感亚型中都是保守的。图1，panel a，显示了可以在所述方法中靶向的PSL2结构的示例。图4说明了包含PSL2结构的感兴趣核苷酸序列的保守性。在某些情况下，所述组合物具有针对IA V的广谱活性，例如针对选自H1N1、H3N2和H5N的2种或更多种IAV的活性。
本公开的方面包括用于抑制样本中的甲型流感病毒(IAV)的方法。在某些实施例中，所述方法包括使包含具有PSL2基序的病毒RNA(vRNA)样本与有效量的药剂接触，所述有效量的药剂特异性结合PSL2基序以抑制所述甲型流感病毒。在某些情况下，样本存在于体外。在特定情况下，样本存在于体内。样本中的vRNA可以包含在病毒粒子中。在某些情况下，vRNA包含在细胞中，例如被病毒粒子感染的细胞。
本公开的方面包括用于抑制细胞中的甲型流感病毒(IAV)的方法。在某些实施例中，所述方法包括使包含具有PSL2基序的病毒RNA(vRNA)的细胞与有效量的药剂接触，所述有效量的药剂特异性结合PSL2基序以抑制所述甲型流感病毒。在某些情况下，细胞存在于体外。在特定情况下，细胞存在于体内。
在某些实施例中，样本(例如，细胞)中的vRNA包含PB2 vRNA。本文所用的所谓“PB2vRNA”是指病毒RNA(例如IAV RNA)，其包括称为包装茎环2(PSL2)的保守RNA结构元件。所述药剂可以与PSL2基序的特定位点结合，以破坏vRNA的整体结构，从而抑制病毒(例如，请参见图14)。在某些情况下，所述药剂会抑制vRNA的包装能力，从而抑制病毒。例如，图1说明了野生型PB2和包装突变vRNA的RNA二级结构。
在某些实施例中，使样本(例如，细胞)与药剂接触导致病毒的1log10或更多滴度缺陷，例如病毒的1.5或更多、2或更多、2.5或更多、3或更多、3.5或更多、4或更多、5或更多、6或更多、7或更多、8或更多、9或更多、10log10或甚至更多滴度缺陷。
在某些实施例中，使样本(例如，细胞)与药剂接触导致病毒的2log10或更多滴度缺陷，例如病毒的2.5或更多、3或更多、3.5或更多、4或更多、5或更多、6或更多、7或更多、8或更多、9或更多、10log10或甚至更多滴度缺陷。
在某些实施例中，所述药剂是包含与vRNA的PSL2基序互补序列的寡核苷酸化合物(例如，如本文所述)或其盐。
在所述方法的某些实例中，寡核苷酸化合物(例如，上述序列之一)与PB2 vRNA区域的结合(例如，通过杂交)破坏了PB2 vRNA的整体二级RNA结构。在某些情况下，寡核苷酸化合物的结合会抑制PB2 vRNA的包装能力，从而抑制病毒。在某些情况下，所述化合物靶向PB2 vRNA的5′末端编码区(-)-有义符号中的核苷酸34-87所定义区域的至少一部分。在某些情况下，所述化合物靶向PB2 vRNA的5′末端编码区(-)-有义符号中的核苷酸1-14所定义区域的至少一部分。在所述方法的一些实例中，所述方法还包括将RNase募集到PSL2以降解vRNA。
本公开的方面包括治疗或预防受试者的甲型流感病毒感染的方法。在某些实施例中，所述方法包括向有需要的受试者给予包含有效量活性剂的药物组合物，所述活性剂结合病毒RNA(vRNA)的PSL2基序(例如，如本文所述)。因此，在某些情况下，受试者是感染了病毒的人。在特定情况下，受试者是有感染风险或疑似感染病毒的人。在某些实施例中，vRNA是PB2 vRNA。
可以采用任何方便的方案将药剂施用于受试者。所采用的具体方案可能会有所不同，例如，取决于给药部位，以及所使用的药剂是否为寡核苷酸、抗体、蛋白质、多肽或小分子。对于体内方案，可以采用任何方便的给药方案。根据药剂的特性和结合亲和力、所需的反应、给药方式(例如局部或全身、眼内、眼周、眼球后、肌内、静脉内、腹膜内、皮下、结膜下、鼻内、外用、滴眼液、i.v.、s.c.、i.p.、口服等，依次类推)、半衰期、细胞数量或移植床或移植组织的大小，可以采用各种方案。在某些情况下，所述药剂经鼻给药。在某些情况下，所述药剂以气雾剂的形式给药。在特定情况下，所述药剂通过喷雾器给药。在特定情况下，所述药剂通过呼吸辅助装置辅助给药，包括但不限于无创正压通气或机械通气。在特定情况下，所述药剂经静脉给药。在其他特定情况下，所述药剂经皮下给药。在特定情况下，所述药剂通过肌肉注射给药。
还提供了包含本发明药剂的药物组合物。所述组合物中可以使用任何方便的赋形剂、载体等。可用于所述组合物在药学上可接受的载体可以包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例有丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯(例如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外溶媒包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发油。静脉内溶媒包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格葡萄糖的补充剂)等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。所述药剂组合物也可以冻干，用于随后的重构和使用。所述组合物还可以包括本文所述的载体。可以使用的载体的实例包括但不限于明矾、微粒、脂质体和纳米颗粒。本发明组合物中可以包含任何方便的添加剂，以增强本发明活性剂的递送。感兴趣的添加剂包括细胞摄取增强剂、载体蛋白、脂质、树状大分子载体、碳水化合物等。
在某些情况下，所述药物组合物还包含一种或多种其他活性剂。感兴趣的活性剂包括本公开所述的其他寡核苷酸化合物和任何方便的感兴趣抗病毒化合物或药剂，包括但不限于金刚烷胺、金刚乙胺、扎那米韦、奥司他韦、帕拉米韦等。
抑制乙型流感病毒的方法
本公开的方面包括设计用于破坏IBV的RNA结构元件的泛基因型组合物，所述RNA结构元件可以包括基因组节段HA的区域。
本公开的方面包括用于抑制样本中的乙型流感病毒(IBV)的方法。在某些实施例中，所述方法包括使包含具有IBV RNA基序的病毒RNA(vRNA)样本与有效量的药剂接触，所述有效量的药剂特异性结合IBV HA基序以抑制所述乙型流感病毒。在某些情况下，样本存在于体外。在特定情况下，样本存在于体内。样本中的vRNA可以包含在病毒粒子中。在某些情况下，vRNA包含在细胞中，例如被病毒粒子感染的细胞。
本公开的方面包括用于抑制细胞中的乙型流感病毒(IBV)的方法。在某些实施例中，所述方法包括使包含具有IBV RNA基序的病毒RNA(vRNA)的细胞与有效量的药剂接触，所述有效量的药剂特异性结合IBV RNA基序以抑制所述乙型流感病毒。在某些情况下，细胞存在于体外。在特定情况下，细胞存在于体内。
在某些实施例中，使样本(例如，细胞)与药剂接触导致病毒的1log10或更多滴度缺陷，例如病毒的1.5或更多、2或更多、2.5或更多、3或更多、3.5或更多、4或更多、5或更多、6或更多、7或更多、8或更多、9或更多、10log10或甚至更多滴度缺陷。
在某些实施例中，使样本(例如，细胞)与药剂接触导致病毒的2log10或更多滴度缺陷，例如病毒的2.5或更多、3或更多、3.5或更多、4或更多、5或更多、6或更多、7或更多、8或更多、9或更多、10log10或甚至更多滴度缺陷。在某些实施例中，所述药剂是包含与vRNA的IBV RNA基序互补序列的寡核苷酸化合物(例如，如本文所述)或其盐。
在所述方法的某些实例中，寡核苷酸化合物(例如，上述序列之一)与IBV vRNA区域的结合(例如，通过杂交)破坏了IBV vRNA的整体二级RNA结构。在某些情况下，寡核苷酸化合物的结合会抑制HA vRNA的包装能力，从而抑制病毒。在所述方法的一些实例中，所述方法还包括将RNase募集到IBV vRNA以降解vRNA。
本公开的方面包括治疗或预防受试者的乙甲型流感病毒感染的方法。在某些实施例中，所述方法包括向有需要的受试者给予包含有效量活性剂的药物组合物，所述活性剂结合病毒RNA的IBV HA RNA基序。因此，在某些情况下，受试者是感染了病毒的人。在特定情况下，受试者是有感染风险或疑似感染病毒的人。
可以采用任何方便的方案将药剂施用于受试者。所采用的具体方案可能会有所不同，例如，取决于给药部位，以及所使用的药剂是否为寡核苷酸、抗体、蛋白质、多肽或小分子。对于体内方案，可以采用任何方便的给药方案。根据药剂的特性和结合亲和力、所需的反应、给药方式(例如局部或全身、眼内、眼周、眼球后、肌内、静脉内、腹膜内、皮下、结膜下、鼻内、外用、滴眼液、i.v.、s.c.、i.p.、口服等，依次类推)、半衰期、细胞数量或移植床或移植组织的大小，可以采用各种方案。在某些情况下，所述药剂经鼻给药。在某些情况下，所述药剂以气雾剂的形式给药。在特定情况下，所述药剂通过喷雾器给药。在特定情况下，所述药剂通过呼吸辅助装置辅助给药，包括但不限于无创正压通气或机械通气。
在特定情况下，所述药剂经静脉给药。在其他特定情况下，所述药剂经皮下给药。在特定情况下，所述药剂通过肌肉注射给药。
还提供了包含本发明药剂的药物组合物。所述组合物中可以使用任何方便的赋形剂、载体等。可用于所述组合物在药学上可接受的载体可以包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例有丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯(例如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外溶媒包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发油。静脉内溶媒包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格葡萄糖的补充剂)等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。所述药剂组合物也可以冻干，用于随后的重构和使用。所述组合物还可以包括本文所述的载体。可以使用的载体的实例包括但不限于明矾、微粒、脂质体和纳米颗粒。本发明组合物中可以包含任何方便的添加剂，以增强本发明活性剂的递送。感兴趣的添加剂包括细胞摄取增强剂、载体蛋白、脂质、树状大分子载体、碳水化合物等。
在某些情况下，所述药物组合物还包含一种或多种其他活性剂。感兴趣的活性剂包括本公开所述的其他寡核苷酸化合物和任何方便的感兴趣抗病毒化合物或药剂，包括但不限于金刚烷胺、金刚乙胺、扎那米韦、奥司他韦、帕拉米韦等。
抑制呼吸道合胞病毒(RSV)的方法
如上所述，本公开的方面包括设计用于破坏RSV的RNA二级结构的药剂和组合物。破坏RSV的RNA二级结构可以抑制RSV病毒。
抑制冠状病毒(CoV)的方法
如上所述，本公开的方面包括设计用于破坏冠状病毒(CoV)的RNA二级结构的药剂和组合物。
破坏CoV的RNA二级结构可以抑制CoV病毒。所述药剂和组合物对多种不同类型的冠状病毒(CoV)有效，其中RNA二级结构在病毒生命周期中很重要。在某些情况下，所述组合物可以称为广谱。本文所用的术语“广谱”是指对两种或更多种不同病毒具有活性的单个部分的抗病毒活性，例如三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、八种或更多种，十种或更多种不同病毒。两种或更多种不同病毒可以选自不同的病毒亚组(例如，人类冠状病毒229E(HCoV-229E)、人类冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、SARS-CoV(严重急性呼吸综合征(SARS)的病原体)、人类冠状病毒NL63(HCoV-NL63，纽黑文冠状病毒)、人类冠状病毒HKU1、MERS-CoV(“中东呼吸综合征冠状病毒”或MERS)、以及严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)或COVID-19(2019年冠状病毒病))。
破坏CoV的RNA二级结构可以显著抑制CoV。图1G显示了可在所述方法中靶向的跨B型冠状病毒中保守的预测RNA二级结构的示例。在某些情况下，所述组合物具有抗冠状病毒的广谱活性，例如抗选自HCoV-299E、HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-NL63、HKU1、MERS-CoV和SARS-CoV-2或COVID-19的一种或多种CoV的活性。在某些情况下，靶标CoV是SARS-CoV-2或COVID-19。在某些情况下，靶标CoV是SARS-CoV。在某些情况下，靶标CoV是MERS-CoV。在某些情况下，所述组合物破坏了靶标CoV保守的RNA二级结构，而不诱导半胱天冬酶或干扰素。
本公开的方面包括用于抑制样本中的冠状病毒(CoV)的方法。在某些实施例中，所述方法包括使包含具有CoV保守RNA二级结构的病毒RNA(vRNA)样本与有效量的药剂接触，所述有效量的药剂特异性结合二级结构以抑制CoV。在某些实施例中，所述方法包括使包含具有CoV保守RNA二级结构的病毒RNA(vRNA)样本与有效量的药剂接触，所述有效量的药剂抑制宿主微RNA(miRNA)与CoV的相互作用。在某些情况下，miRNA是微RNA 191(miR191)。在某些情况下，miRNA可以是以下之一：miR663a、miR-381、miR-744、miR-4508、miR-4730、miR-6777、miR-10396、miR-4749、miR-6787、miR-4706、miR-3675、miR-6810、miR-3675、miR-6812、miR-6796。在某些情况下，保守RNA二级结构包括微RNA结合位点的存在。在某些情况下，微RNA是miR-191。在某些情况下，微RNA可以是上面列出的在病毒RNA中具有预测结合位点的任何微RNA。在某些情况下，本发明的药剂或组合物被设计为隔离用CoV转染的细胞中的miR191。在某些情况下，所述细胞被转染了与荧光素酶报告相关的CoV 5′末端RNA片段。在某些情况下，CoV是SARS-CoV-2或COVID-19。
在某些情况下，样本存在于体外。在特定情况下，样本存在于体内。样本中的vRNA可以包含在病毒粒子中。在某些情况下，vRNA包含在细胞中，例如被病毒感染的细胞。
本公开的方面包括用于抑制细胞中的冠状病毒(CoV)的方法。本公开的方面包括用于抑制人类冠状病毒(CoV)的方法。在某些实施例中，所述方法包括使包含具有CoV保守RNA二级结构的病毒RNA(vRNA)的细胞与有效量的药剂接触，所述有效量的药剂特异性结合二级结构以抑制CoV。在某些情况下，细胞存在于体外。在特定情况下，细胞存在于体内。在某些实施例中，所述药剂(例如，如本文所述)可以结合保守RNA二级结构基序的特定位点，以破坏vRNA的整体结构，从而抑制病毒。在某些情况下，所述药剂会抑制vRNA的包装能力，从而抑制病毒。
药剂
在所述的方法和组合物中，任何方便的药剂都可以用作感兴趣的靶标(例如，PSL2)的药剂。感兴趣的药剂包括但不限于PSL-2的配体、PSL2结合抗体、PSL2的支架蛋白结合剂、寡核苷酸、小分子和肽；或其片段、变体或衍生物；或任何前述的组合。
可用作与本公开相关的药剂的抗体可包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、Fab抗体片段、F(ab)2抗体片段、Fv抗体片段(例如，VH或VL)、单链Fv抗体片段和dsFv抗体片段。此外，抗体分子可以是完全人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。可与本公开结合使用的抗体可包括与任何免疫球蛋白恒定区连接的任何成熟或未加工的抗体可变区。本公开涵盖抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列的微小变化，条件是氨基酸序列中的变化保持所述序列的75％或更多，例如80％或更多、90％或更多、95％或更多，或99％或更多。特别地，保守的氨基酸替换是预期的。保守替换是发生在侧链相关的氨基酸家族中的替换。
通过测定多肽衍生物的比活性，可以确定所述氨基酸的变化是否会产生功能性肽。在某些实施例中，所述药剂是抗体片段(例如，如本文所述)。
在某些实施例中，所述药剂是支架多肽结合剂。支架是指产生多肽药剂的基础肽框架(例如，共有序列或结构基序)。所述基础支架序列包括固定残基和变体残基，它们可以赋予所得多肽药剂不同的功能，例如与靶受体的特异性结合。此类结构基序可以作为特定二级和三级结构元件的组合，或者作为氨基酸残基的可比较一级序列进行表征和结构比较。任何方便的支架和支架多肽都可以用作所述方法中的药剂。在某些实施例中，可以利用重组筛选方法(例如噬菌体展示筛选)来鉴定此类药剂。感兴趣的支架多肽结合物包括但不限于合成小蛋白和重组小蛋白，例如Affibodies。
在某些情况下，所述药剂是结合PSL2的小分子。感兴趣的小分子包括但不限于分子量(MW)大于50且小于约2,500道尔顿(Da)的有机或无机小分子化合物，例如大于50且小于约1000Da，或大于50且小于约500Da。“小分子”涵盖许多生物和化学类别，包括合成、半合成或天然存在的无机或有机分子，也包括合成、重组或天然存在的多肽和核酸。感兴趣的小分子可以包含与蛋白质结构相互作用所必需的官能团，特别是氢键，并且可以包括至少一个胺、羰基、羟基或羧基，并且可以包含至少两个官能化学基团。小分子可以包含被一个或多个上述官能团取代的环状碳或杂环结构和/或芳族或多芳族结构。小分子也存在于生物分子中，包括肽、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或它们的组合。
寡核苷酸化合物
在某些实施例中，药剂是寡核苷酸或其衍生物，或其盐(例如，药学上可接受的盐)。在某些实例中，寡核苷酸与靶基序的特定节段互补(例如，如本文所述)。在所述方法中找到用途的互补寡核苷酸在某些情况下将是至少5个，例如至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、约12个、至少13个、至少14个、至少15个、或甚至更多。
在某些情况下，互补寡核苷酸的长度为75个核苷酸或更小，例如长度为50个核苷酸或更小、长度为45个核苷酸或更小、长度为40个核苷酸或更小、或长度为35个核苷酸或更小，其中长度为受抑制效率、特异性(包括不存在交叉反应性)等支配。在某些情况下，互补寡核苷酸的长度为30个核苷酸或更小，例如长度为25个核苷酸或更小、长度为20个核苷酸或更小、或长度为15个核苷酸或更小，其中长度为受抑制效率、特异性(包括不存在交叉反应性)等支配。本公开提供了短寡核苷酸，例如长度为7、8至15或15至16个核苷酸，所述短寡核苷酸可以是靶标功能的强选择性抑制剂。
在某些实施例中，所述药剂是一种寡核苷酸化合物或其盐，包含与vRNA的靶基序互补的至少5个核苷亚基(例如，至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、或至少20个)。在特定情况下，寡核苷酸的键是修饰的磷酸基团，例如，磷酸的一个或多个氧被不同的取代基取代。不受任何特定理论的束缚，这种修饰可以增加寡核苷酸对核酸裂解的抗性。修饰的磷酸酯基团的实例包括但不限于硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸、硼烷磷酸酯、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。在某些情况下，寡核苷酸的键是修饰的磷酸基团，其中键中的一个或多个非桥接膦酸酯氧原子已被选自S、Se、BRa3、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、H、NRa2或ORb的基团取代，其中Ra是H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基，Rb是H、烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基。在特定情况下，寡核苷酸与磷原子的一个或多个键是手性的，例如，立体异构源中心。立体异构磷原子可以具有“R”构型(本文称为Rp)或“S”构型(本文称为Sp)。在特定实施例中，寡核苷酸的键包括一个或多个立体异构磷原子，具有至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90、95％或更多的Sp构型的对映体过量。在其他特定情况下，寡核苷酸的键包括一个或多个立体异构磷原子，具有至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90、95％或更多的Rp构型的对映体过量。
在特定实施例中，寡核苷酸的一个或多个键选自甲基膦酸酯、P3′→N5′氨基磷酸酯、N3′→P5′氨基磷酸酯、N3′→P5′硫代氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯和硫代磷酸酯键。
在特定情况下，寡核苷酸的一个或多个键是硫代磷酸酯键。在特定情况下，一个或多个硫代磷酸酯键中的磷原子是手性的。在某些情况下，一个或多个硫代磷酸酯键中的手性磷原子具有Rp构型。在某些情况下，一个或多个硫代磷酸酯键中的手性磷原子具有Sp构型。在特定实施例中，寡核苷酸的键包括一个或多个硫代磷酸酯键，具有至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90、95％或更多的Sp构型的对映体过量。在其他特定实施例中，寡核苷酸的键包括一个或多个硫代磷酸酯，具有至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90、95％或更多的Rp构型的对映体过量。
在特定实例中，寡核苷酸序列是桥接核酸(例如，如本文所述)。在特定实例中，寡核苷酸序列包括一个或多个桥接核酸核苷酸，例如2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多，或甚至更多。
在特定实例中，寡核苷酸序列是锁核酸。在特定实例中，寡核苷酸序列包括一个或多个锁核酸核苷酸，例如2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多，或甚至更多。
在特定实例中，寡核苷酸序列是亚乙基桥接核酸(ENA).在特定实例中，寡核苷酸序列包括一个或多个ENA核苷酸，例如2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多，或甚至更多。
在特定实例中，寡核苷酸序列是约束乙基(cEt)核酸。在特定实例中，寡核苷酸序列包括一个或多个cEt核苷酸，例如2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多，或甚至更多。在特定实例中，寡核苷酸序列包括一个或多个(S)-约束乙基核酸，例如2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多，或甚至更多。在特定实例中，寡核苷酸序列包括一个或多个(R)-约束乙基核酸，例如2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多，或甚至更多。在特定实例中，寡核苷酸序列包括一个或多个核糖修饰。在某些情况下，寡核苷酸序列包括一个或多个2′-修饰的核糖(在本文中也称为2′-修饰的核苷酸)。
在特定实例中，寡核苷酸序列包括一个或多个2′-修饰的核苷酸，例如2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多，或甚至更多。2′-修饰的核苷酸包括但不限于具有2′取代基的部分，所述取代基选自烷基、烯丙基、氨基、叠氮基、氟代、硫代、O-烷基，例如O-甲基、O-烯丙基、OCF3、O-(CH2)2-O-CH3(例如，2′-O-甲氧基乙基(MOE))、O-(CH2)2SCH3，)-(CH2)2-ONR2和O-CH2C(O)-NR2，其中每个R独立地选自H、烷基和取代烷基。在特定实例中，寡核苷酸序列包括一个或多个2′-O-甲氧基乙基(MOE)修饰，例如2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多，或甚至更多。
在某些实施例中，所述药剂是包含至少5个脱氧核糖核苷酸单位的寡核苷酸(例如，与靶基序互补的单位，例如PSL2基序)(例如，至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、至少20个)，并且能够募集RNase。在某些情况下，寡核苷酸会招募RNase来催化靶vRNA降解为更小的组分。用于招募RNase的任何方便方法和部分都可以并入所述药剂中(例如，寡核苷酸)。在某些实例中，寡核苷酸药剂还包括招募感兴趣的RNase的序列。应当理解，除非另有说明，否则本文所述的寡核苷酸序列意在包括DNA序列、RNA序列(例如，其中U可以任选地替代T)、混合RNA/DNA序列及其类似物，包括序列中的一个或多个核苷酸是修饰的核苷酸的类似物，例如BNA类似物、LNA类似物、ENA类似物、cEt类似物、2′-修饰的类似物、和/或其中一个或多个核苷间键被取代的类似物，例如用非天然存在的键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯或硫代氨基磷酸酯键)取代。应当理解，在寡核苷酸的一个或多个键包括手性磷原子的实施例中，例如，立体异构源中心，立体异构磷原子可以具有“R”构型(本文称为Rp)或“S”构型(本文称为Sp)。
在某些实施例中，活性剂是包含寡核苷酸序列的化合物，所述寡核苷酸序列包含与PB2 vRNA区域互补的至少8个核苷亚基。在某些实施例中，活性剂是包含寡核苷酸序列的化合物，所述寡核苷酸序列包含与PB2 vRNA区域互补的至少8个和20个或更少(例如，15个或更少)核苷亚基。
选择内源链PSL2序列的一个或多个特定区域由寡核苷酸药剂补充。寡核苷酸的特定序列的选择可以使用经验方法，所述方法是在结构分析的基础上(例如，如本文所述)，在体外或动物模型中测定几个候选序列对靶IAV的抑制作用。
也可以使用寡核苷酸和序列的组合，所述组合是选择靶PSL2的几个区域进行反义互补。
在某些实施例中，寡核苷酸包含选自以下的序列：
5’ACCAAAAGAAT 3’(SEQ ID NO：45)；
5’TGGCCATCAAT 3’(SEQ ID NO：46)；
5’TAGCATACTTA 3’(SEQ ID NO：47)；
5’CCAAAAGA 3’(SEQ ID NO：48)；
5’CATACTTA 3’(SEQ ID NO：49)；
5’CAGACACGACCAAAA 3’(SEQ ID NO：50)；
5’TACTTACTGACAGCC 3’(SEQ ID NO：51)；
5’AGACACGACCAAAAG 3’(SEQ ID NO：52)；
5’ACCAAAAGAAT 3’(SEQ ID NO：53)；
5’TGGCCATCAAT 3’(SEQ ID NO：54)；
5’TAGCATACTTA 3’(SEQ ID NO：55)；
5’CGACCAAAAGAATTC 3’(SEQ ID NO：56)；
5’CGACCAAAAGAATTC 3’(SEQ ID NO：57)；
5’GATGGCCATCAATTA 3’(SEQ ID NO：58)；
5’GATGGCCATCAATTA 3’(SEQ ID NO：59)；
5’TCTAGCATACTTACT 3’(SEQ ID NO：60)；
5’TCTAGCATACTTACT 3’(SEQ ID NO：61)；
5’GAATTCGGATGGCCA 3’(SEQ ID NO：62)；
5’GGCCATCAATTAGTG 3’(SEQ ID NO：63)；
5’TTCGGATGGCCATCA 3’(SEQ ID NO：64)；
5’AGCCAGACAGCGA 3’(SEQ ID NO：65)；和
5’GACAGCCAGACAGCA 3’(SEQ ID NO：66)。
在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′ACCAAAAGAAT 3′(SEQ ID NO：45)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′TGGCCATCAAT 3′(SEQ ID NO：46)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′TAGCATACTTA 3′(SEQ ID NO：47)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′CCAAAAGA 3′(SEQ ID NO：48)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′CATACTTA 3′(SEQ ID NO：49)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′CAGACACGACCAAAA 3′(SEQ ID NO：50)。
在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′TACTTACTGACAGCC 3′(SEQ ID NO：51)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′AGACACGACCAAAAG 3′(SEQ ID NO：52)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′ACCAAAAGAAT 3′(SEQ ID NO：53)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′TGGCCATCAAT 3′(SEQ ID NO：54)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′TAGCATACTTA 3′(SEQ ID NO：55)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′CGACCAAAAGAATTC 3′(SEQ ID NO：56)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′CGACCAAAAGAATTC 3′(SEQ ID NO：57)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′GATGGCCATCAATTA 3′(SEQ ID NO：58)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′GATGGCCATCAATTA 3′(SEQ ID NO：59)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′TCTAGCATACTTACT 3′(SEQ ID NO：60)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′TCTAGCATACTTACT 3′(SEQ ID NO：61)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′GAATTCGGATGGCCA3′(SEQ ID NO：62)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′GGCCATCAATTAGTG3′(SEQ ID NO：63)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′TTCGGATGGCCATCA3′(SEQ ID NO：64)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′AGCCAGACAGCGA 3′(SEQ ID NO：65)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′GACAGCCAGACAGCA 3′(SEQ ID NO：66)。
在某些实施例中，寡核苷酸包含选自以下的序列：
5′CGACCAAAAGAATT 3′(SEQ ID NO：98)；和
5′GACCAAAAGAATTCGG 3′(SEQ ID NO：99)。
在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′CGACCAAAAGAATT 3′(SEQ ID NO：98)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′GACCAAAAGAATTCGG 3′(SEQ ID NO：99)。
在某些实施例中，寡核苷酸包含选自以下的序列：
5′AGCATACTTACTGACA 3’(SEQ ID NO：100)；
5′CATACTTACTGACA 3’(SEQ ID NO：101)；
5′ATACTTACTGACAG 3’(SEQ ID NO：102)；
5′CATACTTACTGACAGC 3’(SEQ ID NO：103)；
5′AGACAGCGACCAAAAG 3’(SEQ ID NO：104)；和
5′ACAGCGACCAAAAG(SEQ ID NO：105)。
在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′AGCATACTTACTGACA 3′(SEQ ID NO：100)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′CATACTTACTGACA 3′(SEQ ID NO：101)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′ATACTTACTGACAG 3′(SEQ ID NO：102)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′CATACTTACTGACAGC 3′(SEQ ID NO：103)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′AGACAGCGACCAAAAG 3′(SEQ ID NO：104)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′ACAGCGACCAAAAG(SEQ ID NO：105)。
在某些实施例中，寡核苷酸包含选自以下的序列：
5′CAGCCAGACAGCGAC 3′(SEQ ID NO：106)；
5′CAGCCAGACAGCGA 3′(SEQ ID NO：107)；
5′ACAGCCAGACAGCGA 3′(SEQ ID NO：108)；和
5′GACAGCCAGACAGCG 3′(SEQ ID NO：109)。
在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′CAGCCAGACAGCGAC 3′(SEQ ID NO：106)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′CAGCCAGACAGCGA 3′(SEQ ID NO：107)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′ACAGCCAGACAGCGA 3′(SEQ ID NO：108)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′GACAGCCAGACAGCG 3′(SEQ ID NO：109)。
在某些实施例中，寡核苷酸包含选自以下的序列：
5′GAATTCGGATGGCCA 3′(SEQ ID NO：62)；
5′AGCCAGACAGCGA 3′(SEQ ID NO：65)；
5′CATCAATTAGTGTCG 3′(SEQ ID NO：110)；
5′CCATCAATTAGTGTCG 3′(SEQ ID NO：111)；
5′GCCATCAATTAGTGTG 3′(SEQ ID NO：112)；
5′AAGAATTCGGATGGC 3′(SEQ ID NO：113)；
5′CAGACAGCGACCAA 3′(SEQ ID NO：114)；和
5′TGACAGCCAGACAGC 3′(SEQ ID NO：115)。
在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′GAATTCGGATGGCCA 3′(SEQ ID NO：62)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′AGCCAGACAGCGA 3′(SEQ ID NO：65)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′CATCAATTAGTGTCG 3′(SEQ ID NO：110)。
在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′CCATCAATTAGTGTCG 3′(SEQ ID NO：111)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′GCCATCAATTAGTGTG 3′(SEQ ID NO：112)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′AAGAATTCGGATGGC 3′(SEQ ID NO：113)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′CAGACAGCGACCAA 3′(SEQ ID NO：114)。在特定实施例中，寡核苷酸包含以下序列：5′TGACAGCCAGACAGC 3′(SEQ ID NO：115)。在某些实例中，寡核苷酸化合物(例如，上述序列之一)与PB2 vRNA区域的结合(例如，通过杂交)破坏了PB2 vRNA的整体二级RNA结构。在特定情况下，将寡核苷酸化合物结合到PB2 vRNA区域会抑制PB2vRNA的包装能力，从而抑制病毒。
在某些实施例中，寡核苷酸包含选自(COV2)的序列：
5’GGTGACATGGTACCACATATATCACGTC 3’(SEQ ID NO：192)
5’GACGTGATATATGTGGTACCATGTCACC 3’(SEQ ID NO：193)
5’GACGTGATATATGTGG 3’(SEQ ID NO：194)
5’CGTGATATATGTGGTA 3’(SEQ ID NO：195)
5’GATATGTGGTACCAT 3’(SEQ ID NO：196)
5’TGGTACCATGTCAC 3’(SEQ ID NO：197)
5’GTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGG 3’(SEQ ID NO：198)
5’CCTCAGCAGCAGATTTCTTAGTGAC 3’(SEQ ID NO：199)
5’CCTCAGCAGCAGATTT 3’(SEQ ID NO：200)
5’TCAGCAGCAGATTTC 3’(SEQ ID NO：201)
5’CAGCAGCAGATTTC 3’(SEQ ID NO：202)
5’CAGATTTCTTAGTGAC 3’(SEQ ID NO：203)
5’TGCTTACGGTTTCGTCCGTGTTGCA 3’(SEQ ID NO：204)
5’TGCAACACGGACGAAACCGTAAGCA 3’(SEQ ID NO：205)
5’TGCAACACGGACGAAA 3’(SEQ ID NO：206)
5’GCAACACGGACGAAAC 3’(SEQ ID NO：207)
5’ACACGGACGAAACCG 3’(SEQ ID NO：208)
5’GGACGAAACCCGTAA 3’(SEQ ID NO：209)
5’ACGAAACCGTAAGCA 3’(SEQ ID NO：210)
5’ACGAAACCGTAAGCA 3’(SEQ ID NO：211)
5’GCAACACGGACGAAAC 3’(SEQ ID NO：212)
5’GCAACACGGACGAAA 3’(SEQ ID NO：213)
5’GCAACACGGACGAAAC 3’(SEQ ID NO：214)
5’GCAACACGGACGAAAC 3’(SEQ ID NO：215)
5’GCAACACGGACGAAAC 3’(SEQ ID NO：216)
5’GCAACACGGACGAA 3’(SEQ ID NO：217)
5’ACACGGACGAAACCG 3’(SEQ ID NO：218)
5’ACACGGACGAAACCG 3’(SEQ ID NO：219)
5’AACACGGACGAAACCG 3’(SEQ ID NO：220)
5’AACACGGACGAAACCG 3’(SEQ ID NO：221)
5’ACGAAACCGTAAGCA 3’(SEQ ID NO：222)
5’ACGAAACCGTAAGCA 3’(SEQ ID NO：223)
5’ATAGGTCCAGACATGTTCC 3’(SEQ ID NO：224)
5’GGAACATGTCTGGACCTAT 3’(SEQ ID NO：225)
5’AACATGTCTGGACCTA 3’(SEQ ID NO：226)
5’ACATGTCTGGACCTAT 3’(SEQ ID NO：227)
5’TATGACTATGTCATATTCA 3’(SEQ ID NO：228)
5’AGTGAATATGACATAGTCATATT 3’(SEQ ID NO：229)
5’TGAATATGACATAGT 3’(SEQ ID NO：230)
5’AATATGACATAGTC 3’(SEQ ID NO：231)
5’GATCTCTTGTAGATCTGTTCTCTAAACGAACTTTAAAATCTGTG 3’(SEQ ID NO：232)
5’CACAGATTTTAAAGTTCGTTTAGAGAACAGATCTACAAGAGATC 3’(SEQ ID NO：233)
5’CACAGATTTTAAAGTT 3’(SEQ ID NO：234)
5’CACAGATTTTAAAGTT 3’(SEQ ID NO：235)
5’CAGATTTTAAAGTTCG 3’(SEQ ID NO：236)
5’GATTTTAAAGTTCGT 3’(SEQ ID NO：237)
5’TAAAGTTCGTTTAGA 3’(SEQ ID NO：238)
5’AAAGTTCGTTTAGA 3’(SEQ ID NO：239)
5’TCGTTTAGAGAACAGAT 3’(SEQ ID NO：240)
5’AGAGAACAGATCTACA 3’(SEQ ID NO：241)
5’AGATCTACAAGAGA 3’(SEQ ID NO：242)
5’ATCTACAAGAGATC 3’(SEQ ID NO：243)
5’AGATTTTAAAGTTCGT 3’(SEQ ID NO：244)
5’GATTTTAAAGTTCGT 3’(SEQ ID NO：245)
5’GATTTTAAAGTTCGT 3’(SEQ ID NO：246)
5’AGATTTTAAAGTTCG 3’(SEQ ID NO：247)
5’TCGTTTAGAGAACAGAT 3’(SEQ ID NO：248)
5’TTCGTTTAGAGAACAG 3’(SEQ ID NO：249)
5’TTCGTTTAGAGAACAG 3’(SEQ ID NO：250)
5’GAGAAAACACACGTCCAACTCAGTTTGCCTG 3’(SEQ ID NO：251)
5’CAGGCAAACTGAGTTGGACGTGTGTTTTCTC 3’(SEQ ID NO：252)
5’CAGGCAAACTGAGTTG 3’(SEQ ID NO：253)
5’CAGGCAAACTGAGTTG 3’(SEQ ID NO：254)
5’CAGGCAAACTGAGT 3’(SEQ ID NO：255)
5’CAAACTGAGTTGGACG 3’(SEQ ID NO：256)
5’AAACTGAGTTGGAC 3’(SEQ ID NO：257)
5’AAACTGAGTTGGACGT 3’(SEQ ID N0：258)
5’GAGTTGGACGTGTGT 3’(SEQ ID NO：259)
5’TTGGACGTGTGTTTTC 3’(SEQ ID NO：260)
5’GGACGTGTGTTTTCTC 3’(SEQ ID NO：261)
5’GGTTTCGTCCGGGTGTGACCG 3’(SEQ ID NO：262)
5’TTTCGGTCACACCCGGACGAAACCTAGAT 3’(SEQ ID NO：263)
5’TTTCGGTCACACCCGG 3’(SEQ ID NO：264)
5’CGGTCACACCCGGACG 3’(SEQ ID NO：265)
5’TCACACCCGGACGAAA 3’(SEQ ID NO：266)
5’CACCCGGACGAAAC 3’(SEQ ID NO：267)
5’CACCCGGACGAAACC 3’(SEQ ID NO：268)
5’CACCCGGACGAAACCT 3’(SEQ ID NO：269)
5’CCGGACGAAACCTA 3’(SEQ ID NO：270)
5’CGGTCACACCCGGACGA 3’(SEQ ID NO：21)
5’CGGTCACACCCGGACG 3’(SEQ ID NO：272)
5’CGGTCACACCCGGACG 3’(SEQ ID NO：273)
5’CGGTCACACCCGGACG 3’(SEQ ID NO：274)
5’GTCACACCCGGACG 3’(SEQ ID NO：275)
5’GTCACACCCGGACG 3’(SEQ ID NO：276)
5’CACCCGGACGAAACC 3’(SEQ ID NO：277)
5’CACCCGGACGAAACC 3’(SEQ ID NO：278)
5’CACCCGGACGAAAC 3’(SEQ ID NO：279)
5’CACACCCGGACGAAAC 3’(SEQ ID NO：280)
5’CACACCCGGACGAAA 3’(SEQ ID NO：281)
5’CACACCCGGACGAA 3’(SEQ ID NO：282)
5’CGAGGCCACGCGGAGTACGATCGA 3’(SEQ ID NO：283)
5’ACTCGATCGTACTCCGCGTGGCCTCGGTGAA 3’(SEQ ID NO：284)
5’TCGATCGTACTCCGC 3’(SEQ ID NO：285)
5’TCGATCGTACTCCG 3’(SEQ ID NO：286)
5’ATCGTACTCCGCGTG 3’(SEQ ID NO：287)
5’ACTCGATCGTACTC 3’(SEQ ID NO：288)
5’CGTGGCCTCGGTGAA 3’(SEQ ID NO：289)
5’GTGGCCTCGGTGAA 3’(SEQ ID NO：290)
5’TAGTTAACTTTAATCTCACATAGCAATCTTTAATC 3’(SEQ ID NO：291)
5’GATTAAAGATTGCTATGTGAGATTAAAGTTAACTA 3’(SEQ ID NO：292)
5’GATTAAAGATTGCTAT 3’(SEQ ID NO：293)
5’TAAAGATTGCTATGTG 3’(SEQ ID NO：294)
5’AAGATTGCTATGTGAG 3’(SEQ ID NO：295)
5’GCTATGTGAGTTAAAG 3’(SEQ ID NO：296)
5’TATGTGAGTTAAAGTT 3’(SEQ ID NO：297)
5’TGTGAGTTAAAGTTAA 3’(SEQ ID NO：298)
5’CGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAG 3’(SEQ ID NO：299)
5’CTGCGTAGAAGCCTTTTGGCAATGTTGTTCCTTGAGGAAGTTGTAGCACG 3’(SEQ ID N0：300)
5’TCGTAGAAGCCTTTTG 3’(SEQ ID NO：301)
5’CGTAGAAGCCTTTTGGC 3’(SEQ ID NO：302)
5’TAGAAGCCTTTTGGCA 3’(SEQ ID NO：303)
5’AAGCCTTTTGGCAATG 3’(SEQ ID NO：304)
5’TTGGCAATGTTGTTCC 3’(SEQ ID NO：305)
5’GCAATGTTGTTCCT 3’(SEQ ID NO：306)
5’CTTGAGGAAGTTGT 3’(SEQ ID NO：307)
5’AGGAAGTTGTAGCACG 3’(SEQ ID NO：308)
5’GCCTATATGGAAGAGCCCTAATGTGTAAAATTAATTTTAGTAG 3’(SEQ ID NO：309)
5’CTACTAAAATTAATTTTACACATTAGGGCTCTTCCATATAGGC 3’(SEQ ID NO：310)
5’CTACTAAAATTAATT 3’(SEQ ID NO：311)
5’TACTAAAATTAATTT 3’(SEQ ID NO：312)
5’ACTAAAATTAATTT 3’(SEQ ID NO：313)
5’AATTAATTTTACACAT 3’(SEQ ID NO：314)
5’ATTTTACACATTAGGG 3’(SEQ ID NO：315)
5’TACACATTAGGGCTC 3’(SEQ ID NO：316)
5’ACATTAGGGCTCTTC 3’(SEQ ID NO：317)
5’TAGGGCTCTTCCATA 3’(SEQ ID NO：318)
5’GCTCTTCCATATAGG 3’(SEQ ID NO：319)
5’AGGTAAGATGGAGAGCCTT 3’(SEQ ID NO：320)
5’AAGGCTCTCCATCTTACCTTTCGG 3’SEQ ID NO：321)
5’AAGGCTCTCCATCTTA 3’(SEQ ID NO：322)
5’AAGGCTCTCCATCT 3’(SEQ ID NO：323)
5’GCTCTCCATCTTACCT 3’(SEQ ID NO：324)
5’TCCATCTTACCTTTCG 3’(SEQ ID NO：325)
5’TGTGTAACATTAGGGAGG 3’(SEQ ID NO：326)
5’CCTCCCTAATGTTACACA 3’(SEQ ID NO：327)
5’CCTCCCTAATGTTACA 3’(SEQ ID NO：328)
5’CTCCCTAATGTTACAG 3’(SEQ ID NO：329)
5’CTCCCTAATGTTACAG 3’(SEQ ID NO：330)
5’TCATGTGGTAGTGTTGGTTTTA 3’(SEQ ID NO：331)
5’TAAAACCAACACTACCACATGA 3’(SEQ ID NO：332)
5’TAAAACCAACACTACC 3’(SEQ ID NO：333)
5’AAACCAACACTACCAC 3’(SEQ ID NO：334)
5’AAACCAACACTACCAC 3’(SEQ ID NO：335)
5’ACCAACACTACCACAT 3’(SEQ ID NO：336)
5’CAACACTACCACATGA 3’(SEQ ID NO：336)
在某些实施例中，寡核苷酸包含选自以下的序列：(IAV PSL2(+)
5’TGTCAGTAAGTATG 3’(SEQ ID NO：337)
5’CTGGCTGTCAGTAAGT 3’(SEQ ID NO：338)
5’TCGCTGTCTGGCTGT 3’(SEQ ID NO：339)
5’CTTTTGGTCGCTGTCT 3’(SEQ ID NO：340)
5’CTTTTGGTCGCTGT 3’(SEQ ID NO：341)
5’TTGGTCGCTGTCTGGC 3’(SEQ ID NO：342)
5’TTGGTCGCTGTCTG 3’(SEQ ID NO：343)
5’GAATTCTTTTGGTCGC 3’(SEQ ID NO：344)
5’GAATTCTTTTGGTCG 3’(SEQ ID NO：345)
5’AATTCTTTTGGTCGC 3’(SEQ ID NO：346)
5’CGAATTCTTTTGGTCG 3’(SEQ ID NO：347)
5’ACACTAATTGATGGC 3’(SEQ ID NO：348)
5’AATTGATGGCCAT 3’(SEQ ID NO：349)
在某些实施例中，寡核苷酸包含选自以下的序列：(IBV(-)
5’CCACAAAATGAAGGCA 3’(SEQ ID NO：350)
5’CACAAAATGAAGGCA 3’(SEQ ID NO：351)
5’CACAAAATGAAGGC 3’(SEQ ID NO：352)
5’CAATAATTGTACTA 3’(SEQ ID NO：353)
5’CAATAATTGTACTA 3’(SEQ ID NO：354)
5’CAATAATTGTACTA 3’(SEQ ID NO：355)
5’CAATAATTGTACTAC 3’(SEQ ID NO：356)
5’CAATAATTGTACTAC 3’(SEQ ID NO：357)
5’TGTACTACTCATGGTA 3’(SEQ ID NO：358)
5’TGTACTACTCATGGTA 3’(SEQ ID NO：359)
5’TGTACTACTCATGGTA 3’(SEQ ID NO：360)
5’GTACTACTCATGGT 3’(SEQ ID NO：361)
5’TTGTACTACTCATGG 3’(SEQ ID NO：362)
5’CATGGTAGTAACATC 3’(SEQ ID NO：363)
5’CTCATGGTAGTAACATC 3’(SEQ ID NO：364)
5’CTCATGGTAGTAACAT 3’(SEQ ID NO：365)
5’CTCATGGTAGTAACAT 3’(SEQ ID NO：366)
5’ACTCATGGTAGTAACA 3’(SEQ ID NO：367)
5’ACTCATGGTAGTAACA 3’(SEQ ID NO：368)
5’ACTCATGGTAGTAAC 3’(SEQ ID NO：369)
5’ACTCATGGTAGTAA 3’(SEQ ID NO：370)
5’CAATGCAGATCGAAT 3’(SEQ ID NO：371)
5’CAATGCAGATCGAAT 3’(SEQ ID NO：372)
5’GATTGCCTTCACGAAA 3’(SEQ ID NO：373)
5GATTGCCTTCACGAAA 3’(SEQ ID NO：374)
在某些实施例中，寡核苷酸包含选自以下的序列：(IBV(+)
5’GCCTTCATTTTGTG 3’(SEQ ID NO：375)
5’ATTGCCTTCATTTTGT 3’(SEQ ID NO：376)
5’ATTGCCTTCATTTTGT 3’(SEQ ID NO：377)
5’TAGTACAATTATTGCC 3’(SEQ ID NO：378)
5’AGTACAATTATTGCC 3’(SEQ ID NO：379)
5’GTACAATTATTGCCTT 3’(SEQ ID NO：380)
5’ACCATGAGTAGTACA 3’(SEQ ID NO：381)
5’CATGAGTAGTACAAT 3’(SEQ ID NO：382)
5’GATGTTACTACCATGAG 3’(SEQ ID NO：383)
5’ATGTTACTACCATGAG 3’(SEQ ID NO：384)
5’CATTGGATGTTACTAC 3’(SEQ ID NO：385)
5’ATTGGATGTTACTACC 3’(SEQ ID NO：386)
5’ATTGGATGTTACTAC 3’(SEQ ID NO：387)
5’TTTCGTGAAGGCAATC 3’(SEQ ID NO：388)
5’TCGTGAAGGCAATC 3’(SEQ ID NO：389)
在某些实施例中，寡核苷酸包含选自以下的序列：(miRNA靶向序列)
5’GGTTTCGTCCGTGTT 3’(SEQ ID NO：390)
5’GTTTCGTCCGTGTT 3’(SEQ ID NO：391)
5’GCTGTCGCCCGTGTC 3’(SEQ ID NO：392)
5’GCTGTCGCCCGTGTC 3’(SEQ ID NO：393)
5’GCTGTCGCCCGTGTC 3’(SEQ ID NO：394)
5’GCTGTCGCCCGTGT 3’(SEQ ID NO：395)
5’TTCGTCCGTG 3’(SEQ ID NO：396)
5’TTCGTCCGTG 3’(SEQ ID NO：397)
5’TTCGTCCGTG 3’(SEQ ID NO：398)
5’CCCACCCAC 3’(SEQ ID NO：399)
5’CCCACCCAC 3’(SEQ ID NG：400)
5’CCCACCCAC 3’(SEQ ID NO：401)
5’TTTCGTCCGT 3’(SEQ ID NO：402)
5’TTTCGTCCGT3’(SEQ ID NO：403)
5’TTTCGTCCGT3’(SEQ ID NO：404)
5’CCCCACCCAC 3’(SEQ ID NO：405)
5’CCCCACCCAC 3’(SEQ ID NO：406)
5’CCCCACCCAC 3’(SEQ ID NO：407)
5’TTTCGTCCGTGT 3’(SEQ ID NO：408)
5’TTTCGTCCGTGT 3’(SEQ ID NO：409)
5’TTTCGTCCGTGT3’(SEQ ID NO：410)
5’TTCCATCCATGT 3’(SEQ ID N0：411)
5’TTCCATCCATGT 3’(SEQ ID NO：412)
5’TTCCATCCATGT 3’(SEQ ID NO：413)
5’TTCCATCCATGT 3’(SEQ ID NO：414)
5’GTTTCGTCCGTGTT 3’(SEQ ID NO：415)
5’GTTTCGTCCGTGTT 3’(SEQ ID NO：416)
5’GTTTCGTCCGTGTT 3’(SEQ ID NO：417)
5’GTTTCGGCCATGTG 3’(SEQ ID NO：418)
5’CGTCCGTGTT 3’(SEQ ID NO：419)
5’CGTCCGTGTT 3’(SEQ ID NO：420)
5’CGTCCGTGTT 3’(SEQ ID NO：421)
5’CGTCCGTGTT 3’(SEQ ID NO：422)
5’CCTCCGTGTC 3’(SEQ ID NO：423)
5’CCTCCGTGTC 3’(SEQ ID NO：424)
5’CCTCCGTGTC 3’(SEQ ID NO：425)
5’TCCGTGTTGC 3’(SEQ ID NO：426)
5’TCCGTGTTGC 3’(SEQ ID NO：427)
5’TCCGTGTTGC 3’(SEQ ID NO：428)
5’TCCGTCTTGC 3’(SEQ ID NO：429)
5’TCCGTCTTGC 3(SEQ ID NO：430)
5’TCCGTTTGC 3’(SEQ ID NO：431)
5’TTTCGTCCGTGTT 3’(SEQ ID NO：432)
5’TTTCGTCCGTGTT 3’(SEQ ID NO：433)
5’TTTCCTCTATGTT 3’(SEQ ID NO：434)
5’TTTCCTCTATGTT 3’(SEQ ID NO：435)
5’GTTTCGTCCGTGT 3’(SEQ ID NO：436)
5’GGTTTCGTCCGTGTT 3’(SEQ ID NO：437)
5’GGTTTCGTCCGTGTT 3’(SEQ ID NO：438)
5’AAGTACGTCCTACTT 3’(SEQ ID NO：439)
5’GGTTTCGTCC 3’(SEQ ID NO：440)
5’GGTTTCGTCC 3’(SEQ ID NO：441)
5’TGGGTTTCGTCCGTT 3’(SEQ ID NO：442)
5’TTTTGGGATTCCGT 3’(SEQ ID NO：443)
5’GCTTTTGGGATTCCGT 3’(SEQ ID NO：444)
5’GCTTTTGGGATTCCGT 3’(SEQ ID NO：445)
5’AGCTGCTTTTGGGATT 3’(SEQ ID NO：446)
5’GAGCTGCTTTTGGGAT 3’(SEQ ID NO：447)
5’CTGCTTTTGGGATTCC 3’(SEQ ID NO：448)
5’TGCTTTTGGGATTC 3’(SEQ ID NO：449)
5’AGCTGCTTTTGGGATT 3’(SEQ ID NO：450)
5’AGCTGCTTTTGGGA 3’(SEQ ID NO：451)
5’CAGCTGCTTTTGGGAT 3’(SEQ ID NO：452)
5’AGCTGCTTTTGGGATT 3’(SEQ ID NO：453)
5’AGCTGCTTTTGGGA 3’(SEQ ID NO：454)
5’AGCTGCTTTTGGGA 3’(SEQ ID NO：455)
5’AGCTGCTTTTGGGATT 3’(SEQ ID NO：456)
5’TGCTTTTGGGATTC 3’(SEQ ID NO：457)
5’GCGGCGCCCCGCCT 3’(SEQ ID NO：458)
5’GCGGCGCCCCGCCT 3’(SEQ ID NO：459)
5’CGGTCCCGCGGCGCCCCGCCT 3’(SEQ ID NO：460)
5’TTTGGGCTTCCTCGCT 3’(SEQ ID NO：461)
5’TTTGGGCTTCCTCG 3’(SEQ ID NO：462)
5’TTTGGGCTTCCTCG 3’(SEQ ID NO：463)
5’TGGGCTTCCTCGCT 3’(SEQ ID NO：464)
5’ATATACTTTGGGCTTC 3’(SEQ ID NO：465)
5’ATATACTTTGGGCTTC 3’(SEQ ID NO：466)
5’ATATACTTTGGGCT 3’(SEQ ID NO：467)
5’ATATACTTTGGGCTT 3’(SEQ ID NO：468)
5’TAGCCCTAGCCCCGCA 3’(SEQ ID NO：469)
5’TAGCCCTAGCCCCGCA 3’(SEQ ID NO：470)
5’TAGCCCTAGCCCCG 3’(SEQ ID NO：471)
5’TGCTGTTAGCCCTA 3’(SEQ ID NO：472)
5’TGCTGTTAGCCCTA 3’(SEQ ID NO：473)
5’GTGTTAGCCCTAGCC 3’(SEQ ID NO：474)
5’GCGCCCAGCCCCGC 3’(SEQ ID NO：475)
5’GCGCCCAGCCCCGC 3’(SEQ ID NO：476)
5’CGCGCGCCCAGCCC 3’(SEQ ID NO：477)
5’CGCGCGCCCAGCCCCGC 3’(SEQ ID NO：478)
5’TGGCATGGAATGGG 3’(SEQ ID NO：479)
5’ATGGAATGGGCTCCGC 3’(SEQ ID NO：480)
5’ATGGAATGGGCTCC 3’(SEQ ID NO：481)
5’AATGGGCTCCGCCAG 3’(SEQ ID NO：482)
5’AATGGGCTCCGCCAG 3’(SEQ ID NO：483)
5’AATGGGCTCCGCCA 3’(SEQ ID NO：484)
5’AATGGGCTCCGCCA 3’(SEQ ID NO：485)
5’CTTACCCGAGGCGGTC 3’(SEQ ID NO：486)
5’TTACCCGAGGCGGT 3’(SEQ ID NO：487)
5’ACCGTACCTTACCCGA 3’(SEQ ID NO：488)
5’CGTACCTTACCCGA 3’(SEQ ID NO：489)
5’CTCCGAGCCCCGCC 3’(SEQ ID NO：490)
5’CCCGGCTCCGAGCCCCGCC 3’(SEQ ID NO：491)
5’TGGCCTGTCCCCGCA 3’(SEQ ID NO：492)
5’TGGCCTGTCCCCGCA 3’(SEQ ID NO：493)
5’GATGCCCTGGCCTG 3’(SEQ ID NO：494)
5’GATGCCCTGGCCTG 3’(SEQ ID NO：495)
5’GCAGCCAGCTCTAC 3’(SEQ ID NO：496)
5’GCAGCCAGCTCTAC 3’(SEQ ID NO：497)
5’AGCCAGCTCTACCC 3’(SEQ ID NO：498)
5’AGCTCTACCCCCGCCA 3’(SEQ ID NO：499)
5’AGCTCTACCCCCGCCA 3’(SEQ ID NG：500)
5’AAAGCAGCGCCCACTT 3’(SEQ ID NO：501)
5’ACTTCCTCCCCGCT 3’(SEQ ID NO：502)
5’CTACAGAAGCCCCATA 3’(SEQ ID NO：503)
5’CTACAGAAGCCCCATA 3’(SEQ ID NO：504)
5’GAAATCTCTACAGAAG 3’(SEQ ID NO：505)
5’GAAATCTCTACAGAAG 3’(SEQ ID NO：506)
5’TGATCCCTGTCCCCAT 3’(SEQ ID NO：507)
5’ATGCTGATCCCTGTC 3’(SEQ ID NO：508)
5’GCCATGCTGATCCCTGTCCCCAT 3’(SEQ ID NO：509)
5’CCATCTCACCCCAT 3’(SEQ ID NO：510)
5’GCTGCTCCTCCCCAT 3’(SEQ ID N0：511)
5’TCTCCAACCCCACAA 3’(SEQ ID NO：512)
5’CTCCAACCCCACAA 3’(SEQ ID NO：513)
5’CAGCCAGCTCTCCAA 3’(SEQ ID NO：514)
5’AGCCAGCTCTCCAA 3’(SEQ ID NO：515)
在某些实施例中，寡核苷酸包含选自以下的序列：(负链靶向LNA)
5’ATCTGTTCTCTAAACGA 3’(SEQ ID NO：516)
5’ATCTGTTCTCTAAACG 3’(SEQ ID NO：517)
5’AGATCTGTTCTCTAAA 3’(SEQ ID NO：518)
5’TCTCTAAACGAACTTT 3’(SEQ ID NO：519)
5’TCTCTAAACGAACTTT 3’(SEQ ID NO：520)
5’CTCTAAACGAACTTTA 3’(SEQ ID NO：521)
5’ACTTTAAAATCTGT 3’(SEQ ID NO：522)
5’GGTTTCGTCCGTGTT 3’(SEQ ID NO：523)
5’GGTTTCGTCCGTGTT 3’(SEQ ID NO：524)
5’GGTTTCGTCCGTGTT 3’(SEQ ID NO：525)
5’TGCTTACGGTTTCGTCC 3’(SEQ ID NO：526)
5’GTTTCGTCCGTGTTGC 3’(SEQ ID NO：527)
5’TAGGTTTCGTCCGG 3’(SEQ ID NO：528)
5’TCGTCCGGGTGTGA 3’(SEQ ID NO：529)
5’TTCGTCCGGGTGTGA 3’(SEQ ID NO：530)
5’TTTCGTCCGGGTGTGA 3’(SEQ ID NO：531)
5’AGGTTTCGTCCGGGT 3’(SEQ ID NO：532)
5’AGGTTTCGTCCGGG 3’(SEQ ID NO：533)
5’AGGTTTCGTCCGGGT 3’(SEQ ID NO：534)
5’TTTCGTCCGGGTGTG 3’(SEQ ID NO：535)
5’AGGCCACGCGGAGTA 3’(SEQ ID NO：536)
5’CACGCGGAGTACGATC 3’(SEQ ID NO：537)
寡核苷酸序列可以包括任何方便数量的DNA、RNA BNA、LNA、ENA、cEt、2′-修饰的核苷酸、或其他化学修饰的核苷酸。在本文所述的寡核苷酸序列的某些实例中，所述序列是RNA/DNA的混合序列。在本文所述的寡核苷酸序列的某些实例中，所述序列是BNA/DNA的混合序列。在本文所述的寡核苷酸序列的某些实例中，所述序列是BNA/RNA的混合序列。在本文所述的寡核苷酸序列的某些实例中，所述序列仅包括BNA核苷酸。在本文所述的寡核苷酸序列的某些实例中，所述序列是LNA/DNA的混合序列。在本文所述的寡核苷酸序列的某些实例中，所述序列是LNA/RNA的混合序列。在本文所述的寡核苷酸序列的某些实例中，所述序列仅包括LNA核苷酸。在本文所述的寡核苷酸序列的某些实例中，所述序列是ENA/DNA的混合序列。在本文所述的寡核苷酸序列的某些实例中，所述序列是ENA/RNA的混合序列。在本文所述的寡核苷酸序列的某些实例中，所述序列仅包括ENA核苷酸。在本文所述的寡核苷酸序列的某些实例中，所述序列是cEt/DNA的混合序列。在本文所述的寡核苷酸序列的某些实例中，所述序列是cEt/RNA的混合序列。在本文所述的寡核苷酸序列的某些实例中，所述序列仅包括cEt核苷酸。在本文所述的寡核苷酸序列的某些实例中，所述序列是2′-修饰的核苷酸/DNA的混合序列。在本文所述的寡核苷酸序列的某些实例中，所述序列是2′-修饰的核苷酸/RNA的混合序列。在本文所述的寡核苷酸序列的某些实例中，所述序列仅包括2′-修饰的核苷酸。在本文所述的寡核苷酸序列的某些实例中，所述序列仅包括DNA核苷酸。在本文所述的寡核苷酸序列的某些实例中，所述序列仅包括RNA核苷酸。
在特定实例中，所述寡核苷酸在序列中具有以下核苷酸类型排列之一(例如，SEQID NOs：45-66之一，或SEQ ID Nos：98-115)：
A；
A-B-A；
A-B-A-B-A；
A-B-A-B-A-B-A；
A-B-A-B-A-B-A-B-A；
B；
B-A-B；
B-A-B-A-B；
B-A-B-A-B-A-B；or
B-A-B-A-B-A-B-A-A；
其中每个A一个独立的修饰核苷酸序列，每个B是一个DNA核苷酸序列。在特定实例中，A是修饰的核苷酸序列，其中核糖部分被修饰，以包括选自BNA、LNA、ENA、cEt和2′-修饰的核苷酸的修饰。在特定实例中，每个A是1至50个核苷酸的序列，例如1至40、1至30、1至20、1至10或1至5个核苷酸。在特定实例中，每个B是1至50个核苷酸的序列，例如1至40、1至30、1至20、1至10或1至5个核苷酸。
在特定实例中，所述寡核苷酸在序列中具有以下核苷酸类型排列之一(例如，SEQID NOs：45-66之一，或SEQ ID Nos：98-115)：
(A)n1；
(A)n2-(B)n3-(A)n2；
(A)n4-(B)n5-(A)n4-(B)n5-(A)n4-(B)n5-(A)n4；Or
(A)n4-(B)n5-(A)n4-(B)n5-(A)n4-(B)n5-(A)n4-(B)n5-(A)n4；
其中，A是修饰的核苷酸，B是DNA核苷酸，n1是8或更多，n2是3-4，n3是6-8，n4是1-2，n5是1-3。在特定实例中，A是修饰的核苷酸，其中核糖部分被修饰，以包括选自BNA、LNA、ENA、cEt和2′-修饰的核苷酸的修饰。
在特定实例中，所述寡核苷酸在序列中具有以下核苷酸类型排列之一(例如，SEQID NOs：45-66之一，或SEQ ID Nos：98-115)：
A，其中A是8个或更多LNA核苷酸的序列；
A-B-A，其中B是6-8个DNA核苷酸的序列，每个A是3-4个LNA核苷酸的序列；
A-B-A，其中B是7-8个DNA核苷酸的序列，每个A是4个LNA核苷酸的序列；
L-D-L-D-L-D-L，其中每个L是1-2个LNA核苷酸的序列，每个D是2个DNA核苷酸的序列；
L-D-L-D-L-D-L，其中每个L是1-2个LNA核苷酸的序列，每个D是1-2个DNA核苷酸的序列；
L-D-L-D-L-D-L，其中每个L是1-2个LNA核苷酸的序列，每个D是1-3个DNA核苷酸的序列；
L-D-L-D-L-D-L-D-L，其中每个L是1-2个LNA核苷酸的序列，每个D是1-3个DNA核苷酸的序列；和
L-D-L-D-L-D-L-D-L，其中每个L是1-2个LNA核苷酸的序列，每个D是1-2个DNA核苷酸的序列。
所述寡核苷酸序列还可包括一个或多个修饰的核苷间键，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和/或硫代氨基磷酸酯键。非天然存在的核苷间键可以包括在所述寡核苷酸序列的任何方便的位置。在核苷间键包括手性磷原子的实施例中，例如，立体异构源中心，立体异构磷原子可以具有“R”构型(本文称为Rp)或“S”构型(本文称为Sp)。包含手性磷原子的所述寡核苷酸序列可以制备为外消旋混合物，或制备为单独的对映异构体。
在特定实施例中，寡核苷酸具有以下序列之一，其中大写字母表示LNA核苷酸，小写字母表示DNA核苷酸(即，脱氧核糖核苷酸单位)：
LNA 1：5’AccAaaAGaaT 3’(SEQ ID NO：67)；
LNA 2：5’TggCcATcaaT 3’(SEQ ID NO：68)；
LNA 3：5’TagCAtActtA 3’(SEQ ID NO：69)；
LNA 4：5’CCAAAAGA 3’(SEQ ID NO：70)；
LNA 5：5’CATACTTA 3’(SEQ ID NO：71)；
LNA 6：5’CagaCaCGaCCaaAA 3’(SEQ ID NO：72)；
LNA 7：5’TAcTtaCTgaCagCC 3’(SEQ ID NO：73)；
LNA 8：5’AGACacgaccaAAAG 3’(SEQ ID NO：74)；
LNA 9：5’TACTtactgacaGCC 3’(SEQ ID NO：75)；
LNA9.2：5’TACttactgacAGCC 3’(SEQ ID NO：76)；
LNA10：5'ACCaaaagAAT 3’(SEQ ID NO：77)；
LNA1 1：5’TGGccatcAAT 3’(SEQ ID NO：78)；
LNA12：5'TAGcatacTTA 3’(SEQ ID NO：79)；
LNA13：5'CgacCAaaAGaattC 3’(SEQ ID NO：80)；
LNA14：5’CGACcaaaagaATTC 3’(SEQ ID NO：81)；
LNA15：5’GaTGgCcATcaAttA 3’(SEQ ID NO：82)；
LNA16：5’GATGgccatcaATTA 3’(SEQ ID NO：83)；
LNA17：5’TcTAgCaTActTacT 3’(SEQ ID NO：84)；
LNA18：5'TCTAgcatactTACT 3’(SEQ ID NO：85)；
LNA19：5’GAAttcggatgGCCA 3’(SEQ ID NO：86)；
LNA20：5’GGCCatcaattaGTG 3’(SEQ ID NO：87)；
LNA21：5’TTCGgatggccaTCA 3’(SEQ ID NO：88)；
LNA22：5’AGCCagacagCGA 3’(SEQ ID NO：89)；和
LNA23：5’GACAgccagacaGCA 3’(SEQ ID NO：90)。
应当理解，对于任何序列LNA1-LNA23(SEQ ID NO：67)-(SEQ ID NO：90)，一个或多个LNA核苷酸可以用选自BNA核苷酸、ENA核苷酸、cEt核苷酸和2′-修饰核苷酸的修饰核苷酸取代。在特定情况下，1、2、3、4或更多个LNA核苷酸可以被BNA核苷酸取代。在特定情况下，1、2、3、4或更多个LNA核苷酸可以被ENA核苷酸取代。在特定情况下，1、2、3、4或更多个LNA核苷酸可以被cEt核苷酸取代。在特定情况下，1、2、3、4或更多个LNA核苷酸可以被2′-修饰的核苷酸取代(例如，被MOE和本文所述的其他取代基取代)。
在特定实施例中，寡核苷酸具有以下序列之一，其中大写字母表示LNA核苷酸，小写字母表示DNA核苷酸(即，脱氧核糖核苷酸单位)：
LNA19：5’GAAttcggatgGCCA 3’(SEQ ID NO：86)；
LNA22：5’AGCCagacagCGA 3’(SEQ ID NO：89)；
LNA22.2：5’CAGCcagacagCGAC 3’(SEQ ID NO：116)；
LNA22.3：5’CAGccagacagCGAC 3’(SEQ ID NO：117)；
LNA22.5：5’CAGccagacaGCGA 3’(SEQ ID NO：118)；
LNA22.6：5’CAGccagacagCGA 3’(SEQ ID NO：119)；
LNA22.7：5’CAGCcagacagCGA 3’(SEQ ID NO：120)；
LNA22.8：5’ACAgccagacagCGA 3’(SEQ ID NO：121)；
LNA22.9：5’ACAGccagacaGCGA 3’(SEQ ID NO：122)；
LNA22.10：5’ACAgccagacaGCGA 3’(SEQ ID NO：123)；
LNA22.11：5’GACAgccagacaGCG 3’(SEQ ID NO：124)；
LNA22.13：5’GACagccagacaGCG 3’(SEQ ID NO：125)；和
LNA22.14：5’GACAgccagacAGCG(SEQ ID NO：126)。
应当理解，对于任何序列LNA19或LNA22-LNA22.14((SEQ ID NO：86)；(SEQ ID NO：89)和(SEQ ID NO：116)-(SEQ ID NO：126))，一个或多个LNA核苷酸可以用选自BNA核苷酸、ENA核苷酸、cEt核苷酸和2′-修饰核苷酸的修饰核苷酸取代。在特定情况下，1、2、3、4或更多个LNA核苷酸可以被BNA核苷酸取代。在特定情况下，1、2、3、4或更多个LNA核苷酸可以被ENA核苷酸取代。在特定情况下，1、2、3、4或更多个LNA核苷酸可以被cEt核苷酸取代。在特定情况下，1、2、3、4或更多个LNA核苷酸可以被2′-修饰的核苷酸取代(例如，被MOE和本文所述的其他取代基取代)。
在特定实施例中，寡核苷酸具有以下序列之一，其中大写字母表示LNA核苷酸，小写字母表示DNA核苷酸(即，脱氧核糖核苷酸单位)：
LNA24：5'CATcaattagtgTCG 3’(SEQ ID NO：127)；
LNA25：5'CCAtcaattagtgTCG 3’(SEQ ID NO：128)；
LNA26：5'GCCatcaattagtGTG 3’(SEQ ID NO：129)；
LNA27：5'AAGAattcggaTGGC 3’(SEQ ID NO：130)；
LNA28：5’CAGacagcgacCAA 3’(SEQ ID NO：131)；和
LNA29：5’TGAcagccagacAGC 3’(SEQ ID NO：132)。
应当理解，对于任何序列LNA24或LNA29(SEQ ID NO：127)-(SEQ ID NO：132)，一个或多个LNA核苷酸可以用选自BNA核苷酸、EN A核苷酸、cEt核苷酸和2′-修饰核苷酸的修饰核苷酸取代。在特定情况下，1、2、3、4或更多个LNA核苷酸可以被BNA核苷酸取代。在特定情况下，1、2、3、4或更多个LNA核苷酸可以被ENA核苷酸取代。在特定情况下，1、2、3、4或更多个LNA核苷酸可以被cEt核苷酸取代。在特定情况下，1、2、3、4或更多个LNA核苷酸可以被2′-修饰的核苷酸取代(例如，被MOE和本文所述的其他取代基取代)。
在特定实施例中，寡核苷酸具有序列LNA14或其衍生物，如表1所示，其中字母前的“+”表示LNA核苷酸，或其他化学修饰的核苷酸(例如，如本文所述)，其他字母表示DNA核苷酸(即，脱氧核糖核苷酸单位)：
表1：LNA 14衍生物
在特定实施例中，寡核苷酸具有序列LNA9或其衍生物，如表2所示，其中字母前的“+”表示LNA核苷酸，或其他化学修饰的核苷酸(例如，如本文所述)，其他字母表示DNA核苷酸(即，脱氧核糖核苷酸单位)：
表2：LNA9衍生物
在特定实施例中，寡核苷酸具有序列LNA8a或其衍生物，如表3所示，其中字母前的“+”表示LNA核苷酸，或其他化学修饰的核苷酸(例如，如本文所述)，其他字母表示DNA核苷酸(即，脱氧核糖核苷酸单位)：
表3：LNA8a衍生物
在特定实施例中，寡核苷酸具有序列lAV-Pos或其衍生物，如表4所示，其中字母前的“+”表示LNA核苷酸，或其他化学修饰的核苷酸(例如，如本文所述)，其他字母表示DNA核苷酸(即，脱氧核糖核苷酸单位)：
表4：靶向LNA的IAV-Pos
| 名称 | 组合物 |
| IAV-Pos9.1 | +T+G+T+CAGTAAG+T+A+T+G(SEQ ID NO：538) |
| IAV-Pos9.2 | +C+T+GGCTGTCAGTA+A+G+T(SEQ ID NO：539) |
| IAV-Pos9.3 | +T+C+GCTGTCTGGC+T+G+T(SEQ.ID NO：540) |
| IAV-Pos8.1 | +C+T+TTTGGTCGCTG+T+C+T(SEQ ID NO：541) |
| IAV-Pos8.2 | +C+T+T+TTGGTCGC+T+G+T(SEQ ID NO：542) |
| IAV-Pos8.3 | +T+T+GGTCGCTGTC+T+G+G+C(SEQ ID NO：543) |
| IAV-Pos8.4 | +T+T+GGTCGCTGT+C+T+G(SEQ ID NO：544) |
| IAV-PoS14.1 | +G+A+A+TTCTTTTGG+T+C+G+C(SEQ ID NO：545) |
| IAV-PoS14.2 | +G+A+ATTCTTTTGG+T+C+G(SEQ ID NO：546) |
| IAV-PoS14.3 | +A+A+T+TCTTTTGG+T+C+G+C(SEQ ID NO：547) |
| IAV-PoS14.4 | +C+G+A+ATCTTTTG+G+T+C+G(SEQ ID NO：548) |
| IAV-Pos1.1 | +A+C+A+CTAATTGAT+G+G+C(SEQ ID NO：549) |
| IAV-Pos1.2 | +A+A+TTGATGGC+C+A+T(SEQ ID NO：550) |
在特定实施例中，寡核苷酸具有序列IBV或其衍生物，如表5所示，其中字母前的“+”表示LNA核苷酸，或其他化学修饰的核苷酸(例如，如本文所述)，其他字母表示DNA核苷酸(即，脱氧核糖核苷酸单位)：
表5：靶向LNA的IBV
在特定实施例中，寡核苷酸具有序列IBV-Pos或其衍生物，如表6所示，其中字母前的“+”表示LNA核苷酸，或其他化学修饰的核苷酸(例如，如本文所述)，其他字母表示DNA核苷酸(即，脱氧核糖核苷酸单位)：
表6：靶向LNA的IBV-Pos
| 名称 | 组合物 |
| IBV-Pos4.1 | +G+C+CTTCATTTT+G+T+G(SEQ ID NO：578) |
| IBV-Pos4.2 | +A+T+TGCCTTCATTT+T+G+T(SEQ ID NO：579) |
| IBV-Pos4.3 | +A+T+T+GCCTTCATT+T+T+G+T(SEQ ID NO：580) |
| IBV-Pos3.1 | +T+A+G+TACAATTAT+T+G+C+C(SEQ ID NO：581) |
| IBV-Pos3.2 | +A+G+TACAATTATT+G+C+C(SEQ ID NO：582) |
| IBV-Pos3.3 | +G+T+ACAATTATTGC+C+T+T(SEQ ID NO：583) |
| IBV-Pos2.1 | +A+C+C+ATGAGTAG+T+A+C+A(SEQ ID NO：584) |
| IBV-Pos2.2 | +C+A+TGAGTAGTAC+A+A+T(SEQ ID NO：585) |
| IBV-Pos1.1 | +G+A+TGTTACTACCAT+G+A+G(SEQ ID NO：586) |
| IBV-Pos1.2 | +A+T+G+TTACTACCAT+G+A+G(SEQ ID NO：587) |
| IBV-Pos1.3 | +C+A+T+TGGATGTTA+C+T+A+C(SEQ ID NO：588) |
| IBV-Pos1.4 | +A+T+TGGATGTTAC+T+A+C+C(SEQ ID NO：589) |
| IBV-Pos1.5 | +A+T+TGGATGTTA+C+T+A+C(SEQ ID NO：590) |
| IBV-Pos-Opp.l | +T+T+TCGTGAAGGCA+A+T+C(SEQ ID NO：591) |
| IBV-Pos-Opp.2 | +T+C+GTGAAGGCA+A+T+C(SEQ ID NO：592) |
在特定实施例中，寡核苷酸具有序列Neg或其衍生物，如表7所示，其中字母前的“+”表示LNA核苷酸，或其他化学修饰的核苷酸(例如，如本文所述)，其他字母表示DNA核苷酸(即，脱氧核糖核苷酸单位)：
表7：靶向LNA的Neg
在特定实施例中，寡核苷酸具有序列miR或其衍生物，如表8所示，其中字母前的“+”表示LNA核苷酸，或其他化学修饰的核苷酸(例如，如本文所述)，其他字母表示DNA核苷酸(即，脱氧核糖核苷酸单位)：
表8：靶向LNA的miR
在特定实施例中，寡核苷酸具有序列Coy或其衍生物，如表8所示，其中字母前的“+”表示LNA核苷酸，或其他化学修饰的核苷酸(例如，如本文所述)，其他字母表示DNA核苷酸(即，脱氧核糖核苷酸单位)：
表9：靶向LNA的Cov
在特定实施例中，寡核苷酸具有以下序列之一，其中大写字母表示LNA核苷酸，小写字母表示DNA核苷酸(即，脱氧核糖核苷酸单位)：
a)LNA14：5’CGACcaaaagaATTC 3’(SEQ ID NO：81)；
b)LNA14.5：5’CGACcaaaagaATT 3’(SEQ ID NO：135)；
c)LNA14.8：5’CGACcaaaagaaTTC 3’(SEQ ID NO：137)；
d)LNA14.28：5’GACcaaaagaatTCGG 3’(SEQ ID NO：148)；
e)LNA14.30：5’GACCaaaagaattCGG 3’(SEQ ID NO：149)；
f)LNA 9：5’TACTtactgacaGCC 3’(SEQ ID NO：75)；
g)LNA9.1：5’AGCAtacttactGACA 3’(SEQ ID NO：159)；
h)LNA9.2a：5’CATacttactgACA 3’(SEQ ID NO：160)；
i)LNA9.8：5’ATActtactgACAG(SEQ ID NO：164)；
j)LNA9.12：5’CATActtactgacAGC(SEQ ID NO：167)；
k)LNA8a：5’AGAcagcgaccaaAAG(SEQ ID NO：188)；
l)LNA8a.1：5’AGACagcgaccaAAAG(SEQ ID NO：189)；和
m)LNA8a.2：5’ACAGcgaccaAAAG(SEQ ID NO：190)。
在特定实施例中，寡核苷酸具有选自(a)-(e)的序列。在特定情况下，寡核苷酸具有选自(f)-(j)的序列。在其他特定情况下，寡核苷酸具有选自(k)-(m)的序列。
应当理解，对于(a)-(m)中的任一序列，或者表1-9中的任一序列，一个或多个LNA核苷酸可以用选自BNA核苷酸、ENA核苷酸、cEt核苷酸和2′-修饰核苷酸的修饰核苷酸取代。在特定情况下，1、2、3、4或更多个LNA核苷酸可以被BNA核苷酸取代。在特定情况下，1、2、3、4或更多个LNA核苷酸可以被ENA核苷酸取代。在特定情况下，1、2、3、4或更多个LNA核苷酸可以被cEt核苷酸取代。在特定情况下，1、2、3、4或更多个LNA核苷酸可以被2′-修饰的核苷酸取代(例如，被MOE和本文所述的其他取代基取代)。
还应当理解，对于上述任何寡核苷酸序列，可以修饰一个或多个DNA核苷酸，以提供相应的BNA、LNA、ENA、cEt或2′-修饰核苷酸。在特定情况下，1、2、3、4或更多个DNA核苷酸可以被BNA核苷酸取代。在特定情况下，可以修饰1、2、3、4或更多个DNA核苷酸，以提供相应的LNA核苷酸。在特定情况下，可以修饰1、2、3、4或更多个DNA核苷酸，以提供相应的ENA核苷酸。在特定情况下，可以修饰1、2、3、4或更多个DNA核苷酸，以提供相应的cEt核苷酸。在特定情况下，可以修饰1、2、3、4或更多个DNA核苷酸，以提供相应的2′-修饰核苷酸(例如，如本文所述)。
在本公开还包括上述寡核苷酸序列的序列突变体。应当理解，在本文所述的任何序列中，1、2、3、4个或更多个核苷酸可以被突变以提供期望的特性，例如增强的抑制活性、与修饰剂的缀合等。
在某些情况下，本文描述的任何一种序列(例如，SEQ ID NO：45-907)包含在更长的序列中，例如，包括额外的5′和/或3′核苷酸。在特定实例中，所述寡核苷酸的长度为75个核苷酸或更少，例如50个或更少、40个或更少、或35个核苷酸或更少。在特定实例中，所述寡核苷酸的长度为30个核苷酸或更少，例如25个或更少、20个或更少、19个或更少、18个或更少、17个或更少、16个或更少、15个或更少、14个或更少、13个或更少、12个或更少、11个或更少、或10个核苷酸或更少。
在某些情况下，所述寡核苷酸化合物包含相对于本文所述序列之一具有缺失的序列(例如，SEQ ID NO：45-907)。例如，从序列的5′和/或3′末端缺失1、2或3个核苷酸的序列，例如SEQ ID NOs：45-96之一。在某些情况下，缺失序列在SEQ ID NOs：45-907之一的5′末端缺失一个核苷酸。
在某些情况下，缺失序列在SEQ ID NOs：45-191之一的3′末端缺失一个核苷酸。在某些情况下，缺失序列在SEQ ID NOs：45-907之一的5′末端缺失两个核苷酸。在某些情况下，缺失序列在SEQ ID NOs：45-907之一的3′末端缺失了两个核苷酸。
在特定实例中，寡核苷酸包含与任一序列具有至少70％同源性的序列(SEQ IDNO：45)-(SEQ ID NO：907)(例如，如本文所定义)。在特定实例中，寡核苷酸包含与任一序列具有70％或更多同源性的序列(SEQ ID NO：45)-(SEQ ID NO：907)，例如75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多，或甚至更多。在特定情况下，寡核苷酸包含与任一序列具有70至80％同源性的序列(SEQ ID NO：45)-(SEQ ID NO：907)。在特定情况下，寡核苷酸包含与任一序列具有80％至90％同源性的序列(SEQ ID NO：45)-(SEQ IDNO：907)。在特定情况下，寡核苷酸包含与任一序列具有90％至99％同源性的序列(SEQ ID NO：45)-(SEQ IDNO：907)。
在特定情况下，寡核苷酸序列可以包括设计用于覆盖靶标PSL2序列中的单核苷酸多态性(SNP)的突变。在某些情况下，寡核苷酸是具有单个突变位点的LNA9的修饰版本，它可以保护PLS2靶序列不受包含LNA9靶序列的核苷酸变化的影响。应当理解，感兴趣的SNP突变可应用于本文所述的任何序列。感兴趣的突变序列包括但不限于以下序列：
5′TACTTACTGACAGTC 3′(SEQ ID NO：91)；
5′TACTTACCGACAGCC 3′(SEQ ID NO：92)；和
5′GGATTTCGGATGGCCA 3′(SEQ ID NO：93)。
在特定实施例中，寡核苷酸具有以下序列之一，其中大写字母表示LNA核苷酸，小写字母表示DNA核苷酸：
LNA9.G74C：5′TACTtactgacaGTC 3′(SEQ ID NO：94)；
LNA9.T80C：5′TACTtaccgacaGCC 3′(SEQ ID NO：95)；和
LNA19.U56C：5′GGATttcggatggCCA 3′(SEQ ID NO：96)。
应当理解，对于任何序列(SEQ ID NO：94)-(SEQ ID NO：96)，一个或多个LNA核苷酸可以用选自ENA核苷酸、cEt核苷酸和2′-修饰核苷酸的修饰核苷酸取代。在特定情况下，1、2、3、4或更多个LNA核苷酸可以被ENA核苷酸取代。在特定情况下，1、2、3、4或更多个LNA核苷酸可以被cEt核苷酸取代。在特定情况下，1、2、3、4或更多个LNA核苷酸可以被2′-修饰的核苷酸取代(例如，被MOE和本文所述的其他取代基取代)。
在特定实例中，寡核苷酸的最大长度对应于PSL2结构的特定区域(例如，对应于核苷酸34-87的子区域)。在特定实例中，寡核苷酸的长度为20个核苷酸或更少，例如15个核苷酸或更少、14个核苷酸或更少、13个核苷酸或更少、12个核苷酸或更少、11个核苷酸或更少、10个核苷酸或更少、9个核苷酸或更少，8个核苷酸或更少，7个核苷酸或更少，或甚至更少。
寡核苷酸可以通过本领域已知的方法化学合成(参见Wagner等人(1993)，同上，和Milligan等人，同上。)寡核苷酸可以从天然磷酸二酯结构进行化学修饰，以增加它们的细胞内稳定性和结合亲和力。文献中已经描述了许多这样的修饰，它们改变了骨架、糖或杂环碱基的化学性质。
骨架化学中有用的变化是硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯，其中两个非桥接氧都被硫取代；亚磷酰胺；烷基磷酸三酯和硼酸磷酸酯。非手性磷酸酯衍生物包括3′-O′-5′-S-硫代磷酸酯、3′-S-5′-O-硫代磷酸酯、3′-CH2-5′-O-膦酸酯、3′-NH-5′-O-氨基磷酸酯和硫代氨基磷酸酯。肽核酸用肽键取代整个核糖磷酸二酯骨架。糖修饰也用于增强稳定性和亲和力。可以使用脱氧核糖的α-构型，其中碱基相对于天然β-构型倒置。在特定情况下，核糖的2′-OH可以被改变，例如，如本文所述。可以改变核糖的2′-OH以形成2′-O-甲基或2′-O-烯丙基糖，这提供了对降解的抗性而不包括亲和力。在特定情况下，核糖2′-OH的修饰可以改善毒性。杂环碱基的修饰必须保持适当的碱基配对。一些有用的取代包括用脱氧尿苷取代脱氧胸苷；用5-甲基-2′-脱氧胞苷和5-溴-2′-脱氧胞苷取代脱氧胞苷。当5-丙炔基-2′-脱氧尿苷和5-丙炔基-2′-脱氧胞苷分别取代脱氧胸苷和脱氧胞苷时，显示出增加亲和力和生物活性。
寡核苷酸试剂可以用任何方便的修饰剂衍生，例如通过将修饰剂缀合到寡核苷酸序列的5′-和/或3′末端。在某些情况下，修饰剂是增强细胞摄取的部分(例如，脂质)。任何方便的脂质都可以与所述寡核苷酸缀合。在某些实例中，修饰剂是脂肪酸，通过可选的连接子连接到5′或3′末端。
脂质基团可以是脂肪烃或脂肪酸，包括但不限于烃和脂肪酸的衍生物，实例包括具有14-20个碳的饱和直链化合物，例如肉豆蔻酸(十四烷酸)、棕榈(十六烷酸)酸和硬脂(十八烷)酸，以及它们相应的脂肪烃形式，十四烷、十六烷和十八烷。可以使用的其他合适的脂质基团的实例是甾醇，例如胆固醇，以及取代的脂肪酸和烃，特别是这些基团的多氟化形式。脂质基团的范围包括衍生物，例如胺、酰胺、酯和氨基甲酸酯衍生物。
在某些情况下，修饰剂是具有期望活性的另一核酸序列(例如，如本文所述的Rnase的招募)。在特定实例中，修饰剂具有特异性结合活性，可将寡核苷酸递送至特定的靶标，例如细胞特异性蛋白。在某些情况下，修饰剂是一种感兴趣的抗体，可特异性结合感兴趣的细胞特异性靶标。在特定实例中，抗体修饰剂特异性结合血凝素(HA)靶标。
所述寡核苷酸活性剂可以以任何方便的形式使用。在某些实例中，寡核苷酸活性剂是单链的。在某些实例中，寡核苷酸活性剂是双链的。在某些实例中，寡核苷酸活性剂是siRNA。在某些实例中，寡核苷酸活性剂是shRNA。在某些实例中，寡核苷酸活性剂是ssRNA。在某些实例中，ssRNA的一个或多个核苷酸可以被LNA核苷酸取代。在某些实例中，寡核苷酸活性剂是ssDNA。在某些实例中，ssDNA的一个或多个核苷酸可以被LNA核苷酸取代。
治疗方法
个体可以单独感染甲型流感病毒和/或感染其他呼吸道病毒，包括但不限于乙型流感病毒(IBV)、冠状病毒(Cov)、呼吸道合胞病毒(RSV)。
本发明特别适用于预防和/或治疗呼吸道感染，以及作为即时疫苗发挥作用。此外，本发明可以与其他疫苗共同给药，以便在其他疫苗生效所需的时间段内提供即时保护。此外，本发明可用于有暴露于疫苗抗性变体风险的接种疫苗的个体。此外，本发明可用于无症状但仍可传播病毒的已接种疫苗的个体。
本发明描述的寡核苷酸可单独使用或与其他寡核苷酸组合使用，以预防和/或治疗本文所述的呼吸道病毒。
本公开的方面包括治疗或预防受试者的甲型流感病毒感染、乙型流感病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)的方法。所述寡核苷酸化合物可作为找到用途的新型抗病毒治疗剂，其可有效破坏包装并完全预防体内其他致命疾病。如示例部分所示，在体内，示例性寡核苷酸化合物的鼻内给药产生了有效的抗病毒功效，并防止了小鼠中的致死性IAV感染。
所述方法的方面包括向有此需要的受试者给予治疗有效量的所述化合物，以治疗或预防受试者的感染。所谓“治疗有效量”是指足以引起所需生物学效应(例如，治疗或预防病症或疾病、甲型流感病毒感染)的化合物浓度。所谓“治疗”是指至少实现了与困扰宿主的病症相关的症状的改善，其中，改善在广义上是指至少降低了与被治疗的病症相关的参数(例如症状)的量级。因此，治疗还包括病理状态或至少与病理状态相关的症状被完全抑制(例如，防止发病)或停止(例如，终止)，以使宿主不再患有该病症，或至少不再具有该病症的特征性症状。因此，治疗包括：(i)预防，即降低临床症状发展的风险，包括使临床症状不发展，例如，防止疾病进展到有害状态；(ii)抑制，即阻止临床症状的进展或进一步进展，例如减轻或完全抑制活动性疾病(例如感染)；和/或(iii)缓解，即引起临床症状的消退。在甲型流感病毒感染的背景下，术语“治疗”包括以下任何一项或全部：减少患者样本中病毒细胞的数量、抑制病毒细胞的复制、以及改善与感染相关的一种或多种症状。
待治疗的受试者可以是需要治疗的受试者，其中待治疗的宿主是可以使用所述化合物进行治疗的受试者。在某些实施例中，受试者是疑似患有甲型流感病毒感染的受试者。在特定实施例中，受试者被诊断为患有甲型流感病毒感染。因此，在某些情况下，受试者是感染了病毒的人。
在特定情况下，受试者是有感染风险或疑似感染病毒的人。在某些实施例中，vRNA是PB2 vRNA。所述方法可用于预防受试者感染甲型流感病毒。所谓“预防”是指处于甲型流感病毒感染风险中的受试者尽管在通常会导致感染的条件下暴露于该病毒，但并未被感染。在某些情况下，给予所述活性剂(例如，寡核苷酸化合物)可保护受试者免受感染达1周或更长时间，例如2周或更长时间、3周或更长时间、1个月或更长时间、2个月或更长时间、3个月或更长时间等。可以根据所述方法给予多剂量的所述化合物，以在延长的时间段内保护受试者免受感染。使用常规方法可以容易地确定时间和剂量。
在某些情况下，所述治疗方法包括测定或诊断受试者是否患有甲型流感病毒感染的步骤。可以使用任何方便的方法来执行测定步骤。在某些情况下，所述测定步骤包括获得受试者的生物样本并化验样本中是否存在病毒细胞。所述样本可以是细胞样本。所述测定步骤可以包括鉴别包括特定突变的病毒细胞。
因此，许多受试者可能适合接受本文公开的所述化合物和药物组合物进行治疗。本文所用的术语“受试者”和“宿主”可互换使用。通常，这样的受试者是“哺乳动物”，而人类是感兴趣的受试者。其他受试者可以包括家养宠物(例如，狗和猫)、家畜(例如，牛、猪、山羊、马等)、啮齿动物(例如，小鼠、豚鼠和大鼠，例如，在疾病动物模型中)、以及非人类灵长类动物(例如，黑猩猩和猴子)。
可以使用任何方便的方法确定所述化合物的给药量，使其量与药学上可接受的稀释剂、载体或溶媒相结合后足以产生预期效果。本公开的单位剂型的规格将取决于所使用的特定化合物和要达到的效果，以及与宿主中每种化合物相关的药效学。
本公开的方面包括治疗或预防冠状病毒(CoV)感染的方法。所述寡核苷酸化合物可作为找到用途的新型抗病毒治疗剂，其可有效破坏CoV的RNA二级结构，从而治疗或预防受试者的CoV感染。在某些情况下，所述寡核苷酸化合物可以抑制宿主miRNA与CoV的相互作用。在某些实例中，所述寡核苷酸化合物可作为找到用途的新型抗病毒治疗剂，其可有效破坏CoV的RNA二级结构，破坏包装并完全预防体内其他致命疾病。
在特定情况下，CoV选自HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-NL63、HKU1、MERS-CoV和SARS-CoV-2。在特定情况下，CoV是SARS-CoV-2。
所述方法的方面包括向有此需要的受试者给予治疗有效量的所述化合物，以治疗或预防受试者的感染。所谓“治疗有效量”是指足以引起所需生物学效应(例如，治疗或预防病症或疾病、甲型流感、乙型流感、冠状病毒感染、RSV感染)的化合物浓度。所谓“治疗”是指至少实现了与困扰宿主的病症相关的症状的改善，其中，改善在广义上是指至少降低了与被治疗的病症相关的参数(例如症状)的量级。因此，治疗还包括病理状态或至少与病理状态相关的症状被部分或完全抑制(例如，防止发病)或停止(例如，终止)，以使宿主不再患有该病症，或至少不再具有该病症的特征性症状。因此，治疗包括：(i)预防，即降低临床症状发展的风险，包括使临床症状不发展，例如，防止疾病进展到有害状态；(ii)抑制，即阻止临床症状的进展或进一步进展，例如减轻或完全抑制活动性疾病(例如感染)；(iii)缓解，即引起临床症状的消退；(iv)防止住院或需要重症监护病房(ICU)的危重状态；(v)缩短住院时间或ICU停留时间；(vi)防止或缩短对辅助通气的需要，包括但不限于补充氧气、无创正压通气(CPAP和/或BPAP)、机械通气；(vii)防止或缩短对体外膜肺氧合(ECMO)装置等辅助体外循环的需要；(viii)防止叠加细菌感染的发展；和(IX)避免死亡。在甲型流感、乙型流感和冠状病毒(CoV)感染的背景下，术语“治疗”包括以下任何一项或全部：减少体内病毒的数量、减少患者体内病毒感染细胞的数量、抑制细胞内和/或细胞外病毒和病毒感染细胞的复制、以及改善与感染相关的一种或多种症状。
待治疗的受试者可以是需要治疗的受试者，其中待治疗的宿主是可以使用本发明化合物进行治疗的受试者。在某些实施例中，受试者是疑似患有冠状病毒感染的受试者。在特定实施例中，受试者被诊断为患有冠状病毒感染。因此，在某些情况下，受试者是感染了病毒的人。
在特定情况下，受试者是有感染风险或疑似感染病毒的人。所述方法可用于预防受试者感染冠状病毒。所谓“预防”是指处于冠状病毒感染风险中的受试者尽管在通常会导致感染的条件下暴露于该病毒，但并未被感染，或受试者的感染严重程度在感染后减轻。在某些情况下，给予所述活性剂(例如，寡核苷酸化合物)可立即保护受试者免受感染达1周或更长时间，例如2周或更长时间、3周或更长时间、1个月或更长时间、2个月或更长时间、3个月或更长时间等。可以根据所述方法给予多剂量的所述化合物，以在延长的时间段内保护受试者免受感染。使用常规方法可以容易地确定时间和剂量。
在某些情况下，所述治疗方法包括测定或诊断受试者是否患有冠状病毒感染的步骤。可以使用任何方便的方法来执行测定步骤。在某些情况下，所述测定步骤包括获得受试者的生物样本并化验样本中是否存在细胞内和/或细胞外病毒和病毒感染细胞。所述样本可以是细胞样本。测定步骤可以包括鉴定细胞内和/或细胞外病毒以及包括特定突变的病毒感染细胞。
在某些实施例中，所述化合物的有效剂量是有效体积，其质量浓度范围为约50ng/ml至约50μg/ml(例如，从约50ng/ml至约40μg/ml、从约30ng/ml至约20μg/ml、从约50ng/ml至约10μg/ml、从约50ng/ml至约1μg/ml、从约50ng/ml至约800ng/ml、从约50ng/ml至约700ng/ml、从约50ng/ml至约600ng/ml、从约50ng/ml至约500ng/ml、从约50ng/ml至约400ng/ml、从约60ng/ml至约400ng/ml、从约70ng/ml至约300ng/ml、从约60ng/ml至约100ng/ml、从约65ng/ml至约85ng/ml、从约70ng/ml至约90ng/ml、从约200ng/ml至约900ng/ml、从约200ng/ml至约800ng/ml、从约200ng/ml约700ng/ml、从约200ng/ml至约600ng/ml、从约200ng/ml至约500ng/ml、从约200ng/ml至约400ng/ml、或从约200ng/ml至约300ng/ml)。
在某些实施例中，所述化合物的有效量是从约10pg至约100mg范围内的量，例如，从约10pg至约50pg、从约50pg至约150pg、从约150pg至约250pg、从约250pg至约500pg、从约500pg至约750pg、从约750pg至约1ng、从约1ng至约10ng、从约10ng至约50ng、从约50ng至约150ng、从约150ng至约250ng、从约250ng至约500ng、从约500ng至约750ng、从约750ng至约1μg、从约1μg至约10μg、从约10μg至约50μg、从约50μg至约150μg、从约150μg至约250μg、从约250μg至约500μg、从约500μg至约750μg、从约750μg至约1mg、从约1mg至约50mg、从约1mg至约100mg、或从约50mg至约100mg。该剂量可以是单剂量，也可以是每日总剂量。每日总剂量的范围可以从10pg到100mg，或者可以从100mg到大约500mg，或者可以从500mg到大约1000mg。
在某些实施例中，所述化合物以单剂量给药。在其他实施例中，所述化合物以多剂量给药。当在一段时间内以多剂量给药时，所述化合物可以在一段时间内每日两次(qid)、每日一次(qd)、隔日一次(qod)、每三天一次、每周三次(tiw)或每周两次(biw)给药。例如，化合物可以在一天至约2年或更长的时间段内qid、qd、qod、tiw或biw给药。例如，化合物可以以任何上述频率给药一周、两周、一个月、两个月、六个月、一年、或两年、或更长时间，取决于各种因素。
可以使用多种方法中的任何一种来确定治疗方法是否有效。例如，从使用所述方法治疗的个体获得的生物样本可以分析病毒细胞的存在和/或水平。对所述治疗方法的有效性评估可以包括使用任何方便的方法在治疗前、治疗期间和/或治疗后对受试者进行评估。所述方法的方面进一步包括评估受试者对治疗的治疗反应的步骤。
在某些实施例中，所述方法包括评估受试者的状况，包括诊断或评估受试者的一种或多种与所治疗的感兴趣的疾病或病症相关的症状(例如，如本文所述)。在某些实施例中，所述方法包括获得受试者的生物样本并进行化验，例如，检测与感兴趣的疾病或病症相关的病毒细胞或其组分的存在(例如，如本文所述)。所述样本可以是细胞样本。所述方法的评估步骤可以使用任何方便的方法在所述化合物给药之前、期间和/或之后进行一次或多次。
在特定情况下，评估步骤包括病毒细胞的鉴别和/或定量。在特定实例中，对受试者的评估包括诊断受试者是否患有病毒感染或其症状。
筛选方法
本公开的方面还包括筛选检定，其被配置为鉴定在本发明方法中找到用途的药剂，例如，如上所述。本公开的方面包括用于筛选具有抑制细胞中甲型流感病毒的能力的候选药剂的方法。在某些实例中，所述方法包括：将包含PSL2基序的病毒RNA(vRNA)的样本与候选药剂接触；以及确定候选药剂是否特异性结合PSL2基序。在某些情况下，特异性结合PSL2基序的药剂将用于治疗患有甲型流感病毒感染的受试者。在某些实例中，所述方法包括：将包含乙型流感病毒基因组RNA片段的病毒RNA(vRNA)的样本与候选药剂接触；以及确定候选药剂是否特异性结合vRNA。在某些情况下，特异性结合HA基序的药剂将用于治疗患有乙型流感病毒感染的受试者。所谓评估或测定是指至少预测给定的受试化合物将具有期望的活性，从而需要在其他试验中进一步检测该化合物，例如动物模型和/或临床试验。
候选药剂选自：小分子、寡核苷酸、抗体和多肽。在某些实例中，测定步骤包括检测细胞参数，其中与未接触候选药剂的细胞相比，细胞中参数的变化表明候选药剂特异性结合PSL2基序。在某些情况下，所述筛选方法是一种RNA结构映射的方法，例如SHAPE分析(通过引物延伸分析选择性2′-羟基酰化)。在特定实例中，候选药剂是寡核苷酸。
可以使用体外模型、基因改变的细胞或动物、或纯化的PSL2蛋白进行药物筛选。可以识别与先导剂竞争、调节或模拟先导剂作用的配体。药物筛选可识别与PSL2基序特定位点结合的药剂。为此目的，可以使用多种测定法，包括标记体外结合试验、凝胶迁移实验、蛋白质结合免疫测定等。源自本文所述结构研究的PSL2三维结构的知识，也可以导致特异性抑制IAV活性的小药物的合理设计。
本文所用的术语“药剂”描述了具有结合PSL2以抑制IAV的能力的任何分子，例如寡核苷酸、蛋白质或药物。通常，以不同药剂浓度平行运行多个分析混合物，以获得对各种浓度的不同响应。通常，这些浓度之一用作阴性对照，即浓度为零或低于检测水平。
本公开的方面还包括筛选检定，其被配置为鉴定在本发明方法中找到用途的药剂，例如，如上所述。本公开的方面包括用于筛选具有抑制细胞中冠状病毒的能力的候选药剂的方法。在某些实例中，所述方法包括：将包含冠状病毒的保守RNA二级结构的病毒RNA(vRNA)样本与候选药剂接触；以及确定候选药剂是否特异性结合保守RNA二级结构基序。在某些情况下，特异性结合保守RNA二级结构基序的药剂将用于治疗患有冠状病毒感染的受试者。所谓评估或测定是指至少预测给定的受试化合物将具有期望的活性，从而需要在其他试验中进一步检测该化合物，例如动物模型和/或临床试验。
候选药剂包括许多化学类别，例如寡核苷酸、抗体、多肽和有机分子，例如分子量大于50且小于约2,500道尔顿的小分子有机化合物。候选药剂包含与蛋白质结构相互作用所必需的官能团，特别是氢键，并且通常包括至少一个胺、羰基、羟基或羧基，优选至少两个官能化学基团。候选药剂通常包含被一个或多个上述官能团取代的环状碳或杂环结构和/或芳族或多芳族结构。候选药剂也存在于生物分子中，包括肽、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或它们的组合。
候选药剂可从多种来源获得，包括合成或天然化合物库。例如，许多方法可用于随机和定向合成多种有机化合物和生物分子，包括随机寡核苷酸和寡肽的表达。或者，采用细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物库是可获得或容易产生的。此外，天然或合成产生的库和化合物很容易通过常规的化学、物理和生物化学手段进行修饰，并可用于产生组合库。可以对已知的药理学药剂进行定向或随机化学修饰，例如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等，以产生结构类似物。在特定实施例中，感兴趣的是通过血脑屏障的化合物。
在筛选检定是结合试验的情况下，一个或多个分子可以连接至信号产生系统的分子上，例如标记，其中该标记可以直接或间接提供可检测的信号。各种标记包括但不限于：放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、酶、特异性结合分子、粒子，例如磁性粒子等。特异性结合分子包括对，例如生物素和链霉亲和素、地高辛和抗地高辛等。对于特异性结合分子，通常用一种分子标记互补分子，以便按照已知的程序进行检测。
筛选检定中可以包括多种其他试剂。这些包括盐、中性蛋白质等试剂，例如用于促进最佳蛋白-蛋白结合和/或减少非特异性或背景相互作用的白蛋白、去污剂等。可能会用到提高测定效率的试剂，例如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗菌剂等。组分的混合物按照提供必要结合的任何顺序添加。温育在任何合适的温度下进行，通常在4至40℃之间。温育时间根据最佳活性进行选择，但也可以优化以促进快速高通量筛选。通常0.1至1小时就足够了。
示例
提出以下示例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制造和使用本发明的完整公开和描述，并不旨在限制发明人认为的发明范围，也不旨在表示以下实验是全部或唯一进行的实验。已努力确保所用数字的准确性(例如数量、温度等)，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份数，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。可以使用标准缩写，例如bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌肉注射；i.p.，腹膜内注射；s.c.，皮下注射；依次类推。
材料和方法
细胞和病毒：HEK 293T和MDCK细胞获自美国典型培养物保藏中心(Manasass，VA)，并维持在含有10％胎牛血清和青霉素-链霉素(Gibco)的Dulbecco改良Eagle培养基中。甲型流感/PR/8/34(PR8)H1N1病毒是使用八质粒反向遗传系统产生的。组织培养的适应流感病毒A/Hong Kong/8/68(HK68)H3N2获自ATCC(ATCC-VR-1679)。病毒在35℃(查尔斯河实验室；SPAEAS)下在10天大的无特异性病原体鸡胚中生长和扩增。
质粒构建和克隆：使用含有来自流感病毒A/PuertoRico/8/34(H1N1)[PR8]、A/NewYork/470/2004(H3N2)[NY470]、A/New York/312/2001(H1N1)[NY312]、A/Brevig Mission/1/1918(H1N1)[1918]、A/California/04/2009(H1N1)[CA09]、A/Vietnam/03/2004(H5N1)[VN1203]和A/Anhui/1/2013(H7N9)的野生型PB2片段的质粒。为了产生PR8包装突变体vRNA，我们使用Stratagene QuickChange XL定点诱变试剂盒(Stratagene)诱变含有PR8的PB2基因的pDZ质粒。通过自动测序确认每个突变构建体的序列。
反向遗传学和病毒滴定：流感病毒A/Puerto Rico/8/34(PR8)使用八质粒反向遗传系统产生(Hoffman et al.，2000)。简而言之，为了产生重组PR8病毒，293T/MDCK共培养物的106个细胞用Lipofectamine 3000(Invitrogen)转染，质粒中包含的8个片段各1ug，利用双向双Pol I/II启动子系统同时合成基因组vRNA和mRNA。转染后24小时采集细胞，并接种到10日龄鸡胚(查尔斯河，研究级特异性无病原体鸡蛋)的尿囊腔中。通过血凝活性评估重组病毒的挽救效果。对每个新挽救的病毒进行进一步的噬菌斑滴定，并通过突变基因的测序来确认突变。如前所述(Szretter et al.，2006)，对融合的MDCK细胞进行噬菌斑测定。室温下，使用50ul病毒稀释液和50ul 0.5％火鸡红细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的悬浮液，在96孔圆底板中进行血凝(HA)测定。
病毒生长动力学：通过用100个噬斑形成单位(PFU)的病毒接种10日龄鸡蛋来测定PR8病毒的生长动力学。在接种后72小时，通过滴定MDCK细胞上的噬斑来测定尿囊液中的病毒滴度。
包装vRNA的分离：为了分析PR8突变病毒的包装vRNA，用大约1000PFU的重组病毒接种10天龄的蛋，并孵育72小时。收获尿囊液，通过低速离心澄清上清液。
然后将澄清上清液在30％蔗糖缓冲液上分层，并以30,000RPM超速离心2.5小时(Beckman Rotor SW41)。将沉淀的病毒重悬于PBS中，并提取TRIzol(Invitrogen)。将沉淀的vRNA重悬于最终体积为20ul的10mM Tris-HCl(pH 8.0)中，并储存在-80℃下。
包装vRNA的qPCR分析：使用通用3′引物(5′-AGGGCTCTTCGGCCAGCRAAAGCAGG)(SEQID NO：97)和Superscript III逆转录酶(RT)(Invitrogen)对大约200ng提取的vRNA进行逆转录。将RT产物稀释10,000倍，并用作定量PCR(qPCR)的模板。然后，如前所述(Marsh etal.，2007)，使用片段特异性引物进行单独的PCR。10ul反应混合物含有1ul稀释的RT产物、0.5uM引物浓度和SYBR Select Master Mix(Applied Biosystems)，其中包括SYBRGreenER染料、200uM脱氧核苷三磷酸、热不稳定UDG、优化SYBR Green Select缓冲液和AmpliTaq DNA聚合酶UP酶。通过分析循环阈值确定相对vRNA浓度，通过平衡HA vRNA水平来标准化总vRNA量，然后计算相对于wt vRNA包装水平的掺入百分比。病毒包装结果代表vRNA掺入的平均水平±两次独立病毒纯化得到的标准偏差，其中vRNA水平一式三份定量，n＝6。
小鼠感染：用异氟醚轻度麻醉6-8周龄雌性BALB/C小鼠组(Jackson Laboratory)，并用50ul 1000 PFU野生型小鼠适应的PR8(H1N1)病毒(ATCC)、PB2突变的PR8重组病毒或无菌PBS鼻内感染。每天测量体重，并在第10天或体重减轻超过20％时人道处死动物。所有动物护理和实验程序均符合美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南，并获得斯坦福大学实验动物护理管理委员会的批准。
锁核酸(LNA)的设计和制备。含有锁核酸(LNA)的寡核苷酸由Exiqon定制合成。大写字母表示LNA。小写字母表示典型的(非锁定)DNA核苷酸。所有寡核苷酸均含有硫代磷酸酯核苷间键。LNA被设计为与PB2片段的PSL2结构中包含的不同序列互补。LNA 8a和9被设计为用于RNAse-H招募的包含6-8个DNA核苷酸的片段。所有LNA的序列如下所示。
LNA 1：5’AccAaaAGaaT 3’(SEQ ID NO：67)
LNA 2：5’TggCcATcaaT 3’(SEQ ID NO：68)
LNA 3：5’TagCAtActtA 3’(SEQ ID NO：69)
LNA 4：5’CCAAAAGA 3’(SEQ ID NO：70)
LNA 5：5’CATACTTA 3’(SEQ ID NO：71)
LNA 6：5’CagaCaCGaCCaaAA 3’(SEQ ID NO：72)
LNA 7：5’TAcTtaCTgaCagCC 3’(SEQ ID NO：73)
LNA 8a：5’AGAcagcgaccaaAAG 3’-具RNase-H活性(SEQ ID NO：188)
LNA 9：5’TACTtactgacaGCC 3’-具RNase-H活性(SEQ ID NO：75)
LNA9.2：5’TACttactgacAGCC 3’(SEQ ID NO：76)
LNA10：5’ACCaaaagAAT 3’(SEQ ID NO：77)
LNA11：5’TGGccatcAAT 3’(SEQ ID NO：78)
LNA12：5’TAGcatacTTA 3’(SEQ ID NO：79)
LNA13：5’CgacCAaaAGaattC 3’(SEQ ID NO：80)
LNA14：5’CGACcaaaagaATTC 3’(SEQ ID NO：81)
LNA15：5’GaTGgCcATcaAttA 3’(SEQ ID NO：82)
LNA16：5’GATGgccatcaATTA 3’(SEQ ID NO：83)
LNA17：5’TcTAgCaTActTacT 3’(SEQ ID NO：84)
LNA18：5’TCTAgcatactTACT 3’(SEQ ID NO：85)
LNA19：5’GAAttcggatgGCCA 3’(SEQ ID NO：86)
LNA20：5’GGCCatcaattaGTG 3’(SEQ ID NO：87)
LNA21：5’TTCGgatggccaTCA 3’(SEQ ID NO：88)
LNA22：5’AGCCagacagCGA 3’(SEQ ID NO：89)
LNA23：5’GACAgccagacaGCA 3’(SEQ ID NO：90)
以下寡核苷酸被设计用于涵盖PSL2序列中的单核苷酸多态性(SNP)。以下示例性序列是具有单突变位点的LNA9的修饰版本，可防御一些禽类和蝙蝠菌株的PLS2序列包含与LNA9靶序列的核苷酸变化。应当理解，类似的设计可以应用于本文所述的任何序列。
LNA9.G74C：5′TACTtactgacaGTC 3′(SEQ ID NO：94)
LNA9.T80C：5′TACTtaccgacaGCC 3′(SEQ ID NO：95)
LNA19.U56C：5′GGATttcggatggCCA 3′(SEQ ID NO：96)
抗病毒检测：将LNA在100μM的无RNAse水中重构，等分，并在一次性使用前储存于-20℃下。按照制造商的方案，使用Lipofectamine 3000(Life Technology)，以1μM、100nM、10nM和1nM的最终浓度将LNA转染到细胞中。对于预防性抗病毒试验，在用指定的LNA转染前24小时，将106个MDCK细胞接种在6孔板中。然后，在转染后4小时、2小时或1小时用0.01MOI的PR8(H1N1)或HK68(H3N2)病毒感染细胞。对于感染后的治疗性抗病毒评估，如所述，将MDCK细胞用PR8或HK68感染。然后，在感染后4小时、2小时或1小时转染LNA。感染48小时后，收集上清液，通过噬菌斑测定确定病毒滴度。
细胞SARS-CoV-2复制测定：对于细胞复制测定，将LNA ASO在100μM储备液的无RNase水中重构，等分，并在一次性使用前储存于-20℃下。转染前一天，将Huh-7、Vero E6或ACE-A549细胞接种在96孔透明底板上，使其在用LNA ASO或加扰LNA处理时达到60-70％的融合度。按照制造商的方案，使用Lipofectamine 
(Life Technologies)，以25nM或100nM的最终浓度将LNA ASO转染到细胞中。然后用表达纳米荧光素酶的SARS-CoV-2报告病毒(SARS-CoV-2 nLUC)以0.3的MOI感染细胞1小时，然后去除病毒并加入新鲜培养基。重组SARS-CoV-2 nLUC是一种真正的完全复制型病毒，其中ORF7已被删除并用nLUC取代。因此，nLUC表达的测量是病毒复制的替代标记，能够筛选抗病毒化合物。
vRNA的体外转录：对于每种野生型分离株(PR8、1918、VN1203、NY470、NY312、CA09和A/Anhui/1/2013 H7N9)和PR8包装突变体克隆，使用T7启动子下的片段特异性引物从质粒中扩增PB2 cDNA。使用Invitrogen DNA凝胶试剂盒对扩增的cDNA进行凝胶纯化。
然后使用T7-MEGAscript通过体外转录产生vRNA。用于SHAPE的vRNA由MEGAclear(Thermofisher，cat.no.AM 1908)纯化，纯度和长度通过毛细管电泳验证。
vRNA的sf-S-HAPE分析：PB2 vRNA在100mM HEPES中折叠(100mM NaCl；2.5mMMgCl；65℃下1分钟，室温冷却5分钟，37℃下20-30分钟)，pH＝8。用NMIA酰化2分钟(Wilkinson et al.，2006)，分别以45℃下1分钟、52℃下25分钟、65℃下5分钟进行逆转录(RT)引物延伸，如前所述(Mortimer and Weeks，2009)。6FAM用于所有标记的引物。这些方案的例外情况如下：(i)酰化后的RNA纯化使用RNA C&C柱(Zymo Research)进行，而不是乙醇沉淀；(ii)加入SHAPE引物缓冲液前后，将混合物在室温下放置2-5分钟，会显著提高RT转录收率；(iii)使用96孔板格式的Sephadex G-50尺寸排阻树脂进行DNA纯化，然后通过真空离心浓缩，可以更显著的去除引物；(iv)在ddGTP RNA测序反应中使用了2pmol RNA。
ABI 3100基因分析仪(填充POP6基质的50cm毛细管)设置为以下参数：电压15kV，T＝60℃，进样时间＝15s。使用GeneScan程序获取每个样品的数据，其中包括重悬于9.75ulHi-Di甲酰胺中的纯化DNA，其中添加了0.25ul ROX 500内标(ABI Cat.602912)。PeakScanner参数设置如下：平滑＝无；窗口大小＝25；大小调用＝当地southern；基线窗口＝51；峰值阈值＝15。片段250和340在计算上被排除在RGX500标准之外(Akbari et al.，2008)。然后使用自定义程序FAST(SHAPE印迹的fast分析)将来自PeakScanner的数据处理为SHAPE数据(Pang et al.，2011)。使用ddGTP阶梯作为外部大小标准和本地Southern方法，FAST自动校正由于处理错误引起的信号差异，调整信号衰减，并将片段长度转换为核苷酸位置(Pang et al.，2011 and Pang et al.，2012)。
RNA结构参数：按照建议，最初尝试了2.6和-0.8kcal/mol的斜率和截距参数(Deigan et al.，2009)；发现更接近0.0kcal/mol(例如～-0.3)的较小截距会产生更少的次优结构(在10％的最大能量差内)。这种微小参数差异可能是由于自动FAST算法在实验和对照数据集之间实现了精确拟合。
在其当前的实现中，FAST被集成到需要MFC(微软基础类库)的RNAstructure中。使用RNAViz 2(De Rijk et al.，2003)绘制RNA结构并着色，并在Adobe Illustrator中完成。
用于突变和映射实验的构建设计、RNA合成和化学修饰：双链DNA模板通过DNA寡聚体的PCR组装来制备，所述寡聚体由如前所述的自动化MATLAB脚本设计(NA_Thermo载于“https：”后跟“//github.”，然后是“com/DasLab/NA_thermo”)(Kladwang and Cordero etal.，2011)。突变和映射(M2)的构建体包括Watson-Crick对应物的所有单个突变体。基于所提出的二级结构中的碱基配对来设计用于突变/挽救的补偿性突变体(Tian et al.，2014)。体外转录反应、RNA纯化和定量步骤如前所述(Kladwang and Cordero et al.，2011)。以96孔板格式进行一维化学映射、突变和映射(M2)和突变/挽救，如前所述(Kladwang and VanLang et al.，2011；Kladwang and Cordero et al.，2011；Cordero etal.，2013)。简而言之，将RNA加热和冷却以去除二级结构异质性；然后适当折叠并与SHAPE试剂(5mg/mL l-甲基-7-硝基靛酸酐(1M7))一起孵育(Mortimer and Weeks，2007)；通过聚(dT)磁珠(Ambion)和FAM标记的Tail2-A20引物淬灭修饰反应并回收RNA；RNA用70％乙醇(EtOH)洗涤两次，并重悬于ddH2O中；然后逆转录为cDNA，并用加热NaOH处理以去除RNA。通过磁珠分离回收最终的cDNA库，漂洗，用ROX-350梯在Hi-Di甲酰胺(Applied Biosystems)中洗脱，加载到毛细管电泳测序仪(ABB 100)中。数据处理、结构建模和数据存储：HiTRACE软件包2.0版用于分析CE数据(MATLAB工具箱和Web服务器均可用(Yoon et al.，2011；Kimet al.，2013))。完成了印迹对齐、基线相减、序列分配、轮廓拟合、衰减校正和归一化，如前所述(Kim et al.，2009；Kladwang et al.，2014)。序列分配由人工完成，并通过测序梯进行验证。使用RNAstructure包5.4版本的Fold程序(Mathews et al.，2004)获得数据驱动的二级结构模型，其中伪能量斜率和截距参数为2.6kcal/mol和-0.8kcal/mol。如前所述计算M2数据集的二维Z得分矩阵和螺旋自举置信度值(Tian et al.，2014；Kladwang andVanLang et al.，2011)。Z得分矩阵用作碱基对的伪自由能，斜率和截距分别为1.0kcal/mol和0kcal/mol。
二级结构图像由VARNA生成(Darty et al.，2009)。所有化学映射数据集，包括一维映射、突变和映射、以及突变/救援，都已存放在RNA映射数据库中(“http：”后跟“7/rmdb.Stanford”，然后是“edu”)(Cordero et al.，2012)。
LNA靶向vRNA的SHAPE分析：PR8片段PB2的DNA模板通过DNA寡聚体的PCR组装制备，体外转录反应、RNA纯化和定量步骤如前所述(Kladwang and VanLang et al.，2011)。如上所述，在96孔板格式中进行一维SHAPE化学映射，但以下情况例外：一旦RNA如所述变性并重新折叠，将100nM每种制备的LNA添加到折叠的RNA中，并与5mg/mL的SHAPE试剂1M7(1-甲基-7-亚硝基靛酸酐)一起温育。如所述进行修饰淬灭、RNA回收、再悬浮、逆转录、cDNA测序和数据处理，参见Kladwang and VanLang et al.，2011。
示例1：
IAV片段PB2包装信号的SHAPE-表征鉴定保守结构
将通过引物延伸(SHAPE)和计算模型分析的选择性2′-羟基酰化应用于IAV片段PB2基因组vRNA，以检索结构化RNA域。来自菌株A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)“PR8”的体外转录全长(-)-有义PB2 vRNA在溶液中折叠(Pang et al.，2011)，并使用亲电子SHAPE试剂进行询问，该试剂优先与以柔性单链状态存在的核苷酸反应(Wilkinson et al.，2006)(图1)。这一分析揭示了大部分2341-nt vRNA在很大程度上是非结构化的(图2)，与最近的生物信息学研究一致，这些研究发现，所有片段(包括PB2)的(+)-有义RNA比(-)-有义RNA具有更高的二级结构保守潜力(Priore et al.，2012；Moss et al.，2011)。这些既往研究并没有分析末端编码区(TCR)，而是终止于PB2 5′TCR末端的80个核苷酸处。SHAPE引导的建模表明该区域中的几个区域包含稳定的RNA二级结构，最显著的是茎环基序，在本文中称为包装茎环2(PSL2)(图1A)，包含核苷酸34-87((-)-有义符号)。该片段包括一组核苷酸，这些核苷酸以前通过未经鉴定的机制进行的突变分析表明与PB2包装有关(图1A-1B，见带圈的核苷酸)(Gao et al.，2012；Marsh et al.，2008；Liang et al.，2008；Gog et al.，2007)。
支持这些先前突变通过破坏PSL2结构起作用的假设，突变体的SHAPE分析产生了不同的构象，这些构象都消除了野生型PSL2结构(图1C、图3)。包含PSL2的60个核苷酸区域在不同亚型和物种来源的季节性和大流行毒株之间在单核苷酸水平上显示出接近100％的序列保守性(图4)，表明存在维持完整PSL2结构的严格生物学要求。由于PB2 vRNA中不同的下游序列可以改变PSL2的二级结构，因此，通过对从各种IAV毒株和亚型(包括高致病性禽流感H5N1和1918疫情H1N1毒株)中分离的全长野生型PB2vRNA进行SHAPE分析，探索了PSL2的结构保守性，尽管茎环内存在两个不同的核苷酸，且侧翼序列存在显著差异，但在这些不同物种和亚型的PB2 RNA的SHAPE引导模型中，PSL2茎环结构得到了恢复(图1D-1F)。
图1A-图IF显示了对全长(-)-有义野生型PB2 vRNA进行的SHAPE-化学映射。颜色表示SHAPE反应性，它与核苷酸是单链的概率成正比。所有结构都被截短以突出5′末端序列结构。由RNAstructure建模算法使用SHAPE伪自由能参数生成的确定结构的能量＝ΔG自由能值。(图1A)来自菌株A/Puerto Rico/8/1934“PR8”(HlNl)的野生型PB2RNA二级结构。颜色编码的圆圈对应于报告的影响PB2包装的同义突变的核苷酸位点(Gao et al.，2012；Marshet al.，2011)。(图IB)(图1a)中同义突变体的包装效率，通过qPCR测定。结果一式三份。误差线＝±SD。下面的方框表示突变体名称和相应的突变变化。核苷酸编号显示在基因组(-)-有义方向。(图1C)PB2包装缺陷突变体vRNA、m757(G44C)和m745(A80U)的SHAPE-确定结构。黑框＝同义突变位点，(图ID-图IF)来自疫情和高致病性菌株的野生型PB2的SHAPE-确定结构，包括不同的亚型：(图ID)1918疫情(A/Brevig Mission/1/1918(H1N1))，(图IE)高致病性禽流感(A/Vietnam/1203/2004(H5N1))，(图IF)2009疫情‘猪流感’(A/California/04/2009(H1N1))。
图2，panel A-B，显示了全长PB2 vRNA的SHAPE反应性。(图2，panel A)来自IAV菌株A/Puertrto Rico/8/1934(H1N1)的全长(-)-有义PB2 vRNA的平均SHAPE反应性(窗口箱大小＝100nt)与核苷酸位置的函数关系。PSL2区域(以蓝色突出显示，nts 34-86)包含5′包装信号域，该域具有高密度密码子，其第三个位置是保守的，并且具有vRNA中最低的SHAPE反应性之一。
PSL2之后的区域相对来说是非结构化的，但在核苷酸1400和1500之间包含有RNA结构存在的另一个可能位点。有趣的是，2011年的生物信息学研究(参考文献19)也预测这第二个内部区域包含有结构元件。(图2，panel B)放大的PSL2区域视图(图2a)。窗口箱大小＝10nt。
图3A-图3E显示包装缺陷突变破坏了野生型的SHAPE反应性。左：突变体的SHAPE反应性绘制为随WT的变化。核苷酸编号从(-)-有义vRNA的5′端开始。橙色条表示突变位点。能量值表示由RNAstructure建模算法使用SHAPE伪自由能参数生成的预测结构的AG自由能。右：来自PR8菌株(H1N1)的全长(-)-有义突变体PB2 vRNA的SHAPE-确定结构。图像被截短以突出显示5′终端区域。(图3A)野生型。包装缺陷突变体：(图3B)m744b(AG83，85UA)。(图3C)m745(A80U)。(图3D)m55c(CU35，36UC)。(图3E)m757(G44C)。
图4显示了包含PSL2结构的核苷酸序列的保守性。跨不同甲型流感病毒亚型和毒株的核酸序列比对的图形表示(“weblogo.”后跟“berkeley”，然后是“.edu”)。总高度表示该核苷酸位置的序列保守性，而每个位置内符号的高度表示该位点每个核苷酸的相对频率。黑框＝PSL2区域。比对中包含的序列：高致病性A/Brevig Mission/1/1918(H1N1)、疫情“猪流感”A/California/04/2009(H1N 1)、现代人类A/New York/470/2004(H3N2)、人类A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)、高致病性禽流感A/Vietnam/03/2004(H5N1)、人类A/HongKong/8/1968(H3N2)和人类A/New York/312/2001(H1N1)。以(-)有义方向编号的RNA核苷酸。对应于上述序列的PB2末端5′区域的序列比对。蓝色阴影框包含PSL2RNA二级结构元件。黑点代表不同的核苷酸位点。
突变和映射策略验证PSL2结构并预测新的包装突变体
为了进一步测试PSL2 RNA结构的形状分析并揭示体内测试所需的其他信息突变，将多维化学映射(Kladwang and Das，2010)方法应用于PSL2片段。首先，突变和映射(M2)测量证实了在每个茎残基发生系统性突变后化学反应模式的破坏，包括先前发现的对PB2包装至关重要的核苷酸的变化(图5A，见注释字段)(Marsh et al.，2008；Gog et al.，2007)。
基于这些M2数据的自动计算分析以高置信度恢复了SHAPE引导的PSL2结构(图1C、图3、图5B-图5D)，进一步验证了结构模型。其次，作为预测性测试，补偿性突变被设计用恢复野生型茎环结构中被初始包装缺陷突变破坏的碱基对(图6，panel A-B)。这些突变挽救变体确实恢复了PSL2 SHAPE模式，提供了模型结构的体外验证碱基对分辨率，并提出了序列变体来测试PSL2结构在体内的作用。
图5A-图5D显示了PSL2 RNA二级结构的二维突变和映射(M2)分析。(图5A)系统性单核苷酸突变和由此产生的化学可及性图谱揭示了RNA三维结构中的相互作用。以灰色标度(黑色＝最高SHAPE反应性)绘制的化学可及性，在来自PR8菌株PB2的PSL2元件的单核苷酸分辨率下跨越88个单突变。反应峰(从左到右)对应于PB2 RNA 5′至3′端的核苷酸。对应于已知包装突变的核苷酸位点(如Marsh et al.，2008所报告)在右侧以蓝色表示。红色箭头表示通过M2分析预测的显著包装缺陷突变位点。(图SB)通过Z得分分析分离的突变和映射数据的强特征(每个残基处平均值的标准偏差数)。通过减去该核苷酸在所有突变体中的平均反应性并除以标准偏差来计算每个核苷酸反应性的Z得分(output_Zscore_from_rdatin HiTRACE)。正方形显示由突变和映射数据引导的二级结构模型。暗信号突出了结构化核苷酸配对的证据。(图SC)5′包装信号区(nts 30-93)的RNA二级结构源自将Z得分并入RNAstructure建模算法：bootstrap置信度估计，以绿色百分比值给出。Bootstrap值提供了结构置信度的精确数字指标。低bootstrap置信度值表明存在替代结构模型。(图5D)每个碱基对的Bootstrap支持值显示为灰度阴影。
图6显示了对先前描述的PR8 PB2突变体的补偿性突变的设计。(图6，panel A)先前描述的同义突变体(m757、m745、m55c)被映射到PSL2结构上。(图6，panel B)根据SHAPE及突变和映射化学分析，在预测恢复野生型PSL2结构的位点设计了补偿性突变(m55c-comp、m745-comp和m757-comp)。黑框核苷酸表示补偿性突变位点，显示了(-)-有义vRNA的方向。对于需要非同义改变来恢复结构的突变，指出了编码蛋白序列的改变。
为了测试在溶液中观察到的PSL2茎环结构是否与细胞环境中的病毒包装相关，Gog et al.，2007和Marsh et al.，2008报告的相同九个同义突变(图1A-图IB、图7panelA)以及通过M2分析表征的四个新同义突变(图7，panel B)被克隆到含有PR8 PB2基因的pDZ质粒中(Marsh et al.，2008；Liang et al.，2008；Gog et al.，2007)(图8)。目前在PR8背景下的9种先前已知的突变体的包装效率与WSN33病毒15中最初描述的相当(图7，panel C)。其中，根据突变体m55c、m757、m745和m744b在PSL2茎区内的位置，预测它们会显示出最显著的损伤(图1C、图3A-图3F、图7)。相比之下，已发表的对PB2包装没有影响的突变(例如m731)映射到非结构化顶端环或落在PSL2之外，并且不改变其结构完整性(图9A)(Marsh et al.，2008)。通过M2-分析鉴定为对体外PSL2结构具有显著影响的三种新同义突变体(m74-1、m74-2和m68)(图5A)显示出PB2包装的显著损失，而与野生型PSL2结构相比，导致SHAPE反应性变化可忽略不计的突变位点给出了类似野生型的包装效率水平(例如，m56)(图7，panelD)。
图7显示了PR8 PB2 vRNA的单一高度保守密码子的同义突变。(图7，panel A)先前发表的与PB2包装有关的同义突变。上一行是亲本PR8 vRNA序列((+)-有义方向)，突变的单核苷酸在下一行以红色粗体显示。基于Marsh et ah.，2008和Gog et al.，2007的报告引入突变的编号和命名。黄色突出显示的区域表示包含PSL2结构的序列。(图7，panel B)设计用于将M2-分析鉴定的同义突变克隆到pDZ质粒中的引物序列(参见补充图4a)。序列处于(+)-有义方向。突出显示的核苷酸＝突变位点。(图7，panel C-D)包装效率代表突变PB2包装相对于亲本野生型PB2的百分比(图7，panel C)先前发表的同义突变体，和(图7，panel D)M2-分析鉴定的同义突变体。来自两个独立实验的结果，一式三份进行测定(n＝6)。误差线代表±SD。
图8显示了PB2包装突变体的命名和相应突变位点。突变命名图，显示了以下突变的名称和位点：1)基于Marsh et al.，2008和Gog et al.，2007的报告，先前发表的与PB2包装有关的同义突变(显示为蓝色)；和2)PSL2结构设计的单突变体(显示为黑色)和双补偿突变体(显示为红色)。
基于基因组(-)-有义vRNA引入突变的编号和命名。突变导致蛋白编码改变的实例用同义(SYN)或非同义(Non-SYN)字段表示。
图9A-图9C显示了同义突变对PSL2结构的影响。左：通过对来自PR8菌株的全长(-)-有义PB2 vRNA的sf-SHAPE分析确定的PB2包装突变体的预测RNA二级结构。为清楚起见，野生型结构显示在右上角框中。右：SHAPE反应性图显示为突变体反应性相对于野生型的变化。能量值和包装效率百分比显示在图标题下方。突变体：(图9A)m731。(图9B)m751。(图9C)m748。先前描述的每种突变体的PB2掺入的包装效率百分比以蓝色突出显示。
补偿性突变不仅挽救了PB2片段的病毒包装(图10，panel A-C，图6，panel A-B)，还挽救了先前报告的受有害突变影响的其他片段，这与提出的PB2在IAV包装中的层级作用一致(Muramoto et al.，2006；Gao et al.，2012；Marsh et al.，2008)(图10，panel D-F)。除了恢复PB2包装外，补偿性突变完全或几乎完全挽救了由缺陷突变引起的病毒滴度损失(图10，panel G-I)。一些非同义补偿性突变能够比其他突变更好地恢复PB2包装(m745-comp和m55c-comp，与m757-comp相比)(图10，panel A-C)，这可能反映了通过外源添加PB2蛋白功能的不完全恢复。这种外源添加是必要的，因为一些非同义突变影响PSL2结构和蛋白质序列。PSL2结构最敏锐的测试来自不需要补充野生型PB2蛋白的包装实验。基于计算枚举和多维突变挽救实验(Tian et al.，2014)，发现了一对同义单一突变挽救取代，排除了野生型PB2蛋白的添加(m52/m65，图11，panel A-B、图12，panel s、图13)。单独进行每个突变(m52和m65)导致PB2掺入的包装效率低于4％且滴度损失超过4log10-超出了先前报告的包装缺陷病毒的极端损害(即2log10)(图11，panel C-D、图7，panel c、图10)。当一起引入到恢复PSL2结构的双突变m52/65-comp菌株中时，尽管序列发生了改变，但补偿性突变将包装效率和病毒滴度恢复到野生型水平。
图10，panel A-I，描述了PR8 PB2包装缺陷突变体中的补偿性突变对病毒包装和滴度的影响。(图10，panel A-C)包装缺陷和补偿性突变PB2 vRNA的包装效率。对于需要非同义改变的补偿性突变，在病毒挽救期间共转染野生型PB2蛋白表达质粒。pWT＝编码野生型PR8 PB2蛋白的表达质粒。相对于wt亲本PR8病毒，值以PB2 vRNA的包装百分比给出。来自两个独立实验的结果，一式三份进行测定(n＝6)。(图panel D-F)包装缺陷和补偿性突变病毒的包装效率及其对其他相互作用片段PB1、PA、NP和MX包装的影响。一式三份进行测定(n＝6)。(图10，panel G-I)噬菌斑测定的病毒滴度。结果以PFU/mL为单位，一式三份进行测定。
图11显示了多维化学映射，揭示了新PB2包装缺陷和补偿性突变体配偶体。(图11，panel A)来自对单个和补偿性双突变的系统单核苷酸突变映射和挽救(突变-映射-挽救)分析的电泳图结果，以测试来自一维数据引导模型的碱基配对，并鉴定预测的成功同义PSL2-缺陷和补偿性突变体对。以灰色标度(黑色＝最高SHAPE反应性)绘制的化学可及性，在来自PR8菌株PB2的PSL2元件的单核苷酸分辨率下跨越88个单突变。反应峰(从左到右)对应于PB2 RNA 5′至3′端的核苷酸。请参阅图12了解突变-挽救对的完整列表。(图11，panelB)单突变体m52(G52U)和m65(C65A)突变设计，以及PSL2结构上的双m52/65挽救对。(图11，panel C)同义单突变体和双突变体突变-挽救对的包装效率。相对于wt亲本PR8病毒，值以PB2 vRNA的包装百分比给出。来自两个独立实验的结果，一式三份进行测定(n＝6)。(图11，panel D)病毒滴度以FU/mL单位，结果一式三份。误差线代表±SD。
图12panel a-t，显示了二维突变-映射-挽救M2R)分析。突变/挽救结果验证了PSL2RNA二级结构。带有补偿性双突变的SHAPE分析电泳图，用于测试来自一维数据引导模型的碱基配对，并识别成功的PSL2缺陷和补偿性突变对。以灰色标度(黑色＝最高SHAPE反应性)绘制的化学可及性，在来自PR8菌株PB2的PSL2元件的单核苷酸分辨率下跨越88个单突变。对于每个测试配对，将野生型、单突变体1、单突变体2和补偿性双突变体进行“四个一组”分组比较。(图12，panel a-r)非同义突变和挽救对。所有未加框的电泳图都是未观察到破坏和/或挽救的配对。
蓝框表示成功的缺陷和挽救突变。(图12，panel s)双同义突变和挽救对。绿框＝成功的同义缺陷和挽救对。(图12，panel t)非同义突变和挽救对的包装效率。相对于wt亲本PR8病毒，值以PB2 vRNA的包装百分比给出。来自两个独立实验的结果，一式三份进行测定(n＝6)。误差线代表±S.D.
图13显示了二维突变-映射-挽救(M2R)突变体的引物序列设计。序列号：(28-43)起始端到终止端。用于将M2R突变体QuickChange突变克隆到pDZ质粒中的引物序列。序列处于(+)-有义方向。左侧字段表示同义(Syn.)或非同义(Non-syn.)改变。突出显示的核苷酸＝突变位点。带方框的突变引物组表示双同义突变体配偶体m52和m65。
为了在体内模型中测试PSL2结构的相关性，对6-8周龄的BALB/C小鼠鼻内接种1000 PFU的野生型PR8病毒，或带有预测会破坏或恢复PSL2结构的携带突变的菌株。与BS照相比，感染了破坏PSL2突变的m745突变株(包装效率20％)或严重包装缺陷型单突变病毒m52(包装效率4％)的小鼠在体重减轻或存活方面分别表现为疾病减轻或无临床症状(图14，panel A-B)。值得注意的是，包含恢复PSL2结构的补偿性突变挽救了病毒的致病性：感染m52/65-comp和m745-comp的动物表现出与感染野生型PR8的小鼠相当的死亡率和存活曲线(图14，panel A-B)。与APLAC指南一致，所有小鼠在体重减轻超过20％时被人道处死。
图14 panel A-B显示了包装缺陷病毒在体内被减毒。感染单一PSL2破坏性和补偿性、PSL2恢复性双突变病毒小鼠的体重减轻和存活百分比。6-8周龄BALB/C雌性小鼠鼻内感染1000PFU的PR8野生型(wt)病毒、包装缺陷型单突变病毒m52和m745、补偿性双突变病毒m52/65和m745-comp、或PBS对照。每天监测小鼠的第0天体重减轻百分比和存活百分比。结果作为两个独立实验的平均值，每种条件6只小鼠。(图14，panelA)体重减轻百分比。(图14，panel B)个体队列的Kaplan-Meir生存图，见(图14，panel A)。
示例2：
PSL2结构的治疗设计和靶向抑制体外和体内IAV感染
为了探索靶向PSL2介导的病毒包装的治疗潜力，设计了九种含有硫代磷酸酯核苷间键的锁核酸(LNA)(Vester and Wengel，2004)，以对抗预测会破坏该元件的整体RNA二级结构的关键残基，从而抑制病毒产率(图15，panel A)。两个设计的LNA，LNA8a和LNA9，在序列上分别与LNA6和LNA7相同，但具有6-7个未修饰(非锁定)的DNA核苷酸，优化了RNase-H的激活(例如，请分别参见LNA 6/8-RNaseH和LNA 7/9-RNaseH)。首先，为了评估LNA结合对PSL2 RNA二级结构的影响，在存在LNA的情况下，对PB2 vRNA进行了趾纹印记和SHAPE化学映射。抗病毒检测结果证实，编码在LNA 6-9中的序列表现出最大的结合和破坏野生型PSL2结构的能力(图16)。
图15，panel A-D显示了靶向PSL2 RNA结构的锁核酸在体外和体内显示出有效的抗病毒活性。(图15，panel A)针对PSL2结构的不同区域设计的互补锁核酸(LNA)的位置。(图15，panel B)为了筛选LNA的抗病毒活性，在用0.01MOI的PR8(H1N1)病毒或A/HongKong/8/68(H3N2)病毒感染前，用100nM的每种指定LNA通过Lipofectamine转染预处理MDCK细胞1小时。感染后48小时，收集上清液，并通过噬菌斑测定确定病毒滴度。来自2个独立实验的结果，一式三份进行测定(n＝6)。(图15，panel C)在滴定浓度(100nM、10nM、InM)下用LNA9预处理(RX)与感染后处理的时程。WT+Lipo＝Lipofectamine对照感染。预处理：在感染前2小时或4小时，用LNA9处理6孔板中融合的MDCK细胞。在指定时间点移除处理过的上清液，并用0.01MOI的wt PR8病毒感染细胞一小时。感染后处理：用0.01MOI的PR8病毒感染MDCK细胞1小时，然后更换上清液，并在感染后2或4小时用LNA9处理细胞。48小时后收集上清液，通过噬菌斑测定确定病毒滴度，一式三份。图15，panel d显示了鼻内LNA治疗对病毒感染小鼠存活的影响。在感染PR8病毒前12小时，对小鼠鼻内给予20ug LNA9、加扰LNA或PBS(未感染对照)。所有小鼠在8hpi和36hpi接受了两次额外的治疗(每种情况下n＝7只小鼠)。
如本文在图15，panel A-D中所描述，序列标签“LNA8”是指序列LNA8a(SEQ ID NO：188)，例如，如本文所述。此外，在图15，panel A-D、图16A和图16B中，LNA 6/8是指序列LNA6(SEQ ID NO：72)和LNA8a(SEQ ID NO：155)，例如，如本文所述。
图16A-图16B显示了对LNA-RNA结合的SHAPE分析。(图16A)在PR8 PB2 vRNA存在下对LNA 1、2、4、5、6/8a和7/9(100nM)进行SHAPE分析的电泳图谱。S1是一种与丙型肝炎病毒IRES RNA相互作用的小分子，被添加作为RNA结合的对照。左侧的列是未标记的反应，没有SHAPE试剂1M7。右：有标记试剂。(图16B)LNA-vRNA组合在LNA滴定浓度中的SHAPE电泳图谱。对于每个LNA，左侧的一组列没有标记试剂。
然后，在第一个预试验中，确定LNA介导的PSL2靶向跨两种不同IAV亚型的抗病毒潜力，MDCK细胞用100nM的每种LNA预处理，并在用0.01MOI的野生型PR8(H1N1)病毒或组织培养适应的A/Hong Kong/8/68(HK68)(H3N2)病毒感染前，通过LipofectamineTM转染递送1小时。感染后48小时，收集上清液，并通过噬菌斑测定测量病毒产率(图15，panel B)。仅靶向PSL2顶环的LNA(LNA1、LNA4)对病毒滴度几乎没有影响。同样，靶向PSL2 3′碱基的LNA 3和5也未能抑制病毒产率。相比之下，LNA6对顶环和中间隆突的核苷酸覆盖导致PR8的滴度缺陷大于2log10(图15，panel A-B)。LNA8a是LNA6的RNase-H激活拷贝，对两种病毒产生了更强的抗病毒活性，最高可达3log。最引人注目的是，LNA9(LNA7的RNase-H激活拷贝)具有最强的抗病毒能力，对PR8和HK68的病毒产率分别降低了近5log和4log。
在确定了最佳候选LNA后，进一步研究了LNA9抗病毒活性的治疗时程和浓度参数。在用0.01MOI野生型PR8病毒感染前2或4小时，或感染后2或4小时，用一剂10倍稀释的LNA9处理MDCK细胞。用LNA预处理的细胞具有最有效的抗病毒反应(大于4log)，即使在最低稀释度(1nM)下也表现出强烈的病毒抑制作用(大于2log)(图15，panel C)。随着感染后治疗时间的增加，抗病毒活性有下降趋势，但即使在最近一次试验的添加时间点，也实现了大于3log的病毒滴度抑制。
示例3：
体内药效实验：单剂量预防扩展
Balb/C雌性小鼠(5只小鼠/组)在用致死剂量的野生型PR8病毒感染前3天(第-3天)或感染前1天(第-1天)用单剂量20ug LNA9鼻内预处理。每天监测小鼠的体重减轻、临床评分和存活率。图17，panel A显示了小鼠随时间变化的存活百分比。图17，panel B显示了给药后随时间变化的体重减轻百分比。
在感染前三天单次给予20ug LNA9可完全保护小鼠免受致命性流感疾病的侵袭。在平均5.5天，当体重减轻超过25％时，人道地处死未经处理的对照小鼠。相比之下，预处理组的体重减轻最小，几乎没有疾病的临床体征，并完全恢复到感染前的体重。
这一结果表明，在感染前几天给予单次可吸入剂量的LNA9，可以提供针对致命性疾病的持久保护，并表明所述化合物可以在流感暴发和疫情期间的预防性治疗中找到用途。
示例4：
在药物存在下连续传代后流感病毒对奥司他韦和LNA9的易感性：药物选择实验
奥司他韦(特敏福)是市场上使用最广泛且库存最多的神经氨酸酶抑制剂(NAI)。与所有NAI一样，奥司他韦需要在病毒神经氨酸酶(NA)蛋白中进行构象重排来适应药物。NA蛋白中任何影响这种重排的突变都会降低奥司他韦的结合亲和力，从而降低药物疗效。值得注意的是，H274Y突变(根据命名法也称为H275Y突变)最常与奥司他韦耐药性相关。在免疫功能低下的患者中快速选择H274Y突变可能导致作为最后手段的NAI药物帕拉米韦的临床失败，这表明在免疫功能低下的宿主中选择多药耐药病毒可能比以前认为的更常见。这一点，再加上最近出现的奥司他韦耐药性和NAI耐药性病毒的传播，表明有必要重新评估NAI的总体使用情况。为了减少当前和未来流感大流行对人类健康可能产生的不利影响，开发新型抗病毒药物势在必行。
PB2片段中包含PSL2茎环的序列区域在来自广泛宿主物种的IAV亚型、毒株和分离株中高度保守，可能反映了对其保存的严格生物学要求。
对该区域的SHAPE分析证实了不同亚型和宿主来源的季节性病毒和疫情病毒之间的PSL2结构保持不变，强烈表明这种结构元件可能是一种新泛基因型治疗靶点(因此，LNA9具有抗IAV分离株的广谱潜力)。此外，由于所述LNA针对的是高度保守的病毒基因组RNA靶标，该靶标显然对其突变能力具有很强的限制，因此，与NAI相比，靶向PSL2的所述LNA预期对耐药性的产生具有更高的屏障。
研究了在药物压力下连续传代后流感病毒对LNA9与奥司他韦的易感性。通过噬菌斑减数测定确定，奥司他韦在药物治疗的第1次传代对PR8的起始IC50为4lnM。随着药物剂量的增加，仅经过6次病毒传代后，奥司他韦的IC50就跃升至50uM-增幅达1000倍。请参阅图18，panels A-D。相比之下，在LNA9存在下病毒传代10次后，IC50在18至16pM之间保持稳定。图19，panel A和B。
LNA9还可用于治疗耐药病毒。使用反向遗传病毒挽救系统，使NA基因发生突变，以包含H274Y耐药突变，生成A/WSN/33(H1N1)病毒的耐药突变体。针对这种病毒，奥司他韦的IC50为53uM。重要的是，LNA9以皮摩尔活性保持了其对WSN H274Y病毒的效价和疗效。图19，panel C。这一结果为使用PSL2靶向LNA治疗NAI耐药病毒提供了强有力的证据。该结果还突出了LNA9对不同IAV分离株的活性。
示例5：
靶向miR的LNA的抗病毒活性：针对假设介导呼吸道病毒复制的microRNA设计的LNA的体外抗病毒疗效的测定。将设计用于靶向microRNA的单个LNA转染到Huh7细胞中，然后用完全复制的SARS-CoV-2-nLuc病毒感染，该病毒在ORF7中含有纳米荧光素酶报告子。感染后48小时，通过荧光素酶活性测量对复制的影响，与用阴性对照Scrambled LNA(Scr.LNA)或阳性对照核苷类似物EIDD处理的对照细胞相比(图20)。虽然靶向SARS-CoV-2RNA基因组的移码元件(FSE)区域的LNA对病毒复制的影响很小，但我们设计用于隔离miR-191的抗miR LNA观察到多个log10减少。抗miR LNA的抑制程度大于EIDD阳性对照！此外，LNA在25纳摩尔浓度下观察到这种程度的抑制，而EIDD阳性对照在5微摩尔浓度下使用。
其他具有抗呼吸道病毒活性的microRNA靶向LNA也已得到类似鉴定，包括：LNA-602.1；LNA-602.6；LNA-6769-5P.3；LNA-6769-5P.6；LNA-942.3P.4；LNA-376c.3；LNA-4433b.1；LNA-191.1；LNA-191.2；LNA-191.3；LNA-191.4；LNA-191.8；LNA-191.8；LNA-19110；LNA-191.11；LNA-191.12；LNA-191.13；LNA-663.1；LNA-663.3；LNA-381.2；LNA-744.2；LNA-744.4；LNA-744.7；LNA-4508.1；LNA-4508.4LNA-4730.2；LNA-4730.6；LNA-6777.4；LNA-10396.1；LNA-10396.2；LNA-4749.2；LNA-4749.4；LNA-4706.3；LNA-4706.4；LNA-3675.2；LNA-3675.3；LNA6810.1；LNA-6810.2；LNA-6810.3；LNA-6812.1；LNA-6796.1；LNA-6796.3对SARS-Cov-2具有强效抗病毒活性，均能抑制约llog10或更多的病毒复制。这些LNA列于上表8。
示例6：
LNA组合对呼吸道病毒的体外抗病毒疗效的测定：将靶向保守SARS-CoV-2 RNA二级结构的LNA与设计用于隔离miR-191的LNA结合，可显著抑制病毒复制。使用上述示例5中描述的试验，将单个LNA组合以显示抗呼吸道病毒活性(图21)。
示例7：
LNA组合对呼吸道病毒的体内疗效。在感染SARS-Cov-2致死性接种物前5天，用溶媒、小分子A或LNA组合鼻内给药一次来处理人类ACE2转基因小鼠。感染后，每天通过临床评分监测动物，其中1＝无症状，较高的评分表明临床状态恶化(图21)。LNA组合在体内抑制呼吸道病毒感染
示例8：
靶向单个microRNA的LNA或靶向呼吸道病毒负链或正链的LNA的抗病毒活性。使用示例5中描述的试验表明，单个LNA具有抗呼吸道病毒活性(图22)。其他具有抗呼吸道病毒活性的LNA已获得类似鉴定，包括但不限于：Neg 3.1；Neg 8.2；Neg 8.4；Neg 10.1；Neg10.1；Neg 12.2；Neg 18.2；Neg 18.3；Neg 18.4；Cov 8.5；Cov 10.1；Cov 11.3；Cov 12.8；Cov 13.9；Cov 14.3；Cov 16.3；Cov 18.1；Covl.1；Cov 1.2；Cov 1.4；Cov 2.1；Cov 2.2；Cov 3.2；Cov 3.2-2；Cov 3.2-3；Cov 3.2-4；Cov 3.2-5；Cov 3.2-6；Cov 3.2-7；Cov 4.1；Cov 4.2；Cov 6.4；Cov 6.5；Cov 6.6；Cov 6.7；Cov 6.8；Cov 6.9；Cov 6.7-1；Cov 6.7-2；Cov 6.8；Cov 6.9；Cov 6.7-1；Cov 6.7-2；Cov 7.2；Cov 7.7；Cov 7.9；Cov 8.1；Cov 8.2；Cov 8.3；Cov 8.4；Cov 8.5；Cov 8.6；Cov 8.2-1；Cov 10.1；Cov 10.4；Cov 11.1；Cov11.2；Cov 11.3；Cov 12.4；Cov 12.5；Cov 12.7；Cov 12.8；Cov 13.1；Cov 13.4；Cov 13.5；Cov 13.6；Cov 13.8；Cov 13.9；Cov 14.1；Cov 14.2；Cov 14.3；Cov 14.4；Cov 16.1；Cov16.2；Cov 16.3；Cov 18.1；Cov 18.5；IBV-LNA0.2；IBV-LNA4.4；IBV-LNA3.4；IBV-LNA2.5；IBV-LNA 1.5具有强效抗病毒活性，均能抑制约llog10或更多的病毒复制。这些LNA列于上表7和表9。
示例9：
抑制呼吸道病毒的LNA可用作即时疫苗，见图23(a-b)鼻内LNA预防性治疗对病毒感染小鼠存活的影响。Kaplan-Meier生存曲线。小鼠(n＝7只小鼠/组)鼻内给药单剂量LNA9、加扰LNA或溶媒(模拟处理)，然后给予野生型PR8病毒的致死性接种物：(a)在感染前3天(第-3天)或感染前1天(第-1天)给予20μg LNA(b)用单剂量30μg LNA9或溶媒对照品预处理一周，(c)LNA9和新设计的LNA14的靶位点，映射到PSL2结构，(d)在PR8 PB2 vRNA存在下，以100nM浓度对未处理的加扰LNA、LNA9和LNA 14进行SHAPE分析的电泳图谱。用所示的1M7SHAPE试剂标记，(e)在致死性PR8感染前一周(第-7天)用单剂量30μg LNA 14或溶媒对照品鼻内预处理小鼠(n＝7只小鼠/组)的Kaplan-Meier生存曲线，(f-h)在PR8病毒感染前两周(第-14天)给予单剂量40μg LNA 14或溶媒LN.，(f)Kaplan-Meier生存曲线，(g)小鼠第0天体重百分比，(h)临床评分，(i-1)小鼠(n＝7)在以1LD100初次致死感染PR8病毒(e)的前一周给予单次40μg鼻内剂量的LNA 14。初始感染后65天，来自(e)的幸存小鼠以及年龄匹配的未感染对照组(n＝7/组)在10LD100下进行第二次攻击。(i)负荷试验时间表，(j)小鼠第0天体重百分比，(k)临床评分。(1)Kaplan-Meier生存曲线，(m)用致死剂量的PR8野生型病毒感染小鼠(n＝10只/组)。感染后3天，通过静脉注射给予小鼠单剂量40μg LNA14、LNA9、加扰LNA或溶媒对照品。Kaplan-Meier生存曲线。
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尽管为了清楚理解的目的，已经通过说明和示例的方式对前述发明进行了一些详细描述，但对于本领域普通技术人员来说，根据本发明的教导，在不背离所附权利要求的精神或范围的情况下，可以对其进行某些改变和修改是显而易见的。
因此，前述仅说明了本发明的原理。应当理解，本领域技术人员将能够设计出各种布置，尽管在此没有明确地描述或示出，但这些布置体现了本发明的原理，并且包括在其精神和范围内。
此外，本文列举的所有示例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为促进本领域做出贡献的概念，并且应被解释为不限于这些具体列举的示例和条件。此外，本文列举的本发明的原理、方面和实施例及其具体示例的所有陈述旨在涵盖其结构和功能等同物。此外，此类等同物旨在包括当前已知的等同物和未来开发的等同物，即，开发的执行相同功能的任何元件，无论结构如何。因此，本发明的范围并不局限于本文所示和所述的实施例。相反，本发明的范围和精神由所附实施例体现。
尽管有所附的权利要求，本文阐述的公开内容也由以下条款描述：
第1条。一种寡核苷酸化合物或其盐，其包含与PB2 vRNA区域互补的寡核苷酸序列，其中该区域包含PB2 vRNA的5′末端编码区(-)-有义符号中的核苷酸34-87。
第2条。第1条所述化合物包含寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列包含与PB2 vRNA区域互补的至少8个核苷亚基。
第3条。第1-2条中任一项的化合物，其中所述寡核苷酸与PB2 vRNA区域的包装茎环2(PSL2)基序的区域互补。
第4条。第1-3条中任一项的化合物，其中所述寡核苷酸包含选自以下键的核苷间键：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和硫代氨基磷酸酯键。
第5条。第1-4条中任一项的化合物，其中所述寡核苷酸的所有核苷间键选自：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯和磷酸二酯键。
第6条。第4或5条中任一项的化合物，其中所述寡核苷酸核苷间键是手性的。
第7条。第1-5条中任一项的化合物，其中所述寡核苷酸包含桥接核酸(BNA)核苷酸。
第8条。第1-5条中任一项的化合物，其中所述寡核苷酸包含锁核酸(LNA)核苷酸。
第9条。第1-5条中任一项的化合物，其中所述寡核苷酸包含亚乙基桥接核酸(ENA)核苷酸。
第10条。第1-5条中任一项的化合物，其中所述寡核苷酸包含约束乙基核酸(cEt)核苷酸。
第11条。第1-5条中任一项的化合物，其中所述寡核苷酸包含2′-修饰的核苷酸。
第12条。第1-11条中任一项的化合物，其中所述寡核苷酸包含选自以下的序列：
5’ACCAAAAGAAT 3’(SEQ ID NO：45)；
5’TGGCCATCAAT 3’(SEQ ID NO：46)；
5’TAGCATACTTA 3’(SEQ ID NO：47)；
5’CCAAAAGA 3’(SEQ ID NO：48)；
5’CATACTTA 3’(SEQ ID NO：49)；
5’CAGACACGACCAAAA 3’(SEQ ID NO：50)；
5’TACTTACTGACAGCC 3’(SEQ ID NO：51)；
5’AGACACGACCAAAAG 3’(SEQ ID NO：52)；
5’ACCAAAAGAAT 3’(SEQ ID NO：53)；
5’TGGCCATCAAT 3’(SEQ ID NO：54)；
5’TAGCATACTTA 3’(SEQ ID NO：55)；
5’CGACCAAAAGAATTC 3’(SEQ ID NO：56)；
5’CGACCAAAAGAATTC 3’(SEQ ID NO：57)；
5’GATGGCCATCAATTA 3’(SEQ ID NO：58)；
5’GATGGCCATCAATTA 3’(SEQ ID NO：59)；
5’TCTAGCATACTTACT 3’(SEQ ID NO：60)；
5’TCTAGCATACTTACT 3’(SEQ ID NO：61)；
5’GAATTCGGATGGCCA 3’(SEQ ID NO：62)；
5’GGCCATCAATTAGTG 3’(SEQ ID NO：63)；
5’TTCGGATGGCCATCA 3’(SEQ ID NO：64)；
5’AGCCAGACAGCGA 3’(SEQ ID NO：65)；
5’GACAGCCAGACAGCA 3’(SEQ ID NO：66)；
5’CGACCAAAAGAATT 3’(SEQ ID NO：98)；
5’GACCAAAAGAATTCGG 3’(SEQ ID NO：99)；
5’AGCATACTTACTGACA 3’(SEQ ID NO：100)；
5’CATACTTACTGACA 3’(SEQ ID NO：101)；
5’ATACTTACTGACAG3’(SEQ ID NO：102)；
5’CATACTTACTGACAGC 3’(SEQ ID NO：103)；
5’AGACAGCGACCAAAAG 3’(SEQ ID NO：104)；
5’ACAGCGACCAAAAG(SEQ ID NO：105)；
5’CAGCCAGACAGCGAC 3’(SEQ ID NO：106)；
5’CAGCCAGACAGCGA 3’(SEQ ID NO：107)；
5’ACAGCCAGACAGCGA 3’(SEQ ID NO：108)；
5’GACAGCCAGACAGCG 3’(SEQ ID NO：109)；
5’CATCAATTAGTGTCG 3’(SEQ ID NO：110)；
5’CCATCAATTAGTGTCG 3’(SEQ ID NO：111)；
5’GCCATCAATTAGTGTG 3’(SEQ ID NO：112)；
5’AAGAATTCGGATGGC 3’(SEQ ID NO：113)；
5’CAGACAGCGACCAA 3’(SEQ ID NO：114)；
5’TGACAGCCAGACAGC 3’(SEQ ID NO：115)；
第13条。第12条中的化合物，其中所述寡核苷酸包含选自以下的序列：
5’GAATTCGGATGGCCA 3’(SEQ ID NO：62)；
5’AGCCAGACAGCGA 3’(SEQ ID NO：65)；
5’CGACCAAAAGAATT 3’(SEQ ID NO：98)；
5’GACCAAAAGAATTCGG 3’(SEQ ID NO：99)；
5’AGCATACTTACTGACA 3’(SEQ ID NO：100)；
5’CATACTTACTGACA 3’(SEQ ID NO：101)；
5’ATACTTACTGACAG 3’(SEQ ID NO：102)；
5’CATACTTACTGACAGC 3’(SEQ ID NO：103)；
5’AGACAGCGACCAAAAG 3’(SEQ ID NO：104)；
5’ACAGCGACCAAAAG(SEQ ID NO：105)；
5’CAGCCAGACAGCGAC 3’(SEQ ID NO：106)；
5'CAGCCAGACAGCGA 3’(SEQ ID NO：107)；
5'ACAGCCAGACAGCGA 3’(SEQ ID NO：108)；
5'GACAGCCAGACAGCG 3’(SEQ ID NO：109)；
5’CATCAATTAGTGTCG 3’(SEQ ID NO：110)；
5’CCATCAATTAGTGTCG 3’(SEQ ID NO：111)；
5’GCCATCAATTAGTGTG 3’(SEQ ID NO：112)；
5’AAGAATTCGGATGGC 3’(SEQ ID NO：113)；
5’CAGACAGCGACCAA 3’(SEQ ID NO：114)；和
5’TGACAGCCAGACAGC 3’(SEQ ID NO：115)。
第14条。第12条中的化合物，包含与选自(SEQ ID Nos 45-66)和(SEQ ID Nos 98-115)的序列具有至少70％序列同一性的寡核苷酸。
第15条。第14条中的化合物，包含与选自(SEQ ID Nos 45-66)和(SEQ ID Nos 98-115)的序列具有至少80％序列同一性的寡核苷酸。
第16条。第15条中的化合物，包含与选自(SEQ ID Nos 45-66)和(SEQ ID Nos 98-115)的序列具有至少90％序列同一性的寡核苷酸。
第17条。第12条中的化合物，其中所述寡核苷酸的一个或多个核苷酸是修饰的核苷酸(例如，如本文所述)。
第18条。第12条中的化合物，其中所述寡核苷酸的一个或多个核苷酸是桥接核酸(BNA)核苷酸。
第19条。第12条中的化合物，其中所述寡核苷酸的所有核苷酸都是锁核酸(LNA)核苷酸。
第20条。第12条中的化合物，其中所述寡核苷酸的一个或多个核苷酸是亚乙基桥接核酸(ENA)核苷酸。
第21条。第12条中的化合物，其中所述寡核苷酸的一个或多个核苷酸是约束乙基核酸(cEt)核苷酸。
第22条。第12条中的化合物，其中所述寡核苷酸的一个或多个核苷酸包含2′-修饰的核苷酸。
第23条。第12条中的化合物，其中所述寡核苷酸包含选自以下的序列：
LNA 1：5’AccAaaAGaaT 3’(SEQ ID NO：67)；
LNA 2：5’TggCcATcaaT 3’(SEQ ID NO：68)；
LNA 3：5’TagCAtActtA3’(SEQ ID NO：69)；
LNA 4：5’CCAAAAGA 3’(SEQ ID NO：70)；
LNA 5：5’CATACTTA 3’(SEQ ID NO：71)；
LNA 6：5’CagaCaCGaCCaaAA 3’(SEQ ID NO：72)；
LNA 7：5’TAcTtaCTgaCagCC 3’(SEQ ID NO：73)；
LNA 8：5’AGACacgaccaAAAG 3’(SEQ ID NO：74)；
LNA 9：5’TACTtactgacaGCC 3’(SEQ ID NO：75)；
LNA 9.2：5’TACttactgacAGCC 3’(SEQ ID NO：76)；
LNA10：5’ACCaaaagAAT 3’(SEQ ID NO：77)；
LNA11：5’TGGccatcAAT 3’(SEQ ID NO：78)；
LNA12：5’TAGcatacTTA 3’(SEQ ID NO：79)；
LNA13：5’CgacCAaaAGaattC 3’(SEQ ID NO：80)；
LNA14：5’CGACcaaaagaATTC 3’(SEQ ID N0：81)；
LNA15：5’GaTGgCcATcaAttA 3’(SEQ ID NO：82)；
LNA16：5’GATGgccatcaATTA 3’(SEQ ID NO：83)；
LNA17：5’TcTAgCaTActTacT 3’(SEQ ID NO：84)；
LNA18：5’TCTAgcatactTACT 3’(SEQ ID NO：85)；
LNA19：5’GAAttcggatgGCCA 3’(SEQ ID NO：86)；
LNA20：5’GGCCatcaattaGTG 3’(SEQ ID NO：87)；
LNA21：5’TTCGgatggccaTCA 3’(SEQ ID NO：88)；
LNA22：5’AGCCagacagCGA 3’(SEQ ID NO：89)；
LNA23：5’GACAgccagacaGCA 3’(SEQ ID NO：90)；
LNA 9.G74C：5’TACTtactgacaGTC 3’(SEQ ID NO：91)；和
LNA 9.T80C：5’TACTtaccgacaGCC 3’(SEQ ID NO：92)；
其中大写字母表示LNA核苷酸，小写字母表示DNA核苷酸。
第24条。第12条中的化合物，其中所述寡核苷酸包含选自以下的序列：
LNA19：5’GAAttcggatgGCCA 3’(SEQ ID NO：86)；
LNA22：5’AGCCagacagCGA 3’(SEQ ID NO：89)；
LNA22.2：5’CAGCcagacagCGAC 3’(SEQ ID NO：116)；
LNA22.3：5’CAGccagacagCGAC 3’(SEQ ID NO：117)；
LNA22.5：5’CAGccagacaGCGA 3’(SEQ ID NO：118)；
LNA22.6：5’CAGccagacagCGA 3’(SEQ ID NO：119)；
LNA22.7：5’CAGCcagacagCGA 3’(SEQ ID NO：120)；
LNA22.8：5’ACAgccagacagCGA 3’(SEQ ID NO：121)；
LNA22.9：5’ACAGccagacaGCGA 3’(SEQ ID NO：122)；
LNA22.10：5’ACAgccagacaGCGA 3’(SEQ ID NO：123)；
LNA22.il：5’GACAgccagacaGCG 3’(SEQ ID NO：124)；
LNA22.13：5’GACagccagacaGCG 3’(SEQ ID NO：125)；和
LNA22.14：5’GACAgccagacAGCG(SEQ ID NO：126)。
第25条。第12条中的化合物，其中所述寡核苷酸包含选自以下的序列：
LNA24：5’CATcaattagtgTCG 3’(SEQ ID NO：127)；
LNA25：5’CCAtcaattagtgTCG 3’(SEQ ID NO：128)；
LNA26：5’GCCatcaattagtGTG 3’(SEQ ID NO：129)；
LNA27：5’AAGAattcggaTGGC 3’(SEQ ID NO：130)；
LNA28：5’CAGacagcgacCAA 3’(SEQ ID NO：131)；和
LNA29：5’TGAcagccagacAGC 3’(SEQ ID NO：132)。
第26条。第12条中的化合物，其中所述寡核苷酸包含选自以下的序列：
LNA14：5’CGACcaaaagaATTC 3’(SEQ ID NO：81)；
LNA14.5：5’CGACcaaaagaATT 3’(SEQ ID NO：135)；
LNA14.8：5’CGACcaaaagaaTTC 3’(SEQ ID NO：137)；
LNA14.28：5’GACcaaaagaatTCGG 3’(SEQ ID NO：148)；
LNA14.30：5’GACCaaaagaattCGG 3’(SEQ ID NO：149)；
LNA 9：5’TACTtactgacaGCC 3’(SEQ ID NO：75)；
LNA9.1：5’AGCAtacttactGACA 3’(SEQ ID NO：159)；
LNA9.2a：5’CATacttactgACA 3’(SEQ ID NO：160)；
LNA9.8：5’ATActtactgACAG(SEQ ID NO：164)；
LNA9.12：5’CATActtactgacAGC(SEQ ID NO：167)；
LNA8a：5’AGAcagcgaccaaAAG(SEQ ID NO：188)；
LNA8a.1：5’AGACagcgaccaAAAG(SEQ ID NO：189)；和
LNA8a.2：5’ACAGcgaccaAAAG(SEQ ID NO：190)。
第27条。第23-26条中任一项的化合物，包含与选自(SEQ ID Nos 67-92)和(SEQID Nos：116-191)的序列具有至少70％序列同一性的寡核苷酸。
第28条。第27条中的化合物，包含与选自(SEQ ID Nos 67-92)和(SEQ ID Nos：116-191)的序列具有至少80％序列同一性的寡核苷酸。
第29条。第28条中的化合物，包含与选自(SEQ ID Nos 67-92)和(SEQ ID Nos：116-191)的序列具有至少90％序列同一性的寡核苷酸。
第30条。第1-29条中任一项的化合物，其中所述寡核苷酸包含至少5个脱氧核糖核苷酸单位并且能够招募RNase。
第31条。第1-30条中任一项的化合物，其中所述化合物与PB2 vRNA区域的结合破坏PB2 vRNA的整体二级RNA结构。
第32条。第1-30条中任一项的化合物，其中所述化合物与PB2 vRNA区域的结合抑制PB2 vRNA的包装能力。
第33条。第1-32条中任一项的化合物，其中所述化合物是具有增强的细胞摄取的寡核苷酸缀合物。
第34条。第33条中的化合物，其中所述化合物是寡核苷酸-脂质缀合物。
第35条。第1-33条中任一项的化合物，其中所述化合物是与细胞特异性蛋白缀合的寡核苷酸。
第36条。一种在细胞中抑制甲型流感病毒的方法，所述方法包括：使包含具有PSL2基序的病毒RNA(vRNA)样本与有效量的药剂接触，所述有效量的药剂特异性结合PSL2基序以抑制所述甲型流感病毒。第37条。第36条中的方法，其中所述药剂是包含至少8个与vRNA的PSL2基序互补的核苷亚基的寡核苷酸化合物或其盐。
第38条。第36或37条中的方法，其中所述药剂是符合第1-35条之一的寡核苷酸化合物。
第39条。第36-38条中任一项的方法，其中所述样本中的vRNA是PB2 vRNA。
第40条。第36-39条中任一项的方法，其中所述试剂与样本接触会导致病毒的至少1log10滴度缺陷。
第41条。第36-39条中任一项的方法，其中所述试剂与样本接触会导致病毒的至少2log10滴度缺陷。
第42条。第36-41条中任一项的方法，其中所述药剂破坏vRNA的PSL2基序的整体结构。
第43条。第36-41条中任一项的方法，其中所述药剂抑制vRNA的PSL2基序的包装能力。
第44条。第36-41条中任一项的方法，其中所述vRNA分离自病毒粒子或细胞。
第45条。第36-41条中任一项的方法，其中所述vRNA包含在病毒粒子或受感染细胞中。
第46条。第36-45条中任一项的方法，其中所述样本是体外的。
第47条。第36-41或45条中任一项的方法，其中所述样本是体内的。
第48条。一种治疗或预防受试者中甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括：向有需要的受试者给予包含有效量活性剂的药物组合物，所述活性剂特异性结合病毒RNA(vRNA)的PSL2基序。
第49条。第48条中的方法，其中所述vRNA是PB2 vRNA。
第50条。第48-49条中任一项的方法，其中所述活性剂是包含寡核苷酸序列的化合物，所述寡核苷酸序列包含与PB2 vRNA区域互补的至少8个核苷亚基。
第51条。第48-50条中任一项的方法，其中所述药剂是符合第1-35条之一的寡核苷酸化合物。
第52条。第48-51条中任一项的方法，其中所述受试者处于甲型流感病毒感染的风险中，并且所述寡核苷酸化合物的给药可保护所述受试者免受感染达1周或更长时间(例如，2周或更长时间、3周或更长时间、1个月或更长时间、2个月或更长时间、3个月或更长时间等)。
第53条第52条中的方法，其中所述给药包括每周、每两周或每月给予有效量的寡核苷酸化合物。
第54条。第48-53条中任一项的方法，其中所述给药导致受试者样本中病毒的至少1log10滴度缺陷。
第55条。第48-53条中任一项的方法，其中所述给药导致受试者样本中病毒的至少2log10滴度缺陷。
第56条。第48-53条中任一项的方法，其中所述活性剂是具有增强的细胞摄取的寡核苷酸缀合物。
第57条。第48-55条中任一项的方法，其中所述活性剂是与细胞特异性蛋白缀合的寡核苷酸。
第58条。第48-55条中任一项的方法，其中所述药物组合物包含细胞摄取增强剂。
第59条。第48-55条中任一项的方法，其中所述药物组合物进一步包含选自第二寡核苷酸活性剂和抗病毒药物的另外活性剂。
第60条。第48-55条中任一项的方法，其中所述活性剂是siRNA、shRNA、反义RNA或反义DNA。
第61条。第48-55条中任一项的方法，其中所述受试者处于感染甲型流感病毒的风险中，并且所述方法可预防感染。
第62条。第48-55条中任一项的方法，其中所述受试者被诊断患有或疑似患有甲型流感病毒感染，并且所述方法可治疗感染。
第63条。一种筛选抑制细胞中甲型流感病毒能力的候选药剂的方法，所述方法包括：
将包含PSL2基序的病毒RNA(vRNA)的样本与候选药剂接触；和
确定候选药剂是否特异性结合PSL2基序；
其中特异性结合PSL2基序的药剂将抑制细胞中的甲型流感病毒。
第64条。第63条中的方法，其中所述候选药剂选自：小分子、核酸和多肽。
第65条。第64条中的方法，其中所述测定步骤包括检测细胞参数，其中与未接触候选药剂的细胞相比，细胞中参数的变化表明候选药剂特异性结合PSL2基序。
第66条。第63-65条中任一项的方法，其中所述特异性结合PSL2基序的药剂将用于治疗患有甲型流感病毒感染的受试者。
第67条。一种治疗或预防受试者呼吸道病毒感染的方法，所述方法包括：
向有需要的受试者给予包含有效量活性剂的药物组合物，所述活性剂特异性结合病毒RNA(vRNA)的靶基序或与所述靶基序相关的受试者的miRNA。
第68条。第67条中的方法，其中所述药剂是一种寡核苷酸化合物，其包含选自由SEQ ID NOS：45至907组成的组。
第69条。第68条中的方法，其中所述方法包括给予两种或更多种序列，其选自由SEQ ID NOS：45至907组成的组的序列。。
第70条。依据第69条，所述方法中两种或多种序列针对不同的呼吸道病毒。
第71条。第67-70条中任一项的方法，其中所述受试者处于呼吸道病毒感染的风险中，并且所述寡核苷酸化合物的给药可保护所述受试者免受感染达1周或更长时间(例如，2周或更长时间、3周或更长时间、1个月或更长时间、2个月或更长时间、3个月或更长时间等)。
第72条第71条中的方法，其中所述给药包括每周、每两周或每月给予有效量的寡核苷酸化合物。
第73条。第67至72条中任一项的方法，其中所述给药导致受试者样本中病毒的至少1log10滴度缺陷。
第74条。第67-73条中任一项的方法，其中所述受试者处于感染呼吸道病毒的风险中，并且所述方法可预防感染。
第75条。第67-73条中任一项的方法，其中所述受试者被诊断患有或疑似患有呼吸道病毒感染，并且所述方法可治疗感染。
在至少一些先前描述的实施例中，在一个实施例中使用的一个或多个元件可以在另一个实施例中互换使用，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解，在不背离所要求保护的可专利主题范围的情况下，可以对上述方法和结构进行各种其他的省略、添加和修改。所有这样的修改和改变旨在落入由所附权利要求限定的可专利主题范围内。
本领域技术人员将理解，一般而言，本文中使用的术语，尤其是所附权利要求(例如，所附权利要求的主体)中使用的术语，通常旨在作为“开放”术语(例如，术语“including”应解释为“包括但不限于”，术语“having”应解释为“至少具有”，术语“includes”应解释为“包括但不限于”等)。本领域技术人员将进一步理解，如果打算引用特定数量的权利要求列举，则这种意图将在权利要求中有明确列出，并且如果没有这种列举，则不存在这种意图。例如，为了有助于理解，以下所附权利要求可能包含使用介绍性短语“至少一个”和“一个或多个”来介绍权利要求列举。然而，此类短语的使用不应被解释为暗示由不定冠词“a”或“an”引入的权利要求列举将包含此类引入的权利要求列举的任何特定权利要求限制为仅包含一个此类列举的实施例，即使同一权利要求包括介绍性短语“一个或多个”或“至少一个”和不定冠词，例如“a”或“an”(例如，“a”和/或“an”应解释为“至少一个”或“一个或多个”)；用于介绍权利要求列举的定冠词的使用也是如此。此外，即使明确列举了所引入的权利要求的具体数目，本领域技术人员将认识到，这种列举应该被解释为至少列举的数目(例如，没有其他修饰词的最基本的“两个列举”，指至少两个列举，或两个或多个列举)。此外，在使用类似于“A、B和C中的至少一个等”的结构时，一般来说，这种结构意在使本领域技术人员理解惯例(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于以下系统：单独A、单独B、单独C、A和B一起、A和C一起、B和C一起、和/或A和B和C一起，等等)。
在使用类似于“A、B或C中的至少一个等”的结构时，一般来说，这种结构意在使本领域技术人员理解惯例(例如，“具有A、B或C中的至少一个的系统”将包括但不限于以下系统：单独A、单独B、单独C、A和B一起、A和C一起、B和C一起、和/或A和B和C一起，等等)。本领域技术人员将进一步理解，实际上表示两个或多个替代术语的任何分离词和/或短语，无论是在说明书、权利要求书或附图中，都应理解为考虑包括一个术语、另一个术语、或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
此外，在根据马库什组描述本公开的特征或方面时，本领域技术人员将认识到，本公开也因此根据马库什组的任何个体成员或成员子组来描述。
如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，例如就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以容易地识别为充分描述，并且能够将相同的范围分解成至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性示例，本文讨论的每个范围都可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还将理解，所有语言，例如“最多”、“至少”、“大于”、“小于”等等，都包括所列举的数字，并指代范围，随后可以将其分解为如上所述的子范围。最后，如本领域技术人员将理解的，一个范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1、2或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1、2、3、4或5个物品的组，等等。
尽管为了清楚理解的目的，已经通过说明和示例的方式对前述发明进行了一些详细描述，但对于本领域普通技术人员来说，根据本发明的教导，在不背离所附权利要求的精神或范围的情况下，可以对其进行某些改变和修改是显而易见的。
因此，前述仅说明了本发明的原理。应当理解，本领域技术人员将能够设计出各种布置，尽管在此没有明确地描述或示出，但这些布置体现了本发明的原理，并且包括在其精神和范围内。
此外，本文列举的所有示例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为促进本领域做出贡献的概念，并且应被解释为不限于这些具体列举的示例和条件。此外，本文列举的本发明的原理、方面和实施例及其具体示例的所有陈述旨在涵盖其结构和功能等同物。此外，此类等同物旨在包括当前已知的等同物和未来开发的等同物，即，开发的执行相同功能的任何元件，无论结构如何。此外，本文所公开的任何内容均不旨在奉献给公众，无论此类公开内容是否在权利要求中明确列出。
因此，本发明的范围并不局限于本文所示和所述的示例性实施例。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求体现。在权利要求中，35 U.S.C.§112(f)或35 U.S.C.§112(6)明确定义为仅当在权利要求中的此类限制的开头引用了确切短语“means for”或确切短语“step for”时，才被援引用于权利要求中的限制；如果权利要求的限制中未使用此类确切短语，则不援引35 U.S.C.§112(f)或35 U.S.C.§112(6)。
Claims (20)
1.一种寡核苷酸化合物或其盐，其包含寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列包含与PB2病毒RNA(vRNA)或其突变体的包装茎环2(PSL2)基序的区域互补的至少8个核苷亚基，其中所述寡核苷酸化合物可抑制病毒产率。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含选自以下键的核苷间键：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和硫代氨基磷酸酯键。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含一个或多个手性核苷间键。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含桥接核酸(BNA)核苷酸。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中所述BNA核苷酸选自由锁核酸(LNA)核苷酸、亚乙基桥接核酸(ENA)核苷酸和约束乙基(cEt)核苷酸组成的组。
6.根据权利要求1所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含一个或多个2′-修饰的核苷酸。
7.根据权利要求1所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含选自以下的序列：
5’ACCAAAAGAAT 3’(SEQ ID NO：45)；
5’TGGCCATCAAT 3’(SEQ ID NO：46)；
5’TAGCATACTTA 3’(SEQ ID NO：47)；
5’CCAAAAGA 3’(SEQ ID NO：48)；
5’CATACTTA 3’(SEQ ID NO：49)；
5’CAGACACGACCAAAA 3’(SEQ ID NO：50)；
5’TACTTACTGACAGCC 3’(SEQ ID NO：51)；
5’AGACACGACCAAAAG 3’(SEQ ID NO：52)；
5’ACCAAAAGAAT 3’(SEQ ID NO：53)；
5’TGGCCATCAAT 3’(SEQ ID NO：54)；
5’TAGCATACTTA 3’(SEQ ID NO：55)；
5’CGACCAAAAGAATTC 3’(SEQ ID NO：56)；
5’CGACCAAAAGAATTC 3’(SEQ ID NO：57)；
5’GATGGCCATCAATTA 3’(SEQ ID NO：58)；
5’GATGGCCATCAATTA 3’(SEQ ID NO：59)；
5’TCTAGCATACTTACT 3’(SEQ ID NO：60)；
5’TCTAGCATACTTACT 3’(SEQ ID N0：61)；
5’GAATTCGGATGGCCA 3’(SEQ ID NO：62)；
5’GGCCATCAATTAGTG 3’(SEQ ID NO：63)；
5’TTCGGATGGCCATCA 3’(SEQ ID NO：64)；
5’AGCCAGACAGCGA 3’(SEQ ID NO：65)；
5’GACAGCCAGACAGCA 3’(SEQ ID NO：66)；
5’CGACCAAAAGAATT 3’(SEQ ID NO：98)；
5’GACCAAAAGAATTCGG 3’(SEQ ID NO：99)；
5’AGCATACTTACTGACA 3’(SEQ ID NO：100)；
5’CATACTTACTGACA 3’(SEQ ID NO：101)；
5’ATACTTACTGACAG 3’(SEQ ID NO：102)；
5’CATACTTACTGACAGC 3’(SEQ ID NO：103)；
5’AGACAGCGACCAAAAG 3’(SEQ ID NO：104)；
5’ACAGCGACCAAAAG(SEQ ID NO：105)；
5’CAGCCAGACAGCGAC 3’(SEQ ID NO：106)；
5’CAGCCAGACAGCGA 3’(SEQ ID NO：107)；
5’ACAGCCAGACAGCGA 3’(SEQ ID NO：108)；
5’GACAGCCAGACAGCG 3’(SEQ ID NO：109)；
5’CATCAATTAGTGTCG 3’(SEQ ID NO：110)；
5’CCATCAATTAGTGTCG 3’(SEQ ID NO：111)；
5’GCCATCAATTAGTGTG 3’(SEQ ID NO：112)；
5’AAGAATTCGGATGGC 3’(SEQ ID NO：113)；
5’CAGACAGCGACCAA 3’(SEQ ID NO：114)；和
5’TGACAGCCAGACAGC 3’(SEQ ID NO：115)，
其中所述寡核苷酸包含一种或多种修饰核酸(例如，BNA、LNA、ENA、cEt或2′_修饰)。
8.根据权利要求1所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含选自以下的序列：
5’GAATTCGGATGGCCA 3’(SEQ ID NO：62)；
5’AGCCAGACAGCGA 3’(SEQ ID NO：65)；
5’CGACCAAAAGAATT 3’(SEQ ID NO：98)；
5’GACCAAAAGAATTCGG 3’(SEQ ID NO：99)；
5’AGCATACTTACTGACA 3’(SEQ ID NO：100)；
5’CATACTTACTGACA 3’(SEQ ID NO：101)；
5’ATACTTACTGACAG 3’(SEQ ID NO：102)；
5’CATACTTACTGACAGC 3’(SEQ ID NO：103)；
5’AGACAGCGACCAAAAG 3’(SEQ ID NO：104)；
5’ACAGCGACCAAAAG(SEQ ID NO：105)；
5’CAGCCAGACAGCGAC 3’(SEQ ID NO：106)；
5’CAGCCAGACAGCGA 3’(SEQ ID NO：107)；
5’ACAGCCAGACAGCGA 3’(SEQ ID NO：108)；
5’GACAGCCAGACAGCG 3’(SEQ ID NO：109)；
5’CATCAATTAGTGTCG 3’(SEQ ID NO：110)；
5’CCATCAATTAGTGTCG 3’(SEQ ID NO：111)；
5’GCCATCAATTAGTGTG 3’(SEQ ID NO：112)；
5’AAGAATTCGGATGGC 3’(SEQ ID NO：113)；
5’CAGACAGCGACCAA 3’(SEQ ID NO：114)；和
5’TGACAGCCAGACAGC 3’(SEQ ID NO：115)。
9.根据权利要求1所述的化合物，其包含与选自(SEQ ID NOs：45-66)和(SEQ ID NOs：98-115)的序列具有至少70％序列同一性的寡核苷酸序列
10.根据权利要求8所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含至少5个脱氧核糖核苷酸单位并且能够招募RNase。
11.根据权利要求7所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含选自以下的序列：
LNA19：5’GAAttcggatgGCCA 3’(SEQ ID NO：86)；
LNA22：5’AGCCagacagCGA 3’(SEQ ID NO：89)；
LNA22.2：5’CAGCcagacagCGAC 3’(SEQ ID NO：116)；
LNA22.3：5’CAGccagacagCGAC 3’(SEQ ID NO：117)；
LNA22.5：5’CAGccagacaGCGA 3’(SEQ ID NO：118)；
LNA22.6：5’CAGccagacagCGA 3’(SEQ ID NO：119)；
LNA22.7：5’CAGCcagacagCGA 3’(SEQ ID NO：120)；
LNA22.8：5’ACAgccagacagCGA 3’(SEQ ID NO：121)；
LNA22.9：5’ACAGccagacaGCGA 3’(SEQ ID NO：122)；
LNA22.10：5’ACAgccagacaGCGA 3’(SEQ ID NO：123)；
LNA22.i1：5’GACAgccagacaGCG 3’(SEQ ID NO：124)；
LNA22.13：5’GACagccagacaGCG 3’(SEQ ID NO：125)；
LNA22.14：5’GACAgccagacAGCG(SEQ ID NO：126)；
LNA24：5’CATcaattagtgTCG 3’(SEQ ID NO：127)；
LNA25：5’CCAtcaattagtgTCG 3’(SEQ ID NO：128)；
LNA26：5’GCCatcaattagtGTG 3’(SEQ ID NO：129)；
LNA27：5’AAGAattcggaTGGC 3’(SEQ ID NO：130)；
LNA28：5’CAGacagcgacCAA 3’(SEQ D NO：131)；
LNA29：5’TGAcagccagacAGC 3’(SEQ ID NO：132)；
LNA14.5：5’CGACcaaaagaATT 3’(SEQ ID NO：135)；
LNA14.8：5’CGACcaaaagaaTTC 3’(SEQ ID NO：137)；
LNA14.28：5’GACcaaaagaatTCGG 3’(SEQ ID NO：148)；
LNA14.30：5’GACCaaaagaattCGG 3’(SEQ ID NO：149)；
LNA9.1：5’AGCAtacttactGACA 3’(SEQ ID NO：159)；
LNA9.2a：5’CATacttactgACA 3’(SEQ ID NO：160)；
LNA9.8：5’ATActtactgACAG(SEQ ID NO：164)；
LNA9.12：5’CATActtactgacAGC(SEQ D NO：167)；
LNA8a：5’AGAcagcgaccaaAAG(SEQ ID NO：188)；
LNA8a.1：5’AGACagcgaccaAAAG(SEQ ID NO：189)；和
LNA8a.2：5’ACAGcgaccaAAAG(SEQ ID NO：190)，
其中大写字母表示LNA核苷酸，小写字母表示DNA核苷酸。
12.根据权利要求1所述的化合物，其包含与选自LNA1-LNA29(SEQ ID NOs：67-92和SEQID NOs：116-191)的序列具有至少70％序列同一性的寡核苷酸序列。
13.一种在细胞中抑制甲型流感病毒的方法，所述方法包括：使包含具有PSL2基序的病毒RNA(vRNA)样本与有效量的根据权利要求1所述的药剂接触。
14.根据权利要求13所述的方法，其中将所述样本与药剂接触导致所述病毒的至少1log10滴度缺陷，或者所述药剂破坏了所述vRNA的PSL2基序的整体结构。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述vRNA分离自病毒粒子或细胞。
16.一种治疗或预防受试者甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括：
向有需要的受试者给予包含有效量的根据权利要求1所述的寡核苷酸化合物的药物组合物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述受试者处于甲型流感病毒感染的风险中，并且所述寡核苷酸化合物的给药可保护所述受试者免受感染达1周或更长时间。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述给药包括每周、每两周或每月给予有效量的所述寡核苷酸化合物。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述药物组合物进一步包含选自第二寡核苷酸活性剂和抗病毒药物的另外活性剂。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述受试者已被诊断为患有或疑似患有甲型流感病毒感染。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| REG | Reference to a national code |
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