CN115997009A - 用于在体内转导造血干细胞和祖细胞的方法和组合物 - Google Patents

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德怀特·莫罗
A·利伯
汉斯-彼得·基姆
迈克尔·库克
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Abstract

本发明涉及造血干细胞和祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cells，HSPC)在受试者(诸如人类受试者)中的体内转导，以及罹患多种病理(诸如尤其是血液疾病、代谢紊乱、癌症和自身免疫性疾病)的受试者的治疗。

Description

用于在体内转导造血干细胞和祖细胞的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年4月27日提交的美国临时申请第63/016,212号和于2020年5月12日提交的美国临时申请第63/023,749号的权益和优先权，其每一个的内容特此通过引用以其整体并入。
序列表
本申请包括序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子提交并且特此通过引用以其整体并入。创建于2021年4月22日的所述ASCII副本被命名为MGA-008WO_SL.txt，并且大小为3,440字节。
发明领域
本发明涉及造血干细胞和祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cells,HSPC)在受试者(诸如人类受试者)中的体内转导，以及罹患多种病理(诸如尤其是血液疾病、代谢紊乱、癌症和自身免疫性疾病)的受试者的治疗。
发明背景
尽管在医学领域取得了进步，但对治疗造血系统病理，诸如尤其是特定血细胞的疾病(例如，镰状细胞病(SCD))、代谢紊乱、癌症和自身免疫性状况仍然存在需求。目前对这样的疾病进行基因治疗的方法包括离体造血干细胞和祖细胞基因治疗，这是一种需要细胞培养和毒性调节方案的具有复杂的制备要求的昂贵程序。
因此，造血干细胞和祖细胞的体内转导可以是期望的，特别是在离体基因治疗具有挑战性的地理区域。然而，鉴于骨髓基质的物理屏障，造血干细胞和祖细胞的体内直接转导是低效的。
此外，在患有一些血红蛋白病(如镰状细胞病)的患者中，使用G-CSF作为动员剂是禁忌的。此外，G-CSF导致非选择性骨髓细胞动员，这引起外周中的白细胞增多和更高数目的细胞因子产生细胞。这增加了外周中与静脉注射的病毒载体接触的细胞因子产生细胞的数目，其继而有助于动员的动物中比非动员的动物中更高的细胞因子水平。外周中动员的(定向的)骨髓细胞也隔离病毒载体，从而减少原始HSPC的有效剂量。此外，与G-CSF/AMD3100相关的五天治疗方案和高成本证明了开发替代性动员方案的合理性。
因此，目前需要改善造血干细胞和祖细胞的体内转导的组合物和方法。
发明概述
本发明提供了用于造血干细胞和祖细胞的体内转导的组合物和方法。例如，这样的方法可以用于提供基因治疗以纠正引起血细胞疾病的基因缺陷。
方法可包括使用如本文描述的C-X-C趋化因子受体2型(CXCR2)激动剂，诸如Gro-β或其变体，诸如Gro-β的截短形式(例如,Gro-βT)，任选地与C-X-C趋化因子受体4型(CXCR4)拮抗剂诸如1,1'-[1,4-亚苯基双(亚甲基)]-双-1,4,8,11-四-氮杂环十四烷或其变体联合，从骨髓动员造血干细胞和祖细胞。动员的造血干细胞和祖细胞可以用包含选择标志物的核酸转导。选择剂可用于选择已经用包含选择标志物的核酸转导的造血干细胞或祖细胞，由此没有用包含选择标志物的核酸转导的造血干细胞或祖细胞不能存活。
因此，在一方面，公开内容涉及将从哺乳动物受试者的骨髓动员的造血干细胞或祖细胞的群体转导到外周血中的方法，其中以约0.001mg/kg至约0.1mg/kg的剂量或以约1mg至约8mg的固定剂量使用选自由Gro-β、Gro-βT及其变体组成的组的CXCR2激动剂，将受试者的造血干细胞或祖细胞动员到外周血中。该方法可包括向受试者施用包含选择标志物的核酸以体内转导造血干细胞或祖细胞以及施用选择剂以选择已经用包含选择标志物的核酸转导的造血干细胞或祖细胞，由此没有用包含选择标志物的核酸转导的造血干细胞或祖细胞不能存活。
在某些实施方案中，核酸包含基因编辑或遗传工程化系统的组分，诸如CRISPR-Cas9系统、睡美人转座酶100x(SB100x)系统或重组酶系统(例如FLP-FRT系统)。
在某些实施方案中，核酸包含治疗基因，诸如γ-珠蛋白基因。在某些实施方案中，核酸包含治疗基因，治疗基因包括编码以下的基因的至少一部分：FANC A-F；因子VIII(F8)；因子IX(F9)；因子X(F10)；威斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白(WASP)；细胞色素B-245β链(CYBB)；中性粒细胞表达弹性蛋白酶(ELANE)；血红蛋白亚基α(HBA)；血红蛋白亚基β(HBB)；丙酮酸激酶、肝脏和RBC(PKLR)；核糖体蛋白S19(RPS19)；ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)；芳基硫酸酯酶A(ARSA)；葡萄糖神经酰胺酶β(GBA)；艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)；艾杜糖醛酸酶，α-L(IDUA)；T细胞免疫调节物1(TCIRG1)；腺苷脱氨酶(ADA)；白细胞介素2受体亚基γ(IL2RG)；布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)；腺苷脱氨酶(ADA)；IL2RG；CD40配体(CD40LG)；叉头盒P3(FOXP3)；白细胞介素4、白细胞介素10、白细胞介素13(IL-4、IL-10、IL-13)；穿孔素1(PRF1)；人工T细胞受体(TCR)；嵌合抗原受体(CAR)；或C-C基序趋化因子受体5(CCR5)。
在某些实施方案中，选择标志物是人类O(6)-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)突变体。
在某些实施方案中，选择剂包括甲基化剂。在某些实施方案中，甲基化剂选自O6-苄基鸟嘌呤(O6BG)、双氯乙基亚硝基脲(BCNU)、替莫唑胺及其组合。
在某些实施方案中，核酸存在于载体中，诸如慢病毒载体、rAAV载体或HDAd5/35++载体。
在某些实施方案中，核酸在施用CXCR2激动剂和/或CXCR4拮抗剂后约10分钟至约10小时施用。
在某些实施方案中，选择剂在施用核酸后约4周和约24周之间施用。
在某些实施方案中，CXCR2激动剂的剂量为大于约0.015mg/kg至小于约0.05mg/kg。在某些实施方案中，CXCR2激动剂以约0.03mg/kg的剂量施用。在某些实施方案中，CXCR2激动剂以约2.5mg至约5.5mg的固定剂量施用。在某些实施方案中，CXCR2激动剂以约1.3mg的固定剂量施用。在某些实施方案中，CXCR2激动剂包括Gro-βT。
在某些实施方案中，该方法还包括施用CXCR2激动剂的步骤。
在某些实施方案中，使用CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂将受试者的造血干细胞或祖细胞动员到外周血中。在某些实施方案中，CXCR4拮抗剂是普乐沙福(plerixafor)。在某些实施方案中，普乐沙福以约240μg/kg的剂量施用至受试者。
在某些实施方案中，CXCR2激动剂与CXCR4拮抗剂同时施用。在某些实施方案中，CXCR2激动剂在CXCR4拮抗剂之后施用。在某些实施方案中，CXCR2激动剂在施用CXCR4拮抗剂的约4小时内施用。在某些实施方案中，CXCR2激动剂在CXCR4拮抗剂后约2小时施用。在某些实施方案中，CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂各自在连续两天被施用。在某些实施方案中，CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂各自在连续两天每天一次被施用。
序列表
<110> 美真达治疗公司等
<120> 用于在体内转导造血干细胞和祖细胞的方法和组合物
<130> MGA-008WO
<140>
<141>
<150> 63/016,212
<151> 2020-04-27
<150> 63/023,749
<151> 2020-05-12
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 73
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> source
<223> /注释="对未知的描述：Gro-β序列"
<400> 1
Ala Pro Leu Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln
1               5                   10                  15
Gly Ile His Leu Lys Asn Ile Gln Ser Val Lys Val Lys Ser Pro Gly
            20                  25                  30
Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Gln
        35                  40                  45
Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Lys Lys Ile Ile Glu
    50                  55                  60
Lys Met Leu Lys Asn Gly Lys Ser Asn
65                  70
<210> 2
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> source
<223> /注释="对人工序列的描述：合成多肽"
<400> 2
Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln Gly Ile His Leu
1               5                   10                  15
Lys Asn Ile Gln Ser Val Lys Val Lys Ser Pro Gly Pro His Cys Ala
            20                  25                  30
Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Gln Lys Ala Cys Leu
        35                  40                  45
Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Lys Lys Ile Ile Glu Lys Met Leu Lys
    50                  55                  60
Asn Gly Lys Ser Asn
65
<210> 3
<211> 73
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> source
<223> /注释="对人工序列的描述：合成多肽"
<400> 3
Ala Pro Leu Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln
1               5                   10                  15
Gly Ile His Leu Lys Asn Ile Gln Ser Val Lys Val Lys Ser Pro Gly
            20                  25                  30
Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Gln
        35                  40                  45
Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Lys Lys Ile Ile Glu
    50                  55                  60
Lys Met Leu Lys Asp Gly Lys Ser Asn
65                  70
<210> 4
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> source
<223> /注释="对人工序列的描述：合成多肽"
<400> 4
Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln Gly Ile His Leu
1               5                   10                  15
Lys Asn Ile Gln Ser Val Lys Val Lys Ser Pro Gly Pro His Cys Ala
            20                  25                  30
Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Gln Lys Ala Cys Leu
        35                  40                  45
Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Lys Lys Ile Ile Glu Lys Met Leu Lys
    50                  55                  60
Asp Gly Lys Ser Asn
65
附图简述
图1A是用于实施例1中CD46转基因小鼠的体内转导的方案的示意图。使用GCSF+普乐沙福(5天)或使用Gro-β+普乐沙福(同时皮下施用)动员血细胞，并且然后在1小时后向小鼠注射所示的量的整合HDAd5/35++mgmt/GFP载体+HDAd-SB载体。
图1B提供了示出在注射MGTA-145后的各个时间点通过流式细胞术测量的LSK(谱系-cKit+Sca1+)细胞的数目的图。
图1C是示出通过甲基纤维素测定测量的外周血中存在的集落形成细胞的数目的图。
图2提供了示出将来自用GCSF+普乐沙福或Gro-β+普乐沙福动员的小鼠的血液铺板后产生的CFU的数目的图。
图3A提供了示出在普乐沙福后在各个时间点收集的各种类型的细胞数目/mL血液并进行Hemavet分析的图。从左到右的条形代表白细胞(WBC)、中性粒细胞(NE)、淋巴细胞(LY)、单核细胞(MO)和嗜酸性粒细胞(EO)。
图3B提供了示出在注射最后一种药物后一小时，使用MGTA-145+普乐沙福比使用G-CSF+普乐沙福动员更少的单个核细胞(mononuclear cells，MNC)的图。
图3C提供了示出通过明亮甲酚蓝检测到的网织红细胞的百分比的图。
图4示出了实施例1的体内转导/选择方案。通过IV注射用HDAd-mgmt/GFP+HDAd-SB转导动员的CD46转基因小鼠。通过IP注射用O6BG/BCNU在转导后的第4周、第6周、第8周和第10周进行4轮选择。转导后第12周对原代小鼠实施安乐死。从原代小鼠中分离谱系阴性细胞，并输注到致死辐射的C57Bl/6小鼠中。对第二移植的小鼠进行随访至16周，进行最终分析。
图5A是示出根据实施例1的方案转导后各个时间点的外周血单个核细胞(PBMC)中GFP标志的图。
图5B是示出第16周时血液、脾和骨髓单个核细胞(MNC)中CD3-、CD19-和Gr-1阳性细胞上GFP表达的图。还示出了骨髓样品中的LSK细胞。
图5C是示出在转导后第16周，对从骨髓分离的谱系阴性细胞进行甲基纤维素测定后，表达GFP+的汇集集落细胞百分比的图。
图6A示出了通过流式细胞术检测PBMC中的人类CD46+细胞所测量的植入百分比。如示出的，MGTA-145+普乐沙福组的白细胞增多远低于G-CSF+普乐沙福组中的白细胞增多。
图6B是示出移植后直到第16周在各个时间点表达GFP的PBMC的百分比的图。
图7A是示出第二移植后第16周血液、脾和骨髓MNC中的细胞组成的图。每个点代表一只动物。未转导的幼稚
Figure BDA0004021082980000061
动物用作对照。
图7B示出了转导后第16周从骨髓中分离的谱系阴性细胞的10天甲基纤维素测定后的集落形成单位(CFU)的数目/2500个Lin-细胞。
图8是示出转导后1小时和6小时小鼠中血清IL-6(pg/ml)水平的图。每个点代表一只动物。来自没有动员的小鼠的样品用作对照。*,p<0.05。
图9A提供了示出在地中海贫血小鼠模型中MGTA-145注射后1小时通过流式细胞术测量的LSK(谱系-cKit+Sca1+)细胞的数目的图。每个点代表一只动物。
图9B提供了示出在地中海贫血(thalassemia)小鼠模型中通过甲基纤维素测定法测量的外周血中出现的集落形成细胞的数目的图。每个点代表一只动物。
图10示出了处理前Hbbth3/CD46tg(地中海贫血)细胞和Hbbtm2/CD46tg(Townes或镰状细胞病模型)细胞的表型。通过对血液涂片进行Giemsa/May-Grünwald染色测量RBC形态。通过明亮甲酚蓝染色测量网织红细胞的百分比。来自CD46小鼠的样品被用作“健康”对照。
详述
本发明提供了用于造血干细胞和祖细胞的体内转导的组合物和方法。例如，这样的方法可以用于提供基因治疗以纠正引起血细胞疾病的基因中的缺陷。
方法可包括使用如本文描述的C-X-C趋化因子受体2型(CXCR2)激动剂，诸如Gro-β或其变体，诸如Gro-β的截短形式(例如，Gro-βT)，任选地与C-X-C趋化因子受体4型(CXCR4)拮抗剂诸如1,1'-[1，4-亚苯基双(亚甲基)]-双-1,4,8,11-四-氮杂环十四烷或其变体联合，从骨髓动员造血干细胞和祖细胞。动员的造血干细胞和祖细胞可以用包含选择标志物的核酸转导。选择剂可用于选择已经用包含选择标志物的核酸转导的造血干细胞或祖细胞，由此没有用包含选择标志物的核酸转导的造血干细胞或祖细胞不能存活。
本发明部分地基于以下发现：可以进行使用CXCR2激动剂(诸如Gro-β、Gro-βT或其变体)，任选地与CXCR4拮抗剂(诸如普乐沙福或其药学上可接受的盐)联合动员的造血干细胞和祖细胞的体内转导，例如，以纠正引起血细胞疾病的基因中的缺陷。另外，CD34+CD90+CD45RA-细胞(一种指示与长期植入相关的干细胞表型的群体)被如本文描述的施用方法有效地动员。因此，使用本文描述的组合物和方法产生的动员的造血干细胞和祖细胞的群体特别适合与体内转导一起使用，用于例如基因治疗。
如本文描述的，造血干细胞能够分化成造血谱系中的众多细胞类型。因此，体内转导可用于纠正细胞类型中的遗传缺陷，并使患者中缺陷或缺乏的细胞类型植入(populate)或再植入。例如，患者可以是罹患一种或更多种血液紊乱诸如尤其是自身免疫性疾病、癌症、血红蛋白病或其他造血病理并且因此需要造血干细胞基因治疗的患者。因此，本发明提供了治疗多种造血状况的方法，造血状况诸如范可尼贫血、血友病A、血友病B、因子X缺乏症、威斯科特-奥尔德里奇综合征、X连锁慢性肉芽肿病、Kostmann’s综合征、α-地中海贫血、β-地中海贫血、镰状细胞病(镰状细胞贫血)、丙酮酸激酶缺乏症、Diamond-Blackfan贫血、X连锁肾上腺脑白质营养不良症、异染性脑白质营养不良症、戈谢病、亨特综合征、I型黏多糖贮积症、骨硬化病、腺苷脱氨酶(ADA)缺陷型重症联合免疫缺陷病、X连锁重症联合免疫缺陷病、X连锁无丙种球蛋白血症、X-连锁高IgM综合征、IPEX综合征、早发性炎性疾病、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症、Schwachman-Diamond综合征、人类免疫缺陷病毒感染和获得性免疫缺陷综合征以及癌症和自身免疫性疾病。
以下部分提供了对CXCR4拮抗剂和CXCR2激动剂的描述，可以将它们施用至受试者从而诱导造血干细胞或祖细胞的群体从干细胞小生境动员到外周血中，此时造血干细胞或祖细胞可经历体内转导，例如，以纠正缺陷基因，用于治疗例如本文描述的一种或更多种干细胞紊乱，诸如癌症、自身免疫性疾病或代谢紊乱。
定义
如本文使用的，术语“约”是指高于或低于所描述的值的10％以内的值。例如，术语“约5nM”指示4.5nM至5.5nM的范围。
如本文使用的，术语“抗体”是指与特定抗原特异性结合或与特定抗原免疫反应的免疫球蛋白分子，并且包括多克隆、单克隆、遗传工程和其他方式修饰形式的抗体，包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体、异源缀合抗体(例如，双特异性抗体、三特异性抗体、和四特异性抗体、双体(diabody)、三体(triabody)和四体(tetrabody))和抗体的抗原结合片段，包括例如Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rIgG和scFv片段。除非另有指示，否则术语“单克隆抗体”(mAb)意指包括能够与靶蛋白特异性结合的完整分子以及抗体片段(包括，例如，Fab和F(ab')2片段)两者。如本文使用的，Fab和F(ab')2片段是指缺乏完整抗体的Fc片段的抗体片段。本文描述了这些抗体片段的实例。
如本文使用的，术语“抗原结合片段”是指抗体的保留与靶抗原特异性结合的能力的一个或更多个片段。抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。抗体片段可以是，例如，Fab、F(ab')2、scFv、双体、三体、亲和体(affibody)、纳米抗体、i-body、适配体或结构域抗体。涵盖术语抗体的“抗原结合片段”的结合片段的实例包括但不限于：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，含有在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)包含VH和VL结构域的dAb；(vi)由VH结构域组成的dAb片段(参见，例如，Ward等人(1989)Nature 341:544-546)；(vii)由VH或VL结构域组成的dAb；(viii)分离的互补决定区(CDR)；和(ix)两个或更多个(例如，两个、三个、四个、五个或六个)分离的CDR的组合，CDR可以任选地通过合成的接头连接。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但它们可以使用重组方法通过接头连接，该接头使得它们能够成为单个蛋白链，其中VL区和VH区配对形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)Science 242:423-426和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。这些抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且可以以与完整抗体相同的方式筛选这些片段的效用。抗原结合片段可以通过重组DNA技术、完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解，或在某些情况下，通过本领域已知的化学肽合成程序产生。
如本文使用的，术语“双特异性抗体”是指，例如，能够结合至少两种不同抗原或同一抗原上的两种不同表位的单克隆抗体，通常是人类或人源化抗体。
如本文使用的，术语“互补决定区”(CDR)是指在抗体的轻链可变结构域和重链可变结构域中均可见的高变区。可变结构域的更高度保守的部分被称为框架区(FR)。描绘抗体的高变区的氨基酸位置可以根据背景和本领域已知的多种定义而变化。可变结构域内的一些位置可以被视为混合高变位置，因为这些位置可以根据一组标准被认为是在高变区内，而根据不同组标准被认为是在高变区外。这些位置中的一个或更多个也可以见于扩展的高变区中。本文描述的抗体可以在这些混合高变位置中含有修饰。天然重链和轻链的可变结构域各自含有通过三个CDR连接的四个框架区，其主要采用β-折叠构型，该CDR形成连接β-折叠结构的环，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每个链中的CDR通过框架区以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的顺序紧密靠近在一起，并且与来自其他抗体链的CDR一起促成抗体的靶结合位点的形成(参见Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,National Institute of Health,Bethesda,MD.,1987)。如本文使用的，除非另有指示，免疫球蛋白氨基酸残基的编号根据Kabat等人的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统进行。
如本文使用的，术语“保守突变”、“保守取代”或“保守氨基酸取代”是指将一个或更多个氨基酸取代为一个或更多个表现出类似的物理化学特性(诸如极性、静电荷和空间体积)的不同的氨基酸。在下表1中总结了20种天然存在的氨基酸中的每一种的这些特性。
表1.天然存在的氨基酸的代表性物理化学特性
Figure BDA0004021082980000101
Figure BDA0004021082980000102
基于A3中的体积：50-100是小的，100-150是中等的，150-200是大的，并且>200是庞大的
从该表理解，保守氨基酸家族包括，例如，(i)G、A、V、L、I、P和M；(ii)D和E；(iii)C、S和T；(iv)H、K和R；(v)N和Q；以及(vi)F、Y和W。因此，保守突变或取代是将一个氨基酸取代为同一氨基酸家族的成员的突变或取代(例如，Ser对Thr或Lys对Arg的取代)。
如本文使用的，“CRU(竞争性再植入单位(competitive repopulating unit))”是指在体内移植后可以被检测到的长期植入干细胞的测量单位。
如本文使用的，术语“双体”是指含有两条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包含通过接头连接的VH和VL结构域，该接头太短(例如，包含五个氨基酸的接头)而不允许同一肽链上的VH和VL结构域的分子内缔合。该构型迫使每个结构域与另一条多肽链上的互补结构域配对，以便形成同源二聚体结构。相应地，术语“三体”是指含有三条肽链的三价抗体，每条肽链含有通过接头连接的一个VH结构域和一个VL结构域，该接头极短(例如，包含1-2个氨基酸的接头)而不允许同一肽链内的VH和VL结构域的分子内缔合。为了折叠成它们的天然结构，以这种方式配置的肽通常是三聚化的，以便将相邻肽链的VH和VL结构域定位成在空间上彼此接近(参见，例如，Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-48)。
如本文使用的，关于基因的术语“破坏”是指阻止功能性基因产物的形成。基因产物仅在实现其正常(野生型)功能时才是功能性的。基因的破坏阻止了由基因编码的功能性因子的表达，并且包括在由基因编码的序列和/或对基因在动物中表达所必需的启动子和/或操作子中插入、缺失或取代一个或更多个碱基。被破坏的基因可以通过例如从动物基因组中去除基因的至少一部分、改变基因以阻止由基因编码的功能性因子的表达、干扰性RNA或通过外源性基因表达显性负性(dominant negative)因子来破坏。遗传修饰造血干细胞/祖细胞的材料和方法被详述于U.S.8,518,701、U.S.2010/0251395和U.S.2012/0222143中，其中每一项的公开内容通过引用以其整体并入本文(在发生冲突的情况下，以本说明书为准)。
如本文使用的，“双重可变结构域免疫球蛋白”(“DVD-Ig”)是指经由接头组合两种单克隆抗体的靶结合可变结构域以产生四价、双靶向单一剂的抗体(参见，例如，Gu等人(2012)Meth.Enzymol.,502:25-41)。
如本文使用的，术语“内源性”描述在特定生物体诸如人类患者中天然存在的物质，诸如分子、细胞、组织或器官(例如，造血干细胞或造血谱系细胞，诸如巨核细胞、凝血细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、原粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、小胶质细胞、粒细胞、单核细胞、破骨细胞、抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、T淋巴细胞或B淋巴细胞)。
如本文使用的，术语“植入潜力”用于指造血干细胞和祖细胞再植入组织的能力，无论这样的细胞是天然循环性的还是通过移植提供。该术语涵盖围绕或导致植入的所有事件，诸如细胞的组织归巢和细胞在感兴趣组织内的定植。使用本领域技术人员已知的任何临床上可接受的参数或通过疾病进展、造血干细胞和祖细胞的存活或接受者的存活来评价受试者的进展，植入效率或植入率可被评价或定量，并且可以包括，例如，评估竞争性再植入单位(CRU)、标志物在干细胞归巢、定植或变成植入到其中的一个或更多个组织)中的掺入或表达。植入也可以通过测量移植后期期间外周血中的白细胞计数来确定。植入还可以通过测量骨髓抽出物样品中转导细胞对骨髓细胞的恢复来评估。
如本文使用的，术语“外源性”描述在特定生物体诸如人类患者中并不天然存在的物质，诸如分子、细胞、组织或器官(例如，造血干细胞或造血谱系细胞，诸如巨核细胞、凝血细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、原粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、小胶质细胞、粒细胞、单核细胞、破骨细胞、抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、T淋巴细胞或B淋巴细胞)。外源性物质包括从外部来源提供至生物体的物质或从外部来源提取的经培养的物质。
如本文使用的，术语“框架区”或“FW区”包括与抗体或其抗原结合片段的CDR相邻的氨基酸残基。FW区残基可以存在于，例如，尤其是人类抗体、人源化抗体、单克隆抗体、抗体片段、Fab片段、单链抗体片段、scFv片段、抗体结构域和双特异性抗体中。
如本文使用的，术语“造血祖细胞”包括能够分化成造血系统的若干种细胞类型，包括但不限于尤其是粒细胞、单核细胞、红细胞、巨核细胞、B细胞和T细胞的多能(pluripotent)细胞。造血祖细胞属于造血细胞谱系并且通常不自我更新。造血祖细胞可以通过例如细胞表面抗原的表达模式来鉴定，并且包括具有以下免疫表型的细胞：Lin-KLS+Flk2-CD34+。造血祖细胞包括短期造血干细胞、多潜能(multi-potent)祖细胞、常见髓样祖细胞、粒细胞-单核细胞祖细胞和巨核细胞-红细胞祖细胞。造血祖细胞的存在可以，例如，通过例如在完整的甲基纤维素测定中检测集落形成单位细胞在功能上来确定，或者通过使用本文描述和本领域已知的流式细胞术和细胞分选测定来检测细胞表面标志物在表型上来确定。
如本文使用的，术语“造血干细胞”(“HSC”)是指具有自我更新和分化成含有不同谱系细胞的成熟血细胞的能力的未成熟的血细胞，所述谱系细胞包括但不限于粒细胞(例如，早幼粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、红细胞(例如，网织红细胞、红细胞)、凝血细胞(例如，原巨核细胞、产生血小板的巨核细胞、血小板)、单核细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞)、树突状细胞、小胶质细胞、破骨细胞和淋巴细胞(例如，NK细胞、B细胞和T细胞)。这样的细胞可以包括CD34+细胞。CD34+细胞是表达CD34细胞表面标志物的未成熟细胞。在人类中，CD34+细胞被认为包括具有以上定义的干细胞特性的细胞亚群，而在小鼠中，HSC是CD34-。另外，HSC还指长期再植入HSC(LT-HSC)和短期再植入HSC(ST-HSC)。基于功能潜力和细胞表面标志物表达，LT-HSC和ST-HSC是分化的。例如，人类HSC是CD34+、CD38-、CD45RA-、CD90+、CD49F+和lin-(对于成熟谱系标志物(包括CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD10、CD11B、CD19、CD20、CD56、CD235A)呈阴性)。在小鼠中，骨髓LT-HSC是CD34-、SCA-1+、C-kit+、CD135-、Slamfl/CD150+、CD48-和lin-(对于成熟谱系标志物(包括Ter119、CD11b、Gr1、CD3、CD4、CD8、B220、IL7ra)呈阴性)，而ST-HSC是CD34+、SCA-1+、C-kit+、CD135-、Slamfl/CD150+和lin-(对于成熟谱系标志物(包括Ter119、CD11b、Gr1、CD3、CD4、CD8、B220、IL7ra)呈阴性)。另外，在内稳态条件下，ST-HSC比LT-HSC更少地静止并且更多地增殖。然而，LT-HSC具有更大的自我更新潜力(即，它们在整个成年期存活，并且可以通过连续接受者连续移植)，而ST-HSC具有有限的自我更新(即，它们仅在有限的时间段内存活，并且不具备连续移植潜力)。这些HSC中的任一种都可以用于本文描述的方法中。ST-HSC特别有用，因为它们是高度增殖性的，并且因此可以更快地产生分化的后代。
如本文使用的，术语“造血干细胞功能潜力”是指造血干细胞的功能特性，其包括1)多潜能性(multi-potency)(其是指分化成多种不同血液谱系细胞的能力，该血液谱系细胞包括但不限于粒细胞(例如，早幼粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、红细胞(例如，网织红细胞、红细胞)、凝血细胞(例如，原巨核细胞、产生血小板的巨核细胞、血小板)、单核细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞)、树突状细胞、小胶质细胞、破骨细胞和淋巴细胞(例如，NK细胞、B细胞和T细胞))，2)自我更新(其是指造血干细胞产生与母细胞具有等同潜力的子细胞的能力，并且此外该能力可以在个体的整个寿命中反复发生而不会衰竭)，以及3)造血干细胞或其后代被重新引入到移植物接受者的能力，届时它们归巢至造血干细胞小生境，并且重建富有成效的和持续的血细胞生成。
如本文使用的，术语“人类抗体”是指其中抗体蛋白的基本上每一部分(例如，所有的CDR、框架区、CL、CH结构域(例如，CH1、CH2、CH3)、铰链以及VL和VH结构域)在人类中基本上无免疫原性、仅具有微小的序列变化或变异的抗体。人类抗体可以在人类细胞中产生(例如，通过重组表达)或由能够表达功能重排的人类免疫球蛋白(诸如重链和/或轻链)基因的非人类的动物或原核或真核细胞产生。当人类抗体是单链抗体时，它可以包括在天然人类抗体中不存在的接头肽。例如，Fv可以含有连接重链的可变区和轻链的可变区的接头肽，诸如二至约八个甘氨酸或其他氨基酸残基。这样的接头肽被认为是人类来源的。人类抗体可以通过本领域已知的多种方法制备，所述方法包括使用源自人类免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。人类抗体还可以使用不能表达功能性内源性免疫球蛋白但可以表达人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生(参见，例如，PCT公布第WO 1998/24893号；第WO1992/01047号；第WO 1996/34096号；第WO 1996/33735号；美国专利第5,413,923号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,569,825号；第5,661,016号；第5,545,806号；第5,814,318号；第5,885,793号；第5,916,771号；和第5,939,598号)。
如本文使用的，术语“人源化”抗体是指包含来源于非人类免疫球蛋白的最少序列的非人类抗体。通常，人源化抗体含有至少一个并且通常两个可变结构域的基本上全部，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人类免疫球蛋白的CDR区。全部或基本上全部FW区也可以是具有人类免疫球蛋白序列的FW区。人源化抗体还可以含有至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人类免疫球蛋白共有序列的恒定区。抗体人源化的方法是本领域已知的，并且已经被描述于例如Riechmann等人(1988)Nature332:323-7；美国专利第5,530,101号；第5,585,089号；第5,693,761号；第5,693,762号；和第6,180,370号中。
如本文使用的，“需要”体内转导和/或基因治疗的患者包括在一种或更多种血细胞类型方面表现出缺乏或缺陷的患者，以及患有干细胞紊乱、自身免疫性疾病、癌症或本文描述的其他病理的患者。造血干细胞通常表现出：1)多潜能性，并且因此可以分化成多种不同的血液谱系细胞，包括但不限于粒细胞(例如，早幼粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、红细胞(例如，网织红细胞、红细胞)、凝血细胞(例如，原巨核细胞、产生血小板的巨核细胞、血小板)、单核细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞)、树突状细胞、小胶质细胞、破骨细胞和淋巴细胞(例如，NK细胞、B细胞和T细胞)，2)自我更新并且因此可以产生与母细胞具有等同潜力的子细胞，以及3)进行体内转导的能力，之后它们归巢至造血干细胞小生境并且重建富有成效的和持续的血细胞生成。例如，患者可以罹患血红蛋白病(例如，非恶性血红蛋白病)，诸如镰状细胞贫血、地中海贫血、范可尼贫血、再生障碍性贫血和威斯科特-奥尔德里奇综合征。受试者可以是罹患以下的受试者：腺苷脱氨酶重症联合免疫缺陷病(ADA SCID)、HIV/AIDS、异染性脑白质营养不良、Diamond-Blackfan贫血和Schwachman-Diamond综合征。受试者可以患有或受以下影响：遗传性血液紊乱(例如，镰状细胞贫血)或自身免疫性紊乱。另外或可选地，受试者可以患有或受以下影响：恶性肿瘤，诸如神经母细胞瘤或血液学癌症。在一些实施方案中，受试者可以患有白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施方案中，受试者患有急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，受试者患有骨髓增生异常综合征。在一些实施方案中，受试者患有自身免疫性疾病，诸如硬皮病、多发性硬化、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、1型糖尿病或本文描述的另一种自身免疫性病理。在一些实施方案中，受试者需要嵌合抗原受体T细胞(CART)疗法。在一些实施方案中，受试者患有或以其他方式受代谢性贮积紊乱影响。受试者可以罹患选自由以下组成的组的代谢紊乱或以其他方式受选自由以下组成的组的代谢紊乱影响：糖原贮积病、黏多糖贮积病、戈谢病、赫尔勒病、鞘脂贮积病、异染性脑白质营养不良，球状细胞脑白质营养不良、脑肾上腺脑白质营养不良、或可以受益于本文所公开的治疗和疗法的任何其他疾病或紊乱，所述其他疾病或紊乱包括但不限于重症联合免疫缺陷病、Wiscott-Aldrich综合征、高免疫球蛋白M(IgM)综合征、切东病(Chediak-Higashi disease)、遗传性淋巴组织细胞增多症、骨硬化病、成骨不全症、贮积病、重型地中海贫血、镰状细胞病、系统性硬化、系统性红斑狼疮、多发性硬化、青少年类风湿性关节炎和在“Bone Marrow Transplantation forNon-Malignant Disease,”ASH Education Book,1:319-338(2000)”中描述的疾病或紊乱，其公开内容在其涉及可以通过施用造血干细胞移植疗法来治疗的病理时通过引用以其整体并入本文。
如本文使用的，术语“白细胞”是指一组异质的有核血细胞类型，并且不包括红细胞和血小板。白细胞可以分为两大类：多形核细胞，其包括嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，以及单个核细胞(mononucleocytes)，其包括淋巴细胞和单核细胞(monocytes)。多形核细胞含有许多胞质颗粒和多叶核(multilobed nucleus)且包括以下几种：嗜中性粒细胞，其通常为变形虫状，有吞噬作用，并且被碱性染料和酸性染料二者染色；以及嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，其分别含有被酸性染料和碱性染料染色的胞质颗粒。
如本文使用的，术语“淋巴细胞”是指参与免疫应答产生的单个核白细胞。通常，淋巴细胞包括B淋巴细胞、T淋巴细胞和NK细胞。
如本文使用的，术语“动员(mobilize)”和“动员(mobilization)”是指这样的过程，通过该过程造血干细胞或祖细胞的群体从干细胞小生境诸如受试者的骨髓被释放到外周血循环中。可以通过例如评估从受试者分离的外周血样品中的造血干细胞或祖细胞的数量或浓度来监测造血干细胞和祖细胞的动员。例如，在将造血干细胞或祖细胞动员方案向受试者施用后，可以从受试者抽取外周血样品，并且随后可以评估外周血样品中的造血干细胞或祖细胞的数量或浓度。动员方案可以包括，例如，CXCR4拮抗剂，诸如本文描述的CXCR4拮抗剂(例如，普乐沙福或其变体)，以及CXCR2激动剂，诸如本文描述的CXCR2激动剂(例如，Gro-β或其变体，诸如Gro-β的截短物，例如，Gro-βT)。可以将施用动员方案后从受试者分离的外周血样品中造血干细胞或祖细胞的数量或浓度与施用动员方案前从受试者分离的外周血样品中造血干细胞或祖细胞的数量或浓度进行比较。在施用动员方案后，观察到受试者的外周血中造血干细胞或祖细胞的数量或浓度增加，是受试者对动员方案有响应并且造血干细胞和祖细胞已经从一个或更多个干细胞小生境诸如骨髓被释放到外周血液循环中的指示。在一些实施方案中，在施用动员方案后，观察到受试者的外周血中造血干细胞或祖细胞的数量或浓度增加了1％、100％、1000％或更多(例如，1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1,000％、或更多)，是受试者对动员方案有响应并且造血干细胞和祖细胞已经从一个或更多个干细胞小生境诸如骨髓被释放到外周血液循环中的指示。用于确定造血干细胞或祖细胞的数量或浓度的方法在本文中描述，并且是本领域已知的，并且包括，例如，流式细胞术技术，该技术基于这样的细胞的抗原表达谱来定量造血干细胞或祖细胞，这在本文中描述。例如，人类HSC是CD34+、CD38-、CD45RA-、CD90+、CD49F+和lin-(对于成熟谱系标志物(包括CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD10、CD11B、CD19、CD20、CD56、CD235A)呈阴性)。用于确定从受试者分离的外周血样品中造血干细胞或祖细胞的数量或浓度的另外的方法包括对样品中集落形成单位(CFU)的数目定量的测定，集落形成单位(CFU)是对活的造血干细胞或祖细胞(与适当的培养基一起孵育后产生造血干细胞或祖细胞的个体群体)的数量的量度。
如本文使用的，术语“动员量(mobilizing amount)”是指在向受试者诸如哺乳动物受试者(例如，人类受试者)施用后动员造血干细胞或祖细胞的群体的一种或更多种剂的量(quantity)，诸如本文描述的CXCR4拮抗剂和/或CXCR2激动剂的量(在一些实施方案中，普乐沙福或其变体，和/或Gro-β或其变体，诸如Gro-β的截短物例如Gro-βT的量)。这些剂的示例性动员量包括足以实现释放以下的群体的量：例如，从约20至约40个CD34+细胞/μL外周血，诸如从约21至约39个CD34+细胞/μL外周血、约22至约38个CD34+细胞/μL外周血、约23至约37个CD34+细胞/μL外周血、约24至约36个CD34+细胞/μL外周血、约25至约35个CD34+细胞/μL外周血、约26至约34个CD34+细胞/μL外周血、约27至约33个CD34+细胞/μL外周血、约28至约32个CD34+细胞/μL外周血或约29至约31个CD34+细胞/μL外周血(例如，约20个CD34+细胞/μL外周血、21个CD34+细胞/μL外周血、22个CD34+细胞/μL外周血、23个CD34+细胞/μL外周血、24个CD34+细胞/μL外周血、25个CD34+细胞/μL外周血、26个CD34+细胞/μL外周血、27个CD34+细胞/μL外周血、28个CD34+细胞/μL外周血、29个CD34+细胞/μL外周血、30个CD34+细胞/μL外周血、31个CD34+细胞/μL外周血、32个CD34+细胞/μL外周血、33个CD34+细胞/μL外周血、34个CD34+细胞/μL外周血、35个CD34+细胞/μL外周血、36个CD34+细胞/μL外周血、37个CD34+细胞/μL外周血、38个CD34+细胞/μL外周血、39个CD34+细胞/μL外周血、40个CD34+细胞/μL外周血或更多)。在某些实施方案中，这些剂的动员量包括足以实现释放以下的群体的量：例如，从约5至约20个CD34+CD90+CD45RA-细胞/μL外周血，诸如从约5至约8个CD34+CD90+CD45RA-细胞/μL外周血、约5至约10个CD34+CD90+CD45RA-细胞/μL外周血、约5至约12个CD34+CD90+CD45RA-细胞/μL外周血、约5至约15个CD34+CD90+CD45RA-细胞/μL外周血、约5至约18个CD34+CD90+CD45RA-细胞/μL外周血、约8至约10个CD34+CD90+CD45RA-细胞/μL外周血、约8至约12个CD34+CD90+CD45RA-细胞/μL外周血、约8至约15个CD34+CD90+CD45RA-细胞/μL外周血、或约8至约18个CD34+CD90+CD45RA-细胞/μL外周血、约8至约20个CD34+CD90+CD45RA-细胞/μL外周血、约10至约12个CD34+CD90+CD45RA-细胞/μL外周血、约10至约15个CD34+CD90+CD45RA-细胞/μL外周血、约10至约18个CD34+CD90+CD45RA-细胞/μL外周血、约10至约20个CD34+CD90+CD45RA-细胞/μL外周血、约12至约15个CD34+CD90+CD45RA-细胞/μL外周血、约10至约18个CD34+CD90+CD45RA-细胞/μL外周血、约10至约20个CD34+CD90+CD45RA-细胞/μL外周血、约12至约15个CD34+CD90+CD45RA-细胞/μL外周血、约12至约18个CD34+CD90+CD45RA-细胞/μL外周血、约12至约20个CD34+CD90+CD45RA-细胞/μL外周血、约15至约18个CD34+CD90+CD45RA-细胞/μL外周血、或约15至约20个CD34+CD90+CD45RA-细胞/μL外周血。在某些实施方案中，这些剂的动员量包括足以实现群体CD34+CD90+CD45RA-细胞/μL外周血至少2倍释放的量，例如，群体CD34+CD90+CD45RA-细胞/μL外周血至少3倍释放、至少4倍释放、至少5倍释放、至少6倍释放、至少7倍释放、至少8倍释放、至少9倍释放或至少10倍释放的量。在某些实施方案中，这些剂的动员量包括足以实现群体CD34+CD90+CD45RA-细胞/μL外周血2倍释放至10倍释放，例如，2倍至4倍释放、2倍至6倍释放、2倍至8倍释放、4倍至6倍释放、4倍至8倍释放、4倍至10倍释放、6倍至8倍释放、6倍至10倍释放或8倍至10倍释放的量。
如本文使用的，术语“单克隆抗体”是指源自单个克隆，包括任何真核、原核或噬菌体克隆的抗体，而不是藉以产生它的方法。
如本文使用的，术语“单核细胞”是指CD14+和CD34-外周血单个核细胞(PBMC)，其通常能够在被一种或更多种外来物质诸如微生物产物活化后分化成巨噬细胞和/或树突状细胞。特别地，单核细胞可以表达升高水平的CD14表面抗原标志物，并且可以表达至少一种选自CD64、CD93、CD180、CD328(也称为唾液酸结合Ig样凝集素(lectin)7或Siglec7)和CD329(唾液酸结合Ig样凝集素(lectin)9或Siglec9)以及花生凝集素(agglutinin)蛋白(PNA)的生物标志物。
如本文使用的，“肽”是指含有通过酰胺键连续结合的多于一个氨基酸残基，诸如天然存在和/或非天然氨基酸残基的单链聚酰胺。肽的实例包括全长蛋白(诸如全长天然存在的蛋白)的较短片段。
如本文使用的，术语“样品”是指取自受试者的样本(例如，血液、血液组分(例如，血清或血浆)、尿液、唾液、羊水、脑脊液、组织(例如，胎盘或真皮)、胰液、绒毛膜绒毛样品和细胞)。例如，样品可以是从正在进行或已经进行本文描述的造血干细胞或祖细胞动员方案的受试者抽取的外周血。
如本文使用的，术语“scFv”是指其中来自抗体的重链和轻链的可变结构域已经连接形成一条链的单链Fv抗体。scFv片段含有单个多肽链，该多肽链包含由接头隔开的抗体轻链可变区(VL)(例如，CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3)和抗体重链可变区(VH)(例如，CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3)。连接scFv片段的VL和VH区的接头可以是包含蛋白原(proteinogenic)氨基酸的肽接头。可以使用替代的接头以增加scFv片段对蛋白水解降解的抗性(例如，含有D-氨基酸的接头)，以增强scFv片段的溶解度(例如，亲水接头诸如含有聚乙二醇的接头或含有重复甘氨酸和丝氨酸残基的多肽)，以改进分子的生物物理稳定性(例如，含有形成分子内或分子间二硫键的半胱氨酸残基的接头)，或以减弱scFv片段的免疫原性(例如，含有糖基化位点的接头)。本领域普通技术人员还应理解，本文描述的scFv分子的可变区可以被修饰，使得它们的氨基酸序列与它们源自的抗体分子的氨基酸序列不同。例如，可以在氨基酸残基处(例如，在CDR和/或框架残基中)进行导致保守取代或改变的核苷酸或氨基酸取代，以便保留或增强scFv与被对应抗体识别的抗原结合的能力。
如本文使用的，短语“干细胞紊乱”广义地指可以通过患者体内的造血细胞或干细胞的体内转导治疗或治愈的任何疾病、紊乱或状况。可以通过患者中造血细胞或干细胞的体内转导来治疗的示例性疾病是镰状细胞贫血、地中海贫血、范可尼贫血、再生障碍性贫血、威斯科特-奥尔德里奇综合征、ADA SCID、HIV/AIDS、异染性脑白质营养不良、Diamond-Blackfan贫血和Schwachman-Diamond综合征。可以通过如本文描述的造血细胞或干细胞的体内转导来治疗的另外的疾病包括血液紊乱(例如，镰状细胞贫血)和自身免疫性紊乱，诸如硬皮病、多发性硬化、溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。可以通过如本文描述的造血细胞或干细胞的体内转导来治疗的另外的疾病包括癌症，诸如本文描述的癌症。示例性干细胞紊乱是恶性肿瘤，诸如神经母细胞瘤或血液学癌症，诸如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症可以是急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。使用造血细胞或干细胞的体内转导可治疗的另外的疾病包括骨髓增生异常综合征。在一些实施方案中，患者患有代谢性贮积紊乱或以其他方式受代谢性贮积紊乱影响。例如，患者可以罹患选自由以下组成的组的代谢紊乱或以其他方式受选自由以下组成的组的代谢紊乱影响：糖原贮积病、黏多糖贮积病、戈谢病、赫尔勒病、鞘脂贮积病、异染性脑白质营养不良，球状细胞脑白质营养不良、脑肾上腺脑白质营养不良、或可以受益于本文所公开的治疗和疗法的任何其他疾病或紊乱，所述其他疾病或紊乱包括但不限于重症联合免疫缺陷病、Wiscott-Aldrich综合征、高免疫球蛋白M(IgM)综合征、切东病、遗传性淋巴组织细胞增多症、骨硬化病、成骨不全症、贮积病、重型地中海贫血、镰状细胞病、系统性硬化、系统性红斑狼疮、多发性硬化、青少年类风湿性关节炎和在“Bone Marrow Transplantation for Non-Malignant Disease,”ASH Education Book,1:319-338(2000)”中描述的疾病或紊乱，其公开内容在其涉及可以通过施用造血干细胞或祖细胞移植疗法来治疗的病理时通过引用以其整体并入本文。
如本文在造血干细胞动员的上下文中使用的，术语“干细胞小生境”是指受试者诸如哺乳动物受试者(例如，人类受试者)内、内源造血干细胞或祖细胞存在于其中的微环境。示例性的干细胞小生境是骨髓组织。
如本文使用的，术语“受试者”和“患者”是指接受如本文描述的对特定疾病或状况的治疗的生物体，诸如人类。在一些实施方案中，需要体内造血干细胞基因治疗的患者，诸如人类患者，可以接受包括转导造血干细胞的群体的治疗，以便治疗干细胞紊乱，诸如本文描述的癌症、自身免疫性疾病或代谢紊乱。在一些实施方案中，转导到患者体内的造血干细胞可以通过施用CXCR4拮抗剂和/或CXCR2激动剂在患者体内动员。
如本文使用的，术语“转导”或“转染”是指通常用于将外源DNA引入到原核或真核宿主细胞中的多种技术中的任一种，诸如电穿孔、脂质转染、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。体内转导或转染通常使用病毒载体进行，如本文更详细描述的。
如本文使用的，术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”是指治疗性治疗，其中目的是在所治疗患者中预防或减缓(减轻)不期望的生理改变或紊乱，或者促进有益表型。本文描述的疗法的有益结果还可以包括在造血干细胞和祖细胞的体内转导之后造血谱系细胞中的一种或更多种的细胞计数或相对浓度的增加，造血谱系细胞诸如巨核细胞、凝血细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、原粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、小胶质细胞、粒细胞、单核细胞、破骨细胞、抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、T淋巴细胞或B淋巴细胞。本文描述的疗法的有益结果还可以包括造血谱系细胞中的一种或更多种的活性或功能的增加。另外的有益结果可以包括致病细胞群体诸如癌细胞或自身免疫细胞的群体的数量的减少。
如本文使用的，术语“变体”和“衍生物”可互换使用，并且是指本文描述的化合物、肽、蛋白或其他物质的天然存在的、合成的和半合成的类似物。本文描述的化合物、肽、蛋白或其他物质的变体或衍生物可以保留或改进原始材料的生物活性。
如本文使用的，术语“载体”包括核酸载体，诸如质粒、DNA载体、质粒、RNA载体、病毒载体或其他合适的复制子。本文描述的表达载体可以含有多核苷酸序列以及例如用于表达蛋白和/或将这些多核苷酸序列整合到哺乳动物细胞基因组中的另外的序列元件。可以用于表达肽和蛋白质的某些载体，诸如本文描述的那些，包括含有指导基因转录的调控序列(诸如启动子和增强子区)的质粒。用于表达本文描述的肽和蛋白的其他有用的载体含有增强这些基因的翻译速率或改进由基因转录产生的mRNA的稳定性或核输出的多核苷酸序列。用于表达本文描述的肽和蛋白的其他有用的载体含有增强这些基因的翻译速率或改进由基因转录产生的mRNA的稳定性或核输出的多核苷酸序列。这些序列元件可以包括，例如，5'和3'非翻译区和多腺苷酸化信号位点，以便指导表达载体上携带的基因的有效转录。本文描述的表达载体还可以含有编码用于选择含有这样的载体的细胞的标志物的多核苷酸。合适的标志物的实例包括编码对抗生素(诸如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素和诺尔丝菌素)的抗性的基因。
如本文使用的，术语“烷基(alkyl)”是指在链中具有例如从1个至20个碳原子的直链或支链烷基基团。烷基基团的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、叔戊基、己基、异己基等。
如本文使用的，术语“亚烷基”是指直链或支链二价烷基基团。二价位置可在烷基链内的相同或不同原子上。亚烷基的实例包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基等。
如本文使用的，术语“杂烷基”是指在链中具有例如从1个至20个碳原子并且在链中还含有一个或更多个杂原子(例如，尤其是氧原子、氮原子或硫原子)的直链或支链烷基基团。
如本文使用的，术语“亚杂烷基(heteroalkylene)”是指直链或支链二价杂烷基基团。二价位置可以在杂烷基链内的相同或不同原子上。二价位置可以是一个或更多个杂原子。
如本文使用的，术语“烯基”是指在链中具有例如从2个至20个碳原子的直链或支链烯基基团。烯基基团的实例包括乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、叔丁烯基、己烯基等。
如本文使用的，术语“亚烯基”是指直链或支链二价烯基基团。二价位置可以在烯基链内的相同或不同原子上。亚烯基的实例包括亚乙烯基、亚丙烯基、异亚丙烯基、亚丁烯基等。
如本文使用的，术语“杂烯基”是指在链中具有例如从2个至20个碳原子并且在链中还含有一个或更多个杂原子(例如尤其是，氧原子、氮原子或硫原子)的直链或支链烯基基团。
如本文使用的，术语“亚杂烯基(heteroalkenylene)”是指直链或支链二价杂烯基基团。二价位置可以在杂烯基链内的相同或不同原子上。二价位置可以是一个或更多个杂原子。
如本文使用的，术语“炔基”是指在链中具有例如从2个至20个碳原子的直链或支链炔基基团。炔基基团的实例包括炔丙基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。
如本文使用的，术语“亚炔基”是指直链或支链二价炔基基团。二价位置可以在炔基链内的相同或不同原子上。
如本文使用的，术语“杂炔基”是指在链中具有例如从2个至20个碳原子并且在链中还含有一个或更多个杂原子(例如尤其是，氧原子、氮原子或硫原子)的直链或支链炔基基团。
如本文使用的，术语“亚杂炔基(heteroalkynylene)”是指直链或支链二价杂炔基基团。二价位置可以在杂炔基链内的相同或不同原子上。二价位置可以是一个或更多个杂原子。
如本文使用的，术语“环烷基”是指是饱和的并且具有例如从3个至12个碳环原子的单环，或稠合、桥连，或螺多环环结构。环烷基基团的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、双环[3.1.0]己烷等。
如本文使用的，术语“亚环烷基(cycloalkylene)”是指二价环烷基基团。二价位置可以在环结构内的相同或不同原子上。亚环烷基的实例包括亚环丙基、亚环丁基、亚环戊基、亚环己基等。
如本文使用的，术语“杂环烷基”是指饱和的并且每个环结构具有例如从3个至12个选自碳原子和杂原子(例如尤其是，氮原子、氧原子和硫原子)的环原子的单环、或稠合、桥连或螺多环环结构。环结构可以例如在碳、氮或硫环成员上含有一个或更多个氧代基团。
如本文使用的，术语“亚杂环烷基”是指二价杂环烷基基团。二价位置可以在环结构内的相同或不同原子上。
如本文使用的，术语“芳基”是指含有例如从6个至19个碳原子的单环或多环芳族环体系。芳基基团包括但不限于苯基、芴基、萘基等。二价位置可以是一个或更多个杂原子。
如本文使用的，术语“亚芳基”是指二价芳基基团。二价位置可以在相同或不同的原子上。
如本文使用的，术语“杂芳基”是指单环杂芳族或双环或三环稠环杂芳族基团。杂芳基基团包括吡啶基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、吡唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、1,3,4-三嗪基、1,2,3-三嗪基、苯并呋喃基、[2,3-二氢]苯并呋喃基、异苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并三唑基、异苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚基、3H-吲哚基、苯并咪唑基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹嗪基、喹唑啉基、酞嗪基、喹喔啉基、噌啉基、萘啶基、吡啶并[3,4-b]吡啶基、吡啶并[3,2-b]吡啶基、吡啶并[4,3-b]吡啶基、喹啉基、异喹啉基、四唑基、5,6,7,8-四氢喹啉基、5,6,7,8-四氢异喹啉基、嘌呤基、蝶啶基、咔唑基、呫吨基、苯并喹啉基等。
如本文使用的，术语“亚杂芳基”是指二价杂芳基基团。二价位置可以在相同或不同的原子上。二价位置可以是一个或更多个杂原子。
除非通过单个取代基的定义另外限制，否则前述化学部分，诸如“烷基”、“亚烷基”、“杂烷基”、“亚杂烷基”、“烯基”、“亚烯基”、“杂烯基”、“亚杂烯基”、“炔基”、“亚炔基”、“杂炔基”、“亚杂炔基”、“环烷基”、“亚环烷基”、“杂环烷基”、“亚杂环烷基”、“芳基”、“亚芳基”、“杂芳基”和“亚杂芳基”基团可以任选地被取代。如本文使用的，术语“任选地被取代的”是指化合物或部分包含由化合物或部分或其位点的化合价所允许的一个或更多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)取代基，诸如选自由以下组成的组的取代基：烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、烷基芳基、烷基杂芳基、烷基环烷基、烷基杂环烷基、氨基、铵、酰基、酰氧基、酰基氨基、氨基羰基、烷氧基羰基、脲基、氨基甲酸酯、芳基、杂芳基、亚磺酰基、磺酰基、烷氧基、硫烷基、卤素、羧基、三卤代甲基、氰基、羟基、巯基、硝基等。取代可以包括其中相邻取代基经历环闭合的情况，诸如邻位官能取代基的环闭合，以形成通过例如环闭合形成的内酰胺、内酯、环酐、缩醛、半缩醛、硫缩醛、缩醛胺和半缩醛胺，以例如提供保护基团。
动员造血干细胞和祖细胞以及释放细胞用于扩增和治疗用途的方法
本发明部分地基于这样的发现，即通过向哺乳动物受试者(例如，人类受试者)施用特定剂量的CXCR2激动剂，诸如Gro-β、Gro-βT或其变体，任选地与CXCR4拮抗剂组合，可以动员造血干细胞和祖细胞。
CXCR2激动剂
Gro-β、Gro-βT及其变体
可以与本文描述的组合物和方法一起使用的示例性CXCR2激动剂是Gro-β及其变体。Gro-β(也被称为生长调控蛋白β、趋化因子(C-X-C基序)配体2(CXCL2)和巨噬细胞炎性蛋白2-α(MIP2-α))是一种能够例如通过刺激从外周嗜中性粒细胞释放蛋白酶而动员造血干细胞和祖细胞的细胞因子。
除了Gro-β之外，可以与本文描述的组合物和方法一起使用的示例性CXCR2激动剂是Gro-β的截短形式，诸如特征在于在Gro-β的N-末端处缺失从1个至8个氨基酸的那些(例如，特征在于N-末端缺失1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸或8个氨基酸的肽)。在一些实施方案中，可以与本文描述的组合物和方法一起使用的CXCR2激动剂包括Gro-βT，其特征在于从Gro-β的N-末端缺失前四个氨基酸。Gro-βT表现出特别有利的生物学特性，诸如诱导造血干细胞和祖细胞动员的能力，其功效比Gro-β的功效高几个数量级。Gro-β和Gro-βT被描述于例如美国专利第6,080,398号中，其公开内容通过引用以其整体并入本文。
另外，可以与本文描述的组合物和方法一起使用的示例性CXCR2激动剂是含有在SEQ ID NO:1的位置69处取代了天冬酰胺残基的天冬氨酸残基的Gro-β变体。该肽在本文中被称为Gro-βN69D。相似地，可以与本文描述的组合物和方法一起使用的CXCR2激动剂包括含有在SEQ ID NO:2的位置65处取代了天冬酰胺残基的天冬氨酸残基的Gro-β变体。这种肽在本文称为Gro-βT N65D，不仅保留造血干细胞和祖细胞动员能力，而且表现出比Gro-βT大得多的功效。Gro-βN69D和Gro-βT N65D在例如美国专利第6,447,766号中描述，其公开内容通过引用以其整体并入本文。
Gro-β、Gro-βT、Gro-βN69D和Gro-βT N65D的氨基酸序列列于下表2中。
表2.Gro-β及其选择的变体的氨基酸序列
Figure BDA0004021082980000271
可与本文描述的组合物和方法一起使用的另外的CXCR2激动剂包括Gro-β的其他变体，诸如相对于Gro-β具有一个或更多个氨基酸取代、插入和/或缺失的肽。在一些实施方案中，可与本文描述的组合物和方法一起使用的CXCR2激动剂包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的肽(例如，与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列同一性的肽)。在一些实施方案中，CXCR2激动剂的氨基酸序列仅以一个或更多个保守氨基酸取代的方式不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，CXCR2激动剂的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列差异为不多于20个、不多于15个、不多于10个、不多于5个或不多于1个非保守氨基酸取代。在一些实施方案中，CXCR2激动剂是Gro-β。在一些实施方案中，Gro-βT未被共价修饰。在一些实施方案中，Gro-β不用聚亚烷基二醇部分诸如聚乙二醇部分共价修饰。
可与本文描述的组合物和方法一起使用的CXCR2激动剂的另外的实例是Gro-βT的变体，诸如相对于Gro-βT具有一个或更多个氨基酸取代、插入和/或缺失的肽。在一些实施方案中，CXCR2激动剂可以是与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的肽(例如，与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列同一性的肽)。在一些实施方案中，CXCR2激动剂的氨基酸序列仅以一个或更多个保守氨基酸取代的方式不同于SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，CXCR2激动剂的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列差异为不多于20个、不多于15个、不多于10个、不多于5个或不多于1个非保守氨基酸取代。
可与本文描述的组合物和方法一起使用的CXCR2激动剂的另外的实例是Gro-βN69D的变体，诸如相对于Gro-βN69D具有一个或更多个氨基酸取代、插入和/或缺失的肽。在一些实施方案中，CXCR2激动剂可以是与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的肽(例如，与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列同一性的肽)。在一些实施方案中，CXCR2激动剂的氨基酸序列仅以一个或更多个保守氨基酸取代的方式不同于SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施方案中，CXCR2激动剂的氨基酸序列与SEQ ID NO:3的氨基酸序列差异为不多于20个、不多于15个、不多于10个、不多于5个或不多于1个非保守氨基酸取代。
可与本文描述的组合物和方法一起使用的CXCR2激动剂的另外的实例是Gro-βTN65D的变体，诸如相对于Gro-βT N65D具有一个或更多个氨基酸取代、插入和/或缺失的肽。在一些实施方案中，CXCR2激动剂可以是与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的肽(例如，与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列同一性的肽)。在一些实施方案中，CXCR2激动剂的氨基酸序列仅以一个或更多个保守氨基酸取代的方式不同于SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施方案中，CXCR2激动剂的氨基酸序列与SEQ ID NO:4的氨基酸序列差异为不多于20个、不多于15个、不多于10个、不多于5个或不多于1个非保守氨基酸取代。
CXCR4拮抗剂
用于与本文描述的组合物和方法一起使用的示例性CXCR4拮抗剂是由式(I)表示的化合物
Z-接头-Z'(I)
或其药学上可接受的盐，其中Z是：
(i)含有9个至32个环成员的环状多胺(cyclic polyamine)，其中环成员中的2个至8个是由2个或更多个碳原子彼此隔开的氮原子；或
(ii)由式(IA)表示的胺
Figure BDA0004021082980000291
其中A包含含有至少一个氮原子的单环或双环稠环系统，并且B是H或具有1个至20个原子的取代基；
并且其中Z'是：
(i)含有9个至32个环成员的环状多胺，其中环成员中的2个至8个是由2个或更多个碳原子彼此隔开的氮原子；
(ii)由式(IB)表示的胺
Figure BDA0004021082980000292
其中A'包含含有至少一个氮原子的单环或双环稠环系统，并且B'是H或具有1个至20个原子的取代基；或
(iii)由式(IC)表示的取代基
–N(R)–(CR2)n–X  (IC)
其中每个R独立地是H或C1-C6烷基，n是1或2，并且X是芳基或杂芳基基团或硫醇；
其中接头是键、任选地被取代的亚烷基(例如，任选地被取代的C1-C6亚烷基)、任选地被取代的亚杂烷基(例如，任选地被取代的C1-C6亚杂烷基)、任选地被取代的亚烯基(例如，任选地被取代的C2-C6亚烯基)、任选地被取代的亚杂烯基(例如，任选地被取代的C2-C6亚杂烯基)、任选地被取代的亚炔基(例如，任选地被取代的C2-C6亚炔基)、任选地被取代的亚杂炔基(例如，任选地被取代的C2-C6亚杂炔基)、任选地被取代的亚环烷基、任选地被取代的亚杂环烷基、任选地被取代的亚芳基或任选地被取代的亚杂芳基。
在一些实施方案中，Z和Z'可以各自独立地是含有9个至32个环成员的环状多胺，其中环成员中的2个至8个是由2个或更多个碳原子彼此隔开的氮原子。在一些实施方案中，Z和Z'是相同的取代基。作为一个实例，Z可以是包含10个至24个环成员的环状多胺。在一些实施方案中，Z可以是含有14个环成员的环状多胺。在一些实施方案中，Z包含4个氮原子。在一些实施方案中，Z是1,4,8,11-四偶氮环十四烷。
在一些实施方案中，接头由式(ID)表示
Figure BDA0004021082980000301
其中环D是任选地被取代的芳基基团、任选地被取代的杂芳基基团、任选地被取代的环烷基基团或任选地被取代的杂环烷基基团；并且X和Y各自独立地是任选地被取代的亚烷基(例如，任选地被取代的C1-C6亚烷基)、任选地被取代的亚杂烷基(例如，任选地被取代的C1-C6亚杂烷基)、任选地被取代的亚烯基(例如，任选地被取代的C2-C6亚烯基)、任选地被取代的亚杂烯基(例如，任选地被取代的C2-C6亚杂烯基)、任选地被取代的亚炔基(例如，任选地被取代的C2-C6亚炔基)或任选地被取代的亚杂炔基(例如，任选地被取代的C2-C6亚杂炔基)。
作为一个实例，接头可以由式(IE)表示
Figure BDA0004021082980000302
其中环D是任选地被取代的芳基基团、任选地被取代的杂芳基基团、任选地被取代的环烷基基团或任选地被取代的杂环烷基基团；并且X和Y各自独立地是任选地被取代的亚烷基(例如，任选地被取代的C1-C6亚烷基)、任选地被取代的亚杂烷基(例如，任选地被取代的C1-C6亚杂烷基)、任选地被取代的亚烯基(例如，任选地被取代的C2-C6亚烯基)、任选地被取代的亚杂烯基(例如，任选地被取代的C2-C6亚杂烯基)、任选地被取代的亚炔基(例如，任选地被取代的C2-C6亚炔基)或任选地被取代的亚杂炔基(例如，任选地被取代的C2-C6亚杂炔基)。在一些实施方案中，X和Y各自独立地是任选地被取代的C1-C6亚烷基。在一些实施方案中，X和Y是相同的取代基。在一些实施方案中，X和Y可以各自是亚甲基、亚乙基、亚正丙基、亚正丁基、亚正戊基或亚正己基基团。在一些实施方案中，X和Y各自是亚甲基基团。
接头可以是，例如，1,3-亚苯基、2,6-吡啶、3,5-吡啶、2,5-噻吩、4,4′-(2,2′-联嘧啶)、2,9-(1,10-菲咯啉)等。在一些实施方案中，接头是1,4-亚苯基-双-(亚甲基)。
可与本文描述的组合物和方法一起使用的CXCR4拮抗剂包括普乐沙福(本文中也被称为“AMD3100”和“Mozibil”)或其药学上可接受的盐，由式(II)表示，1,1′-[1,4-亚苯基双(亚甲基)]-双-1,4,8,11-四-氮杂环十四烷。
Figure BDA0004021082980000311
可以与本文描述的组合物和方法一起使用的另外的CXCR4拮抗剂包括普乐沙福的变体，诸如美国专利第5,583,131号中描述的化合物，该专利的公开内容在其涉及CXCR4拮抗剂时通过引用并入本文。在一些实施方案中，CXCR4拮抗剂可以是选自由以下组成的组的化合物：1,1′-[1,3-亚苯基双(亚甲基)]-双-1,4,8,11-四-氮杂环十四烷、1,1′-[1,4-亚苯基-双-(亚甲基)]-双-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、1,1′-[1,4-亚苯基-双-(亚甲基)]-双-1,4,8,11-四氮杂环十四烷的双-锌或双-铜配合物、1,1′-[3,3′-亚联苯基-双-(亚甲基)]-双-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、11,11′-[1,4-亚苯基-双-(亚甲基)]-双-1,4,7,11-四氮杂环十四烷、1,11′-[1,4-亚苯基-双-(亚甲基)]-1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,7,11-四氮杂环十四烷、1,1′-[2,6-吡啶-双-(亚甲基)]-双-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、1,1-[3,5-吡啶-双-(亚甲基)]-双-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、1,1′-[2,5-噻吩-双-(亚甲基)]-双-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、1,1′-[4,4′-(2,2′-联吡啶)-双-(亚甲基)]-双-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、1,1′-[2,9-(1,10-菲咯啉)-双-(亚甲基)]-双-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、1,1′-[1,3-亚苯基-双-(亚甲基)]-双-1,4,7,10-四氮杂环十四烷、1,1′-[1,4-亚苯基-双-(亚甲基)]-双-1,4,7,10-四氮杂环十四烷、1′-[5-硝基-1,3-亚苯基双(亚甲基)]双-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、1′,1′-[2,4,5,6-四氯-1,3-亚苯基双(亚甲基)]双-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、1,1′-[2,3,5,6-四-氟-1,4-亚苯基双(亚甲基)]双-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、1,1′-[1,4-萘-双-(亚甲基)]双-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、1,1′-[1,3-亚苯基双-(亚甲基)]双-1,5,9-三氮杂环十二烷、1,1′-[1,4-亚苯基-双-(亚甲基)]-1,5,9-三氮杂环十二烷、1,1′-[2,5-二甲基-1,4-亚苯基双-(亚甲基)]-双-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、1,1′-[2,5-二氯-1,4-亚苯基双-(亚甲基)]-双-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、1,1′-[2-溴-1,4-亚苯基双-(亚甲基)]-双-1,4,8,11-四氮杂环十四烷和1,1′-[6-苯基-2,4-吡啶双-(亚甲基)]-双-1,4,8,11-四氮杂环十四烷。
在一些实施方案中，CXCR4拮抗剂是US 2006/0035829中描述的化合物，该专利的公开内容在其涉及CXCR4拮抗剂时通过引用并入本文。在一些实施方案中，CXCR4拮抗剂可以是选自由以下组成的组的化合物：3,7,11,17-四氮杂双环(13.3.1)十七-1(17),13,15-三烯、4,7,10,17-四氮杂双环(13.3.1)十七-1(17),13,15-三烯；1,4,7,10-四氮杂环十四烷；1,4,7-三氮杂环十四烷和4,7,10-三氮杂双环(13.3.1)十七-1(17),13,15-三烯。
CXCR4拮抗剂可以是WO 2001/044229中描述的化合物，该专利的公开内容在其涉及CXCR4拮抗剂时通过引用并入本文。在一些实施方案中，CXCR4拮抗剂可以是选自由以下组成的组的化合物：N-[4-(11-氟-1,4,7-三氮杂环十四烷基)-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-2-(氨基甲基)吡啶、N-[4-(11,11-二氟-1,4,7-三氮杂环十四烷基)-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-2-(氨基甲基)吡啶、N-[4-(1,4,7-三氮杂环十四烷-2-酰基)-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-2-(氨基甲基)吡啶、N-[12-(5-氧-1,9-二氮杂环十四烷基)-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-2-(氨基甲基)吡啶、N-[4-(11-氧-1,4,7-三氮杂环十四烷基)-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-2-(氨基甲基)吡啶、N-[4-(11-硫杂-1,4,7-三氮杂环十四烷基)-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-2-(氨基甲基)吡啶、N-[4-(11-硫杂(sulfoxo)-1,4,7-三氮杂环十四烷基)-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-2-(氨基甲基)吡啶、N-[4-(11-磺酰-1,4,7-三氮杂环十四烷基)-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-2-(氨基甲基)吡啶和N-[4-(3-羧杂(carboxo)-1,4,7-三氮杂环十四烷基)-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-2-(氨基甲基)吡啶。
可与本文描述的组合物和方法一起使用的另外的CXCR4拮抗剂包括WO 2000/002870中描述的化合物，该专利的公开内容在其涉及CXCR4拮抗剂时通过引用并入本文。在一些实施方案中，CXCR4拮抗剂可以是选自由以下组成的组的化合物：N-[1,4,8,11-四氮杂环十四烷基-1,4-亚苯基双-(亚甲基)]-2-(氨基甲基)吡啶、N-[1,4,8,11-四氮杂环十四烷基-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-N-甲基-2-(氨基甲基)吡啶、N-[1,4,8,11-四氮杂环十四烷基-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-4-(氨基甲基)吡啶、N-[1,4,8,11-四氮杂环十四烷基-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-3-(氨基甲基)吡啶、N-[1,4,8,11-四氮杂环十四烷基-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-(2-氨基甲基-5-甲基)吡嗪、N-[1,4,8,11-四氮杂环十四烷基-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-2-(氨基乙基)吡啶、N-[1,4,8,11-四氮杂环十四烷基-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-2-(氨基甲基)噻吩、N-[1,4,8,11-四氮杂环十四烷基-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-2-(氨基甲基)硫醇、N-[1,4,8,11-四氮杂环十四烷基-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-2-氨基苄胺、N-[1,4,8,11-四氮杂环十四烷基-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-4-氨基苄胺、N-[1,4,8,11-四氮杂环十四烷基-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-4-(氨基乙基)咪唑、N-[1,4,8,11-四氮杂环十四烷基-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-苄胺、N-[4-(1,4,7-三氮杂环十四烷基)-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-2-(氨基甲基)吡啶、N-[7-(4,7,10,17-四氮杂双环[13.3.1]十七-1(17),13,15-三烯基)-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-2-(氨基甲基)吡啶、N-[7-(4,7,10-三氮杂双环[13.3.1]十七-1(17),13,15-三烯基)-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-2-(氨基甲基)吡啶、N-[1-(1,4,7-三氮杂环十四烷基)-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-2-(氨基甲基)吡啶、N-[4-[4,7,10,17-四氮杂双环[13.3.1]十七-1(17),13,15-三烯基]-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-2-(氨基甲基)吡啶、N-[4-[4,7,10-三氮杂双环[13.3.1]十七-1(17),13,15-三烯基]-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-2-(氨基甲基)吡啶、N-[1,4,8,11-四氮杂环十四烷基-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-嘌呤、1-[1,4,8,11-四氮杂环十四烷基-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-4-苯基哌嗪、N-[4-(1,7-二氮杂环十四烷基)-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-2-(氨基甲基)吡啶和N-[7-(4,10-二氮杂双环[13.3.1]十七-1(17),13,15-三烯基)-1,4-亚苯基双(亚甲基)]-2-(氨基甲基)吡啶。
在一些实施方案中，CXCR4拮抗剂是选自由以下组成的组的化合物：1-[2,6-二甲氧基吡啶-4-基(亚甲基)]-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、1-[2-氯吡啶-4-基(亚甲基)]-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、1-[2,6-二甲基吡啶-4-基(亚甲基)]-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、1-[2-甲基吡啶-4-基(亚甲基)]-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、1-[2,6-二氯吡啶-4-基(亚甲基)]-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、1-[2-氯吡啶-5-基(亚甲基)]-1,4,8,11-四氮杂环十四烷和7-[4-甲基苯基(亚甲基)]-4,7,10,17-四氮杂双环[13.3.1]十七-1(17),13,15-三烯。
在一些实施方案中，CXCR4拮抗剂是美国专利第5,698,546号中描述的化合物，该专利的公开内容在其涉及CXCR4拮抗剂时通过引用并入本文。在一些实施方案中，CXCR4拮抗剂可以是选自由以下组成的组的化合物：7,7′-[1,4-亚苯基-双(亚甲基)]双-3,7,11,17-四氮杂双环[13.3.1]十七-1(17),13,15-三烯、7,7′-[1,4-亚苯基-双(亚甲基)]双[15-氯-3,7,11,17-四氮杂双环[13.3.1]十七-1(17),13,15-三烯]、7,7′-[1,4-亚苯基-双(亚甲基)]双[15-甲氧基-3,7,11,17-四氮杂双环[13.3.1]十七-1(17),13,15-三烯]、7,7′-[1,4-亚苯基-双(亚甲基)]双-3,7,11,17-四氮杂双环[13.3.1]-十七-13,16-三烯-15-酮、7,7′-[1,4-亚苯基-双(亚甲基)]双-4,7,10,17-四氮杂双环[13.3.1]-十七-1(17),13,15-三烯、8,8′-[1,4-亚苯基-双(亚甲基)]双-4,8,12,19-四氮杂双环[15.3.1]十九-1(19),15,17-三烯、6,6′-[1,4-亚苯基-双(亚甲基)]双-3,6,9,15-四氮杂双环[11.3.1]十五-1(15),11,13-三烯、6,6′-[1,3-亚苯基-双(亚甲基)]双-3,6,9,15-四氮杂双环[11.3.1]十五-1(15),11,13-三烯和17,17′-[1,4-亚苯基-双(亚甲基)]双-3,6,14,17,23,24-六氮杂三环[17.3.1.18,12]二十四-1(23),8,10,12(24),19,21-己烯。
在一些实施方案中，CXCR4拮抗剂是美国专利第5,021,409号中描述的化合物，该专利的公开内容在其涉及CXCR4拮抗剂时通过引用并入本文。在一些实施方案中，CXCR4拮抗剂可以是选自由以下组成的组的化合物：2,2′-双环胺(bicyclam)、6,6′-双环胺、3,3′-(双-1,5,9,13-四氮杂环十六烷)、3,3′-(双-1,5,8,11,14-戊氮杂环十六烷)、亚甲基(或聚亚甲基)二-1-N-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、3,3′-双-1,5,9,13-四氮杂环十六烷、3,3′-双-1,5,8,11,14-戊氮杂环十六烷、5,5′-双-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、2,5′-双-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、2,6′-双-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、11,11′-(1,2-乙烷二基)双-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、11,11′-(1,2-丙烷二基)双-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、11,11′-(1,2-丁烷二基)双-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、11,11′-(1,2-戊烷二基)双-1,4,8,11-四氮杂环十四烷和11,11′-(1,2-己烷二基)双-1,4,8,11-四氮杂环十四烷。
在一些实施方案中，CXCR4拮抗剂是WO 2000/056729中描述的化合物，该专利的公开内容在其涉及CXCR4拮抗剂时通过引用并入本文。在一些实施方案中，CXCR4拮抗剂可以是选自由以下组成的组的化合物：N-(2-吡啶基甲基)-N′-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[b]吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(6,7-二氢-5H-环戊[b]吡啶-7-基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(1,2,3,4-四氢-1-萘基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(1-萘基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[2-[(2-吡啶基甲基)氨基]乙基]-N′-(1-甲基-1,2,3,4-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[2-[(1H-咪唑-2-基甲基)氨基]乙基]-N′-(1-甲基-1,2,3,4-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(1,2,3,4-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[2-[(1H-咪唑-2-基甲基)氨基]乙基]-N′-(1,2,3,4-四氢-1-萘基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(2-苯基-5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N,N′-双(2-吡啶基甲基)-N′-(2-苯基-5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(5,6,7,8-四氢-5-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(1H-咪唑-2-基甲基)-N′-(5,6,7,8-四氢-5-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(1H-咪唑-2-基甲基)-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[(2-氨基-3-苯基)丙基]-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(1H-咪唑-4-基甲基)-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(2-喹啉基甲基)-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(2-(2-萘甲酰基)氨基乙基)-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[(S)-(2-乙酰氨基-3-苯基)丙基]-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[(S)-(2-乙酰氨基-3-苯基)丙基]-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[3-((2-萘基甲基)氨基)丙基]-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[2-(S)-吡咯烷基甲基]-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[2-(R)-吡咯烷基甲基]-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[3-吡唑基甲基]-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[2-吡咯基甲基]-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[2-噻吩基甲基]-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[2-噻唑基甲基]-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[2-呋喃基甲基]-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[2-[(苯基甲基)氨基]乙基]-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(2-氨基乙基)-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-3-吡咯烷基-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-4-哌啶基-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[2-[(苯基)氨基]乙基]-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(7-甲氧基-1,2,3,4-四氢-2-萘基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(6-甲氧基-1,2,3,4-四氢-2-萘基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(1-甲基-1,2,3,4-四氢-2-萘基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(7-甲氧基-3,4-二氢萘基)-1-(氨基甲基)-4-苯甲酰胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(6-甲氧基-3,4-二氢萘基)-1-(氨基甲基)-4-苯甲酰胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(1H-咪唑-2-基甲基)-N′-(7-甲氧基-1,2,3,4-四氢-2-萘基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(8-羟基-1,2,3,4-四氢-2-萘基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(1H-咪唑-2-基甲基)-N′-(8-羟基-1,2,3,4-四氢-2-萘基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(8-氟-1,2,3,4-四氢-2-萘基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(1H-咪唑-2-基甲基)-N′-(8-氟-1,2,3,4-四氢-2-萘基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(5,6,7,8-四氢-7-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(1H-咪唑-2-基甲基)-N′-(5,6,7,8-四氢-7-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[2-[(2-萘基甲基)氨基]乙基]-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[2-(异丁基氨基)乙基]-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[2-[(2-吡啶基甲基)氨基]乙基]-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[2-[(2-呋喃基甲基)氨基]乙基]-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(2-胍基乙基)-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[2-[双-[(2-甲氧基)苯基甲基]氨基]乙基]-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[2-[(1H-咪唑-4-基甲基)氨基]乙基]-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[2-[(1H-咪唑-2-基甲基)氨基]乙基]-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[2-(苯基脲基)乙基]-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[[N″-(正丁基)甲酰氨基]甲基]-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(甲酰氨基甲基)-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[(N″-苯基)甲酰氨基甲基]-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(羧甲基)-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(苯基甲基)-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(1H-苯并咪唑-2-基甲基)-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(5,6-二甲基-1H-苯并咪唑-2-基甲基)-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺(氢溴酸盐)、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(5-硝基-1H-苯并咪唑-2-基甲基)-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[(1H)-5-氮杂苯并咪唑-2-基甲基]-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N-(4-苯基-1H-咪唑-2-基甲基)-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-[2-(2-吡啶基)乙基]-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(2-苯并噁唑基)-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(反式-2-氨基环己基)-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(2-苯基乙基)-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(3-苯基丙基)-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N′-(反式-2-氨基环戊基)-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-[[4-[[(2-吡啶基甲基)氨基]甲基]苯基]甲基]-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-甘氨酰胺、N-[[4-[[(2-吡啶基甲基)氨基]甲基]苯基]甲基]-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-(L)-丙氨酰胺、N-[[4-[[(2-吡啶基甲基)氨基]甲基]苯基]甲基]-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-(L)-天冬酰胺、N-[[4-[[(2-吡啶基甲基)氨基]甲基]苯基]甲基]-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-吡嗪酰胺、N-[[4-[[(2-吡啶基甲基)氨基]甲基]苯基]甲基]-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-(L)-脯氨酰胺、N-[[4-[[(2-吡啶基甲基)氨基]甲基]苯基]甲基]-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-(L)-赖氨酰胺、N-[[4-[[(2-吡啶基甲基)氨基]甲基]苯基]甲基]-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-苯甲酰胺、N-[[4-[[(2-吡啶基甲基)氨基]甲基]苯基]甲基]-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-吡啶甲酰胺、N′-苄基-N-[[4-[[(2-吡啶基甲基)氨基]甲基]苯基]甲基]-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-脲、N′-苯基-N-[[4-[[(2-吡啶基甲基)氨基]甲基]苯基]甲基]-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-脲、N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[细菌吡啶-9-基)-4-[[(2-吡啶基甲基)氨基]甲基]苯甲酰胺、N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-4-[[(2-吡啶基甲基)氨基]甲基]苯甲酰胺、N,N′-双(2-吡啶基甲基)-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N,N′-双(2-吡啶基甲基)-N′-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[细菌吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N,N′-双(2-吡啶基甲基)-N′-(6,7-二氢-5H-环戊[细菌吡啶-7-基)-1,4-苯二甲胺、N,N′-双(2-吡啶基甲基)-N′-(1,2,3,4-四氢-1-萘基)-1,4-苯二甲胺、N,N′-双(2-吡啶基甲基)-N′-[(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)甲基]-1,4-苯二甲胺、N,N′-双(2-吡啶基甲基)-N′[(6,7-二氢-5H-环戊[细菌吡啶-7-基)甲基]-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N-(2-甲氧基乙基)-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-吡啶基甲基)-N-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]-N′-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N,N′-双(2-吡啶基甲基)-1,4-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)苯二甲胺、N-[(2,3-二甲氧基苯基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N,N′-双(2-吡啶基甲基)-N-[1-(N″-苯基-N″-甲基脲基)-4-哌啶基]-1,3-苯二甲胺、N,N′-双(2-吡啶基甲基)-N-[N″-对甲苯磺酰苯丙氨酰基)-4-哌啶基]-1,3-苯二甲胺、N,N′-双(2-吡啶基甲基)-N-[1-[3-(2-氯苯基)-5-甲基-异噁唑-4-酰基]-4-哌啶基]-1,3-苯二甲胺、N-[(2-羟基苯基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[细菌吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N-[(4-氰基苯基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[细菌吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N-[(4-氰基苯基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-[(4-乙酰胺基苯基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-[(4-苯氧基苯基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[细菌吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N-[(1-甲基-2-甲酰氨基)乙基]-N,N′-双(2-吡啶基甲基)-1,3-苯二甲胺、N-[(4-苄氧基苯基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[细菌吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N-[(噻吩-2-基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[细菌吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N-[1-(苄基)-3-吡咯烷基]-N,N′-双(2-吡啶基甲基)-1,3-苯二甲胺、N-[[1-甲基-3-(吡唑-3-基)]丙基]-N,N′-双(2-吡啶基甲基)-1,3-苯二甲胺、N-[1-(苯基)乙基]-N,N′-双(2-吡啶基甲基)-1,3-苯二甲胺、N-[(3,4-亚甲二氧基苯基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[b]吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N-[1-苄基-3-羧甲基-4-哌啶基]-N,N′-双(2-吡啶基甲基)-1,3-苯二甲胺、N-[(3,4-亚甲二氧基苯基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(3-吡啶基甲基)-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[b]吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N-[[1-甲基-2-(2-甲苯基)甲酰氨基]乙基]-N,N′-双(2-吡啶基甲基)-1,3-苯二甲胺、N-[(1,5-二甲基-2-苯基-3-吡唑啉酮-4-基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-[(4-丙氧基苯基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[b]吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N-(1-苯基-3,5-二甲基吡唑啉-4-基甲基)-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-[H-咪唑-4-基甲基]-N,N′-双(2-吡啶基甲基)-1,3-苯二甲胺、N-[(3-甲氧基-4,5-亚甲二氧基苯基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[b]吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N-[(3-氰基苯基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[b]吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N-[(3-氰基苯基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(5-乙基噻吩-2-基甲基)-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[b]吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N-(5-乙基噻吩-2-基甲基)-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-[(2,6-二氟苯基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[b]吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N-[(2,6-二氟苯基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-[(2-二氟甲氧基苯基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[b]吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-二氟甲氧基苯基甲基)-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(1,4-苯并二氧六环-6-基甲基)-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[b]吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N,N′-双(2-吡啶基甲基)-N-[1-(N″-苯基-N″-甲基脲基)-4-哌啶基]-1,4-苯二甲胺、N,N′-双(2-吡啶基甲基)-N-[N″-对甲苯磺酰基苯丙氨酰基)-4-哌啶基]-1,4-苯二甲胺、N-[1-(3-吡啶甲酰氨基)-4-哌啶基]-N,N′-双(2-吡啶基甲基)-1,4-苯二甲胺、N-[1-(环丙基甲酰氨基)-4-哌啶基]-N,N′-双(2-吡啶基甲基)-1,4-苯二甲胺、N-[1-(1-苯基环丙基甲酰氨基)-4-哌啶基]-N,N′-双(2-吡啶基甲基)-1,4-苯二甲胺、N-(1,4-苯并二氧六环-6-基甲基)-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-[1-[3-(2-氯苯基)-5-甲基-异噁唑-4-甲酰氨基]-4-哌啶基]-N,N′-双(2-吡啶基甲基)-1,4-苯二甲胺、N-[1-(2-硫代甲基吡啶-3-甲酰氨基)-4-哌啶基]-N,N′-双(2-吡啶基甲基)-1,4-苯二甲胺、N-[(2,4-二氟苯基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(1-甲基吡咯-2-基甲基)-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-[(2-羟基苯基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-[(3-甲氧基-4,5-亚甲二氧基苯基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(3-吡啶基甲基)-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-[2-(N″-吗啉代甲基)-1-环戊基]-N,N′-双(2-吡啶基甲基)-1,4-苯二甲胺、N-[(1-甲基-3-哌啶基)丙基]-N,N′-双(2-吡啶基甲基)-1,4-苯二甲胺、N-(1-甲基苯并咪唑-2-基甲基)-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-[1-(苄基)-3-吡咯烷基]-N,N′-双(2-吡啶基甲基)-1,4-苯二甲胺、N-[[(1-苯基-3-(N″-吗啉代)]丙基]-N,N′-双(2-吡啶基甲基)-1,4-苯二甲胺、N-[1-(异丙基)-4-哌啶基]-N,N′-双(2-吡啶基甲基)-1,4-苯二甲胺、N-[1-(乙氧羰基)-4-哌啶基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-[(1-甲基-3-吡唑基)丙基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-[1-甲基-2-(N″,N″-二乙基甲酰氨基)乙基]-N,N′-双(2-吡啶基甲基)-1,4-苯二甲胺、N-[(1-甲基-2-苯磺酰基)乙基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-[(2-氯-4,5-亚甲二氧基苯基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-[1-甲基-2-[N″-(4-氯苯基)甲酰氨基]乙基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(1-乙酰氧基吲哚-3-基甲基)-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[b]吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N-[(3-苄氧基-4-甲氧基苯基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[b]吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N-(3-喹啉基甲基)-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-[(8-羟基)-2-喹啉基甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[b]吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-喹啉基甲基)-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[b]吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N-[(4-乙酰胺基苯基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[b]吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N-[1H-咪唑-2-基甲基]-N,N′-双(2-吡啶基甲基)-1,4-苯二甲胺、N-(3-喹啉基甲基)-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[b]吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N-(2-噻唑基甲基)-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[b]吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N-(4-吡啶基甲基)-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[b]吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N-[(5-苄氧基)苯并[b]吡咯-3-基甲基]-N,N′-双(2-吡啶基甲基)-1,4-苯二甲胺、N-(1-甲基吡唑-2-基甲基)-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[b]吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N-[(4-甲基)-1H-咪唑-5-基甲基]-N,N′-双(2-吡啶基甲基)-1,4-苯二甲胺、N-[[(4-二甲基氨基)-1-萘基]甲基]-N,N′-双(2-吡啶基甲基)-1,4-苯二甲胺、N-[1,5-二甲基-2-苯基-3-吡唑啉酮-4-基甲基]-N,N′-双(2-吡啶基甲基)-1,4-苯二甲胺、N-[1-[(1-乙酰基-2-(R)-脯氨酰基]-4-哌啶基]-N-[2-(2-吡啶基)乙基]-N′-(2-吡啶基甲基)-1,3-苯二甲胺、N-[1-[2-乙酰胺基苯甲酰基-4-哌啶基]-4-哌啶基]-N-[2-(2-吡啶基)乙基]-N′-(2-吡啶基甲基)-1,3-苯二甲胺、N-[(2-氰基-2-苯基)乙基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[b]吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N-[(N″-乙酰色氨酰基)-4-哌啶基]-N-[2-(2-吡啶基)乙基]-N′-(2-吡啶基甲基)-1,3-苯二甲胺、N-[(N″-苯甲酰缬氨酰基)-4-哌啶基]-N-[2-(2-吡啶基)乙基]-N′-(2-吡啶基甲基)-1,3-苯二甲胺、N-[(4-二甲基氨基苯基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[b]吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N-(4-吡啶基甲基)-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(1-甲基苯并咪唑-2-基甲基)-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[b]吡啶-9-基)-1,4-苯二甲胺、N-[1-丁基-4-哌啶基]-N-[2-(2-吡啶基)乙基]-N′-(2-吡啶基甲基)-1,3-苯二甲胺、N-[1-苯甲酰基-4-哌啶基]-N-[2-(2-吡啶基)乙基]-N′-(2-吡啶基甲基)-1,3-苯二甲胺、N-[1-(苄基)-3-吡咯烷基]-N-[2-(2-吡啶基)乙基]-N′-(2-吡啶基甲基)-1,3-苯二甲胺、N-[(1-甲基)苯并[b]吡咯-3-基甲基]-N-[2-(2-吡啶基)乙基]-N′-(2-吡啶基甲基)-1,3-苯二甲胺、N-[1H-咪唑-4-基甲基]-N-[2-(2-吡啶基)乙基]-N′-(2-吡啶基甲基)-1,3-苯二甲胺、N-[1-(苄基)-4-哌啶基]-N-[2-(2-吡啶基)乙基]-N′-(2-吡啶基甲基)-1,4-苯二甲胺、N-[1-甲基苯并咪唑-2-基甲基]-N-[2-(2-吡啶基)乙基]-N′-(2-吡啶基甲基)-1,4-苯二甲胺、N-[(2-苯基)苯并[b]吡咯-3-基甲基]-N-[2-(2-吡啶基)乙基]-N′-(2-吡啶基甲基)-1,4-苯二甲胺、N-[(6-甲基吡啶-2-基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,4-苯二甲胺、N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基甲基)-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,3-苯二甲胺、N-[(2-甲氧基苯基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,3-苯二甲胺、N-[(2-乙氧苯基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(6,7,8,9-四氢-5H-环庚[b]吡啶-9-基)-1,3-苯二甲胺、N-(苄氧基乙基)-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,3-苯二甲胺、N-[(2-乙氧基-1-萘基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,3-苯二甲胺、N-[(6-甲基吡啶-2-基)甲基]-N′-(2-吡啶基甲基)-N-(5,6,7,8-四氢-8-喹啉基)-1,3-苯二甲胺、1-[[4-[[(2-吡啶基甲基)氨基]甲基]苯基]甲基]胍、N-(2-吡啶基甲基)-N-(8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)-1,4-苯二甲胺、1-[[4-[[(2-吡啶基甲基)氨基]甲基]苯基]甲基]高哌嗪、1-[[3-[[(2-吡啶基甲基)氨基]甲基]苯基]甲基]高哌嗪、反式和顺式-1-[[4-[[(2-吡啶基甲基)氨基]甲基]苯基]甲基]-3,5-哌啶二胺、N,N′-[1,4-亚苯基双(亚甲基)]双-4-(2-嘧啶基)哌嗪、1-[[4-[[(2-吡啶基甲基)氨基]甲基]苯基]甲基]-1-(2-吡啶基)甲基胺、2-(2-吡啶基)-5-[[(2-吡啶基甲基)氨基]甲基]-1,2,3,4-四氢异喹啉、1-[[4-[[(2-吡啶基甲基)氨基]甲基]苯基]甲基]-3,4-二氨基吡咯烷、1-[[4-[[(2-吡啶基甲基)氨基]甲基]苯基]甲基]-3,4-二乙酰氨基吡咯烷、8-[[4-[[(2-吡啶基甲基)氨基]甲基]苯基]甲基]-2,5,8-三氮杂-3-氧杂双环[4.3.0]壬烷和8-[[4-[[(2-吡啶基甲基)氨基]甲基]苯基]甲基]-2,5,8-三氮杂双环[4.3.0]壬烷。
可用于与本文描述的组合物和方法一起使用的另外的CXCR4拮抗剂包括在WO2001/085196、WO 1999/050461、WO 2001/094420和WO 2003/090512中描述的那些，其中每一项的公开内容在其涉及抑制CXCR4活性或表达的化合物时通过引用并入本文。
可用于与本文描述的组合物和方法一起使用的另外的CXCR4拮抗剂包括在WO2015/063768中描述的那些，例如类似物4F-苯甲酰基TN14003(4F-苯甲酰基-Arg-Arg-Nal-Cys-Tyr-Cit-Lys-DLys-Pro-Tyr-Arg-Cit-Cys-Arg-NH2；其中Nal＝萘丙氨酸，Cit＝瓜氨酸，DLys＝D-赖氨酸)，也称为BL-8040(BioLineRx,Modi’in,Israel)。
可用于与本文描述的组合物和方法一起使用的另外的CXCR4拮抗剂包括抗CXCR4抗体(包括如以上描述的抗体片段的修饰形式)。可用于与本文描述的组合物和方法一起使用的抗CXCR4抗体包括乌洛鲁单抗(WO 2008/060367中的F7；也称为BMS-936564或MDX-1338；Bristol-Myers Squibb)，以及表3中提供的抗体，包括修饰形式和片段。
表3：示例性抗CXCR4抗体
Figure BDA0004021082980000431
用于肽和蛋白质的重组表达的方法
肽和蛋白可以在宿主细胞中表达，例如，通过向宿主细胞递送编码对应肽或蛋白质的核酸。以下部分描述了可用于将本文描述的编码肽和蛋白的核酸引入宿主细胞用于重组表达的目的的多种技术。
用于重组表达的转染技术
可用于将多核苷酸诸如编码多肽的核酸引入细胞的技术(例如哺乳动物细胞，诸如人类细胞)是本领域已知的。在一些实施方案中，电穿孔可用于通过向感兴趣的细胞施加静电势使哺乳动物细胞(例如人类细胞)透化。以这种方式经受外部电场的哺乳动物细胞，诸如人类细胞，随后易摄取外源性核酸。哺乳动物细胞的电穿孔详细描述于，例如，Chu等人(1987)Nucleic Acids Research 15:1311中，其公开内容通过引用并入本文。类似的技术，NucleofectionTM利用施加的电场来刺激外源多核苷酸到真核细胞的细胞核中的摄取。NucleofectionTM和用于进行该技术的方案详细描述于，例如，Distler等人(2005)Experimental Dermatology 14:315以及U.S.2010/0317114中，其各自的公开内容通过引用并入本文。
对转染宿主细胞用于重组肽和蛋白表达的目的有用的另外的技术包括挤压穿孔法。这种技术诱导细胞的快速机械变形，以刺激细胞对外源DNA通过响应于施加的应力而形成的膜孔的摄取。这种技术的优点在于不需要载体来将核酸递送到细胞中，诸如人类细胞中。挤压穿孔详细描述于，例如，Sharei等人(2013)Journal of Visualized Experiments81:e50980中，其公开内容通过引用并入本文。
脂质体转染代表了另一种可用于细胞转染的技术。这种方法包括将核酸加载到脂质体中，脂质体通常向脂质体外部呈现阳离子官能团，诸如季胺或质子化胺。由于细胞膜的阴离子性质，这促进了脂质体和细胞之间的静电相互作用，其最终引起外源核酸的摄取，例如，通过脂质体与细胞膜的直接融合或通过复合物的胞吞。脂质体转染详细描述于，例如，美国专利第7,442,386号中，其公开内容通过引用并入本文。利用与细胞膜的离子相互作用来引发外来核酸的摄取的类似技术包括使细胞与阳离子聚合物-核酸复合物接触。与多核苷酸缔合以赋予有利于与细胞膜相互作用的正电荷的示例性阳离子分子为活化的树枝状大分子(描述于例如Dennig(2003)Topics in Current Chemistry 228:227中，其公开内容通过引用并入本文)和二乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖，二乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖作为转染剂的施用详细描述于例如Gulick等人(1997)Current Protocols in MolecularBiology 40:I:9.2:9.2.1中，其公开内容通过引用并入本文。磁珠是另一种可以用于以温和且有效的方式转染细胞的工具，因为该方法利用施加磁场来引导核酸的摄取。该技术详细描述于例如U.S.2010/0227406中，其公开内容通过引用并入本文。
另一种用于诱导细胞摄取外源性核酸的有用工具是激光转染(laserfection)，该技术包括将细胞暴露于特定波长的电磁辐射，以便温和地使细胞透化并且允许多核苷酸穿过细胞膜。该技术详细描述于例如Rhodes等人(2007)Methods in Cell Biology 82:309中，其公开内容通过引用并入本文。
微囊泡代表可以用于出于重组表达的目的将编码本文描述的肽或蛋白的核酸引入宿主细胞中的另一种潜在的媒介物。在一些实施方案中，由糖蛋白VSV-G与例如基因组修饰蛋白诸如核酸酶的共过表达诱导的微囊泡可以用于有效地将蛋白递送到细胞中，该蛋白随后催化内源性多核苷酸序列的位点特异性裂解，以便使细胞基因组准备好进行感兴趣的多核苷酸诸如基因或调节序列的共价掺入。用于真核细胞遗传修饰的这样的囊泡(也称为Gesicles)的使用详细描述于例如Quinn等人Genetic Modification of Target Cells byDirect Delivery of Active Protein[摘要]中，于：Methylation changes in earlyembryonic genes in cancer[摘要]中,于：美国基因与细胞疗法学会第18届年度会议纪录汇编(Proceedings of the 18th Annual Meeting of the American Society of Geneand Cell Therapy)；2015年5月13日,摘要第122号中。
用于重组表达的核酸递送病毒载体
病毒基因组提供了丰富的载体来源，这些载体可用于将编码本文描述的肽和蛋白质的外源核酸有效递送到宿主细胞中用于重组表达的目的。病毒基因组是用于基因递送的特别有用的载体，因为包含在这样的基因组中的多核苷酸可以被掺入到细胞的基因组中，例如，通过普遍性(generalized)或特异性(specialized)转导的方式。这些过程可以作为病毒载体自然复制周期的一部分发生，并且可以不需要添加蛋白质或试剂来诱导基因整合。可用于将编码本文描述的肽或蛋白质的核酸分子引入宿主细胞以进行重组表达的病毒载体的实例包括细小病毒(parvovirus)诸如腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、腺病毒(例如，Ad5、Ad26、Ad34、Ad35和Ad48)、冠状病毒(coronavirus)、负链RNA病毒诸如正粘病毒(orthomyxovirus)(诸如流感病毒)、弹状病毒(rhabdovirus)(例如狂犬病病毒和水泡性口炎病毒)、副粘病毒(paramyxovirus)(例如麻疹病毒和仙台病毒)、正链RNA病毒诸如小核糖核酸病毒(picornavirus)和甲病毒(alphaviru)以及双链DNA病毒，包括腺病毒、疱疹病毒(例如，1型和2型单纯疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如，痘苗病毒、改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)、禽痘(fowlpox)病毒和金丝雀痘病毒(canarypox))。可用于将编码本文描述的肽和蛋白的多核苷酸递送至宿主细胞用于重组表达目的的其他病毒包括，例如，诺沃克病毒、披膜病毒(togavirus)、黄病毒(flavivirus)、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括禽白血病肉瘤病毒、哺乳动物C型病毒、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV群、慢病毒、泡沫病毒(spumavirus)(Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication,In Fundamental Virology,第三版,B.N.Fields,等人编著，Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,1996)。其他实例包括鼠白血病病毒、鼠肉瘤病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、牛白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒、禽白血病病毒、人类T细胞白血病病毒、狒狒(baboon)内源病毒、长臂猿(Gibbon ape)白血病病毒、Mason Pfizer猴病毒、猿猴(simian)免疫缺陷病毒、猿猴肉瘤病毒、劳斯肉瘤病毒和慢病毒。载体的其他实例在例如美国专利第5,801,030号中描述，其公开内容在其涉及用于基因递送以及重组蛋白和肽表达的病毒载体时通过引用并入本文。
造血干细胞和祖细胞的体内遗传修饰的方法
在使用本文描述的一种或更多种方法动员造血干细胞和祖细胞之后，可以例如通过编辑(例如，纠正、破坏等)内源基因对动员的细胞进行遗传修饰。
核酸
在某些实施方案中，用于体内转导的核酸包括成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas系统，该系统最初在细菌和古菌中演化为针对病毒感染的适应性防御机制。CRISPR/Cas系统包括质粒DNA内的回文重复序列和相关的Cas9核酸酶。DNA和蛋白的这种整体(ensemble)通过首先将外来DNA掺入CRISPR基因座中来指导对靶序列的位点特异性DNA裂解。含有这些外来序列和CRISPR基因座的重复间隔元件的多核苷酸继而在宿主细胞中被转录，以产生指导RNA，该指导RNA随后可以与靶序列退火并且使Cas9核酸酶定位至该位点。以此方式，可以在外来多核苷酸中产生高度位点特异性的Cas9介导的DNA裂解，因为使Cas9与靶DNA分子极为接近的相互作用是由RNA:DNA杂交控制的。因此，理论上人们可以设计裂解任何感兴趣的靶DNA分子的CRISPR/Cas系统。这种技术已经被用来编辑真核生物的基因组(Hwang等人(2013)Nature Biotechnology 31:227，其公开内容通过引用并入本文)，并且可以用作位点特异性地编辑造血干细胞基因组的有效手段，以便例如在掺入编码靶蛋白的基因前裂解DNA。CRISPR/Cas调节基因表达的使用已在例如US 8,697,359中描述，其公开内容通过引用并入本文。
在将感兴趣的基因掺入造血干细胞前，用于位点特异性地裂解基因组DNA的替代方法包括使用锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。与CRISPR/Cas系统不同，这些酶不包含用于定位至特定靶序列的指导多核苷酸。替代地，靶特异性由这些酶内的DNA结合结构域控制。ZFN和TALEN在基因组编辑应用中的使用在例如Urnov等人(2010)Nature Reviews Genetics 11:636；和在Joung等人(2013)Nature Reviews MolecularCell Biology 14:49中描述，这二者的公开内容通过引用并入本文。
可用于将核酸掺入造血干细胞基因组的另外的基因编辑技术包括ARCUSTM兆核酸酶(meganuclease)，其可以合理设计以便位点特异性地裂解基因组DNA。考虑到已经为这样的酶建立了确定的结构-活性关系，使用这些酶是有利的。单链兆核酸酶可以在某些氨基酸位置处被修饰，以便产生在期望的位置处选择性地裂解DNA的核酸酶，从而使得能够将治疗性基因位点特异性地掺入造血干细胞的核DNA中。这些单链核酸酶已经被广泛描述于，例如，U.S.8,021,867和U.S.8,445,251中，其中每一项的公开内容通过引用并入本文。
其他基因编辑系统包括睡美人转座酶100x(SB100x)系统。(参见,Mates等人(2009)Nat Genet 41(6):753-761)。SB100x是包含转座子和转座酶的合成转座子系统。SB转座酶(Tc1/mariner型的)将转座子插入接受者DNA序列中的TA二核苷酸碱基对中。根据本文描述的方法，可以将治疗基因置于转座子上，并且在体内转导之后，将转座子在TA二核苷酸处插入到造血干细胞或祖细胞的基因组中。
适用于本文描述方法的其他基因编辑系统包括位点特异性重组酶。如本文使用的，术语“重组酶”或“位点特异性重组酶”包括参与涉及一个或更多个重组位点(例如，两个、三个、四个、五个、七个、十个、十二个、十五个、二十个、三十个、五十个等)的重组反应的切除或整合蛋白、酶、辅因子或相关蛋白，其可以是野生型蛋白质(参见Landy(1993)CURRENTOPINION IN BIOTECHNOLOGY 3:699-707)，或其突变体、衍生物(例如，包含重组蛋白序列或其片段的融合蛋白)、片段及变体。适用于本发明特定实施方案的重组酶的说明性实例包括但不限于：Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、OC31、Cin、Tn3解离酶、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、Gin、SpCCEl.和ParA。
选择标志物和选择剂
在某些实施方案中，本文公开的方法包括(1)向受试者施用包含选择标志物的核酸以体内转导造血干细胞或祖细胞，以及(2)施用选择剂以选择已经用包含选择标志物的核酸转导的造血干细胞或祖细胞，由此没有用包含选择标志物的核酸转导的造血干细胞或祖细胞不能存活。
在某些实施方案中，选择标志物是人类O(6)-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)突变体。
在某些实施方案中，选择剂包括甲基化剂。在某些实施方案中，甲基化剂选自O6-苄基鸟嘌呤(O6BG)、双氯乙基亚硝基脲(BCNU)、替莫唑胺及其组合。已经用核酸转导的造血干细胞或祖细胞将携带选择标志物(例如，人类O(6)-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)突变体)并将对甲基化剂具有抗性并存活，而未被转导的细胞将不能存活。
用于基因编辑的治疗基因和靶
在某些实施方案中，核酸包含(1)可被供应以提供受试者中丢失或有缺陷的基因的治疗基因，或(2)纠正受试者中有缺陷的基因(基因靶)的基因编辑系统。以下提供了治疗基因或基因靶的列表，包括它们在其中表达的细胞和由它们的破坏引起的疾病：HSC：范可尼贫血(FANC A-F)。血小板：血友病A(因子VIII(F8))；血友病B(因子IX(F9))；因子X缺乏症(因子X(F10))；威斯科特-奥尔德里奇综合征(威斯科特奥尔德里奇综合征蛋白(WASP))。中性粒细胞：X连锁慢性肉芽肿病(细胞色素B-245β链(CYBB))；Kostmann’s综合征(中性粒细胞表达弹性蛋白酶(ELANE))。红细胞：α-地中海贫血(血红蛋白亚基α(HBA))；β-地中海贫血和镰状细胞病(血红蛋白亚基β(HBB))；丙酮酸激酶缺乏症(丙酮酸激酶，肝脏和红细胞(PKLR))；Diamond-Blackfan贫血(核糖体蛋白S19(RPS19))。单核细胞：X-连锁肾上腺脑白质营养不良(ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1))；异染性脑白质营养不良(芳基硫酸酯酶A(ARSA))；戈谢病(葡萄糖神经酰胺酶β(GBA))；亨特综合征(艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS))；黏多糖贮积症I型(艾杜糖醛酸酶，α-L(IDUA))；骨硬化病(T细胞免疫调节物1(TCIRG1))。B细胞：腺苷脱氨酶(ADA)缺乏型重症联合免疫缺陷病(腺苷脱氨酶(ADA))；X连锁重症联合免疫缺陷病(白细胞介素2受体亚基γ(IL2RG))；威斯科特-奥尔德里奇综合征(威斯科特奥尔德里奇综合征蛋白(WASP))；X-连锁无丙种球蛋白血症(布鲁顿酪氨酸激酶(BTK))。T细胞：腺苷脱氨酶(ADA)缺乏型重症联合免疫缺陷病(ADA)；X连锁重症联合免疫缺陷病(IL2RG)；威斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白(WASP)；X连锁高IgM综合征(CD40配体(CD40LG))；IPEX综合征(叉头盒P3(FOXP3))；早发性炎性疾病(白细胞介素4、白细胞介素10、白细胞介素13(IL-4、IL-10、IL-13))；噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(穿孔素1(PRF1))；癌症(人工T细胞受体(TCR)、癌症；嵌合抗原受体(CAR))；人类免疫缺陷病毒(C-C基序趋化因子受体5(CCR5))。
核酸的病毒递送
通常，病毒载体是来源于病毒的双链环状DNA分子。病毒载体可用于在靶细胞中递送和表达一种或更多种治疗性核酸。某些病毒载体稳定地将它们自己掺入到染色体DNA中。通常，病毒载体包括允许在宿主细胞中复制一种或更多种载体编码的核酸(例如，治疗性核酸)的至少一个启动子序列。病毒载体可以任选地包括本文描述的一种或更多种非治疗性组分，诸如选择标志物。
本文描述的方法包括使用逆转录病毒载体、腺病毒来源的载体和/或腺相关病毒载体作为用于外源基因体内转移(特别是到人类中)的重组基因递送系统。用于产生重组逆转录病毒和用这样的病毒在体外或体内感染细胞的方案可以在Current Protocols inMolecular Biology,Ausubel,F.M.等人(编著)Greene Publishing Associates,(1989)，第9.10-9.14节和其他标准实验室手册中找到。
用作DNA载体和病毒载体的转导剂的病毒诸如腺病毒、逆转录病毒和慢病毒可以用于实施本发明。说明性逆转录病毒包括但不限于：Moloney鼠白血病病毒(M-MuLV)、Moloney鼠肉瘤病毒(MoMSV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、Friend鼠白血病病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳斯肉瘤病毒(RSV))以及慢病毒。如本文使用的，术语“慢病毒”是指复杂逆转录病毒的组(group)(或属)。说明性慢病毒包括但不限于：HIV(人类免疫缺陷病毒；包括HIV 1型和HIV 2型)；visna-maedi(VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
在某些实施方案中，腺病毒可以根据本文描述的方法使用。可以对腺病毒的基因组进行操作，使其编码和表达治疗基因，但就其在正常裂解病毒生命周期中的复制能力而言是失活的。来源于腺病毒Ad 5型dl324株或其它腺病毒株(例如，Ad2、Ad3、Ad7等)的合适腺病毒载体是本领域技术人员已知的。重组腺病毒在某些情况下可能是有利的，因为它们不能感染非分裂细胞，并且可用于感染各种各样的细胞类型，包括上皮细胞。此外，病毒颗粒相对稳定，并且易于纯化和浓缩，并且如上所述，可以被修饰以影响感染性谱。此外，引入的腺病毒DNA(和其中包含的外来DNA)不整合到宿主细胞的基因组中，而是保持游离(episomal)，从而避免了由于其中引入的DNA整合到宿主基因组(例如，逆转录病毒DNA)中的原位插入诱变而可能发生的潜在问题。此外，相对于其他基因递送载体，腺病毒基因组对外来DNA的携带能力很大(高达8千碱基)。
腺相关病毒是一种天然存在的缺陷病毒，为了高效复制和生产性生命周期，它需要另一种病毒(诸如腺病毒或疱疹病毒)作为辅助病毒。它也是几种可以将其DNA整合到非分裂细胞中的病毒之一，并表现出高频率的稳定整合。
在某些实施方案中，使用整合的、辅助依赖的腺病毒(例如，HD-Ad5/35++)载体系统。HD-Ad5/35++载体靶向CD46(一种在HSPC上一致地表达的受体)。参见，例如Wang等人(2019)Blood Advances 3(19):2883-2894。
治疗方法
如本文描述的，造血干细胞和祖细胞的体内转导可用于有相应需要的受试者(例如，罹患干细胞紊乱的患者)的基因治疗方法。造血干细胞和祖细胞表现出多潜能性，并且因此可以分化成多种不同的血液谱系，包括但不限于粒细胞(例如，早幼粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、红细胞(例如，网织红细胞、红细胞)、凝血细胞(例如，原巨核细胞、产生血小板的巨核细胞、血小板)、单核细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞)、树突状细胞、小胶质细胞、破骨细胞和淋巴细胞(例如，NK细胞、B细胞和T细胞)。另外，造血干细胞能够自我更新并且因此可以产生与母细胞具有等同潜力的子细胞，并且还具有在体内转导治疗基因后重新归巢至造血干细胞小生境并且重建富有成效的和持续的血细胞生成的能力的特征。因此，转导的造血干细胞和祖细胞代表了用于治疗患者患有造血谱系细胞类型的缺陷或缺乏的许多种紊乱的有用的治疗方法。缺陷或缺乏可以由例如由于自身反应性免疫细胞诸如与自身抗原交叉反应的T淋巴细胞或B淋巴细胞的活性(例如，在患者罹患自身免疫性紊乱诸如本文描述的自身免疫性紊乱的情况下)而导致的内源性造血细胞群体的耗尽而引起。另外或可选地，细胞活性的缺陷或缺乏可以由酶的异常表达(例如，在患者罹患多种代谢紊乱诸如本文描述的代谢紊乱的情况下)而引起。
因此，造血干细胞的体内转导可用于纠正造血谱系的一种或更多种细胞类型中的缺陷或缺乏基因，从而治疗与内源性血细胞群体中的缺陷或耗尽相关的病理。造血干细胞的体内转导可以用于治疗，例如，非恶性血红蛋白病(例如，选自由以下组成的组的血红蛋白病：镰状细胞贫血、地中海贫血、范可尼贫血、再生障碍性贫血和威斯科特-奥尔德里奇综合征)。在这些情况下，诸如，可以将CXCR4拮抗剂和/或CXCR2激动剂施用至受试者以响应于这样的治疗将造血干细胞和祖细胞的群体从干细胞小生境诸如骨髓释放到循环外周血中。如此动员的造血干细胞和祖细胞然后可以用核酸在体内转导，该核酸可以包含例如治疗基因和选择标记。当将选择剂施用至受试者时，未被包含治疗基因和选择标志物的核酸转导的造血干细胞或祖细胞不能存活。然后，转导的细胞可以归巢到造血干细胞小生境，并重构携带治疗基因的细胞的群体。
另外或可选地，造血干细胞和祖细胞可以用于治疗免疫缺陷，诸如先天性免疫缺陷。另外或可选地，本文描述的组合物和方法可以用于治疗获得性免疫缺陷(例如，选自由以下组成的组的获得性免疫缺陷：HIV和AIDS)。在这些情况下，例如，可以将CXCR4拮抗剂和/或CXCR2激动剂施用至受试者以引起造血干细胞和祖细胞的群体从干细胞小生境诸如骨髓释放到循环外周血中。然后可以用核酸在体内转导如此动员的造血干细胞和祖细胞。在选择核酸之后，选择的细胞可以归巢到造血干细胞小生境并重构携带治疗基因的免疫细胞的群体(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞或其他免疫细胞)。
造血干细胞和祖细胞还可以用于治疗代谢紊乱(例如，选自由以下组成的组的代谢紊乱：糖原贮积病、黏多糖贮积病、戈谢病、赫尔勒病、鞘脂贮积病和异染性脑白质营养不良、球状细胞脑白质营养不良和脑肾上腺脑白质营养不良)。在这些情况下，诸如，可以将CXCR4拮抗剂和/或CXCR2激动剂施用至受试者以使造血干细胞和祖细胞的群体从干细胞小生境诸如骨髓释放到循环外周血中。然后可以用核酸在体内转导如此动员的造血干细胞和祖细胞。在选择核酸之后，选择的细胞可以归巢到造血干细胞小生境，并重构携带治疗基因的造血细胞的群体。
另外或可选地，造血干细胞或祖细胞可以用于治疗恶性肿瘤或增生性紊乱，诸如血液学癌症或骨髓增生性疾病。在癌症治疗的情况下，例如，可以将CXCR4拮抗剂和/或CXCR2激动剂施用至受试者以使造血干细胞和祖细胞的群体从干细胞小生境诸如骨髓释放到循环外周血中。然后可以用核酸在体内转导如此动员的造血干细胞和祖细胞。在选择核酸之后，选择的细胞可以归巢到造血干细胞小生境并重构携带治疗基因的细胞的群体。可以根据本文描述的组合物和方法来治疗的示例性血液学癌症是急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，以及其他癌性状况，包括神经母细胞瘤。
可以使用如本文描述的方法和组合物治疗的另外的疾病包括但不限于腺苷脱氨酶缺乏症和重症联合免疫缺陷病、高免疫球蛋白M综合征、切东病、遗传性淋巴组织细胞增多症、骨硬化病、成骨不全症、贮积病、重型地中海贫血、系统性硬化、系统性红斑狼疮、多发性硬化和青少年类风湿性关节炎。
另外，造血干细胞和祖细胞的体内转导可以用于治疗自身免疫性紊乱。在一些实施方案中，转导的造血干细胞和祖细胞可以归巢至干细胞小生境诸如骨髓，并且建立富有成效的血细胞生成。这继而可以置换在自身免疫性细胞清除期间耗尽的细胞群体，该自身免疫性细胞清除可能由于自身反应性淋巴细胞(例如，自身反应性T淋巴细胞和/或自身反应性B淋巴细胞)的活性而出现。可以治疗的自身免疫性疾病包括但不限于银屑病、银屑病性关节炎、1型糖尿病(Type 1diabetes mellitus)(1型糖尿病(Type 1diabetes))、类风湿性关节炎(RA)、人类系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化(MS)、炎性肠病(IBD)、淋巴细胞性结肠炎、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、艾迪生氏病(Addison's disease)、普秃、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征(APS)、再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性卵巢炎、巴洛病、白塞氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、恰加斯氏病、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、克罗恩氏病、瘢痕性类天疱疮、乳糜泻-疱疹样皮炎、冷凝集素病、CREST综合征、恶性萎缩性丘疹病、盘状红斑狼疮、自主神经功能障碍、子宫内膜异位、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、肺出血肾炎综合征、格雷夫斯病、格林-巴利综合征(GBS)、桥本氏甲状腺炎、化脓性汗腺炎、特发性和/或急性血小板减少性紫癜、特发性肺纤维化、IgA神经病变、间质性膀胱炎、青少年关节炎、川崎病、扁平苔藓、莱姆病、梅尼埃病、混合性结缔组织病(MCTD)、重症肌无力、神经性肌强直、斜视眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)、视神经炎、奥德氏甲状腺炎、寻常型天疱疮、恶性贫血、多软骨炎、多肌炎和皮肌炎、原发性胆汁性肝硬化、结节性多动脉炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、原发性无丙种球蛋白血症、雷诺现象、莱特尔综合征、风湿热、结节病、硬皮病、干燥综合征、僵人综合征、高安氏动脉炎、颞动脉炎(又称“巨细胞动脉炎”)、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、外阴痛(“外阴前庭炎”)和韦格纳肉芽肿病。
CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂给药、核酸施用和核酸选择的动力学
对于受试者施用CXCR4拮抗剂和CXCR2激动剂两者的情况，可以基本上同时(例如，在同一时间或一个紧接着另一个之后)向受试者施用这两种剂。在一些实施方案中，CXCR4拮抗剂和CXCR2激动剂可以彼此共配制，并在同一药物组合物中施用。可选地，CXCR4拮抗剂和CXCR2激动剂可配制成不同的药物组合物，并分别但基本上同时向受试者施用。
在一些实施方案中，在施用CXCR4拮抗剂后向受试者施用CXCR2激动剂。在一些实施方案中，CXCR2激动剂在施用CXCR4拮抗剂约12小时内(例如，约10小时、8小时、6小时、4小时、2小时或1小时内)向受试者施用。在一些实施方案中，CXCR2激动剂在CXCR4拮抗剂的施用之后约30分钟至约180分钟，诸如约40分钟至约160分钟、约50分钟至约150分钟、约60分钟至约140分钟、约70分钟至约130分钟、约60分钟至约120分钟、约70分钟至约110分钟或约80分钟至约100分钟(例如，在CXCR4拮抗剂的施用之后约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约105分钟、约110分钟、约115分钟、约120分钟、约125分钟、约130分钟、约135分钟、约140分钟、约145分钟、约150分钟、约155分钟、约160分钟、约165分钟、约170分钟、约175分钟或约180分钟)向受试者施用。在一些实施方案中，CXCR2激动剂在CXCR4拮抗剂后约2小时施用。
在某些实施方案中，用于体内转导的核酸的施用在完成CXCR4拮抗剂和CXCR2激动剂的施用后约10分钟至约2小时(例如，在施用CXCR4拮抗剂和CXCR2激动剂后约10分钟至约1.9小时、约20分钟至约1.8小时、约25分钟至约1.7小时、约30分钟至约1.6小时、约40分钟至约1.5小时、约1小时至约2小时)发生。在某些实施方案中，用于体内转导的核酸的施用在完成CXCR4拮抗剂和CXCR2激动剂的施用后约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟或约120分钟发生。在某些实施方案中，用于体内转导的核酸的施用在完成CXCR4拮抗剂和CXCR2激动剂的施用后约10分钟至约20分钟(例如，在完成CXCR4拮抗剂和CXCR2激动剂的施用后约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟或约20分钟)发生。
在某些实施方案中，用于体内转导的核酸的施用在施用CXCR2激动剂和/或CXCR4拮抗剂后约2小时至约10小时之间，例如，在约2小时至约3小时之间、在约2小时至约4小时之间、在约2小时至约5小时之间、在约2小时至约6小时之间、在约2小时至约7小时之间、在约2小时至约8小时之间、在约2小时至约9小时之间、在约3小时至约4小时之间、在约3小时至约5小时之间、在约3小时至约6小时之间、在约3小时至约7小时之间、在约3小时至约8小时之间、在约3小时至约9小时之间、在约3小时至约10小时之间、在约4小时至约5小时之间、在约4小时至约6小时之间、在约4小时至约7小时之间、在约4小时至约8小时之间、在约4小时至约9小时之间、在约4小时至约10小时之间、在约5小时至约6小时之间、在约5小时至约7小时之间、在约5小时至约8小时之间、在约5小时至约9小时之间、在约5小时至约10小时之间、在约6小时至约7小时之间、在约6小时至约8小时之间、在约6小时至约9小时之间、在约6小时至约10小时之间、在约7小时至8小时之间、在约7小时至约9小时之间、在约7小时至约10小时之间、在约8小时至约9小时之间、在约8小时至约10小时之间、或在约9小时至约10小时之间发生。
在某些实施方案中，选择剂在施用核酸后约4周和约24周之间(例如约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18周、约19周、约20周、约21周、约22周、约23周、约24周)施用。在某些实施方案中，选择剂施用一次。在某些实施方案中，在核酸的施用后约4周和约10周之间开始，在2个周期、3个周期、4个周期、5个周期、6个周期、7个周期或8个周期内施用选择剂。在某些实施方案中，周期间隔1天、间隔2天、间隔3天、间隔4天、间隔5天、间隔6天、间隔1周、间隔2周、间隔3周或间隔4周。
CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂的施用途径
本文描述的CXCR4拮抗剂和CXCR2激动剂可以通过多种途径向患者施用，诸如静脉内、皮下、肌肉内或肠胃外。在任何特定情况下，最合适的施用途径将取决于所施用的特定剂、患者、药物配制方法、施用方法(例如，施用时间和施用途径)、患者的年龄、体重、性别、所治疗疾病的严重程度、患者的饮食和患者的排泄率。
药物组合物
本文所设想的CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂可各自配制成药物组合物，用于向受试者诸如哺乳动物受试者(例如，人类受试者)施用。例如，本文设想的药物组合物包含与一种或更多种合适的稀释剂、运载体和/或赋形剂混合的CXCR2激动剂和/或CXCR4拮抗剂。药物组合物可以包括无菌水性悬浮液。用于选择和制备合适制剂的常规程序和成分描述于，例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy(2012,第22版)中和The UnitedStates Pharmacopeia:The National Formulary(2015,USP 38NF 33)中，其公开内容通过引用以其整体并入本文。
药物组合物可以单独的或与药学上可接受的运载体组合(其比例可以由活性药物成分(即CXCR2激动剂和/或CXCR4拮抗剂)的量、选择的施用途径和标准药物实践来确定)施用至受试者，诸如人类受试者。
CXCR2激动剂和/或CXCR4拮抗剂的施用和剂量
设想的CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂可以通过一种或更多种施用途径向受试者诸如哺乳动物受试者(例如，人类受试者)施用。例如，设想的CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂可以通过尤其是静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内或皮下输注向受试者施用。
设想的CXCR2激动剂可以以在约0.001mg/kg受试者体重至约1mg/kg受试者体重之间，例如在约0.001mg/kg至约0.1mg/kg之间、在约0.05mg/kg和约0.1mg/kg之间、在约0.05mg/kg和约0.07mg/kg之间、以及在约0.07mg/kg和约0.1mg/kg之间的量施用。
设想的CXCR2激动剂可以以在约0.001mg/kg和小于约0.05mg/kg之间，例如，在约0.0015mg/kg和小于约0.05mg/kg之间、在约0.002mg/kg和小于约0.05mg/kg之间、在约0.025mg/kg和小于约0.05mg/kg之间、在约0.003mg/kg和小于约0.05mg/kg之间、在约0.0035mg/kg和小于约0.05mg/kg之间、在约0.004mg/kg和小于约0.05mg/kg之间、在约0.0045mg/kg和小于约0.05mg/kg之间、在约0.005mg/kg和小于约0.05mg/kg之间、在约0.0055mg/kg和小于约0.05mg/kg之间、在约0.006mg/kg和小于约0.05mg/kg之间、在约0.0065mg/kg和小于约0.05mg/kg之间、在约0.007mg/kg和小于约0.05mg/kg之间、在约0.075mg/kg和小于约0.05mg/kg之间、在约0.008mg/kg和小于约0.05mg/kg之间、在约0.0085mg/kg和小于约0.05mg/kg之间、在约0.009mg/kg和小于约0.05mg/kg之间、在约0.0095mg/kg和小于约0.05mg/kg之间、在约0.01mg/kg和小于约0.05mg/kg之间、在约0.015mg/kg和小于约0.05mg/kg之间、在约0.02和小于约0.05mg/kg之间、在约0.025mg/kg和小于约0.05mg/kg之间；在约0.03mg/kg和小于约0.05mg/kg之间、在约0.035mg/kg和小于约0.05mg/kg之间、在约0.04mg/kg和小于约0.05mg/kg之间、以及在约0.045mg/kg和小于约0.05mg/kg之间的量施用。
在某些实施方案中，CXCR2激动剂可以以在约0.001mg/kg和约0.049mg/kg之间，例如在约0.001mg/kg和约0.045mg/kg之间、在约0.001mg/kg和约0.04mg/kg之间、在约0.001mg/kg和约0.035mg/kg之间、在约0.001mg/kg和约0.03mg/kg之间、在约0.001mg/kg和约0.025mg/kg之间、在约0.001mg/kg和约0.02mg/kg之间、在约0.001mg/kg和约0.015mg/kg之间、在约0.001mg/kg和约0.01mg/kg之间的量施用。
在某些实施方案中，CXCR2激动剂可以以在约0.01mg/kg和小于约0.05mg/kg之间、在约0.01mg/kg和约0.049mg/kg之间、在约0.01mg/kg和约0.045mg/kg之间、在约0.01mg/kg和约0.04mg/kg之间、在约0.01mg/kg和约0.035mg/kg之间、在约0.01mg/kg和约0.03mg/kg之间、在约0.01mg/kg和约0.025mg/kg之间、在约0.01mg/kg和约0.02mg/kg之间、以及在约0.01mg/kg和约0.015mg/kg之间的量施用。
在某些实施方案中，CXCR2激动剂可以以在约0.02mg/kg和小于约0.05mg/kg之间、在约0.02mg/kg和约0.049mg/kg之间、在约0.02mg/kg和约0.045mg/kg之间、在约0.02mg/kg和约0.04mg/kg之间、在约0.02mg/kg和约0.035mg/kg之间、在约0.02mg/kg和约0.03mg/kg之间、以及在约0.02mg/kg和约0.025mg/kg之间的量施用。
在某些实施方案中，CXCR2激动剂以约0.03mg/kg的剂量施用。
在某些实施方案中，CXCR2激动剂以约1mg至约8mg的固定剂量施用。例如，CXCR2激动剂可以约1mg至约1.5mg、约1mg至约2mg、约1mg至约2.5mg、约1mg至约3mg、约1mg至约3.5mg、约1mg至约4mg、约1mg至约4.5mg、约1mg至约5mg、约1mg至约5.5mg、约1mg至约6mg、约1mg至约6.5mg、约1mg至约7mg、约1mg至约7.5mg、约1.5mg至约2mg、约1.5mg至约2.5mg、约1.5mg至约3mg、约1.5mg至约3.5mg、约1.5mg至约4mg、约1.5mg至约4.5mg、约1.5mg至约5mg、约1.5mg至约5.5mg、约1.5mg至约6mg、约1.5mg至约6.5mg、约1.5mg至约7mg、约1.5mg至约7.5mg、约1.5mg至约8mg、约2mg至约2.5mg、约2mg至约3mg、约2mg至约3.5mg、约2mg至约4mg、约2mg至约4.5mg、约2mg至约5mg、约2mg至约5.5mg、约2mg至约6mg、约2mg至约6.5mg、约2mg至约7mg、约2mg至约7.5mg、约2mg至约8mg、约2.5mg至约3mg、约2.5mg至约3.5mg、约2.5mg至约4mg、约2.5mg至约4.5mg、约2.5mg至约5mg、约2.5mg至约5.5mg、约2.5mg至约6mg、约2.5mg至约6.5mg、约2.5mg至约7mg、约2.5mg至约7.5mg、约2.5mg至约8mg、约3mg至约3.5mg、约3mg至约4mg、约3mg至约4.5mg、约3mg至约5mg、约3mg至约5.5mg、约3mg至约6mg、约3mg至约6.5mg、约3mg至约7mg、约3mg至约7.5mg、约3mg至约8mg、约3.5mg至约4mg、约3.5mg至约4.5mg、约3.5mg至约5mg、约3.5mg至约5.5mg、约3.5mg至约6mg、约3.5mg至约6.5mg、约3.5mg至约7mg、约3.5mg至约7.5mg、约3.5mg至约8mg、约4mg至约4.5mg、约4mg至约5mg、约4mg至约5.5mg、约4mg至约6mg、约4mg至约6.5mg、约4mg至约7mg、约4mg至约7.5mg、约4mg至约8mg、约4.5mg至约5mg、约4.5mg至约5.5mg、约4.5mg至约6mg、约4.5mg至约6.5mg、约4.5mg至约7mg、约4.5mg至约7.5mg、约4.5mg至约8mg、约5mg至约5.5mg、约5mg至约6mg、约5mg至约6.5mg、约5mg至约7mg、约5mg至约7.5mg、约5mg至约8mg、约5.5mg至约6mg、约5.5mg至约6.5mg、约5.5mg至约7mg、约5.5mg至约7.5mg、约5.5mg至约8mg、约6mg至约6.5mg、约6mg至约7mg、约6mg至约7.5mg、约6mg至约8mg、约6.5mg至约7mg、约6.5mg至约7.5mg、约6.5mg至约8mg、约7mg至约7.5mg、约7mg至约8mg、约7.5mg至8mg的固定剂量施用。在某些实施方案中，CXCR2激动剂以约1.3mg、2.5mg或5.5mg的固定剂量施用。
在某些实施方案中，CXCR2激动剂可以以约0.001mg/kg/天、约0.0015mg/kg/天、约0.002mg/kg/天、约0.0025mg/kg/天、约0.003mg/kg/天、约0.0035mg/kg/天、约0.004mg/kg/天、约0.0045mg/kg/天、约0.005mg/kg/天、约0.0055mg/kg/天、约0.006mg/kg/天、约0.0065mg/kg/天、约0.007mg/kg/天、约0.0075mg/kg/天、约0.008mg/kg/天、约0.0085mg/kg/天、约0.009mg/kg/天、约0.0095mg/kg/天、约0.01mg/kg/天、约0.015mg/kg/天、约0.02mg/kg/天、约0.025mg/kg/天、约0.03mg/kg/天、约0.035mg/kg/天、约0.04mg/kg/天、约0.045mg/kg/天、约0.049mg/kg/天、或小于约0.05mg/kg/天的量施用。在某些实施方案中，CXCR2激动剂以约1.3mg/天、2.5mg/天或5.5mg/天的固定剂量施用。
在某些实施方案中，CXCR2激动剂以约1mg/天至约8mg/天的固定剂量施用。例如，CXCR2激动剂可以以约1mg/天、约1.5mg/天、约2mg/天、约2.5mg/天、约3.5mg/天、约4mg/天、约5mg/天、约5.5mg/天、约6mg/天、约6.5mg/天、约7mg/天、约7.5mg/天、或约8mg/天的固定剂量施用。
在一些实施方案中，CXCR4拮抗剂是普乐沙福或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，CXCR4拮抗剂(例如，普乐沙福或其药学上可接受的盐)向受试者皮下施用。在一些实施方案中，CXCR4拮抗剂(例如，普乐沙福或其药学上可接受的盐)以约50μg/kg受试者的体重至约500μg/kg受试者的体重的剂量，诸如约50μg/kg、55μg/kg、60μg/kg、65μg/kg、70μg/kg、75μg/kg、80μg/kg、85μg/kg、90μg/kg、95μg/kg、100μg/kg、105μg/kg、110μg/kg、115μg/kg、120μg/kg、125μg/kg、130μg/kg、135μg/kg、140μg/kg、145μg/kg、150μg/kg、155μg/kg、160μg/kg、165μg/kg、170μg/kg、175μg/kg、180μg/kg、185μg/kg、190μg/kg、195μg/kg、200μg/kg、205μg/kg、210μg/kg、215μg/kg、220μg/kg、225μg/kg、230μg/kg、235μg/kg、240μg/kg、245μg/kg、250μg/kg、255μg/kg、260μg/kg、265μg/kg、270μg/kg、275μg/kg、280μg/kg、285μg/kg、290μg/kg、295μg/kg、300μg/kg、305μg/kg、310μg/kg、315μg/kg、320μg/kg、325μg/kg、330μg/kg、335μg/kg、340μg/kg、345μg/kg、350μg/kg、355μg/kg、360μg/kg、365μg/kg、370μg/kg、375μg/kg、380μg/kg、385μg/kg、390μg/kg、395μg/kg、400μg/kg、405μg/kg、410μg/kg、415μg/kg、420μg/kg、425μg/kg、430μg/kg、435μg/kg、440μg/kg、445μg/kg、450μg/kg、455μg/kg、460μg/kg、465μg/kg、470μg/kg、475μg/kg、480μg/kg、485μg/kg、490μg/kg、495μg/kg、或500μg/kg的剂量向受试者施用。在一些实施方案中，CXCR4拮抗剂(例如，普乐沙福或其药学上可接受的盐)以约200μg/kg至约300μg/kg的剂量，诸如约240μg/kg的剂量向受试者施用。
例如，在一些实施方案中，CXCR4拮抗剂(例如，普乐沙福或其药学上可接受的盐)以约50μg/kg/天至约500μg/kg/天的剂量，诸如约50μg/kg/天、55μg/kg/天、60μg/kg/天、65μg/kg/天、70μg/kg/天、75μg/kg/天、80μg/kg/天、85μg/kg/天、90μg/kg/天、95μg/kg/天、100μg/kg/天、105μg/kg/天、110μg/kg/天、115μg/kg/天、120μg/kg/天、125μg/kg/天、130μg/kg/天、135μg/kg/天、140μg/kg/天、145μg/kg/天、150μg/kg/天、155μg/kg/天、160μg/kg/天、165μg/kg/天、170μg/kg/天、175μg/kg/天、180μg/kg/天、185μg/kg/天、190μg/kg/天、195μg/kg/天、200μg/kg/天、205μg/kg/天、210μg/kg/天、215μg/kg/天、220μg/kg/天、225μg/kg/天、230μg/kg/天、235μg/kg/天、240μg/kg/天、245μg/kg/天、250μg/kg/天、255μg/kg/天、260μg/kg/天、265μg/kg/天、270μg/kg/天、275μg/kg/天、280μg/kg/天、285μg/kg/天、290μg/kg/天、295μg/kg/天、300μg/kg/天、305μg/kg/天、310μg/kg/天、315μg/kg/天、320μg/kg/天、325μg/kg/天、330μg/kg/天、335μg/kg/天、340μg/kg/天、345μg/kg/天、350μg/kg/天、355μg/kg/天、360μg/kg/天、365μg/kg/天、370μg/kg/天、375μg/kg/天、380μg/kg/天、385μg/kg/天、390μg/kg/天、395μg/kg/天、400μg/kg/天、405μg/kg/天、410μg/kg/天、415μg/kg/天、420μg/kg/天、425μg/kg/天、430μg/kg/天、435μg/kg/天、440μg/kg/天、445μg/kg/天、450μg/kg/天、455μg/kg/天、460μg/kg/天、465μg/kg/天、470μg/kg/天、475μg/kg/天、480μg/kg/天、485μg/kg/天、490μg/kg/天、495μg/kg/天、或500μg/kg/天的剂量向受试者施用。在一些实施方案中，CXCR4拮抗剂(例如，普乐沙福或其药学上可接受的盐)以约200μg/kg/天至约300μg/kg/天的剂量，诸如约240μg/kg/天的剂量向受试者施用。在一些实施方案中，CXCR4拮抗剂可以作为单剂量施用。在其他实施方案中，CXCR4拮抗剂可以作为两个或更多个剂量施用。
设想的CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂可以以一个或更多个剂量向受试者施用。例如，CXCR2激动剂和/或CXCR4拮抗剂可以作为单剂量或两个、三个、四个、五个或更多个剂量施用。当施用多于一个剂量时，后续剂量可在初始剂量后在同一天或在初始剂量后一天或更多天、一周或更多周、一个月或更多个月或者一年或更多年期间提供。例如，本文描述的设想的CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂可以每天、每周、每月或每年一次或更多次向受试者，诸如人类受试者施用，这取决于诸如受试者的年龄、体重、性别、受试者的饮食和受试者的排泄率这样的因素。
在某些实施方案中，设想的CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂各自以每天一次的单剂量施用。在某些实施方案中，设想的CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂各自在连续两天被施用。在某些实施方案中，设想的CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂各自在连续两天以单剂量每天一次被施用。在某些实施方案中，连续两天施用设想的CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂提高了CD34+细胞的产量。在某些实施方案中，连续两天施用设想的CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂允许动员足够数目的CD34+细胞用于体内转导，其中一天施用是不足的。在某些实施方案中，受试者可以患有导致干细胞从骨髓中动员不足的状况。
白细胞增多
在某些实施方案中，CXCR2激动剂和任选地CXCR4拮抗剂的施用导致白细胞增多的最小变化(即，血液中白细胞数目的最小变化)。在某些实施方案中，白细胞是中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞或其组合。相反，用于动员中性粒细胞的传统治疗选择G-CSF增强了白细胞增多，这是有问题的，例如在镰状细胞病的患者中，白细胞诸如中性粒细胞粘附于内皮，从而增加了严重和危及生命的并发症诸如血管闭塞危机的风险。因此，在某些实施方案中，例如在施用CXCR2激动剂和任选地CXCR4拮抗剂后约1小时、3小时、6小时、9小时、24小时或48小时，施用CXCR2激动剂和任选地CXCR4拮抗剂导致存在小于约30x1000个白细胞/ml血液、小于约20x1000个白细胞/ml血液、小于约10x1000个白细胞/ml血液。
细胞因子水平
在某些实施方案中，施用CXCR2激动剂和任选地CXCR4拮抗剂导致血液中IL-6水平的最小变化。相反，G-CSF引起血液中高水平的细胞因子，这在例如镰状细胞病患者中是有问题的。因此，在某些实施方案中，例如在施用CXCR2激动剂和任选地CXCR4拮抗剂后约1小时、3小时、6小时、9小时、24小时或48小时，施用CXCR2激动剂和任选地CXCR4拮抗剂导致小于约150pg IL-6/ml血液、小于约100pg IL-6/ml血液或小于约75pgIL-6/ml血液。在某些实施方案中，与施用CXCR2激动剂和任选地CXCR4拮抗剂之前患者的血清IL-6水平相比，施用CXCR2激动剂和任选地CXCR4拮抗剂基本上不会导致患者的血清IL-6水平增加。在一些实施方案中，与施用CXCR2激动剂和任选地CXCR4拮抗剂之前患者的血清IL-6水平相比，施用CXCR2激动剂和任选地CXCR4拮抗剂导致患者的血清IL-6水平小于5％的增加、小于10％的增加、小于15％的增加、小于20％的增加、小于30％的增加或小于50％的增加。
本文描述的药物组合物可以以一个或更多个剂量向受试者施用。当施用多于一个剂量时，可以在初始剂量后一天或更多天、一周或更多周、一个月或更多个月或者一年或更多年后提供后续剂量。例如，本文描述的药物组合物可以每天、每周、每月或每年一次或更多次向受试者，诸如罹患本文描述的一种或更多种疾病、状况或紊乱的人类受试者施用，这取决于诸如受试者的年龄、体重、性别、所治疗疾病的严重程度、受试者的饮食和受试者的排泄率这样的因素。
实施例
提出以下实施例以便为本领域普通技术人员提供可以如何使用、制备和评价本文描述的组合物和方法的描述，并且所述实施例意图仅仅是示例性的，而不意图限制本发明的范围。
实施例1：在体内转导和选择后，用Gro-β+普乐沙福动员引起与G-CSF+普乐沙福相 当的体内转导
本实施例展示，造血干细胞和祖细胞可以使用MGTA-145(Gro-βT)+普乐沙福动员并在体内转化。如图1A中示出的，用GCSF+普乐沙福(5天)或用Gro-β+普乐沙福(同时sc给予)动员CD46转基因小鼠，并且然后在1小时后注射整合的HDAd5/35++mgmt/GFP载体+HDAd-SB载体(参见，例如，Li等人(2018)Mol Ther Methods Clin Dev.9:148-152)。地塞米松也在两种动员方案中使用。
在MGTA-145注射后的各个时间点通过流式细胞术测量LSK(谱系-cKit+Sca1+)细胞的数目(图1B)。通过将固定体积的血液铺板在集落测定培养基中并对随时间形成的集落数目评分来进行测定(图1C)。如示出的，用MGTA-145+普乐沙福的动员在MGTA-145注射后约15分钟引起动员峰值。如图2中示出的，用MGTA-145(图中的“Gro-β”)+普乐沙福(图中的AMD3100)的动员引起比用G-CSF+普乐沙福(图中的AMD3100)的动员的更少的细胞动员。然而，令人惊讶的是，如以下更详细描述的，使用MGTA-145+普乐沙福动员的细胞的体内转导与使用GCSF+普乐沙福动员的细胞的体内转导一样有效。
在普乐沙福后的各个时间点收集血液样品，并进行Hemavet分析。如图3A中示出的，MGTA-145+普乐沙福组的白细胞增多远低于G-CSF+普乐沙福组中的白细胞增多。相似地，图3B提供了示出注射最后一种药物后一小时，使用MGTA-145+普乐沙福比使用G-CSF+普乐沙福动员更少的单个核细胞(MNC)的图。这些观察表明，与使用G-CSF+普乐沙福的动员相比，使用MGTA-145+普乐沙福的动员对于患有血液紊乱(例如，镰状细胞贫血)的患者可能是有利的。图3C示出了通过明亮甲酚蓝检测到的网织红细胞的百分比。
如图4中的方案所示出的，在动员和注射HDAd5/35++mgmt/GFP载体+HDAd-SB载体后，在第4周、第6周、第8周和第10周用IP O6-苄基鸟嘌呤(O6BG)+双氯乙基亚硝基脲(BCNU)进行4轮选择。体内转导后12周处死小鼠并且收获骨髓lin-细胞用于移植到第二接受者(致死照射的C57Bl/6小鼠)中。对第二移植的小鼠进行随访至16周，进行最终分析。
如图5A-图5C中示出的，在移植后，第二接受者中存在相当水平的GFP+细胞。图5A示出了移植后10周和12周PBMC中增加的细胞百分比。图5B示出了第16周时血液、脾和骨髓MNC中CD3-、CD19-和Gr-1阳性细胞上GFP表达的百分比。还分析了骨髓样品中的LSK细胞。这些数据示出了血液、脾和骨髓中GFP+细胞的相当水平。图5C示出了其中在转导后第16周从骨髓中分离谱系阴性细胞，并将2500个细胞铺板用于甲基纤维素测定的实验的结果。示出了汇集的集落细胞中GFP表达的百分比。综上所述，这些结果示出，无论是使用G-CSF+普乐沙福还是MGTA-145+普乐沙福来动员细胞，体内转导都以相似的水平发生。
接下来，通过流式细胞术测量植入以检测PBMC中的人类CD46+细胞。如图6A中示出的，无论使用G-CSF+普乐沙福或MGTA-145+普乐沙福来动员细胞，均可看到相当水平的植入。另外，如图6B中示出的，在移植后直到第16周的各个时间点监测PBMC中GFP的表达，示出转导后转导基因的稳定维持。
在第二移植后第16周，测量血液、脾和骨髓MNC中的细胞组成，并在图7A中示出。每个点代表一只动物。未转导的幼稚动物用作对照。此外，谱系阴性(Lin-)细胞在第16周从骨髓中分离。将2500个细胞铺板用于甲基纤维素测定。在10天后对集落的数目计数，并在图7B中示出。这些数据指示，无论使用G-CSF+普乐沙福还是MGTA-145+普乐沙福来动员细胞，都可以在多于一个细胞谱系中观察到植入。
评估了响应于动员和转导的细胞因子水平的分析。在转导后1小时和6小时，收集血清样品用于IL-6ELISA。如图8中示出的，与用G-CSF+普乐沙福(“G-CSF)动员相比，用MGTA-145+普乐沙福(“MGTA-145”)动员引起最小的细胞因子升高。每个点代表一只动物。来自没有动员的小鼠的样品用作对照。*,p<0.05。
在恒河猴中重复了相似的实验，并展示了高水平的γ珠蛋白表达，γ珠蛋白通过睡美人转座酶转化到HSPC中。
另外，评估地中海贫血和镰状细胞病的动物模型。Hbbth3/CD46tg小鼠(地中海贫血病模型)用MGTA-145+普乐沙福动员。在MGTA-145施用后15分钟收集血液样品。LSK(谱系-cKit+Sca1+)细胞的数目通过流式细胞术测量，并在图9A中示出。通过甲基纤维素测定测量外周血中存在的集落形成细胞的数目，如在图9B中示出的。每个点代表一只动物。这些数据表明，在地中海贫血小鼠模型中，MGTA-145+普乐沙福可以高效地动员HSC。
图10示出了处理前Hbbth3/CD46tg(地中海贫血)和Hbbtm2/CD46tg(Townes或镰状细胞病模型)的表型。通过血液涂片的Giemsa/May-Grünwald染色测量RBC形态。通过明亮甲酚蓝染色测量网织红细胞的百分比。来自CD46小鼠的样品被用作“健康”对照。
实施例2：用于镰状细胞贫血基因治疗的造血干细胞和祖细胞的体内转导
本实施例将展示造血干细胞和祖细胞可以使用Gro-β或MGTA-145+普乐沙福动员并用HDAd5/35++mgmt载体体内转化，HDAd5/35++mgmt载体能够通过Cas-CRISPR编辑添加γ基因和重新激活内源性γ珠蛋白(参见，例如，Li等人(2018)Blood 131(26):2915-2928和Richter等人(2016)Blood 128:2206-2217)。
Townes/CD46tg转基因小鼠(其中小鼠珠蛋白基因被人类珠蛋白基因置换的小鼠模型(参见Ryan等人(1997)Science 278(5339):873-876))将用GCSF+普乐沙福(5天)或用Gro-β+普乐沙福(2.5mg/kg Gro-β或MGTA-145和5mg/kg普乐沙福同时sc给予)动员，并且然后在1小时后用整合HDAd5/35++mgmt载体注射(i.v.)。动物(一半)的一个队列将接受O6BG/BCNU处理以在体内选择转导的HSC/祖细胞。具体地，O6BG/BCNU处理将以间隔两周、从载体注射后第4周开始的三个周期给予。体内转导的动物将被随访18周。在此期间，将分析血液样品的γ-珠蛋白、βδ-珠蛋白表达(HPLC，qRT-PCR)，靶位点裂解(T7E1A测定)，以及表型校正(血液学、网织红细胞、RBC形态)。在第18周，分析还将包括骨髓、脾和肝。脾细胞将用于分析T细胞对基因组编辑酶(iCas，SB100x，Flpe)的响应。
将处死小鼠，并将分析血液/组织的表型校正。骨髓lin-细胞将被移植到致命辐射的第二接受者中，然后将随访第二接受者16周。在此时间段结束时，将基于全基因组测序和RNA/miRNA-Seq(评价转录组变化)评估与预处理样品相比的长期遗传毒性效应。
由于GCSF可引起镰状细胞贫血患者中的并发症，相信使用Gro-β或MGTA-145+普乐沙福动员可以更安全。另外，相信使用Gro-β或MGTA-145+普乐沙福的动员将动员更多的原始HSC。
其他实施方案
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指示通过引用并入的相同程度。
虽然已经结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但是应该理解，本发明能够具有进一步的修改，并且本申请意图覆盖本发明的任何变化、用途或修改，所述本发明的任何变化、用途或修改在总体上遵循本发明的原则，并且包括在本发明所属的领域内是已知或惯用实践之内的并且可以被应用于在上文中陈述的必要特征且落入本权利要求书的范围的此类偏离。
其他实施方案落入本权利要求书内。

Claims (27)

1.一种将从哺乳动物受试者的骨髓中动员的造血干细胞或祖细胞的群体转导到外周血中的方法，
其中以约0.001mg/kg至约0.1mg/kg的剂量或以约1mg至约8mg的固定剂量使用选自由Gro-β、Gro-βT及其变体组成的组的CXCR2激动剂将所述受试者的造血干细胞或祖细胞动员到外周血中,
所述方法包括：
a.向所述受试者施用包含选择标志物的核酸以体内转导所述造血干细胞或祖细胞以及
b.施用选择剂以选择已经用所述包含选择标志物的核酸转导的造血干细胞或祖细胞，由此没有用所述包含选择标志物的核酸转导的造血干细胞或祖细胞不能存活。
2.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述核酸包含基因编辑或遗传工程化系统的组分。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述系统选自CRISPR-Cas9系统、睡美人转座酶100x(SB100x)系统和FLP-FRT系统。
4.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述核酸还包含治疗基因。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述治疗基因包括γ-珠蛋白基因的至少一部分或编码以下的至少一部分的基因：FANC A-F；因子VIII(F8)；因子IX(F9)；因子X(F10)；威斯科特奥尔德里奇综合征蛋白(WASP)；细胞色素B-245β链(CYBB)；中性粒细胞表达弹性蛋白酶(ELANE)；血红蛋白亚基α(HBA)；血红蛋白亚基β(HBB)；丙酮酸激酶、肝脏和RBC(PKLR)；核糖体蛋白S19(RPS19)；ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)；芳基硫酸酯酶A(ARSA)；葡萄糖神经酰胺酶β(GBA)；艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)；艾杜糖醛酸酶，α-L(IDUA)；T细胞免疫调节物1(TCIRG1)；腺苷脱氨酶(ADA)；白细胞介素2受体亚基γ(IL2RG)；布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)；腺苷脱氨酶(ADA)；IL2RG；CD40配体(CD40LG)；叉头盒P3(FOXP3)；白细胞介素4、白细胞介素10、白细胞介素13(IL-4、IL-10、IL-13)；穿孔素1(PRF1)；人工T细胞受体(TCR)；嵌合抗原受体(CAR)；或C-C基序趋化因子受体5(CCR5)。
6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述选择标志物包括人类O(6)-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)突变体。
7.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述选择剂包括甲基化剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述甲基化剂选自O6-苄基鸟嘌呤(O6BG)、双氯乙基亚硝基脲(BCNU)、替莫唑胺及其组合。
9.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述核酸存在于载体中。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述载体选自慢病毒载体、rAAV载体和HDAd5/35++载体。
11.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述核酸在施用所述CXCR2激动剂和/或CXCR4拮抗剂后约10分钟至约10小时施用。
12.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述选择剂在施用所述核酸后约4周和约24周之间施用。
13.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述剂量为大于约0.015mg/kg至小于约0.05mg/kg。
14.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述CXCR2激动剂包括Gro-βT。
15.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述CXCR2激动剂以约0.03mg/kg的剂量施用。
16.根据任一前述权利要求所述的方法，还包括施用所述CXCR2激动剂的步骤。
17.根据任一前述权利要求所述的方法，其中使用所述CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂将所述受试者的造血干细胞或祖细胞动员到外周血中。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述CXCR4拮抗剂是普乐沙福。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述普利沙福以约240μg/kg的剂量施用至所述受试者。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述CXCR2激动剂与所述CXCR4拮抗剂同时施用。
21.根据权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述CXCR2激动剂在所述CXCR4拮抗剂之后施用。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述CXCR2激动剂在施用所述CXCR4拮抗剂的约4小时内施用。
23.根据权利要求21或权利要求22所述的方法，其中所述CXCR2激动剂在所述CXCR4拮抗剂后约2小时施用。
24.根据权利要求17-23中任一项所述的方法，其中所述CXCR2激动剂和所述CXCR4拮抗剂各自在连续两天被施用。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述CXCR2激动剂和所述CXCR4拮抗剂各自在连续两天每天一次被施用。
26.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述固定剂量为约2.5mg至约5.5mg。
27.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述固定剂量为约1.3mg。
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