CN115996755A - 双官能分子及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本公开一般地涉及合成双官能分子的组合物及其应用，所述双官能分子包含特异性结合靶核糖核酸序列的第一结构域和特异性结合靶蛋白的第二结构域。

Description

双官能分子及其使用方法
背景技术
在任意给定时间，细胞中特定蛋白的量反映蛋白合成与降解生化途径之间的平衡。在此平衡的合成侧，蛋白生成起始于转录并随着翻译继续。因此，控制这些过程在确定哪种蛋白存在于细胞和蛋白量方面起到关键作用。另外，细胞加工其RNA转录物和新生成蛋白的方式也极大影响蛋白水平。mRNA分子在细胞中的量和类型反映该细胞的功能。事实上，每个细胞中每秒生成数以千计的转录物。鉴于这种统计，基因表达的主要控制点通常在蛋白生成过程的—开始—转录起始，并不令人奇怪。RNA转录产生有效控制点，因为许多蛋白能从单一mRNA分子生成。确实，疾病或其症状能如下预防、改善或治疗：选择性增加相关基因的转录或基因的RNA水平。
结合伴侣之间的结合特异性可提供工具以有效递送分子到特定靶标，例如，选择性增加基因的转录或基因的RNA水平。
发明内容
在一些方面，本文所述的合成双官能分子包含的第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包含第一小分子或反义寡核苷酸(ASO)，其中所述第一结构域特异性结合靶核糖核酸(RNA)序列；所述第二结构域包含第二小分子或适体，其中所述第二结构域特异性结合靶内源蛋白；其中所述第一结构域与所述第二结构域缀合。在一些实施方案中，所述靶内源蛋白是胞内蛋白。在一些实施方案中，所述第一结构域通过接头分子与所述第二结构域缀合。在一些实施方案中，所述接头分子是化学接头。在一些实施方案中，所述第一结构域是ASO。在一些实施方案中，所述ASO包含一种或多种锁核酸(LNA)、一种或多种修饰核碱基或其组合。在一些实施方案中，所述ASO可以包含任意可用修饰，如对糖、核碱基或核苷酸间连接(如对连接磷酸酯/磷酸二酯键/磷酸二酯骨架)的修饰。在一些实施方案中，所述ASO包含至少2种锁核酸。在一些实施方案中，所述ASO包含至少3种锁核苷酸。在一些实施方案中，所述ASO包含至少4种锁核苷酸。在一些实施方案中，所述ASO包含至少5种锁核苷酸。在一些实施方案中，所述ASO包含至少6种锁核苷酸。在一些实施方案中，所述ASO包含1-7种锁核苷酸。在一些实施方案中，所述ASO包含5’锁末端核苷酸、3’锁末端核苷酸或者5’和3’锁末端核苷酸。在一些实施方案中，所述ASO包含在ASO内部位置的锁核苷酸。在一些实施方案中，所述ASO包含序列，其包含30％-60％的GC含量。在一些实施方案中，所述ASO包括8-30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所述ASO包括12-25个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所述ASO包括14-24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所述ASO包括16-20个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所述ASO选自表1A和1B所列的那些。在一些实施方案中，所述第一结构域是第一小分子。在一些实施方案中，所述第一小分子选自表2所列的那些。在一些实施方案中，所述第二结构域是第二小分子。在一些实施方案中，所述第二小分子选自表3所列的那些。在一些实施方案中，所述第二小分子是分子量为900道尔顿或更小的有机化合物。在一些实施方案中，所述第二小分子是分子量为600道尔顿或更小的有机化合物。在一些实施方案中，所述第二小分子是JQ1。在一些实施方案中，所述第二小分子是iBET762。在一些实施方案中，所述第二小分子是依鲁替尼(ibrutinib)。在一些实施方案中，所述第二结构域是适体。在一些实施方案中，所述适体选自表3所列的那些。在一些实施方案中，所述接头在ASO的5’末端或3’末端缀合。在一些实施方案中，所述接头在ASO内部位置缀合。在一些实施方案中，所述合成双官能分子还包含第三结构域，其与第一结构域、接头、第二结构域或其任意组合缀合。在一些实施方案中，所述第三结构域包含第三小分子。在一些实施方案中，所述第三结构域提高细胞对合成双官能分子的摄取。在一些实施方案中，所述合成双官能分子还包含一个或多个第二结构域。在一些实施方案中，所述一个或多个第二结构域中的每一个特异性结合单一靶内源蛋白。在一些实施方案中，所述靶核糖核酸序列是核RNA或胞质RNA。在一些实施方案中，所述核RNA或胞质RNA是长非编码RNA(lncRNA)、前mRNA(pre-mRNA)、mRNA、微小RNA(microRNA)、增强子RNA、转录的RNA、新生RNA(nascent RNA)、染色体富集RNA、核糖体RNA、膜富集RNA或线粒体RNA。在一些实施方案中，所述靶核糖核酸是内含子。在一些实施方案中，所述靶核糖核酸是外显子。在一些实施方案中，所述靶核糖核酸是非翻译区。在一些实施方案中，所述靶核糖核酸是翻译成蛋白的区域。
在一些方面，本文所述合成双官能分子包含：第一结构域、多个第二结构域和接头，所述第一结构域包含第一小分子或反义寡核苷酸(ASO)，其中所述第一结构域特异性结合靶核糖核酸(RNA)序列；所述多个第二结构域各自包含第二小分子或适体，其中所述多个第二结构域中的每一个特异性结合靶内源蛋白；所述接头缀合第一结构域与多个第二结构域。在一些实施方案中，所述多个第二结构域中的每一个包含第二小分子。在一些实施方案中，所述合成双官能分子包含2、3、4或5个第二结构域。在一些实施方案中，所述多个第二结构域包含相同的结构域。在一些实施方案中，所述多个第二结构域包含不同的结构域。在一些实施方案中，所述多个第二结构域结合相同的靶内源蛋白。在一些实施方案中，所述多个第二结构域结合不同的靶内源蛋白。在一些实施方案中，所述合成双官能分子还包含第三结构域，其与第一结构域、接头、多个第二结构域或其任意组合缀合。在一些实施方案中，所述第三结构域包含第三小分子。在一些实施方案中，所述第三结构域提高细胞对合成双官能分子的摄取。在一些实施方案中，所述靶内源蛋白是胞内蛋白。在一些实施方案中，所述靶内源蛋白是酶或调节蛋白。在一些实施方案中，所述第二结构域结合靶内源蛋白上的活性位点或别构位点。在一些实施方案中，所述第二结构域与靶内源蛋白的结合是非共价或共价的。在一些实施方案中，所述第二结构域与靶内源蛋白的结合是共价和可逆的或者共价和不可逆的。在一些实施方案中，所述靶内源蛋白增加基因的转录，所述基因选自表4或表5所列的那些。在一些实施方案中，包含靶核酸序列的核糖核酸增加基因的转录，所述基因选自表4或表5所列的那些。在一些实施方案中，所述基因的转录上调或增加。在一些实施方案中，所述基因与表5所列那些的疾病相关。在一些实施方案中，所述基因与疾病或病症相关。在一些实施方案中，所述疾病是由有机体导致的任何病症。在一些实施方案中，所述有机体是朊病毒、细菌、病毒、真菌或寄生虫。在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症、代谢病、炎性疾病、自身免疫病、心血管疾病、感染性疾病、遗传病或神经系统疾病。在一些实施方案中，所述疾病是癌症且其中靶基因是致癌基因。在一些实施方案中，所述疾病是单倍性不足疾病或功能丧失疾病。
在一些方面，增加细胞中基因的转录或基因的RNA水平的方法包括：向细胞施用合成双官能分子，所述合成双官能分子包含：第一结构域、第二结构域和接头，所述第一结构域包含第一小分子或反义寡核苷酸(ASO)，其中所述第一结构域特异性结合靶核糖核酸序列；所述第二结构域包含第二小分子或适体，其中所述第二结构域特异性结合靶内源蛋白；所述接头缀合第一结构域与第二结构域；其中所述靶内源蛋白增加细胞中的基因的转录或基因的RNA水平。在一些实施方案中，所述方法增加基因的转录。在一些实施方案中，所述方法增加基因的RNA水平。在一些实施方案中，所述细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述人细胞受病毒感染。在一些实施方案中，所述人细胞是癌细胞。在一些实施方案中，所述细胞是细菌细胞。在一些实施方案中，所述接头是化学接头。在一些实施方案中，所述第一结构域是ASO。在一些实施方案中，所述ASO包含一种或多种锁核酸(LNA)、一种或多种修饰的核碱基或其组合。在一些实施方案中，所述ASO可以包含任意可用修饰，如对糖、核碱基或核苷酸间连接(如对连接磷酸酯/磷酸二酯键/磷酸二酯骨架)的修饰。在一些实施方案中，所述ASO包含至少2种锁核酸。在一些实施方案中，所述ASO包含至少3种锁核苷酸。在一些实施方案中，所述ASO包含至少4种锁核苷酸。在一些实施方案中，所述ASO包含至少5种锁核苷酸。在一些实施方案中，所述ASO包含至少6种锁核苷酸。在一些实施方案中，所述ASO包含1-7种锁核苷酸。在一些实施方案中，所述ASO包含5’锁末端核苷酸、3’锁末端核苷酸或者5’和3’锁末端核苷酸。在一些实施方案中，所述ASO包含在ASO内部位置的锁核苷酸。在一些实施方案中，所述ASO包含序列，其包含30％-60％的GC含量。在一些实施方案中，所述ASO包括8-30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所述ASO包括12-25个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所述ASO包括14-24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所述ASO包括16-20个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所述第一结构域是第一小分子。在一些实施方案中，所述第一小分子选自表2。在一些实施方案中，所述第二结构域是第二小分子。在一些实施方案中，所述第二小分子结合蛋白(如胞内蛋白)。在一些实施方案中，所述第二小分子选自表3。在一些实施方案中，所述第二小分子是分子量为900道尔顿或更小的有机化合物。在一些实施方案中，所述第二小分子是JQ1。在一些实施方案中，所述第二小分子是iBET762。在一些实施方案中，所述第二小分子是依鲁替尼。在一些实施方案中，所述第二结构域是适体。在一些实施方案中，所述适体选自表3。在一些实施方案中，所述接头在ASO的5’末端或3’末端缀合。在一些实施方案中，所述接头在ASO内部位置缀合。在一些实施方案中，所述合成双官能分子还包含第三结构域，其与第一结构域、接头、第二结构域或其任意组合缀合。在一些实施方案中，所述第三结构域包含第三小分子。在一些实施方案中，所述第三结构域提高细胞对合成双官能分子的摄取。在一些实施方案中，所述合成双官能分子还包含一个或多个第二结构域。在一些实施方案中，所述一个或多个第二结构域中的每一个特异性结合单一靶内源蛋白。在一些实施方案中，所述靶核糖核酸序列是核RNA或胞质RNA。在一些实施方案中，所述核RNA或胞质RNA是长非编码RNA(lncRNA)、前mRNA、mRNA、微小RNA、增强子RNA、转录的RNA、新生RNA、染色体富集RNA、核糖体RNA、膜富集RNA或线粒体RNA。在一些实施方案中，所述靶核糖核酸是内含子或外显子。在一些实施方案中，所述靶序列是mRNA或前mRNA上的翻译或非翻译区。
在一些方面，增加细胞中基因的转录或基因的RNA水平的方法包括：向细胞施用合成双官能分子，所述合成双官能分子包含：第一结构域、多个第二结构域和接头，所述第一结构域包含第一小分子或反义寡核苷酸(ASO)，其中所述第一结构域特异性结合靶核糖核酸(RNA)序列；所述多个第二结构域各自包含第二小分子或适体，其中所述多个第二结构域中的每一个特异性结合靶内源蛋白；所述接头缀合第一结构域与多个第二结构域；其中所述靶内源蛋白增加细胞中的基因的转录。在一些实施方案中，所述方法增加基因的转录。在一些实施方案中，所述方法增加基因的RNA水平。在一些实施方案中，所述多个第二结构域中的每一个包含第二小分子。在一些实施方案中，所述多个第二结构域是2、3、4或5个第二结构域。在一些实施方案中，所述多个第二结构域中的每一个包含相同的结构域。在一些实施方案中，所述多个第二结构域中的每一个包含不同的结构域。在一些实施方案中，所述多个第二结构域中的每一个结合相同的靶内源蛋白。在一些实施方案中，所述多个第二结构域中的每一个结合不同的靶内源蛋白。在一些实施方案中，所述合成双官能分子还包含第三结构域，其与第一结构域、接头、第二结构域或其任意组合缀合。在一些实施方案中，所述第三结构域包含第三小分子。在一些实施方案中，所述第三结构域提高细胞对合成双官能分子的摄取。在一些实施方案中，所述靶内源蛋白是胞内蛋白。在一些实施方案中，所述靶内源蛋白是酶或调节蛋白。在一些实施方案中，所述多个第二结构域中的每一个特异性结合靶内源蛋白上的活性位点或别构位点。在一些实施方案中，所述多个第二结构域中的每一个与靶内源蛋白的结合是非共价或共价的。在一些实施方案中，所述多个第二结构域中的每一个与靶内源蛋白的结合是共价和可逆的或这共价和不可逆的。在一些实施方案中，所述基因选自表4或表5。在一些实施方案中，所述基因的转录上调或增加。在一些实施方案中，所述基因与表5的疾病相关。在一些实施方案中，所述基因与疾病或病症相关。在一些实施方案中，所述疾病是由有机体导致的任何病症。在一些实施方案中，所述有机体是朊病毒、细菌、病毒、真菌或寄生虫。在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症、代谢病、炎性疾病、自身免疫病、心血管疾病、感染性疾病、遗传病或神经系统疾病。
附图说明
以下本公开实施方案的详细描述在结合附图一起阅读时，能更好地理解。出于阐述本公开的目的，附图显示目前举例的实施方案。然而，应理解本公开不限于附图所示实施方案的精确安排和工具。
图1显示依鲁替尼和ASO的缀合物，本文所提供双官能分子的示例性实施方案，分别经依鲁替尼形成与布鲁顿氏酪氨酸激酶(Bruton’s Tyrosine Kinase，BTK)的三元复合物以及经ASO形成Cy5标记IVT RNA。
图2显示PVT1 ASO1-JQ1诱导的MYC表达。PVT1 ASO1-JQ1通过RNAiMax以400、200、100和50nM转染至HEK293T细胞。细胞在转染后24小时收获用于qPCR分析。游离JQ1、游离PVT1 ASO和Scramble ASO-JQ1(Scr-JQ1)作为阴性对照测试。
图3A和3B描述PVT1 ASO1-JQ1的阴性对照，显示分子的特异性。2个Scramble ASO和8个非PVT1靶向(NPT)ASO与JQ1缀合并通过RNAiMax以100nM转染至HEK293T细胞。细胞在转染后24小时收获用于qPCR分析。游离JQ1和游离PVT1 ASO作为额外阴性对照测试(图3A)。PVT1 ASO1结合物和游离JQ1通过RNAiMax以100nM一起转染至HEK293T细胞。细胞在转染后24小时收获用于qPCR分析。游离JQ1、PVT1 ASO结合物和PVT1 ASO1降解剂作为额外阴性对照测试(图3B)。
图4显示PVT1 ASO1-(-)JQ1在诱导MYC表达中失活。PVT1 ASO1-(-)JQ1通过RNAiMax以100nM转染至HEK293T细胞。细胞在转染后24小时收获用于qPCR分析。游离JQ1、游离PVT1 ASO和Scramble ASO-JQ1(Scr-JQ1)作为阴性对照测试。
图5描述PVT1 ASO1-JQ1的剂量确定(titration)。PVT1 ASO1-JQ1和对照通过RNAiMax以所示剂量转染至HEK293T细胞。细胞在转染后24小时收获用于qPCR分析。
图6显示PVT1 ASO1序列中心的交换核苷酸使PVT1 ASO1-JQ1分子失活。PVT1 ASO1序列内的2-5个核苷酸交换(图左侧黑色柱中的灰色块)。PVT1 ASO1-JQ1分子通过RNAiMax以100nM转染至HEK293T细胞(图右侧)。细胞在转染后24小时收获用于qPCR分析。结果显示交换5’末端的前2个核苷酸或3’末端的前4个核苷酸对于分子活性影响较小(如PVT1-Scr1、PVT1-Scr4和PVT1-Scr8)；而ASO序列中心的交换核苷酸对活性影响显著。
图7和8描述PVT1 ASO1-JQ1处理增加细胞中的MYC基因转录物(图7)以及MYC蛋白(图8)。
图9描述ASO与小分子之间的2个不同接头，显示类似活性。V1 PVT1 ASO1-JQ1和V2PVT1 ASO1-JQ1通过RNAiMax以400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125nM转染至HEK293T细胞。细胞在转染后24小时收获用于qPCR分析。游离JQ1、PVT1 ASO1、Scramble ASO-JQ1(ScrB-JQ1)和V2 PVT1 ASO1-JQ1作为阴性对照纳入。
图10描述PVT1 ASO1-iBET762诱导的MYC表达。PVT1 ASO1-iBET762通过RNAiMax以400、200、100和50nM转染至HEK293T细胞。细胞在转染后24小时收获用于qPCR分析。游离iBET762、游离PVT1 ASO和Scramble ASO-iBET762(Scr-iBET762)作为阴性对照测试。
图11A和11B描述额外PVT1 ASO-JQ1分子诱导MYC表达。PVT1 ASO1到ASO20的基因组定位(图11A)。PVT1 ASO1-JQ1到PVT1 ASO20-JQ1通过RNAiMax以400、133、44和15nM转染至HEK293T细胞(图11B)。细胞在转染后24小时收获用于qPCR分析。
图12描述额外PVT1 ASO-iBET762分子诱导MYC表达。PVT1 ASO1-iBET762到PVT1ASO20-iBET762通过RNAiMax以400、133、44和15nM转染至HEK293T细胞。细胞在转染后24小时收获用于qPCR分析。
图13A-13B描述限定支持MYC表达增加的活性袋。PVT1 ASO1-JQ1、PVT1 ASO30-JQ1到PVT1 ASO33-JQ1通过RNAiMax以400、133、44和15nM转染至HEK293T细胞。细胞在转染后24小时收获用于qPCR分析。结果显示PVT1 ASO30-JQ1到PVT1 ASO33-JQ1不增加MYC表达(图13A)。PVT1 ASO1到ASO20和ASO29到ASO33的基因组定位。显示鉴定的活性袋(活性袋1)(图13B)。
图14A-14C描述PVT1 ASO-JQ1分子诱导MYC表达。显示PVT1 ASO21到ASO29的基因组定位(图14A)。对照PVT1 ASO1-JQ1以及PVT1 ASO21-JQ1到PVT1 ASO29-JQ1通过RNAiMax以400、133、44和15nM转染至HEK293T细胞。细胞在转染后24小时收获用于qPCR分析(图14B)。PVT1 ASO24和ASO25的基因组定位。图14C显示鉴定的活性袋(活性袋2)。
图15描述MYC ASO-JQ1分子诱导MYC表达。MYC ASO1-JQ1到PVT1 ASO6-JQ1以及对照PVT1 ASO1-JQ1通过RNAiMax以400、133、44和15nM转染至HEK293T细胞。细胞在转染后24小时收获用于qPCR分析。
图16描述MYC ASO-iBET762分子诱导MYC表达。MYC ASO1-iBET762到PVT1 ASO6-iBET762以及对照PVT1 ASO1-iBET762通过RNAiMax以400、133、44和15nM转染至HEK293T细胞。细胞在转染后24小时收获用于qPCR分析。
图17描述SCN1A ASO1-JQ1分子诱导SCN1A表达。JQ1、SCN1A-ASO1、Scr-JQ1及SCN1AASO1-JQ1(“SCN1A-JQ1”)各自通过RNAiMax以100、50、25、12.5、6.25和3.125nM转染至SK-N-AS细胞。细胞在转染后48小时收获用于qPCR分析。
图18描述SCN1A ASO1-iBET762分子诱导SCN1A表达。iBET762、SCN1A-ASO1、Scr-iBET762及SCN1A ASO1-iBET762(“SCN1A-iBET762”)各自通过RNAiMax以100、50、25、12.5、6.25和3.125nM转染至SK-N-AS细胞。细胞在转染后48小时收获用于qPCR分析。
图19描述的qRT-PCR显示，BTK蛋白在细胞中进行RNA免疫沉淀(RIP)后，HSP70、MALAT1和ACTB的RNA水平，所述细胞转染有BTK和依鲁替尼缀合的ASO，靶向HSP70和MALAT1。
图20描述SYNGAP1 ASO2-JQ1增加SYNGAP1表达。SYNGAP1 ASO1-JQ1到SYNGAP1ASO4-JQ1通过RNAiMax以200和67nM转染至HEK293T细胞。细胞在转染后48小时收获用于qPCR分析。
具体实施方式
本公开一般涉及双官能分子。整体上，双官能分子设计并合成以结合2个或更多独特靶标。第一靶标可以是核酸序列，例如RNA。第二靶标可以是蛋白、肽或其他效应分子。本文所述双官能分子包含特异性结合靶核酸序列(如靶RNA序列)的第一结构域和特异性结合靶蛋白的第二结构域。本公开还描述双官能分子组合物、其组合物制品及其应用。
本公开关于特定实施方案和参考某些图来描述，但本公开不限于此，仅通过权利要求限定。下文所列术语一般以其常识理解，除非另有说明。
本文描述的包含特异性结合靶RNA序列的第一结构域和特异性结合靶内源蛋白的第二结构域的合成双官能分子，包含这类双官能分子的组合物，使用这些双官能分子的方法等，是部分基于阐述双官能分子如何用于实现不同技术效果(如增加细胞中的RNA水平或转录)的示例，双官能分子包含不同组分例如独特序列、不同长度和修饰的核苷酸(如锁核苷酸)。基于这些示例，下文描述考虑示例所涉及的特定发现的多种变化和组合。
双官能分子
在一方面，本公开涉及一种双官能分子，其包含结合靶核酸序列(如靶RNA序列)的第一结构域和结合靶蛋白的第二结构域。设计并合成本文所述双官能分子，从而第一结构域与第二结构域缀合。
第一结构域
本文所述双官能分子包含特异性结合靶核酸序列(如RNA序列)的第一结构域。在一些实施方案中，第一结构域包含小分子或反义寡核苷酸(ASO)。
反义寡核苷酸(ASO)
在一些实施方案中，本文所述双官能分子的第一结构域是ASO，其特异性结合靶RNA序列。
常规方法能用于设计以足够特异性结合靶序列的核酸。本文所用术语“核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用。在一些实施方案中，所述方法包括使用本领域已知生物信息学方法来鉴定二级结构区域。本文所用术语“二级结构”指单一核酸聚合物内或2个聚合物之间的碱基配对相互作用。例如，RNA的二级结构包括但不限于双链区段、凸起、内部环、茎环结构(发夹)、二茎连接(同轴堆叠)、假结、g-四联体、准(quasi)螺旋结构和吻式发夹。例如，“基因步移”法能用于优化核酸活性；例如，能制成跨靶RNA或基因长度、10-30核苷酸的一系列寡核苷酸，然后测试活性。可选地，能在靶序列之间留下例如5-10核苷酸或更多的缺口，以减少合成和测试的寡核苷酸数目。
一旦例如在感兴趣序列内鉴定一个或多个靶区域、区段或位点，则选择与靶标足够互补的核苷酸序列，即充分杂交且特异性足够(即几乎不结合其他非靶RNA)，以产生期望效果，如结合RNA。
如本文所述，杂交指氢键结合，其可以是互补核苷或核苷酸碱基之间的沃森-克里克、Hoogsteen或保守Hoogsteen氢键。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键配对的互补核碱基。本文所述的互补指，2个核苷酸之间精确配对的能力。例如，若寡核苷酸某一位置处的核苷酸能够与RNA分子同一位置的核苷酸发生氢键结合，则ASO和RNA视作在该位置彼此互补。当各分子中足够数量的对应位置被能够相互形成氢键的核苷酸占据时，ASO和RNA彼此互补。因此，“特异性杂交”和“互补”是这样的术语，其用于指示足够程度的互补性和精确配对，从而在ASO与RNA靶标之间发生稳定且特异性的结合。例如，若ASO某一位置的碱基能够与RNA对应位置的碱基发生氢键结合，则所述碱基视作在该位置彼此互补。不需要100％互补。
本领域应理解，互补核酸序列不需要与其靶核酸100％互补以可特异性杂交。用于本方法目的的互补核酸序列是可特异性杂交的，此时序列与靶RNA分子或靶基因的结合引起本文所述的期望效果，有足够程度的互补性以避免序列与非靶RNA序列在期望特异性结合的条件下的非特异性结合，如在体内试验或治疗性处理情况下、在体外试验情况下的生理条件，在试验于适当严紧情况下进行的条件。
一般，用于本文所述方法的ASO与靶核酸内靶区域有至少80％序列互补性，如与RNA内靶区域有90％、95％或100％序列互补性。例如，反义寡核苷酸20个核碱基中18个互补并因而与靶区域特异杂交的反义化合物，代表90％互补性。ASO与靶核酸区域的互补百分比能用基本局部比对搜索工具(BLAST程序)(Altschul et al.,J.Mol.Biol.,1990,215,403-410；Zhang和Madden,Genome Res.,1997,7,649-656)常规确定。与RNA杂交的ASO能通过常规实验鉴定。一般，ASO必须保持对其靶标的特异性，即必须不直接结合预期靶标以外的物质。
在某些实施方案中，本文所述ASO包含沿着寡核苷酸或其区域以确定模式或基序排列的修饰和/或未修饰核碱基。在某些实施方案中，各核碱基是修饰的。在某些实施方案中，核碱基都不是修饰的。在某些实施方案中，各嘌呤或各嘧啶是修饰的。在某些实施方案中，各腺嘌呤是修饰的。在某些实施方案中，各鸟嘌呤是修饰的。在某些实施方案中，各胸腺嘧啶是修饰的。在某些实施方案中，各尿嘧啶是修饰的。在某些实施方案中，各胞嘧啶是修饰的。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的一些或所有胞嘧啶核碱基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包括一段修饰的核碱基。在某些实施方案中，所述段处于寡核苷酸3’末端。在某些实施方案中，所述段在寡核苷酸3’末端的3个核苷内。在某些实施方案中，所述段处于寡核苷酸5’末端。在某些实施方案中，所述段处于寡核苷酸5’末端的3个核苷内。
在某些实施方案中，包含修饰的核碱基的一个核苷位于修饰的寡核苷酸的中央区域内。在某些这类实施方案中，核苷的糖部分是2’-β-D-脱氧核糖部分。在某些这类实施方案中，修饰的核碱基选自：5-甲基胞嘧啶、2-巯基嘧啶、2-巯基胸腺嘧啶、6-甲基腺嘌呤、肌苷、假尿嘧啶或5-丙炔嘧啶。
在某些实施方案中，本文所述ASO包含沿着寡核苷酸或其区域以确定模式或基序排列的修饰和/或未修饰的核苷间(intemucleoside)连接。在某些实施方案中，各核苷间连接是磷酸二酯核苷间连接(P＝O)。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的各核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接(P＝S)。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的各核苷间连接独立选自硫代磷酸酯核苷间连接和磷酸二酯核苷间连接。在某些实施方案中，各硫代磷酸酯核苷间连接独立选自立构无规(stereorandom)硫代磷酸酯、(Sp)硫代磷酸酯和(Rp)硫代磷酸酯。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸中央区域内的核苷间连接全部是修饰的。在某些这类实施方案中，5’区和3’区的一些或所有核苷间连接是未修饰的磷酸连接。在某些实施方案中，末端核苷间连接是修饰的。在某些实施方案中，核苷间连接基序包括在至少一个5’区和3’区中的至少一个的磷酸二酯核苷间连接，其中至少一个磷酸二酯连接不是末端核苷间连接，且剩余核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。在某些这类实施方案中，全部硫代磷酸酯连接是立构无规的。在某些实施方案中，5’区和3’区的所有硫代磷酸酯连接是(Sp)硫代磷酸酯，并且中央区域包含至少一个Sp、Sp、Rp基序。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸群富含包含这类核苷间连接基序的修饰的寡核苷酸。
在某些实施方案中，ASO包含具有交替核苷间连接基序的区域。在某些实施方案中，寡核苷酸包含均匀修饰的核苷间连接区。在某些这类实施方案中，核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施方案中，寡核苷酸的全部核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施方案中，寡核苷酸的各核苷间连接选自磷酸二酯或磷酸酯和硫代磷酸酯。在某些实施方案中，寡核苷酸的各核苷间连接选自磷酸二酯或磷酸酯和硫代磷酸酯，且至少一个核苷间连接是硫代磷酸酯。
在某些实施方案中，ASO包含至少6个硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少8个硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少10个硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一段的至少6个连续硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一段的至少8个连续硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一段的至少10个连续硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一段的至少12个连续硫代磷酸酯核苷间连接。在某些这类实施方案中，至少一个这类段位于寡核苷酸3’末端。在某些这类实施方案中，至少一个这类段位于寡核苷酸3’末端的3个核苷内。
在某些实施方案中，ASO包含一个或多个甲基膦酸酯连接。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含含所有硫代磷酸酯连接的连接基序，除了1个或2个甲基膦酸酯连接。在某些实施方案中，一个甲基膦酸酯连接位于寡核苷酸中央区域。
在某些实施方案中，期望排列硫代磷酸酯核苷间连接和磷酸二酯核苷间连接的数目以维持核酸酶抗性。在某些实施方案中，期望排列硫代磷酸酯核苷间连接的数目和位置以及磷酸二酯核苷间连接的数目和位置以维持核酸酶抗性。在某些实施方案中，硫代磷酸酯核苷间连接的数目可减少，且磷酸二酯核苷间连接的数目可增加。在某些实施方案中，硫代磷酸酯核苷间连接的数目可减少，且磷酸二酯核苷间连接的数目可增加，同时仍维持核酸酶抗性。在某些实施方案中，期望降低硫代磷酸酯核苷间连接的数目，同时保持核酸酶抗性。在某些实施方案中，期望增加磷酸二酯核苷间连接的数目，同时保持核酸酶抗性。
本文所述ASO可以短或长。ASO长度可以是8-200个核苷酸，一些情况中是10-100，一些情况中是12-50。
在一些实施方案中，ASO包括8-30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括9-30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括10-30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括11-30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括12-30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括13-30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括14-30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括15-30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括16-30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括17-30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括18-30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括19-30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括20-30个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，ASO包括8-29个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括9-29个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括10-28个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括11-28个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括12-28个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括13-28个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括14-28个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括15-28个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括16-28个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括17-28个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括18-28个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括19-28个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括20-28个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，ASO包括8-27个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括9-27个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括10-26个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括10-25个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括10-24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括11-24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括12-24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括13-24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括14-24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括15-24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括16-24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括17-28个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括18-24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括19-24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括20-24个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，ASO包括10-27个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括11-26个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括12-25个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括12-24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括12-23个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括12-22个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括12-21个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括12-20个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，ASO包括16-27个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括16-26个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括16-25个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括16-24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括16-23个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括16-22个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括16-21个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO包括16-20个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，ASO包括8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29个或更多核苷酸，以及30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9个或更少核苷酸的长度。
本文所用术语“GC含量”或“鸟嘌呤-胞嘧啶含量”指DNA或RNA分子中作为鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)的含氮碱基百分比。此量度指示隐含4个总碱基的G和C碱基比例，也包括DNA中的腺嘌呤和胸腺嘧啶以及RNA中的腺嘌呤和尿嘧啶。在一些实施方案中，ASO包含序列，其包含30％-60％GC的含量。在一些实施方案中，ASO包含序列，其包含35％-60％的GC含量。在一些实施方案中，ASO包含序列，其包含40％-60％的GC含量。在一些实施方案中，ASO包含序列，其包含45％-60％的GC含量。在一些实施方案中，ASO包含序列，其包含50％-60％的GC含量。在一些实施方案中，ASO包含序列，其包含30％-55％的GC含量。在一些实施方案中，ASO包含序列，其包含30％-50％的GC含量。在一些实施方案中，ASO包含序列，其包含30％-45％的含量。在一些实施方案中，ASO包含序列，其包含30％-40％的GC含量。在一些实施方案中，ASO包含序列，其包含30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59％或更高以及60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31％或更低的GC含量。
在一些实施方案中，核苷酸包括以下至少一个或多个：10-30个核苷酸的长度；包含30％-60％GC含量的序列；和至少一个锁核苷酸。在一些实施方案中，核苷酸包括以下至少2个或更多个：10-30个核苷酸的长度；包含30％-60％GC含量的序列；和至少一个锁核苷酸。在一些实施方案中，核苷酸包括10-30个核苷酸的长度；包含30％-60％GC含量的序列；和至少一个锁核苷酸。
ASO可以是任意连续段的核酸。在一些实施方案中，ASO可以是任意连续段的脱氧核糖核酸(DNA)、RNA、非天然、人工核酸、修饰的核酸或其任意组合。ASO可以是线性核苷酸。在一些实施方案中，ASO是寡核苷酸。在一些实施方案中，ASO是单链多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸是假双链(如单链多核苷酸自杂交部分)。
在一些实施方案中，ASO是未修饰的核苷酸。在一些实施方案中，ASO是修饰的核苷酸。本文所用术语“修饰的核苷酸”指对糖、核碱基或核苷间连接有至少一个修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，本文所述ASO是单链，化学修饰和合成产生的。在一些实施方案中，本文所述ASO可修饰成包含高亲和RNA结合物(如锁核酸(LNA))以及化学修饰。在一些实施方案中，ASO包括一个或多个残基，残基修饰成增加核酸酶抗性和/或提高ASO对靶序列的亲和性。在一些实施方案中，ASO包含核苷酸类似物。在一些实施方案中，ASO可在靶细胞如神经元细胞内从核酸序列表达，例如通过病毒(如慢病毒、AAV或腺病毒)或非病毒载体递送。
在一些实施方案中，本文所述ASO能包含相对于参考序列的一个或多个取代、插入和/或添加、缺失以及共价修饰。
在一些实施方案中，本文所述ASO包含一个或多个转录后修饰(如加帽、剪切、聚腺苷酸化、剪接、聚A序列、甲基化、酰化、磷酸化、赖氨酸和精氨酸残基的甲基化、乙酰化、巯基和酪氨酸残基的亚硝基化等)。一个或多个转录后修饰能是任意转录后修饰，如RNA内所鉴定超过100种不同核苷修饰中的任何一种(Rozenski,J,Crain,P,and McCloskey,J.(1999).The RNA Modification Database:1999update.Nucl Acids Res 27:196-197)。
在一些实施方案中，本文所述ASO可包含任意可用修饰，如对糖、核碱基或核苷间连接(如对连接磷酸酯/磷酸二酯键/磷酸二酯骨架)的修饰。在一些实施方案中，本文所述ASO可包含修饰的核碱基、修饰的核苷或其组合。
在一些实施方案中，修饰的核碱基选自：5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶、烷基或炔基取代的嘧啶、烷基取代的嘌呤、N-2,N-6和0-6取代的嘌呤。在一些实施方案中，修饰的核碱基选自：2-氨基丙基腺嘌呤、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-N-甲基鸟嘌呤、6-N-甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-巯基胞嘧啶、5-丙炔(-C≡C-CH3)尿嘧啶、5-丙炔胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-核糖酰尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代，8-氨基，8-巯基，8-硫代烷基，8-羟基，8-氮杂和其他8-取代的嘌呤、5-卤代，尤其是5-溴，5-三氟甲基，5-卤代尿嘧啶和5-卤代胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮腺嘌呤、6-N-苯甲酰腺嘌呤、2-N-异丁酰鸟嘌呤、4-N-苯甲酰胞嘧啶、4-N-苯甲酰尿嘧啶、5-甲基4-N-苯甲酰胞嘧啶、5-甲基4-N-苯甲酰尿嘧啶、通用碱基、疏水性碱基、混杂碱基、尺寸扩增的碱基和氟代碱基。其他修饰的核碱基包括三环嘧啶，如l,3-二氮杂吩噁嗪-2-酮、l,3-二氮杂吩噻嗪-2-酮和9-(2-氨基乙氧基)-l,3-二氮杂吩噁嗪-2-酮(G-clamp)。修饰的核碱基也可包括其中嘌呤或嘧啶碱基用其他杂环取代的那些，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。
在一些其他实施方案中，本文所述ASO包含至少一个选自以下的核苷：吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔-尿苷、1-丙炔-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷和4-甲氧基-2-硫代-假尿苷。在一些实施方案中，本文所述ASO包含至少一个选自以下的核苷：5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯-胞苷、吡咯-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉林(zebularine)、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫代-泽布拉林、2-硫代-泽布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷和4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷。在一些实施方案中，本文所述ASO包含至少一个选自以下的核苷：2-氨基嘌呤、2、6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯腺苷、N6-(顺-羟基异戊烯)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺-羟基异戊烯)腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰腺苷、N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺苷、2-甲硫基-腺苷和2-甲氧基-腺苷。在一些实施方案中，本文所述核苷包括至少一个选自以下的核苷：肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷(wyosine)、怀丁苷(wybutosine)、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷和N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷。
其他核碱基包括Merigan et ah,U.S.3,687,808，The Concise Encyclopedia OfPolymer Science And Engineering,Kroschwitz,J.I.,Ed.,John Wiley&Sons,1990,858-859；Englisch et al.,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613；Sanghvi,Y.S.,Chapter 15,Antisense Research and Applications,Crooke,S.T.andLebleu,B.,Eds.,CRC Press,1993,273-288；以及Chapters 6and 15,Antisense DrugTechnology,Crooke S.T.,Ed.,CRC Press,2008,163-166and 442-443中公开的那些。
在一些实施方案中，修饰的核苷包括具有2个核碱基的双头核苷。这种化合物详述于Sorinas et al.,J.Org.Chem,2014 79:8020-8030。
在一些实施方案中，ASO包含与靶核酸互补的修饰的寡核苷酸或由其组成，所述靶核酸包含一个或多个修饰的核碱基。在一些实施方案中，修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。在一些实施方案中，各胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在一些实施方案中，ASO中嘧啶核碱基的一个或多个原子能用任选取代的氨基、任选取代的巯基、任选取代的烷基(如甲基或乙基)或者卤素(如氯或氟)取代或置换。在一些实施方案中，修饰(如一种或多种修饰)在各糖和核苷间连接中存在。修饰可以是对脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或其杂交体(hydrid)的核糖核酸(RNA)的修饰。额外修饰如本文所述。
在一些实施方案中，本文所述ASO包含至少一种N(6)甲基腺苷(m6A)修饰。在一些实施方案中，N(6)甲基腺苷(m6A)修饰能降低本文所述核苷酸的免疫原性。
在一些实施方案中，修饰可包括化学或细胞诱导修饰。例如，胞内RNA修饰的一些非限制性实例由Lewis和Pan,“RNA modifications and structures cooperate to guideRNA-protein interactions”,Nat Reviews Mol Cell Biol,2017,18:202-210所述。在一些实施方案中，本文所述核苷酸的化学修饰可增强免疫逃避。本文所述ASO可通过本领域完善的方法合成和/或修饰，如描述于"Current protocols in nucleic acid chemistry,"Beaucage,S.L.et al.(Eds.),John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY,USA的那些，该文献援引加入本文。例如，修饰包括末端修饰如5'末端修饰(磷酸化(单-、二-和三-)、缀合、反向连接等),3'末端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)、碱基修饰(如用稳定碱基、去稳定碱基或与扩增伴侣库碱基配对的碱基来代替)、去除碱基(脱碱基核苷酸)或缀合碱基。修饰的核苷酸碱基还可包括5-甲基胞苷和假尿苷。在一些实施方案中，碱基修饰可调节本文所述核苷酸的表达、免疫应答、稳定性、亚细胞定位等功能效果。在一些实施方案中，修饰包括双正交核苷酸，如非天然碱基。参见例如Kimoto et al,Chem Commun(Camb),2017,53:12309,DOI:10.1039/c7cc06661a，该文献援引加入本文。
在一些实施方案中，本文所述ASO可包含一个或多个(A)修饰的核苷和(B)修饰的核苷间连接。
(A)修饰的核苷
修饰的核苷包括修饰的糖部分、修饰的核碱基或者修饰的糖部分和修饰的核碱基。
1.某些修饰的糖部分
在某些实施方案中，糖部分是非双环、修饰的呋喃糖基糖部分。在某些实施方案中，修饰的糖部分是双环或三环呋喃糖基糖部分。在某些实施方案中，修饰的糖部分是糖替代物。这类糖替代物可包括对应那些其他类型修饰的糖部分的一个或多个取代。
在某些实施方案中，修饰的糖部分是非双环、修饰的呋喃糖基糖部分，含有一个或多个无环取代基，包括但不限于2’、3’、4’和/或5’位的取代基。在某些实施方案中，呋喃糖基糖部分是核糖基糖部分。在某些实施方案中，呋喃糖基糖部分是β-D-呋喃核糖基糖部分。在某些实施方案中，非双环修饰的糖部分的一个或多个无环取代基是分支的。适合非双环修饰的糖部分的2’-取代基的实例包括但不限于：2’-F、2'-OCH3(“2’-OMe”或“2’-O-甲基”)和2'-O(CH2)2OCH3(“2’-MOE”)。在某些实施方案中，2’-取代基选自：卤素、烯丙基、氨基、叠氮基、SH、CN、OCN、CF3、OCF3、O-C1-C10烷氧基、O-C1-C10取代的烷氧基、C1-C10烷基、C1-C10取代烷基、S-烷基、N(Rm)-烷基、O-烯基、S-烯基、N(Rm)-烯基、O-炔基、S-炔基、N(Rm)-炔基、O-亚烷基-O-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2ON(Rm)(Rn)或OCH2C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中各Rm和Rn独立地是H、氨基保护基、或者取代或未取代的C1-C10烷基以及2’-取代基，描述于Cook et al.,U.S.6,531,584；Cook et al.,U.S.5,859,221；和Cook et al.、U.S.6,005,087。这些2’-取代基的某些实施方案能用独立选自以下的一个或多个取代基进一步取代：羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基(NO2)、巯基、硫代烷氧基、硫代烷基、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。3’-取代基的实例包括3’-甲基(参见Frier,et al.,The ups and downs of nucleic acid duplex stability:structure-stabilitystudies on chemically-modified DNA:RNA duplexes.Nucleic Acids Res.,25,4429-4443,1997)。适合非双环修饰的糖部分的4’-取代基的实例包括但不限于烷氧基(如甲氧基)、烷基和Manoharan et al.,WO 2015/106128所述的那些。适合非双环修饰的糖部分的5’-取代基的实例包括但不限于：5’-甲基(R或S)、5’-烯丙基、5’-乙基、5'-乙烯基和5’-甲氧基。在某些实施方案中，非双环修饰的糖包括一个以上的非桥接糖取代基，例如2'-F-5'-甲基糖部分和修饰的糖部分及修饰的核苷，如Migawa et al.,WO 2008/101157和Rajeevet al.,US2013/0203836所述。2’,4’-二氟修饰的糖描述于Martinez-Montero,et al.,Rigid 2',4'-difluororibonucleosides:synthesis,conformational analysis,andincorporation into nascent RNA by HCV polymerase.J.Org.Chem.,2014,79:5627-5635。含2’-修饰(OMe或F)和4’-修饰(OMe或F)的修饰的糖部分描述于Malek-Adamian etal.,J.Org.Chem,2018,83:9839-9849。
在某些实施方案中，2’-取代核苷或非双环2’-修饰的核苷包含糖部分，所述糖部分包含非桥接2’-取代基，所述2’-取代基选自：F、NH2、N3、OCF3、OCH3、O(CH2)3NH2、CH2CH＝CH2、OCH2CH＝CH2、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2ON(Rm)(Rn)、O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2和N-取代乙酰胺(OCH2C(＝O)-N(Rm)(Rn))，其中各Rm和Rn独立地是H、氨基保护基、或者取代或未取代的C1-C10烷基。
在某些实施方案中，2’-取代核苷或非双环2’-修饰的核苷包含糖部分，所述糖部分包含非桥接2’-取代基，所述2’-取代基选自：F、OCF3、OCH3、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2ON(CH3)2、O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2和OCH2C(＝0)-N(H)CH3(“NMA”)。
在某些实施方案中，2’-取代核苷或非双环2’-修饰的核苷包含糖部分，所述糖部分包含非桥接2’-取代基，所述2’-取代基选自：F、OCH3和OCH2CH2OCH3。
在某些实施方案中，2’-脱氧核糖的4’O能用S取代以产生4’-硫代DNA(参见Takahashi et al.,Nucleic Acids Research 2009,37:1353-1362)。此修饰能与本文详述的其他修饰组合。在某些这类实施方案中，糖部分在2’位进一步修饰。在某些实施方案中，糖部分包含2’-氟。带有此糖部分的胸苷描述于Watts et al.,J.Org.Chem.2006,71(3):921-925(4’-S-氟5-甲基阿糖尿苷或FAMU)。
某些修饰的糖部分包含形成第二环的桥接糖取代基，产生双环糖部分。在某些这类实施方案中，双环糖部分包含4'与2'呋喃糖环原子之间的桥。在某些这类实施方案中，呋喃糖环是核糖环。含这种4’至2’桥接糖取代基的糖部分的实例包括但不限于含有以下的双环糖：4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-CH2-O-2'(“LNA”)、4'-CH2-S-2'、4'-(CH2)2-O-2'(“ENA”)、4'-CH(CH3)-0-2'(当采用S构型时，称为“受限乙基”或“cEt”)、4’-CH2-O-CH2-2’、4’-CH2-N(R)-2’、4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(“受限MOE”或“cMOE”)和其类似物(参见例如Seth et al.,U.S.7,399,845,Bhat et al.,U.S.7,569,686,Swayze et al.,U.S.7,741,457和Swayze et al.,U.S.8,022,193)、4'-C(CH3)(CH3)-O-2'和其类似物(参见例如Seth et al.,U.S.8,278,283)、4'-CH2-N(OCH3)-2'和其类似物(参见例如Prakash etal.,U.S.8,278,425)、4'-CH2-O-N(CH3)-2'(参见例如Allerson et al.,U.S.7,696,345和Allerson et al.,U.S.8,124,745)、4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(参见例如Zhou,et al,J.Org.Chem.,2009,74,118-134)、4'-CH2-C(＝CH2)-2'和其类似物(参见例如Seth et al.,U.S.8,278,426)、4’-C(RaRb)-N(R)-O-2’、4’-C(RaRb)-O-N(R)-2’、4'-CH2-O-N(R)-2'和4'-CH2-N(R)-O-2'，其中各R、Ra和Rb独立地是H、保护基或C1-C12烷基(参见例如Imanishi etal.,U.S.7,427,672)、4’-C(＝O)-N(CH3)2-2’、4’-C(＝0)-N(R)2-2’、4’-C(＝S)-N(R)2-2’和其类似物(参见例如Obika et al.,WO2011052436A1,Yusuke,W02017018360A1)。
在某些实施方案中，这样的4’至2’桥独立包含1-4个连接的基团，其独立选自：-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(Ra)＝C(Rb)-.-C(Ra)＝N-、-C(＝NRa)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(＝O)x-和-N(Ra)-；其中:x是0、1或2；n是1、2、3或4；各Ra和Rb独立地是H、保护基、羟基、C1-C12烷基、取代C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代C5-C20芳基、杂环基、取代杂环基、杂芳基、取代杂芳基、C5-C7脂环基、取代C5-C7脂环基、卤素、OJ1、NJ1J2.SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、取代酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或亚磺酰基(sulfoxyl)(S(＝O)-J1)；且各J1和J2独立地是H、C1-C12烷基、取代C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、取代酰基、杂环基、取代杂环基、C1-C12氨烷基、取代C1-C12氨烷基或保护基。
本领域已知额外双环糖部分，参见例如：Freier et al,Nucleic AcidsResearch,1997,25(22),4429-4443,Albaek et al,J.Org.Chem.,2006,71,7731-7740,Singh et al.,Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin et al.,Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Kumar et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；Singh et al.,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；Srivastava et al.,J.Am.Chem.Soc.,2017,129,8362-8379；Elayadi et al.,；Christiansen,et al.,J.Am.Chem.Soc.1998,120,5458-5463；Wengel et al.,U.S.7,053,207；Imanishi et al.,U.S.6,268,490；Imanishi etal.U.S.6,770,748；Imanishi et al.,U.S.RE44,779；Wengel et al.,U.S.6,794,499；Wengel et al.,U.S.6,670,461；Wengel et al.,U.S.7,034,133；Wengel et al.,U.S.8,080,644；Wengel et al,U.S.8,034,909；Wengel et al.,U.S.8,153,365；Wengel et al.,U.S.7,572,582；and Ramasamy et al.,U.S.6,525,191；Torsten et al.,WO 2004/106356；Wengel et al.,WO 1999/014226；Seth et al.,WO 2007/134181；Seth et al.,U.S.7,547,684；Seth et al.,U.S.7,666,854；Seth et al.,U.S.8,088,746；Seth etal.,U.S.7,750,131；Seth et al.,U.S.8,030,467；Seth et al.,U.S.8,268,980；Seth etal.,U.S.8,546,556；Seth et al.,U.S.8,530,640；Migawa et al.,U.S.9,012,421；Sethet al.,U.S.8,501,805和美国专利公开号Allerson et al.,US2008/0039618和Migawa etal.,US2015/0191727。
在某些实施方案中，双环糖部分和纳入这些双环糖部分的核苷通过异构构型进一步定义。例如，UNA核苷(本文所述)可采用如下α-U构型或β-D构型：
Figure BDA0003956144350000161
α-U-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)或α-U-UNA双环核苷纳入显示反义活性的反义寡核苷酸(Frieden et al.,Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372)。本文中，关于双环核苷的整体说明包括2种异构构型。当特定双环核苷(如FNA)的位置在本文所示例的实施方案中鉴定时，其采用β-D构型，除非另有说明。
在某些实施方案中，修饰的糖部分包含一个或多个非桥接糖取代基和一个或多个桥接糖取代基(如5’-取代和4’-2’桥连糖)。
含修饰的呋喃糖基糖部分的核苷和修饰的呋喃糖基糖部分可由核苷糖部分上取代的位置来指示。呋喃糖基环位置后的术语“修饰”如“2’-修饰”指示，糖部分包含2’位的所示修饰且可包含额外修饰和/或取代基。4’-2’桥连糖部分是2’-修饰和4’-修饰或“2’,4’-修饰”。呋喃糖基环位置后的术语“取代”如”2’-取代”或“2’-4’-取代”指示，仅此位置具有寡核苷酸的未修饰的糖部分中所发现那些以外的取代基。因此，下列糖部分由下式表示。
在核苷和/或寡核苷酸的情况下，非双环、修饰的呋喃糖基糖部分由式I表示：
Figure BDA0003956144350000162
其中B是核碱基；且L1和L2各自独立地是核苷间连接、末端基、缀合基团(conjugategroup)或羟基。在R基中，R3-7中至少一个不是H和/或R1和R2中至少一个不是H或OH。在2’-修饰的呋喃糖基糖部分中，R1和R2中至少一个不是H或OH，且各R3-7独立选自H或H以外的取代基。在4’-修饰的呋喃糖基糖部分中，R5不是H，且各R1-4、6、7独立选自H或H以外的取代基；且对于呋喃糖基环中各位置诸如此类。立体化学未定义，除非另有说明。
在核苷和/或寡核苷酸的情况下，非双环、修饰、取代的呋喃糖基糖部分由式I表示，其中B是核碱基；且L1和L2各自独立地是核苷间连接、末端基、缀合基团基或羟基。在R基中，R3-7中任一(且不超过一个)是H以外的取代基或者R1或R2之一是H或OH以外的取代基。立体化学未定义，除非另有说明。非双环、修饰、取代的呋喃糖基糖部分的实例包括2’-取代核糖基、4’-取代核糖基和5’-取代核糖基糖部分，以及取代的2’-脱氧呋喃糖基糖部分，如4’-取代的2’-脱氧核糖基和5’-取代的2’-脱氧核糖基糖部分。
在核苷和/或寡核苷酸的情况下，2’-取代核糖基糖部分由式II表示：
Figure BDA0003956144350000171
其中B是核碱基；且L1和L2各自独立地是核苷间连接、末端基、缀合基团基或羟基。R1是H或OH以外的取代基。立体化学如所示定义。
在核苷和/或寡核苷酸的情况下，4’-取代核糖基糖部分由式III表示：
Figure BDA0003956144350000172
其中B是核碱基；且L1和L2各自独立地是核苷间连接、末端基、缀合基团基或羟基。R5是H以外的取代基。立体化学如所示定义。
在核苷和/或寡核苷酸的情况下，5’-取代核糖基糖部分由式IV表示：
Figure BDA0003956144350000173
其中B是核碱基；且L1和L2各自独立地是核苷间连接、末端基、缀合基团基或羟基。R6或R7是H以外的取代基。立体化学如所示定义。
在核苷和/或寡核苷酸的情况下，2’-脱氧呋喃糖基糖部分由式V表示：
Figure BDA0003956144350000174
其中B是核碱基；且L1和L2各自独立地是核苷间连接、末端基、缀合基团基或羟基。各R1-5独立选自H和非H取代基。如果所有R1-5各自是H，则糖部分是未取代的2’-脱氧呋喃糖基糖部分。立体化学未定义，除非另有说明。
在核苷和/或寡核苷酸的情况下，4’-取代的2’-脱氧核糖基糖部分由式VI表示：
Figure BDA0003956144350000181
其中B是核碱基；且L1和L2各自独立地是核苷间连接、末端基、缀合基团基或羟基。R3是H以外的取代基。立体化学如所示定义。
在核苷和/或寡核苷酸的情况下，5’-取代的2’-脱氧核糖基糖部分由式VII表示：
Figure BDA0003956144350000182
其中B是核碱基；且L1和L2各自独立地是核苷间连接、末端基、缀合基团基或羟基。R4或R5是H以外的取代基。立体化学如所示定义。
未取代的2’-脱氧呋喃糖基糖部分可以是未修饰(β-D-2’-脱氧核糖基)或经修饰的。修饰、未取代的2’-脱氧呋喃糖基糖部分的实例包括β-E-2’-脱氧核糖基、α-L-2’-脱氧核糖基、α-D-2’-脱氧核糖基和β-D-木糖基糖部分。例如，在核苷和/或寡核苷酸的情况下，β-L-2’-脱氧核糖基糖部分由式VIII表示：
Figure BDA0003956144350000183
其中B是核碱基；且L1和L2各自独立地是核苷间连接、末端基、缀合基团基或羟基。立体化学如所示定义。α-L-核糖基核苷酸和β-D-木糖基核苷酸的合成如Gaubert et al.,Tetehedron 2006,62:2278-2294所述。DNA和RNA核苷的额外异构体如Vester,et al.,“Chemically modified oligonucleotides with efficient RNase H response,”Bioorg.Med.Chem.Letters,2008,18:2296-2300所述。
在某些实施方案中，修饰的糖部分是糖替代物(surrogate)。在某些这类实施方案中，糖部分的氧原子用例如硫、碳或氮原子代替。在某些这类实施方案中，修饰的糖部分还包含本文所述桥接和/或非桥接取代基。例如，某些糖替代物包含4’-硫原子以及2'-位(参见例如Bhat et al.,U.S.7,875,733和Bhat et al.,U.S.7,939,677)和/或5’位的取代。
在某些实施方案中，糖替代物包含5个原子以外的环。例如，在某些实施方案中，糖替代物包含6元四氢吡喃(“THP”)。这类四氢吡喃可进一步修饰或取代。含这种修饰的四氢吡喃的核苷包括但不限于己糖醇核酸(“HNA”)、阿卓糖醇(altritol)核酸(“ANA”)、甘露醇核酸(“MNA”)(参见例如Leumann,CJ.Bioorg.&Med.Chem.2002,10,841-854)、氟HNA(“F-HNA”，参见例如Swayze et al.,U.S.8,088,904；Swayze et al.,U.S.8,440,803；Swayzeet al.,U.S.8,796,437；和Swayze et al.,U.S.9,005,906；F-HNA还能称为F-THP或3'-氟四氢吡喃)、F-CeNA和3’-阿拉伯糖(ara)-HNA，其具有下式，其中L1和L2各自独立地是连接修饰的THP核苷与寡核苷酸剩余部分的核苷间连接，或者L1和L2之一是连接修饰的THP核苷与寡核苷酸剩余部分的核苷间连接且L1和L2中另一个是H、羟基保护基、连接的缀合基团或者5'或3'-末端基。
Figure BDA0003956144350000191
额外糖替代物包括具有下式的THP化合物：
Figure BDA0003956144350000192
其中对于各所述修饰的THP核苷，Bx独立地是核碱基部分；T3和T4各自独立地是连接修饰的THP核苷与寡核苷酸剩余部分的核苷间连接，或者T3和T4之一是连接修饰的THP核苷与寡核苷酸剩余部分的核苷间连接且T3和T4中另一个是H、羟基保护基、连接的缀合基团或者5'或3'-末端基；q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自独立地是H、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代C2-C6炔基；各R1和R2独立选自：氢、卤素、取代或未取代烷氧基、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2和CN，其中X是O、S或NJ1，且各J1、J2和J3独立地是H或C1-C6烷基。
在某些实施方案中，提供修饰的THP核苷，其中q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自是H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中至少一个是H以外的基团。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中至少一个是甲基。在某些实施方案中，提供修饰的THP核苷，其中R1和R2之一是F。在某些实施方案中，R1是F且R2是H，在某些实施方案中，R1是甲氧基且R2是H。在某些实施方案中，R1是甲氧基乙氧基且R2是H。
在某些实施方案中，糖替代物包含没有杂原子的环。例如，描述了含双环[3.1.0]-己烷的核苷(参见例如Marquez et al.,J.Med.Chem.1996,39:3739-3749)。
在某些实施方案中，糖替代物包含有5个以上原子和1个以上杂原子的环。例如，报道了含吗啉代糖部分的核苷及其在寡核苷酸中的应用(参见例如Braasch et al.,Biochemistry,2002,41,4503-4510和Summerton et al.,U.S.5,698,685；Summerton etal.,U.S.5,166,315；Summerton et al.,U.S.5,185,444；和Summerton et al.,U.S.5,034,506)。本文所用术语“吗啉代”指含下列结构的糖替代物：
Figure BDA0003956144350000201
在某些实施方案中，吗啉代是可修饰的，例如通过从上述吗啉代结构中加入或改变多个取代基。这类糖替代物在本文中称为“修饰的吗啉代”。在某些实施方案中，吗啉代残基代替全核苷酸，包括核苷间连接，且具有下示结构，其中Bx是杂环碱基部分。
Figure BDA0003956144350000202
在某些实施方案中，糖替代物包含无环部分。含这类无环糖替代物的核苷和寡核苷酸的实例包括但不限于：肽核酸(“PNA”)、无环丁基核酸(参见例如Kumar et al.,Org.Biomol.Chem.,2013,11,5853-5865)、乙二醇核酸(“GNA”,参见Schlegel et al.,J.Am.Chem.Soc.2017,139:8537-8546)以及Manoharan et al.,WO2011/133876所述核苷和寡核苷酸。
本领域已知能用于修饰的核苷的许多其他双环和三环糖及糖替代物环体系。某些这类环体系描述于Hanessian et al.,J.Org.Chem.,2013,78:9051-9063且包括bcDNA和tcDNA。还描述了对bcDNA和tcDNA的修饰，如6’-氟(Dogovic and Ueumann,J.Org.Chem.,2014,79:1271-1279)。
在某些实施方案中，修饰的核苷是DNA模拟物(mimic)。“DNA模拟物”指DNA核苷以外的核苷，其中核碱基直接连接环的碳原子，其结合环内第二碳原子，其中第二碳原子包括连接至少一个氢原子的键，其中核碱基和至少一个氢原子相对于2个碳原子之间的键，彼此为反式。
在某些实施方案中，DNA模拟物包含由下式表示的结构：
Figure BDA0003956144350000203
其中Bx代表杂环碱基部分。
在某些实施方案中，DNA模拟物包含由下式之一表示的结构：
Figure BDA0003956144350000204
其中X是O或S，且Bx代表杂环碱基部分。
在某些实施方案中，DNA模拟物是糖替代物。在某些实施方案中，DNA模拟物是环己烯基或己糖醇核酸。在某些实施方案中，DNA模拟物描述于Vester,et al.,“Chemicallymodified oligonucleotides with efficient RNase H response,”Bioorg.Med.Chem.Letters,2008,18:2296-2300的图1，该文献援引加入本文。在某些实施方案中，DNA模拟物核苷具有选自以下的式：
Figure BDA0003956144350000211
其中Bx是杂环碱基部分，且L1和L2各自独立地是连接修饰的THP核苷与寡核苷酸剩余部分的核苷间连接，或者L1和L2之一是连接修饰的THP核苷与寡核苷酸剩余部分的核苷间连接且L1和L2中另一个是H、羟基保护基、连接的缀合基团或者5'或3'-末端基。在某些实施方案中，DNA模拟物是α,β-受限核酸(CAN)、2',4'-碳环-LNA或2',4'-碳环-ENA。在某些实施方案中，DNA模拟物具有选自以下的糖部分：4’-C-羟甲基-2’-脱氧核糖基、3’-C-羟甲基-2’-脱氧核糖基、3’-C-羟甲基-阿拉伯糖基、3’-C-2’-O-阿拉伯糖基、3’-C-亚甲基-延伸-木糖基、3’-C-2’-O-哌嗪-阿拉伯糖基。在某些实施方案中，DNA模拟物具有选自以下的糖部分：2’-甲基核糖基、2’-S-甲基核糖基、2’-氨基核糖基、2’-NH(CH2)-核糖基、2’-NH(CH2)2-核糖基、2’-CH2-F-核糖基、2’-CHF2-核糖基、2’-CF3-核糖基、2’＝CF2核糖基、2’-乙基核糖基、2’-烯基核糖基、2’-炔基核糖基、2’-O-4’-C-亚甲基核糖基、2’-氰基阿拉伯糖基、2’-氯阿拉伯糖基、2’-氟阿拉伯糖基、2’-溴阿拉伯糖基、2’-叠氮基阿拉伯糖基、2'-甲氧基阿拉伯糖基和2’-阿拉伯糖基。在某些实施方案中，DNA模拟物具有选自4’-甲基-修饰的脱氧呋喃糖基、4’-F-脱氧呋喃糖基、4’-OMe-脱氧呋喃糖基的糖部分。在某些实施方案中，DNA模拟物具有选自以下的糖部分：5’-甲基-2’-β-D-脱氧核糖基、5’-乙基-2’-β-D-脱氧核糖基、5’-烯丙基-2’-β-D-脱氧核糖基、2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基。在某些实施方案中，DNA模拟物在PCT/US00/267929第32-33页列为B型核苷酸，其内容整体援引加入本文。
2.修饰的核碱基
在某些实施方案中，修饰的核碱基选自：5-取代嘧啶、6-氮杂嘧啶、烷基或炔基取代嘧啶、烷基取代嘌呤以及N-2、N-6和O-6取代嘌呤。在某些实施方案中，修饰的核碱基选自：2-氨丙基腺嘌呤、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-N-甲基鸟嘌呤、6-N-甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-巯基胞嘧啶、5-丙炔(-C≡C-CH3)尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-核糖酰尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基、8-氮杂和其他8-取代的嘌呤，5-卤代，尤其是5-溴、5-三氟甲基、5-卤代尿嘧啶和5-卤代胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮腺嘌呤、6-N-苯甲酰腺嘌呤、2-N-异丁酰鸟嘌呤、4-N-苯甲酰胞嘧啶、4-N-苯甲酰尿嘧啶、5-甲基4-N-苯甲酰胞嘧啶、5-甲基4-N-苯甲酰尿嘧啶、通用碱基、疏水性碱基、混杂碱基、尺寸扩增的碱基和氟代碱基。其他修饰的核碱基包括三环嘧啶，如l,3-二氮杂吩噁嗪-2-酮、l,3-二氮杂吩噻嗪-2-酮和9-(2-氨基乙氧基)-l,3-二氮杂吩噁嗪-2-酮(G形夹)。修饰的核碱基也可包括其中嘌呤或嘧啶碱基用其他杂环代替的那些，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其他核碱基包括Merigan et al.,U.S.3,687,808公开的那些，The Concise Encyclopedia Of Polymer Science AndEngineering,Kroschwitz,J.I.,Ed.,John Wiley&Sons,1990,858-859；Englisch et al.,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613；Sanghvi,Y.S.,Chapter 15,Antisense Research and Applications,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Eds.,CRC Press,1993,273-288公开的那些；以及Antisense Drug Technology,Crooke S.T.,Ed.,CRCPress,2008,163-166and 442-443第6和15章公开的那些。在某些实施方案中，修饰的核苷包括有2个核碱基的双头核苷。这种化合物详述于Sorinas et al.,J.Org.Chem,2014 79:8020-8030。
教授制备某些上述修饰的核碱基以及其他修饰的核碱基的出版物包括但不限于：Manoharan et al.,US2003/0158403；Manoharan et al.,US2003/0175906；Dinh et al.,U.S.4,845,205；Spielvogel et al.,U.S.5,130,302；Rogers et al.,U.S.5,134,066；Bischofberger et al.,U.S.5,175,273；Urdea et al.,U.S.5,367,066；Benner et al.,U.S.5,432,272；Matteucci et al.,U.S.5,434,257；Gmeiner et al.,U.S.5,457,187；Cook et al.,U.S.5,459,255；Froehler et al.,U.S.5,484,908；Matteucci et al.,U.S.5,502,177；Hawkins et al.,U.S.5,525,711；Haralambidis et al.,U.S.5,552,540；Cook et al.,U.S.5,587,469；Froehler et al.,U.S.5,594,121；Switzer et al.,U.S.5,596,091；Cook et al.,U.S.5,614,617；Froehler et al.,U.S.5,645,985；Cook et al.,U.S.5,681,941；Cook et al.,U.S.5,811,534；Cook et al.,U.S.5,750,692；Cook etal.,U.S.5,948,903；Cook et al.,U.S.5,587,470；Cook et al.,U.S.5,457,191；Matteucci et al.,U.S.5,763,588；Froehler et al.,U.S.5,830,653；Cook et al.,U.S.5,808,027；Cook et al.,6,166,199和Matteucci et al.,U.S.6,005,096。
在某些实施方案中，化合物包含修饰的寡核苷酸或由其组成，所述修饰的寡核苷酸与包含一个或多个修饰的核碱基的靶核酸互补。在某些实施方案中，修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，各胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
(B)修饰的核苷间连接
在某些实施方案中，相对于仅有磷酸二酯核苷间连接的化合物，由于所需特性而选择有一个或多个修饰的核苷间连接的本文所述化合物，所述特性例如细胞摄取增强、对靶核酸亲和性提高以及在核酸酶存在下稳定性增加。
在某些实施方案中，化合物包含与靶核酸互补的修饰的寡核苷酸或由其组成，所述靶核酸包含一个或多个修饰的核苷间连接。在某些实施方案中，修饰的核苷间连接是硫代磷酸酯连接。在某些实施方案中，反义化合物的各核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的核苷可连接在一起，使用任意核苷间连接。2个主要核苷间连接种类通过有或没有磷原子定义。代表性含磷核苷间连接包括未修饰的磷酸二酯核苷间连接、修饰的磷酸三酯如THP磷酸三酯和异丙基磷酸三酯，膦酸酯如膦酸甲酯、膦酸异丙酯、膦酸异丁酯和膦酰乙酸酯，亚磷酰胺、硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯(“HS-P＝S”)。代表性非含磷核苷间连接包括但不限于亚甲基甲亚氨基(-CH2-N(CH3)-O-CH2-)、硫代二酯、硫代氨基甲酸酯(-O-C(＝O)(NH)-S-)；硅氧烷(-O-SiH2-O-)；甲缩醛、硫代乙酰胺(TANA)、alt-硫代甲缩醛、甘氨酰胺和N,N'-二甲肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)。相较天然存在的磷酸酯键，修饰的核苷间连接能用于改变，通常是增加寡核苷酸的核酸酶抗性。制备含磷和非含磷核苷间连接的方法为本领域技术人员熟知。
具有手性中心的代表性核苷间连接包括但不限于膦酸烷基酯和硫代磷酸酯。含具有手性中心的核苷间连接的修饰的寡核苷酸能制备为含立构无规核苷间连接的修饰的寡核苷酸群，或制备为含硫代磷酸酯连接的修饰的寡核苷酸群，采用特定立体化学构型。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸群包括硫代磷酸酯核苷间连接，其中所有硫代磷酸酯核苷间连接是立构无规的。这类修饰的寡核苷酸能用合成方法产生，从而导致随机选择各硫代磷酸酯连接的立体化学构型。本文所述全部硫代磷酸酯连接是立构无规的，除非另有规定。然而，如本领域技术人员所充分理解，各单独寡核苷酸分子的各单独硫代磷酸酯具有确定的立体构型。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸群富集含一个或多个特定硫代磷酸酯核苷间连接的修饰的寡核苷酸，其具有特定的、独立选择的立体化学构型。在某些实施方案中，特定硫代磷酸酯键的特定构型在群体中至少65％分子内存在。在某些实施方案中，特定硫代磷酸酯键的特定构型在群体中至少70％分子内存在。在某些实施方案中，特定硫代磷酸酯键的特定构型在群体中至少80％分子内存在。在某些实施方案中，特定硫代磷酸酯键的特定构型在群体中至少90％分子内存在。在某些实施方案中，特定硫代磷酸酯键的特定构型在群体中至少99％分子内存在。这种手性富集的修饰的寡核苷酸群能用本领域已知合成方法产生，如Oka et al.,JACS 125,8307(2003),Wan et al..Nuc.Acid.Res.42,13456(2014)和WO 2017/015555所述方法。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸群富集有至少一个所示硫代磷酸酯的修饰的寡核苷酸，其采用(Sp)构型。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸群富集有至少一个所示硫代磷酸酯的修饰的寡核苷酸，其采用(Rp)构型。在某些实施方案中，包含(Rp)和/或(Sp)硫代磷酸酯的修饰的寡核苷酸分别包括一个或多个下式，其中“B”指示核碱基：
Figure BDA0003956144350000231
除非另有说明，本文所述修饰的寡核苷酸的手性核苷间连接可以是立构无规的或采用特定立体化学构型。
中性核苷间连接包括但不限于磷酸三酯、膦酸酯、MMI(3'-CH2-N(CH3)-O-5')、酰胺-3(3'-CH2-C(＝O)-N(H)-5')、酰胺-4(3'-CH2-N(H)-C(＝O)-5')、甲缩醛(3'-O-CH2-O-5')、甲氧基丙基和硫代甲缩醛(3'-S-CH2-O-5')。其他中性核苷间连接包括非离子键，包括硅氧烷(二烷基硅氧烷)、羧酸酯、甲酰胺、硫化物、磺酸酯和酰胺(参见例如CarbohydrateModifications in Antisense Research；Y.S.Sanghvi and P.D.Cook,Eds.,ACSSymposium Series 580；第3和4章,40-65)。其他中性核苷间连接包括含混合N、O、S和CH2组分部分的非离子键。
在某些实施方案中，核酸能2’至5’连接，而不是标准的3’至5’连接。这种连接如本文所示：
Figure BDA0003956144350000241
在核苷和/或寡核苷酸的情况下，非双环、2’-连接修饰的呋喃糖基糖部分由式IX表示：
Figure BDA0003956144350000242
其中B是核碱基；L1是核苷间连接、末端基、缀合基团或羟基，且L2是核苷间连接。立体化学未定义，除非另有说明。
在某些实施方案中，核苷能由邻近(vinicinal)2’,3’-磷酸二酯键连接。在某些实施方案中，核苷是苏糖呋喃糖基核苷(TNA；参见Bala et al.,J Org.Chem.2017,82:5910-5916)。TNA连接如本文所示：
Figure BDA0003956144350000243
额外修饰连接包括α,β-D-CNA型连接和相关构象受限连接，如下所示。这类分子的合成如前所述(参见Dupouy et al.,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,2014,45:3623-3627；Borsting et al..Tetahedron,2004,60:10955-10966；Ostergaard et al.,ACSChem.Biol.2014,9:1975-1979；Dupouy et al.,Eur.J.Org.Chem.,2008,1285-1294；Martinez et al.,PLoS One,2011,6:e25510；Dupouy et al.,Eur.J Org.Chem.,2007,5256-5264；Boissonnet et al.,New J.Chem.,2011,35:1528-1533)。
Figure BDA0003956144350000251
在一些实施方案中，本文所述ASO与靶核糖核苷酸至少部分互补。在一些实施方案中，ASO是互补核酸序列，其设计成在严紧调节下与RNA杂交。在一些实施方案中，寡核苷酸选择成与靶标充分互补，即杂交足够好且特异性充足，以产生期望效果。
在一些实施方案中，ASO靶向MALAT1 RNA。在一些实施方案中，ASO靶向XIST RNA。在一些实施方案中，ASO靶向HSP70 RNA。在一些实施方案中，ASO靶向MYC RNA。在一些实施方案中，靶向MALAT1的ASO包括序列CGUUAACUAGGCUUUA(SEQ ID NO:1)。在一些实施方案中，靶向XIST的ASO包括序列GGAAGGGAATCAGCAGGTAT(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，靶向HSP70的ASO包括序列TCTTGGGCCGAGGCTACTGA(SEQ ID NO:3)。在一些实施方案中，靶向MYC的ASO包括序列CCTGGGGCTGGTGCATTTTC(SEQ ID NO:4)。在一些实施方案中，ASO序列是CGUUAACUAGGCUUUA (SEQ ID NO:1)。在一些实施方案中，ASO序列是GGAAGGGAATCAGCAGGTAT(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，ASO序列是TCTTGGGCCGAGGCTACTGA (SEQ ID NO:3)。在一些实施方案中，ASO序列是CCTGGGGCTGGTGCATTTTC(SEQ ID NO:4)。
在一些实施方案中，ASO靶向MALAT1 RNA。在一些实施方案中，ASO包含与CGTTAACTAGGCTTTA (SEQ ID NO:5)具有至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同性的序列。在一些实施方案中，ASO包含SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，ASO由SEQ ID NO:5组成。
在一些实施方案中，ASO靶向HSP70 RNA。在一些实施方案中，ASO包含与TCTTGGGCCGAGGCTACTGA(SEQ ID NO:6)具有至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同性的序列。在一些实施方案中，ASO包含SEQ ID NO:6。在一些实施方案中，ASO由SEQ ID NO:6组成。
在一些实施方案中，ASO靶向PVT1 RNA。在一些实施方案中，ASO包含与选自SEQ IDNO:7-39、64、67、68和71的序列(任选具有一个或多个取代)具有至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同性的序列。在一些实施方案中，ASO包含选自SEQ ID NO:7-39、64、67、68和71的序列，任选具有一个或多个取代。在一些实施方案中，ASO选自PVT1 ASO1、PVT1 ASO2、PVT1 ASO3、PVT1ASO4、PVT1 ASO5、PVT1 ASO6、PVT1 ASO7、PVT1 ASO8、PVT1 ASO9、PVT1 ASO10、PVT1 ASO11、PVT1 ASO12、PVT1 ASO13、PVT1 ASO14、PVT1 ASO15、PVT1 ASO16、PVT1 ASO17、PVT1 ASO18、PVT1 ASO19、PVT1 ASO20、PVT1 ASO21、PVT1 ASO22、PVT1 ASO23、PVT1 ASO24、PVT1 ASO25、PVT1 ASO26、PVT1 ASO27、PVT1 ASO28、PVT1 ASO29、PVT1 ASO30、PVT1 ASO31、PVT1 ASO32和PVT1 ASO33，如下表1A或1B所示。
在一些实施方案中，ASO靶向MYC RNA。在一些实施方案中，ASO包含与选自SEQ IDNO:40-45的序列(任选具有一个或多个取代)具有至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同性的序列。在一些实施方案中，ASO包含选自SEQ ID NO:40-45的序列，任选具有一个或多个取代。在一些实施方案中，ASO选自MYC ASO1、MYC ASO2、MYC ASO3、MYC ASO4、MYC ASO5和MYC ASO6，如下表1A或1B所示。
在一些实施方案中，ASO靶向SCN1A RNA。在一些实施方案中，ASO包含与选自SEQID NO:46的序列(任选具有一个或多个取代)具有至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同性的序列。在一些实施方案中，ASO包括具有SEQ ID NO:46的序列，任选具有一个或多个取代。在一些实施方案中，ASO是SCN1A ASO1，如下表1A或1B所示。
在一些实施方案中，ASO靶向SYNGAP1 RNA。在一些实施方案中，ASO包含与选自SEQID NO:47-50的序列(任选具有一个或多个取代)具有至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同性的序列。在一些实施方案中，ASO包含选自SEQ ID NO:47-50的序列，任选具有一个或多个取代。在一些实施方案中，ASO选自SYNGAP1ASO1、SYNGAP1 ASO2、SYNGAP1 ASO3和SYNGAP1 ASO4，如下表1A或1B所示。
在一些实施方案中，本文所述ASO的序列可通过在任一或两个末端的位置1、2、3、4和5核苷酸中的一个或多个处的一个或多个缺失、取代和/或插入来修饰。
表1A.ASO序列
Figure BDA0003956144350000271
Figure BDA0003956144350000281
Figure BDA0003956144350000291
1购自IDT，作为5’-叠氮N修饰形式.
在一些实施方案中，本文所述ASO可化学修饰。在一些实施方案中，本文所述ASO的一个或多个核苷酸可用内部2’-甲氧基乙氧基(i2MOEr)和/或3’-羟基-2’-甲氧基乙氧基(32MOEr)化学修饰，例如导致下表1B所示的那些。
表1B.化学ASO修饰
Figure BDA0003956144350000292
Figure BDA0003956144350000301
Figure BDA0003956144350000311
Figure BDA0003956144350000321
Figure BDA0003956144350000331
1购自IDT，作为5’-叠氮N修饰形式.
表1A显示ASO序列和其在人基因组中的坐标。表1B显示各ASO的示例性化学修饰。Mod代码遵循IDT Mod代码:+＝LNA，*＝硫代磷酸酯键；i2MOErA ＝内部2’-甲氧基乙氧基A，i2MOErC＝内部2’-甲氧基乙氧基MeC，32MOErA ＝3’-羟基-2’-甲氧基乙氧基A等。
本文所用术语“MALAT 1”或“转移相关肺腺癌转录物1”也称为NEAT2(非编码核富集丰富转录物2)，指大的、较少剪接的非编码RNA，其在哺乳动物中高度保守且在核内高表达。在一些实施方案中，MALAT1可在多种生理过程中发挥作用，如交替剪接、核组织结构和基因表达的表观遗传调节。在一些实施方案中，MALAT1可在多种病理过程中发挥作用，从糖尿病并发症到癌症。在一些实施方案中，MALAT1可在转移相关基因的表达调控中发挥作用。在一些实施方案中，MALAT1可在细胞运动的正调节中通过转录和/或转录后调控运动相关基因来发挥作用。
本文所用术语“XIST”或“X失活特异性转录物”指胎盘哺乳动物X染色体上的非编码RNA，其充当X失活过程的主要效应物。XIST是参与X失活的Xic(X染色体失活中心)组分。XIST RNA在失活X染色体的Xic中专门表达，但在活性X染色体没有。XIST转录物通过剪接和聚腺苷酸化加工。然而，XIST RNA不编码蛋白且保持未翻译。失活X染色体包被有XIST RNA，其对于失活是必需的。XIST RNA参与X染色体沉默，这是通过募集包含大量生物分子的XIST沉默复合物实现。XIST介导的基因沉默在雌性杂合对象的发育早期起始并在整个细胞生命中维持。
本文所用术语“70千道尔顿热激蛋白”、“Hsp70”或“DnaK”指保守泛表达热激蛋白的家族。在一些实施方案中，Hsp70是用于细胞折叠的细胞机制的重要部分。在一些实施方案中，Hsp70有助于保护细胞免于应激。
本文所用术语“MYC”指MYC原癌基因，这是转录因子myc家族成员的bHLH转录因子。MYC基因是原癌基因并编码在细胞周期进程、细胞凋亡和细胞转化中发挥作用的核磷蛋白。编码的蛋白与相关转录因子MAX形成异二聚体。此复合物结合E box DNA共有序列并调节特定靶基因的转录。在一些实施方案中，此基因的扩增经常在多个人癌症中观察到。在一些实施方案中，涉及此基因的易位与人患者中的伯基特(Burkitt)淋巴瘤和多发性骨髓瘤相关。
本文所用术语“PVT1”或“浆细胞瘤变体易位1”指长非编码RNA，其由位于癌相关区8q24的人PVT1基因编码。PVT1的多种活性包括过表达、调节miRNA表达、蛋白相互作用、靶向调控基因、形成融合基因、充当竞争内源RNA (ceRNA)、与MYC相互作用等。
本文所用术语“SCN1A”或“电压门控钠通道α亚基1”编码电压门控钠通道的α-1亚基(Na(V)1.1)。扩膜α亚基形成通道的中心孔。通道对应跨细胞膜的电压差以产生允许钠离子通过膜的孔。在一些实施方案中，SCN1A相关疾病包括早期婴儿型癫痫性脑病(EpilepticEncephalopathy,Early Infantile)、6和全面性癫痫伴热性惊厥附加症，2型(6andGeneralized Epilepsy With Febrile Seizures Plus,Type 2)。
本文所用术语“SYNGAP1”或“突触RasGTP酶激活蛋白1”位于脑部且为制备名为SynGAP的蛋白提供指引，该蛋白在脑神经细胞中发挥重要作用。SynGAP在神经细胞之间的连接(突触)处发现，在该处发生细胞间通讯。连接的神经细胞用作脑回路的“接线”。突触能够随着时间改变和适应，重布脑回路，这对于学习和记忆是关键的。SynGAP有助于调节突触适应和促进合适的脑连线。蛋白功能在影响未来认识能力的早期脑发育关键期中尤其重要。
第一结构域小分子
在一些实施方案中，本文所述双官能分子的第一结构域特异性结合靶RNA，所述结构域是小分子。在一些实施方案中，小分子选自表2。
在一些实施方案中，小分子是1000道尔顿或更小的有机化合物。在一些实施方案中，小分子是900道尔顿或更小的有机化合物。在一些实施方案中，小分子是800道尔顿或更小的有机化合物。在一些实施方案中，小分子是700道尔顿或更小的有机化合物。在一些实施方案中，小分子是600道尔顿或更小的有机化合物。在一些实施方案中，小分子是500道尔顿或更小的有机化合物。在一些实施方案中，小分子是400道尔顿或更小的有机化合物。
本文所用术语“小分子”指可调节生物过程的小分子量(<900道尔顿)有机化合物。在一些实施方案中，小分子结合特定生物大分子并充当效应募集物，改变靶标的活性或功能。在一些实施方案中，小分子结合核苷酸。在一些实施方案中，小分子结合RNA。在一些实施方案中，小分子结合修饰的核酸。在一些实施方案中，小分子结合内源核酸序列。在一些实施方案中，小分子结合外源核酸序列。在一些实施方案中，小分子结合人工核酸序列。在一些实施方案中，小分子结合蛋白或多肽。在一些实施方案中，小分子结合酶。在一些实施方案中，小分子结合受体。在一些实施方案中，小分子结合内源多肽。在一些实施方案中，小分子结合外源多肽。在一些实施方案中，小分子结合人工多肽。在一些实施方案中，小分子通过共价结合来结合生物大分子。在一些实施方案中，小分子通过非共价结合来结合生物大分子。在一些实施方案中，小分子通过不可逆结合来结合生物大分子。在一些实施方案中，小分子通过可逆结合来结合生物大分子。在一些实施方案中，小分子直接结合生物大分子。在一些实施方案中，小分子间接结合生物大分子。
常规方法能用于设计和鉴定小分子，其以足够特异性结合靶序列。在一些实施方案中，所述方法包括使用本领域已知生物信息学方法以鉴定二级结构区域，如1、2个或更多茎环结构和假结，和选择用小分子靶向的这些区域。
在一些实施方案中，用于本发明方法目的的小分子可特异性结合序列与靶RNA或RNA结构，且有足够特异性程度以避免序列在期望特异性结合的条件下与非靶RNA序列的非特异性结合，如在体内试验或治疗性处理情况和体外试验情况的生理条件下，在试验于适当严紧条件进行的条件下。
一般地，小分子必须保持对其靶标的特异性，即必须不直接结合预期靶标以外的转录物，或直接显著影响其表达水平。
在一些实施方案中，小分子结合核苷酸。在一些实施方案中，小分子结合RNA。在一些实施方案中，小分子结合修饰的核酸。在一些实施方案中，小分子结合内源核酸序列。在一些实施方案中，小分子结合外源核酸序列。在一些实施方案中，小分子结合人工核酸序列。
在一些实施方案中，小分子通过共价键特异性结合靶RNA。在一些实施方案中，小分子通过非共价键特异性结合靶RNA或基因序列。在一些实施方案中，小分子通过不可逆结合特异性结合靶RNA序列。在一些实施方案中，小分子通过可逆结合特异性结合靶RNA序列。在一些实施方案中，小分子直接特异性结合靶RNA或基因序列。在一些实施方案中，小分子间接特异性结合靶RNA序列。
在一些实施方案中，小分子特异性结合核RNA或胞质RNA。在一些实施方案中，小分子特异性结合参与编码、解码、调节和表达基因的RNA。在一些实施方案中，小分子特异性结合在蛋白合成、转录后修饰或DNA复制中发挥作用的RNA。在一些实施方案中，小分子特异性结合调节RNA。在一些实施方案中，小分子特异性结合非编码RNA。
在一些实施方案中，小分子特异性结合RNA序列特定区域。例如，能靶向特定功能区，如包含已知RNA定位基序的区域(即与RNA作用的靶核酸互补的区域)。或者或另外地，能靶向高保守区，如通过对齐来自不同物种的序列并寻找有高度相同性的区域而鉴定的区域，所述物种如灵长类(例如人)和啮齿动物(例如小鼠)。
表2.结合RNA的示例性第一结构域小分子
Figure BDA0003956144350000361
Figure BDA0003956144350000371
Figure BDA0003956144350000381
Figure BDA0003956144350000391
靶RNA
在一些实施方案中，包含靶核糖核酸序列的靶核糖核苷酸是核RNA或胞质RNA。在一些实施方案中，核RNA或胞质RNA是长非编码RNA (lncRNA)、前mRNA、mRNA、微小RNA、增强子RNA、转录的RNA、新生RNA、染色体富集RNA、核糖体RNA、膜富集RNA或线粒体RNA。在一些实施方案中，靶核糖核酸是内含子。在一些实施方案中，靶核糖核酸是外显子。在一些实施方案中，靶核糖核酸是非翻译区。在一些实施方案中，靶核糖核酸是翻译成蛋白的区域。在一些实施方案中，靶序列是mRNA或前mRNA上的翻译或非翻译区。
在一些实施方案中，靶核糖核苷酸是参与编码、非编码、调节和表达基因的RNA。在一些实施方案中，靶核糖核苷酸是在基因的蛋白合成、转录后修饰或DNA复制中发挥作用的RNA。在一些实施方案中，靶核糖核苷酸是调节RNA。在一些实施方案中，靶核糖核苷酸是非编码RNA。在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸的区域选自靶核糖核苷酸的全长RNA序列，包括所有内含子和外显子。
结合ASO或小分子的区域可以是靶核糖核苷酸的区域。靶核糖核苷酸的区域可以包括多种特征。ASO或小分子随后可以结合靶核糖核苷酸的这一区域。在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸的区域基于下列标准选择：(i)SNP频率、(ii)长度、(iii)缺乏连续胞嘧啶、(iv)缺乏连续相同核苷酸、(v)GC含量、(vi)相较人转录物组对靶核糖核苷酸独特的序列、(vii)无法蛋白结合和(viii)二级结构评分。在一些实施方案中，靶核糖核苷酸的区域包括至少2个或更多个上述标准。在一些实施方案中，靶核糖核苷酸的区域包括至少3个或更多个上述标准。在一些实施方案中，靶核糖核苷酸区域包括至少4个或更多个上述标准。在一些实施方案中，靶核糖核苷酸区域包括至少5个或更多个上述标准。在一些实施方案中，靶核糖核苷酸区域包括至少6个或更多个上述标准。在一些实施方案中，靶核糖核苷酸区域包括至少7个或更多个上述标准。在一些实施方案中，靶核糖核苷酸区域包括8个上述标准。本文所用术语“转录物组”指特定细胞或特定细胞群中的一组全部RNA分子(转录物)。在一些实施方案中，其指全部RNA。在一些实施方案中，其仅指mRNA。在一些实施方案中，除了分子特性，其包括各RNA分子的量或浓度。
在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有5％以下的SNP频率。本文所用术语“单核苷酸多态性”或“SNP”指在基因组特定位置出现的单核苷酸取代，其中各变化以群体中1％以上的水平存在。在一些实施方案中，SNP在基因编码序列、基因非编码区或基因间区域范围内。在一些实施方案中，编码区中的SNP是同义SNP或非同义SNP，其中同义SNP不影响蛋白序列，而非同义SNP改变蛋白的氨基酸序列。在一些实施方案中，非同义SNP是错义或无义的。在一些实施方案中，不在蛋白编码区的SNP影响基因剪接、转录因子结合、信使RNA降解或非编码RNA序列。在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有4％以下的SNP频率。在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有3％以下的SNP频率。在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有2％以下的SNP频率。在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有1％以下的SNP频率。在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有0.9％以下的SNP频率。在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有0.8％以下的SNP频率。在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有0.7％以下的SNP频率。在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有0.6％以下的SNP频率。
在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有0.5％以下的SNP频率。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有0.4％以下的SNP频率。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有0.3％以下的SNP频率。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有0.2％以下的SNP频率。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有0.1％以下的SNP频率。
在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有包含30％-70％GC含量的序列。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有包含40％-70％GC含量的序列。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有包含30％-60％GC含量的序列。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有包含40％-60％GC含量的序列。
在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有8-30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有9-30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有10-30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有11-30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有12-30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有13-30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有14-30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有15-30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有16-30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有17-30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有18-30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有19-30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有20-30个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有8-29个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有9-29个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有10-29个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有11-29个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有12-29个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有13-29个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有14-29个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有15-29个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有16-29个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有17-29个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有18-29个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有19-29个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有20-29个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有8-28个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有8-27个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有8-26个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有8-25个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有8-24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有8-23个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有8-22个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有8-21个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有8-20个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有10-28个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有11-28个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有12-28个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有13-28个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有14-28个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有15-28个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有12-27个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有12-26个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有12-25个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有12-24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有12-23个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有12-22个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有12-21个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有12-20个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有相较人转录物组对靶核糖核苷酸独特的序列。在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有缺乏至少3个连续胞嘧啶的序列。在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有缺乏至少4个连续相同核苷酸的序列。在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有缺乏4个连续相同核苷酸的序列。在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有缺乏4个连续相同鸟嘌呤的序列。在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有缺乏4个连续相同腺嘌呤的序列。在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有缺乏4个连续相同尿嘧啶的序列。
在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域结合或不结合蛋白。在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域包含或不包含序列基序或结构基序，所述序列基序或结构基序适合结合RNA识别基序、双链RNA结合基序、K同源结构域或RNA结合蛋白的锌指。作为一个非限制性实例，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有或不具有序列基序或结构基序，其列于Pan et al.,BMC Genomics,19,511(2018)和Dominguez et al.,Molecular Cell 70,854–867(2018)；其内容各自整体援引加入本文。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域包含或不包含蛋白结合位点。蛋白结合位点的实例包括但不限于，诸如以下蛋白的结合位点：ACIN1、AGO、APOBEC3F、APOBEC3G、ATXN2、AUH、BCCIP、CAPRIN1、CELF2、CPSF1、CPSF2、CPSF6、CPSF7、CSTF2、CSTF2T、CTCF、DDX21、DDX3、DDX3X、DDX42、DGCR8、EIF3A、EIF4A3、EIF4G2、ELAVL1、ELAVL3、FAM120A、FBL、FIP1L1、FKBP4、FMR1、FUS、FXR1、FXR2、GNL3、GTF2F1、HNRNPA1、HNRNPA2B1、HNRNPC、HNRNPK、HNRNPL、HNRNPM、HNRNPU、HNRNPUL1、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、ILF3、KHDRBS1、LARP7、LIN28A、LIN28B、m6A、MBNL2、METTL3、MOV10、MSI1、MSI2、NONO、NONO-、NOP58、NPM1、NUDT21、PCBP2、POLR2A、PRPF8、PTBP1、RBFOX2、RBM10、RBM22、RBM27、RBM47、RNPS1、SAFB2、SBDS、SF3A3、SF3B4、SIRT7、SLBP、SLTM、SMNDC1、SND1、SRRM4、SRSF1、SRSF3、SRSF7、SRSF9、TAF15、TARDBP、TIA1、TNRC6A、TOP3B、TRA2A、TRA2B、U2AF1、U2AF2、UNK、UPF1、WDR33、XRN2、YBX1、YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2、YWHAG、ZC3H7B、PDK1、AKT1以及结合RNA的任何其他蛋白。
在一些实施方案中，小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有二级结构。在一些实施方案中，ASO特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有受限二级结构。在一些实施方案中，靶核糖核苷酸区域的二级结构通过RNA结构预测软件预测，如CentroidFold、CentroidHomfold、Context Fold、CONTRAfold、Crumple、CyloFold、GTFold、IPknot、KineFold、Mfold、pKiss、Pknots、PknotsRG、RNA123、RNAfold、RNAshapes、RNAstructure、SARNA-Predict、Sfold、Sliding Windows&Assembly、SPOT-RNA、SwiSpot、UNAFold和vsfold/vs subopt。
在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有以下至少2个或更多个：(i)5％以下的SNP频率、(ii)8-30个核苷酸的长度、(iii)缺乏3个连续胞嘧啶的序列、(iv)缺乏4个连续相同核苷酸的序列、(v)包含30％-70％GC含量的序列、(vi)相较人转录物组对靶核糖核苷酸独特的序列、和(vii)无蛋白结合。在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有以下至少3个或更多个：(i)5％以下的SNP频率、(ii)8-30个核苷酸的长度、(iii)缺乏3个连续胞嘧啶的序列、(iv)缺乏4个连续相同核苷酸的序列、(v)包含30％-70％GC含量的序列、(vi)相较人转录物组对靶核糖核苷酸独特的序列、和(vii)无蛋白结合。在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有以下至少4个或更多个：(i)5％以下的SNP频率、(ii)8-30个核苷酸的长度、(iii)缺乏3个连续胞嘧啶的序列、(iv)缺乏4个连续相同核苷酸的序列、(v)包含30％-70％GC含量的序列、(vi)相较人转录物组对靶核糖核苷酸独特的序列、和(vii)无蛋白结合。在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有以下至少5个或更多个：(i)5％以下的SNP频率、(ii)8-30个核苷酸的长度、(iii)缺乏3个连续胞嘧啶的序列、(iv)缺乏4个连续相同核苷酸的序列、(v)包含30％-70％GC含量的序列、(vi)相较人转录物组对靶核糖核苷酸独特的序列、和(vii)无蛋白结合。在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有以下至少6个或更多个：(i)5％以下的SNP频率、(ii)8-30个核苷酸的长度、(iii)缺乏3个连续胞嘧啶的序列、(iv)缺乏4个连续相同核苷酸的序列、(v)包含30％-70％GC含量的序列、(vi)相较人转录物组对靶核糖核苷酸独特的序列、和(vii)无蛋白结合。在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有以下至少7个或更多个：(i)5％以下的SNP频率、(ii)8-30个核苷酸的长度、(iii)缺乏3个连续胞嘧啶的序列、(iv)缺乏4个连续相同核苷酸的序列、(v)包含30％-70％GC含量的序列、(vi)相较人转录物组对靶核糖核苷酸独特的序列、和(vii)无蛋白结合。在一些实施方案中，ASO或小分子特异性结合的靶核糖核苷酸区域具有(i)5％以下的SNP频率、(ii)8-30个核苷酸的长度、(iii)缺乏3个连续胞嘧啶的序列、(iv)缺乏4个连续相同核苷酸的序列、(v)包含30％-70％GC含量的序列、(vi)相较人转录物组对靶核糖核苷酸独特的序列、和(vii)无蛋白结合。
在一些实施方案中，ASO或小分子能设计成靶向RNA序列的特定区域。例如，能靶向特定功能区，如包含已知RNA定位基序的区域(即与RNA作用的靶核酸互补的区域)。或者或另外地，能靶向高保守区，如通过对齐来自不同物种的序列并寻找有高度相同性的区域而鉴定的区域，所述物种如灵长类(例如人)和啮齿动物(例如小鼠)。相同性百分比能用基本局部比对搜索工具(BLAST程序)(Altschul et al.,J.Mol.Biol.,1990,215,403-410；Zhang and Madden,Genome Res.,1997,7,649-656)常规确定，例如使用默认参数。
在一些实施方案中，如本文所述，双官能分子结合靶RNA并募集靶内源蛋白(如效应物)，这通过使靶内源蛋白结合第二结构域。或者，在一些实施方案中，ASO或小分子可如下增加转录：经募集到靶位点的靶内源蛋白来结合靶RNA或基因序列，通过双官能分子的第二结构域(如效应物募集物)与靶内源蛋白(如效应物)之间的相互作用。
在一些实施方案中，靶RNA或基因是非编码RNA、蛋白编码RNA。在一些实施方案中，靶RNA或基因包括MALAT1 RNA。在一些实施方案中，靶RNA或基因包括XIST RNA。在一些实施方案中，靶RNA或基因包括HSP70 RNA。在一些实施方案中，靶RNA或基因包括MYC RNA。在一些实施方案中，靶RNA或基因是MALAT1 RNA。在一些实施方案中，靶RNA或基因是XIST RNA。在一些实施方案中，靶RNA或基因是HSP70 RNA。在一些实施方案中，靶RNA或基因是MYCRNA。
第二结构域
在一些实施方案中，本文所述双官能分子的第二结构域特异性结合靶内源蛋白(如效应物)，所述第二结构域包含小分子或适体。在一些实施方案中，第二结构域特异性结合靶内源蛋白上的活性位点或别构位点。
第二结构域小分子
在一些实施方案中，第二结构域是小分子。在一些实施方案中，小分子选自表3。
常规方法能用于设计以足够特异性结合靶蛋白的小分子。在一些实施方案中，用于本方法目的的小分子可特异性结合序列与靶蛋白以引起期望效果，如增加转录，且有足够程度的特异性以避免序列在需要特异性结合的条件下与非靶蛋白序列的非特异性结合，如在体内试验或治疗性处理情况和体外试验情况的生理条件下，在试验于适当严紧条件进行的条件下。
在一些实施方案中，小分子结合效应物。在一些实施方案中，小分子结合蛋白或多肽。在一些实施方案中，小分子结合内源蛋白或多肽。在一些实施方案中，小分子结合外源蛋白或多肽。在一些实施方案中，小分子结合重组蛋白或多肽。在一些实施方案中，小分子结合人工蛋白或多肽。在一些实施方案中，小分子结合融合蛋白或多肽。在一些实施方案中，小分子结合酶。在一些实施方案中，小分子结合酶调节蛋白。在一些实施方案中，小分子结合受体。在一些实施方案中，小分子结合信号蛋白或肽。在一些实施方案中，小分子结合转录因子。在一些实施方案中，小分子结合转录调节物或介体(mediator)。
在一些实施方案中，小分子通过共价键特异性结合靶蛋白。在一些实施方案中，小分子通过非共价键特异性结合靶蛋白。在一些实施方案中，小分子通过不可逆结合来结合靶蛋白。在一些实施方案中，小分子通过可逆结合来结合靶蛋白。在一些实施方案中，小分子通过与靶蛋白侧链相互作用来特异性结合靶蛋白。在一些实施方案中，小分子通过与靶蛋白N末端相互作用来特异性结合靶蛋白。在一些实施方案中，小分子通过与靶蛋白C末端相互作用来特异性结合靶蛋白。在一些实施方案中，小分子特异性结合靶内源蛋白上的活性位点或别构位点。
在一些实施方案中，小分子特异性结合靶蛋白序列的特定区域。例如，能靶向特定功能区，如区域，包括催化结构域、激酶结构域、蛋白-蛋白相互作用结构域、蛋白-DNA相互作用结构域、蛋白-RNA相互作用结构域、调节结构域、信号结构域、核定位结构域、核输出结构域、跨膜结构域、糖基化位点、修饰位点或磷酸化位点。或者或另外地，能靶向高保守区，如通过对齐来自不同物种的序列并寻找有高度相同性的区域而鉴定的区域，所述物种如灵长类(例如人)和啮齿动物(例如小鼠)。
本文所用术语“依鲁替尼(Ibrutinib)”或“伊布替尼(Imbruvica)”指小分子药物，其永久结合布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)，更特异性结合在B细胞中重要的BTK蛋白的ATP结合袋。在一些实施方案中，依鲁替尼用于治疗B细胞癌症，如套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(
Figure BDA0003956144350000451
macroglobulinemia)。
本文所用术语“ORY-1001”指高效和选择性赖氨酸特异性组蛋白脱甲基酶1A(LSD1)抑制剂，其诱导LSD1靶基因上的H3K4me2积聚、肿大分化以及AML中的白血病干细胞容量下降。在一些实施方案中，ORY-1001显示与标准治疗(standard-of-care)药物和选择性表观遗传抑制剂的有效协同。在一些实施方案中，ORY-1001正在白血病和实体瘤患者中评估。
在一些实施方案中，第二结构域包含pan-BET布罗莫结构域抑制剂。在一些实施方案中，第二结构域包含小分子JQ1。如本文所用，“JQ1”指噻吩并三唑并二氮杂卓(thienotriazolodiazepine)和布罗莫结构域蛋白BET家族的抑制剂。在一些实施方案中，第二结构域包含小分子IBET762。如本文所用，“IBET762”或“iBET762”指苯并二氮杂卓(benzodiazepine)化合物，其以纳摩尔级亲和性选择性结合识别乙酰基的BET袋。
表3.示例性第二结构域小分子和适体
Figure BDA0003956144350000461
Figure BDA0003956144350000471
Figure BDA0003956144350000481
适体
在一些实施方案中，本文所述双官能分子的第二结构域特异性结合靶内源蛋白，所述结构域是适体。在一些实施方案中，适体选自表3。
本文所用术语“适体”指结合特定靶分子的寡核苷酸或肽分子。在一些实施方案中，适体结合靶蛋白。
常规方法能用于设计和选择适体，其以足够特异性结合靶蛋白。在一些实施方案中，用于本方法目的的适体结合靶蛋白以募集蛋白(如效应物)。一旦募集，蛋白达到期望效果如增加转录，且有足够特异性程度以避免序列在期望特异性结合的条件下与非靶蛋白序列的非特异性结合，如在体内试验或治疗性处理情况和体外试验情况的生理条件下，在试验于适当严紧条件进行的条件下。
在一些实施方案中，适体结合蛋白或多肽。在一些实施方案中，适体结合内源蛋白或多肽。在一些实施方案中，适体结合外源蛋白或多肽。在一些实施方案中，适体结合重组蛋白或多肽。在一些实施方案中，适体结合人工蛋白或多肽。在一些实施方案中，适体结合融合蛋白或多肽。在一些实施方案中，适体结合酶。在一些实施方案中，适体结合酶调节蛋白。在一些实施方案中，适体结合受体。在一些实施方案中，适体结合信号蛋白或肽。在一些实施方案中，适体结合转录因子。在一些实施方案中，适体结合转录调节物或介体。
在一些实施方案中，适体通过共价键特异性结合靶蛋白。在一些实施方案中，适体通过非共价键特异性结合靶蛋白。在一些实施方案中，适体通过不可逆结合来结合靶蛋白。在一些实施方案中，适体通过可逆结合来结合靶蛋白。在一些实施方案中，适体特异性结合靶内源蛋白上的活性位点或别构位点。
在一些实施方案中，适体特异性结合靶蛋白序列的特定区域。例如，能靶向特定功能区，如区域，包括催化结构域、激酶结构域、蛋白-蛋白相互作用结构域、蛋白-DNA相互作用结构域、蛋白-RNA相互作用结构域、调节结构域、信号结构域、核定位结构域、核输出结构域、跨膜结构域、糖基化位点、修饰位点或磷酸化位点。或者或另外地，能靶向高保守区，如通过对齐来自不同物种的序列并寻找有高度相同性的区域而鉴定的区域，所述物种如灵长类(例如人)和啮齿动物(例如小鼠)。
在一些实施方案中，适体减少或干扰蛋白活性或功能如增加转录，这通过本文所述双官能分子的第一结构域之间的相互作用，在募集到靶位点后结合靶蛋白实现。或者，适体结合靶蛋白并募集本文所述双官能分子，从而允许第一结构域特异性结合靶RNA序列。
在一些实施方案中，第二结构域包括结合组蛋白脱乙酰酶的适体。在一些实施方案中，第二结构域包括结合BTK的适体。在一些实施方案中，第二结构域包括结合LSD1的适体。
多个第二结构域
在一些实施方案中，本文所提供合成双官能分子，其包含第一结构域以及一个或多个第二结构域。在一些实施方案中，双官能分子具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个第二结构域。在一些实施方案中，一个或多个第二结构域各自特异性结合靶内源蛋白。
一方面，合成双官能分子包含特异性结合靶RNA序列的第一结构域，多个第二结构域，其中多个第二结构域各自特异性结合单一靶内源蛋白。在一些实施方案中，合成双官能分子还包含缀合第一结构域与多个第二结构域的接头。
在一些实施方案中，第一结构域包含小分子或ASO。在一些实施方案中，双官能分子包含多个第二结构域。多个第二结构域各自包含小分子或适体。在一些实施方案中，多个第二结构域各自包含小分子。在一些实施方案中，多个第二结构域各自包含适体。
在一些实施方案中，双官能分子包含多个第二结构域，如2、3、4、5、6、7、8、9或10个第二结构域。在一个实施方案中，双官能分子具有2个第二结构域。在一个实施方案中，双官能分子具有3个第二结构域。在一个实施方案中，双官能分子具有4个第二结构域。在一个实施方案中，双官能分子具有5个第二结构域。在一个实施方案中，双官能分子具有6个第二结构域。在一个实施方案中，双官能分子具有7个第二结构域。在一个实施方案中，双官能分子具有8个第二结构域。在一个实施方案中，双官能分子具有9个第二结构域。在一个实施方案中，双官能分子具有10个第二结构域。在一个实施方案中，双官能分子具有超过10个第二结构域。
在一些实施方案中，多个第二结构域是相同的结构域。在一些实施方案中，多个第二结构域是不同的结构域。在一些实施方案中，多个第二结构域结合相同的靶标。在一些实施方案中，多个第二结构域结合不同的靶标。
靶蛋白
在一些实施方案中，靶蛋白可以是效应物。在其他实施方案中，靶蛋白可以是内源蛋白或多肽。在一些实施方案中，靶蛋白可以是外源蛋白或多肽。在一些实施方案中，靶蛋白可以是重组蛋白或多肽。在一些实施方案中，靶蛋白可以是人工蛋白或多肽。在一些实施方案中，靶蛋白可以是融合蛋白或多肽。在一些实施方案中，靶蛋白可以是酶。在一些实施方案中，靶蛋白可以是受体。在一些实施方案中，靶蛋白可以是信号蛋白或肽。在一些实施方案中，靶蛋白可以是转录因子。在一些实施方案中，靶蛋白可以是转录调节物或介体。
在一些实施方案中，靶蛋白的活性或功能如转录，可通过结合本文所提供双官能分子的第二结构域而增加。在一些实施方案中，靶蛋白募集本文所述双官能分子，这通过结合本文所提供双官能分子的第二结构域，从而允许第一结构域特异性结合靶RNA序列实现。在一些实施方案中，靶蛋白还募集额外功能结构域或蛋白。
在一些实施方案中，靶蛋白包括转录修饰酶。在一些实施方案中，靶蛋白包括组蛋白脱乙酰酶。在一些实施方案中，靶蛋白包括转录激活因子。在一些实施方案中，靶蛋白包括转录抑制因子。在一些实施方案中，靶蛋白包括酪氨酸激酶。在一些实施方案中，靶蛋白包括组蛋白脱甲基酶。在一些实施方案中，靶蛋白包括RNA修饰酶。在一些实施方案中，靶蛋白包括RNA甲基转移酶。
在一些实施方案中，靶蛋白是转录修饰酶。在一些实施方案中，靶蛋白是组蛋白脱乙酰酶。在一些实施方案中，靶蛋白是转录激活因子。在一些实施方案中，靶蛋白是转录抑制因子。在一些实施方案中，靶蛋白是酪氨酸激酶。在一些实施方案中，靶蛋是组蛋白脱甲基酶。在一些实施方案中，靶蛋是核酸酶。在一些实施方案中，靶蛋是RNA修饰酶。在一些实施方案中，靶蛋白是RNA甲基转移酶。
在一些实施方案中，靶蛋白包括BRD4。本文所用术语“BRD4”或“含布罗莫结构域蛋白4”指表观遗传识别因子(epigenetic reader)，其识别组蛋白并充当转录调节物以引发肿瘤生长和炎症反应。BRD4是BET(布罗莫结构域和额外末端结构域)家族成员。包括小鼠在内的哺乳动物BET蛋白的结构域高度保守。pan-BET抑制剂(+)-JQ1可抑制血管生成，血管生成促进炎症、感染、免疫病症和癌变。
接头
在一些实施方案中，合成双官能分子包含特异性结合靶RNA序列的第一结构域和特异性结合靶内源蛋白的第二结构域，其中第一结构域通过接头分子缀合第二结构域。
在某些实施方案中，本文所述双官能分子的第一结构域和第二结构域能化学连接或经化学接头(L)偶联。在某些实施方案中，接头是包含一个或多个共价连接的结构单元的基团。在某些实施方案中，接头直接连接第一结构域与第二结构域。在某些实施方案中，接头间接连接第一结构域与第二结构域。在一些实施方案中，一个或多个接头能用于连接第一结构域、一个或多个第二结构域、第三结构域或其组合。
在某些实施方案中，接头是键、CRL1RL2、O、S、SO、SO2、NRL3、SO2NRL3、SONRL3、CONRL3、NRL3CONRw、NRL3SO2NRw、CO、CRL＝CRL2、C≡C、SiRL1RL2、P(0)RL1、P(0)ORL1、NRL3C(＝NCN)NRW、NRL3C(＝NCN)、NRL3C(＝CNO2)NRL4、C3-n-环烷基，其任选由0-6个RL1和/或RL2基团取代、C3-n-杂环基，其任选由0-6个RLI和/或RL2基团取代、芳基，其任选由0-6个RLI和/或RL2基团取代、杂芳基，其任选由0-6个RLI和/或RL2基团取代，其中RLI或RL2可以各自独立地连接其他基团以形成环烷基和/或杂环基部分，其可以进一步取代由0-4个R基团取代；其中RL1、RL2、RL3、Rw和RL5各自独立地是H、卤素、Ci8烷基、OCi8烷基、SCi8烷基、NHCi8烷基、N(Ci8烷基)2、C3n-环烷基、芳基、杂芳基、C3n-杂环基、OCi8环烷基、SCi8环烷基、NHCi8环烷基、N(Ci8环烷基)2、N(Ci8环烷基)(Ci g烷基)、OH、NH2、SH、SO2Ci8烷基、P(0)(OCi8烷基)(Ci_烷基)、P(0)(OCi8烷基)2、CC-Ci8烷基、CCH、CH＝CH(Ci8烷基)、C(Ci8烷基)＝CH(Ci8烷基)、C(Ci8烷基)＝C(Ci8烷基)2、Si(OH)3、Si(Ci8烷基)3、Si(OH)(Ci8烷基)2、COCi8烷基、CO2H、卤素、CN、CF3、CHF2、CH2F、NO2、SF5、SO2NHCi8烷基、SO2N(Ci8烷基)2、SONHCi8烷基、SON(Ci8烷基)2、CONHCi8烷基、CON(Ci8烷基)2、N(Ci8烷基)CONH(Ci8烷基)、N(Ci_烷基)CON(Ci8烷基)2、NHCONH(Ci8烷基)、NHCON(Ci8烷基)2、NHCONH2、N(Ci8烷基)SO2NH(Ci8s烷基)、N(Ci8烷基)SO2N(Ci8烷基)2、NHSO2NH(Ci8烷基)、NHSO2N(Ci8烷基)2、NHSO2NH2。
在某些实施方案中，接头(L)选自：-(CH2)n-(低级烷基)-、-(CH2)n-(低级烷氧基)-、-(CH2)n-(低级烷氧基)-OCH2-C(O)-、-(CH2)n-(低级烷氧基)-(低级烷基)-OCH2-C(O)-、-(CH2)n-(环烷基)-(低级烷基)-OCH2-C(O)-、-(CH2)n-(杂环烷基)-、-(CH2CH2O)n-(低级烷基)-O-CH2-C(O)-、-(CH2CH2O)n-(杂环烷基)-O-CH2-C(O)-、-(CH2CH2O)n-芳基-O-CH2-C(O)-、-(CH2CH2O)n-(杂芳基)-0-CH2-C(O)-、-(CH2CH2O)-(环烷基)-O-(杂芳基)-O-CH2-C(O)-、-(CH2CH2O)n-(环烷基)-O-芳基-O-CH2-C(O)-、-(CH2CH2O)n-(低级烷基)-NH-芳基-O-CH2-C(0)-、-(CH2CH2O)n-(低级烷基)-O-芳基-C(O)-、-(CH2CH2O)n-环烷基-O-芳基-C(O)-、-(CH2CH2O)n-环烷基-O-(杂芳基)-C(O)-，其中n可以是0 -10；
Figure BDA0003956144350000521
在额外实施方案中，接头基团是任选取代的(聚)乙二醇，其具有1-约100个乙二醇单元、约1-约50个乙二醇单元、1-约25个乙二醇单元、约1-10个乙二醇单元、1-约8个乙二醇单元和1-6个乙二醇单元、2-4个乙二醇单元，或是任选取代的烷基，其夹杂有任选取代的O、N、S、P或Si原子。在某些实施方案中，接头由芳基、苯基、苄基、烷基、亚烷基或杂环基取代。在某些实施方案中，接头可以是不对称或对称的。
在本文任何实施方案中，接头基团可以是本文所述任何适当部分。在一个实施方案中，接头是取代或未取代的聚乙二醇基团，大小范围是约1-约12个乙二醇单元、1-约10个乙二醇单元、约2-约6个乙二醇单元、约2-5个乙二醇单元、约2-4个乙二醇单元。
尽管第一结构域和第二结构域可经任何就接头化学而言合适且稳定的基团共价连接接头基团，但是在一些方面，接头独立共价键合第一结构域和第二结构域，这通过酰胺、酯、硫酯、酮基、氨基甲酸酯(尿烷)、碳或醚实现，所述基团各自可以插入第一结构域和第二结构域的任何地方以提供最大结合。在某些优选方面，接头可以连接第一结构域和/或第二结构域上任选取代的烷基、亚烷基、烯烃或炔烃基、芳基或杂环基。
在某些实施方案中，接头可以是直链，具有4-24个线性原子，直链中的碳原子可以用氧、氮、酰胺、氟化碳等取代，例如以下：
Figure BDA0003956144350000531
Figure BDA0003956144350000541
在一些实施方案中，接头包括位置异构体的混合物。在一些实施方案中，位置异构体的混合物选自接头1-5：
Figure BDA0003956144350000542
Figure BDA0003956144350000551
在一些实施方案中，接头包括模块接头。在一些实施方案中，模块接头包括一个或多个模块区，其可用接头模块取代。在一些实施方案中，具有可用接头模块取代的模块区的模块接头包括：
Figure BDA0003956144350000561
在某些实施方案中，接头可以是非直链，并且可以是脂肪族或芳族或杂芳环部分。一些接头的实例包括但不限于以下：
Figure BDA0003956144350000571
其中“X”可以是原子范围为2-14个的直链且可以包含杂原子如氧，并且“Y”可以是O、N、S(O)n(n＝0、1或2)。
其他接头的实例包括但不限于：烯丙基(4-甲氧基苯基)二甲基硅烷、6-(烯丙氧基羰基氨基)-1-己醇、3-(烯丙氧基羰基氨基)-1-丙醇、4-氨基丁醛乙醛缩二乙醇、(E)-N-(2-氨乙基)-4-{2-[4-(3-叠氮基丙氧基)苯基]二氮烯基}苯甲酰胺盐酸盐、N-(2-氨乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐、氨基-PEG4-炔烃、氨基-PEG4-叔丁酯、氨基-PEG5-叔丁酯、氨基-PEG6-叔丁酯、20-叠氮基-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十烷酸、17-叠氮基-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷酸、苄基N-(3-羟丙基)氨基甲酸酯、4-(Boc-氨基)-1-丁醇、4-(Boc-氨基)溴丁烷、2-(Boc-氨基)乙硫醇、2-[2-(Boc-氨基)乙氧基]乙氧乙酸(二环己铵)盐、2-(Boc-氨基)溴乙烷、6-(Boc-氨基)-1-己醇、21-(Boc-氨基)-4,7,10,13,16,19-六氧杂二十一烷酸purum、6-(Boc-氨基)溴己烷、3-(Boc-氨基)-1-丙醇、3-(Boc-氨基)溴丙烷、15-(Boc-氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷酸purum、N-Boc-1,4-丁二胺、N-Boc-尸胺、N-Boc-乙醇胺、N-Boc-乙二胺、N-Boc-2,2′-(亚乙基二氧基)二乙胺、N-Boc-1,6-己二胺、N-Boc-1,6-己二胺盐酸盐、N-Boc-4-异硫氰基苯胺、N-Boc-3-异硫氰酰基丙胺、N-Boc-N-甲基乙二胺、BocNH-PEG4-酸、BocNH-PEG5-酸、N-Boc-m-苯二胺、N-Boc-p-苯二胺、N-Boc-1,3-丙二胺、N-Boc-1,3-丙二胺、N-Boc-N′-琥珀酰-4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺、N-Boc-4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺、N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺、4-溴丁酸、4-溴丁酰氯、N-(2-溴乙基)邻苯二甲酰亚胺、6-溴-1-己醇、8-溴辛酸、8-溴-1-辛醇、3-(4-溴苯基)-3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶、N-(3-溴苯基)邻苯二甲酰亚胺、4-(叔丁氧基甲基)苯甲酸、叔丁基2-(4-{[4-(3-叠氮基丙氧基)苯基]偶氮基}苯甲酰氨)氨基甲酸乙酯、2-[2-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)乙氧基]乙胺、叔丁基4-羟丁酸酯、水合氯醛、4-(2-氯丙酰)苯乙酸、1,11-二氨基-3,6,9-三氧杂十一烷、二-Boc-胱胺、二乙二醇单烯丙基醚、3,4-二氢-2H-吡喃-2-甲醇、4-[(2,4-二甲氧基苯基)(Fmoc-氨基)甲基]苯氧乙酸、4-(二苯羟甲基)苯甲酸、4-(Fmoc-氨基)-1-丁醇、2-(Fmoc-氨基)乙醇、2-(Fmoc-氨基)溴乙烷、6-(Fmoc-氨基)-1-己醇、5-(Fmoc-氨基)-1-戊醇、3-(Fmoc-氨基)-1-丙醇、3-(Fmoc-氨基)溴丙烷、N-Fmoc-2-溴乙胺、N-Fmoc-1,4-丁二胺氢溴酸盐、N-Fmoc-尸胺氢溴酸盐、N-Fmoc-乙二胺溴氢酸盐、N-Fmoc-1,6-己二胺溴氢酸盐、N-Fmoc-1,3-丙二胺溴氢酸盐、N-Fmoc-N″-琥珀酰-4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺、(3-甲酰-1-吲哚)乙酸、4-羟苄醇、N-(4-羟丁基)三氟乙酰胺、4′-羟基-2,4-二甲氧基二苯甲酮、N-(2-羟乙基)马来酰亚胺、4-[4-(1-羟乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基]丁酸、N-(2-羟乙基)三氟乙酰胺、N-(6-羟乙基)三氟乙酰胺、4-羟基-2-甲氧基苯甲醛、4-羟基-3-甲氧苄醇、4-(羟甲基)苯甲酸、4-(羟甲基)苯氧基乙酸、羟基-PEG4-叔丁酯、羟基-PEG5-叔丁酯、羟基-PEG6-叔丁酯、N-(5-羟戊基)三氟乙酰胺、4-(4′-羟苯偶氮基)苯甲酸、2-马来酰亚胺甲磺酸乙酯、6-巯基-1-己醇、苯甲酰甲基4-(溴甲基)乙酸苯酯、炔丙基-PEG6-酸、4-氨磺酰苯甲酸、4-氨磺酰丁酸、4-(Z-氨基)-1-丁醇、6-(Z-氨基)-1-己醇、5-(Z-氨基)-1-戊醇、N-Z-1,4-丁二胺盐酸盐、N-Z-乙醇胺、N-Z-乙二胺盐酸盐、N-Z-1,6-己二胺盐酸盐、N-Z-1,5-戊二胺盐酸盐和N-Z-1,3-丙二胺盐酸盐。
在一些实施方案中，接头在ASO 5’末端或3’末端缀合。在一些实施方案中，接头ASO非5’末端或3’末端的位置缀合。
在一些实施方案中，合成双官能分子包含特异性结合靶RNA序列的第一结构域、多个第二结构域以及缀合第一结构域与多个第二结构域的接头，其中所述多个第二结构域各自特异性结合单一靶内源蛋白。
在一些实施方案中，接头包含1-10个接头-核苷。在一些实施方案中，这类接头-核苷是修饰的核苷。在某些实施方案中，这类接头-核苷包含修饰的糖部分。在一些实施方案中，接头-核苷是未修饰的。在一些实施方案中，接头-核苷包含任选受保护的杂环碱基，其选自：嘌呤、取代的嘌呤、嘧啶或取代的嘧啶。在一些实施方案中，可剪切部分是核苷，其选自：尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、4-N-苯甲酰胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、4-N-苯甲酰-5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤、6-N-苯甲酰腺嘌呤、鸟嘌呤和2-N-异丁酰鸟嘌呤。通常期望接头-核苷在其到达靶组织后从寡聚化合物中切割。
在一些实施方案中，接头-核苷通过可剪切键彼此连接以及与寡聚化合物剩余部分连接。在一些实施方案中，这类可剪切键是磷酸二酯键。
接头-核苷在本文中不视作寡核苷酸的一部分。因此，在寡聚化合物包含寡核苷酸且寡聚化合物也包含缀合基团的实施方案中，所述寡核苷酸由指定数目或范围的连接的核苷和/或指定百分比的参照核酸的互补物组成，所述缀合基团包含含接头-核苷的缀合物接头，这些接头-核苷不针对寡核苷酸长度计数且不用于确定寡核苷酸对参照核酸的百分比互补性。
在一些实施方案中，接头可以是非核酸接头。非核酸接头可以是化学键，如一个或多个共价键或非共价键。在一些实施方案中，非核酸接头是肽或蛋白接头。这种接头可以是2-30个氨基酸或更长。接头包括灵活、刚性或可切割的本文所述接头。
在一些实施方案中，接头是单化学键(即缀合物部分经缀合物接头通过单键附于寡核苷酸)。在一些实施方案中，接头包括链结构，如烃链，或诸如乙二醇、核苷或氨基酸单元的重复单元的寡聚物。
接头的实例包括但不限于吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-l-羧酸盐(SMCC)和6-氨基己酸(AHEX或AHA)。其他接头包括但不限于取代或未取代的Ci-Cio烷基、取代或未取代的C2-C10烯基或者取代或未取代的C2-C10炔基，其中优选取代基的非限制性列表包括羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、巯基、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。
最常用的灵活接头具有主要由Gly和Ser残基延伸(“GS”接头)组成的序列。灵活接头可用于连接需要某种程度移动或相互作用的结构域，且可以包括小、非极性(如Gly)或极性(如Ser或Thr)氨基酸。纳入Ser或Thr还能通过与水分子形成氢键来维持接头在水溶液中的稳定性，并因而减少接头与蛋白部分之间的不利相互作用。
刚性接头用于保持结构域之间的固定距离并维持其独立功能。当结构域空间分离对保护一个或多个组分在融合中的稳定性或生物活性关键时，刚性接头也有用。刚性接头可具有α螺旋结构或Pro富集序列(XP)n，X指定为任何氨基酸，优选Ala、Lys或Glu。
可剪切接头可以在体内释放游离功能结构域。在一些实施方案中，接头可在特定条件下切割，如存在还原试剂或蛋白酶。体内可剪切接头可以利用二硫键的可逆性质。一个实例包括2个Cys残基之间的凝血酶敏感性序列(如PRS)。体外凝血酶处理CPRSC引起凝血酶敏感性序列剪切，同时可逆二硫键保持完整。这类接头已知且描述于例如Chen etal..2013.Fusion Protein Linkers:Property,Design and Functionality.Adv DrugDeliv Rev.65(10):1357–1369。融合中接头的体内剪切也可通过病理条件(例如癌症或炎症)下体内表达、特定细胞或组织中表达、或某些细胞区室内限制的蛋白酶完成。许多蛋白酶特异性在限制性区室中提供接头的较慢剪切。
连接分子的实例包括疏水接头，如带负电的磺酸基；脂质，如聚(--CH2--)烃链，例如聚乙二醇(PEG)基团、其不饱和变体、其羟基化变体、其酰胺化或另外含N变体、非碳接头；碳水化合物接头；磷酸二酯接头，或其他能够共价连接2个或更多多肽的分子。也包括非共价接头，如多肽连接的疏水脂质小球，例如通过多肽疏水区或多肽的疏水延伸如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸丰富的残基系列，或者也许以及丙氨酸、苯丙氨酸或甚至酪氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸或其他疏水残基。多肽可用基于电荷的化学连接，从而多肽的带正电部分连接另一多肽或核酸的负电荷。
在一些实施方案中，接头包含一个或多个选自以下的基团：烷基、氨基、氧代、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚和羟基氨基。在某些这类实施方案中，接头包含选自烷基、氨基、氧代、酰胺和醚基的基团。在一些实施方案中，接头包含选自烷基和酰胺基的基团。在一些实施方案中，接头包含选自烷基和醚基的基团。在一些实施方案中，接头包含至少一个磷部分。在一些实施方案中，接头包含至少一个磷酸基。在一些实施方案中，接头包含至少一个中性连接基团。
在一些实施方案中，接头是双官能连接部分，例如本领域已知用于使缀合基团附于寡聚化合物的那些，如本文提供的ASO。一般地，双官能连接部分包含至少2个官能团。一个官能团选择成结合寡聚化合物上的特定位点，而另一个选择成结合缀合基团。用于双官能连接部分的官能团的实例包括但不限于亲电体(electrophile)和亲核体(nucleophile)，前者用于与亲核基团反应，后者用于与亲电基团反应。在一些实施方案中，双官能连接部分包含一个或多个选自以下的基团：氨基、羟基、羧酸、巯基、烷基、烯基和炔基。
第三结合结构域
在一些实施方案中，本文所提供双官能分子还包含第三结构域。第三结构域与第一结构域、接头、第二结构域或其组合缀合。在一些实施方案中，第三结构域包含小分子或肽。在一些实施方案中，第三结构域增强细胞对合成双官能分子的摄取。在其他实施方案中，第三结构域靶向递送合成分子到特定位点(如细胞)。
第三结构域小分子
在一些实施方案中，第三结构域是小分子。
常规方法能用于设计以足够特异性结合靶内源蛋白的小分子。在一些实施方案中，用于本方法目的的小分子可特异性结合序列与靶蛋白以引起期望效果，如增强细胞对合成双官能分子的摄取，且有足够程度的特异性以避免序列与非靶蛋白在期望特异性结合的条件下的非特异性结合，如在体内试验或治疗性处理情况下、在体外试验情况下的生理条件，在试验于适当严紧情况下进行的条件。
在一些实施方案中，第三结构域小分子结合效应物。在一些实施方案中，小分子结合蛋白或多肽。在一些实施方案中，小分子结合内源蛋白或多肽。在一些实施方案中，小分子结合外源蛋白或多肽。在一些实施方案中，小分子结合重组蛋白或多肽。在一些实施方案中，小分子结合人工蛋白或多肽。在一些实施方案中，小分子结合融合蛋白或多肽。在一些实施方案中，小分子结合细胞受体。在一些实施方案中，小分子结合参与内吞作用或胞饮作用的细胞受体。在一些实施方案中，小分子结合用于内吞作用或胞饮作用的细胞膜。在一些实施方案中，小分子结合酶。在一些实施方案中，小分子结合酶调节蛋白。在一些实施方案中，小分子结合受体。在一些实施方案中，小分子结合信号蛋白或肽。在一些实施方案中，小分子结合转录因子。在一些实施方案中，小分子结合转录调节物或介体。
在一些实施方案中，小分子通过共价键特异性结合靶蛋白。在一些实施方案中，小分子通过非共价键特异性结合靶蛋白。在一些实施方案中，小分子通过不可逆结合特异性结合靶蛋白。在一些实施方案中，小分子通过可逆结合特异性结合靶蛋白。在一些实施方案中，小分子通过与靶蛋白侧链相互作用来特异性结合靶蛋白。在一些实施方案中，小分子通过与靶蛋白N末端相互作用来特异性结合靶蛋白。在一些实施方案中，小分子通过与靶蛋白C末端相互作用来特异性结合靶蛋白。在一些实施方案中，小分子特异性结合靶内源蛋白上的活性位点或别构位点。
在一些实施方案中，第三结构域小分子特异性结合靶蛋白序列特定区域。例如，能靶向特定功能区，如区域，包括催化结构域、激酶结构域、蛋白-蛋白相互作用结构域、蛋白-DNA相互作用结构域、蛋白-RNA相互作用结构域、调节结构域、信号结构域、核定位结构域、核输出结构域、跨膜结构域、糖基化位点、修饰位点或磷酸化位点。或者或另外地，能靶向高保守区，如通过对齐来自不同物种的序列并寻找有高度相同性的区域而鉴定的区域，所述物种如灵长类(例如人)和啮齿动物(例如小鼠)。
某些缀合化合物
在某些实施方案中，第三结构域可包含一个或多个小分子或寡聚化合物，其包含寡核苷酸(修饰或未修饰)或由其组成，其任选包含一个或多个缀合基团和/或末端基团。缀合基团由一个或多个缀合部分和缀合接头组成，所述接头连接缀合部分与小分子或寡核苷酸。缀合基团可附于小分子或寡核苷酸任一端或两端和/或任何内部位置。在某些实施方案中，缀合基团附于修饰的寡核苷酸中核苷的2'位。在某些实施方案中，附于寡核苷酸任一端或两端的缀合基团是末端基团。在某些这类实施方案中，缀合基团或末端基团附于寡核苷酸的3’和/或5’-末端。在某些这类实施方案中，缀合基团(或末端基团)附于寡核苷酸的3’末端。在某些实施方案中，缀合基团附于寡核苷酸的3’末端附近。在某些实施方案中，缀合基团(或末端基团)附于寡核苷酸的5’末端。在某些实施方案中，缀合基团附于寡核苷酸的5’末端附近。末端基团的实例包括但不限于缀合基团、加帽基团、磷酸部分、保护基团、修饰或未修饰的核苷以及独立地修饰或未修饰的2个或更多核苷。
A.某些缀合基团
在某些实施方案中，小分子或寡核苷酸共价附于一个或多个缀合基团。在某些实施方案中，缀合基团改变所附小分子或寡核苷酸的一种或多种特性，包括但不限于药效学、药代动力学、稳定性、结合、吸收、组织分布、细胞分布、细胞摄取、电荷和清除。在某些实施方案中，缀合基团赋予所附小分子或寡核苷酸新特性，如能够使检测所附小分子或寡核苷酸可行的荧光团或报告基团。
之前描述了某些缀合基团和缀合部分，例如：胆固醇部分(Letsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553-6556)、胆酸(Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4,1053-1060)、硫醚，如己基-S-三苯甲硫醇(Manoharan etal.,Ann.NY.Acad.Sci.,1992,660,306-309；Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1993,3,2765-2770)、巯基胆固醇(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20,533-538)、脂肪链，如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras et al.,EMBO J.,1991,10,1111-1118；Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259,327-330；Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75,49-54)、磷脂，如双-十六烷基-rac-甘油或三乙铵l,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651-3654；Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18,3777-3783)、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan etal.,Nucleosides&Nucleotides,1995,14,969-973),、或金刚烷乙酸、棕榈基部分(Mishraet al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229-237)、十八胺或己氨基-羰基-羟胆固醇部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,i,923-937)、生育酚基团(Nishina etal.,Molecular Therapy Nucleic Acids,2015,4,e220；doi:l0.l038/mtna.20l4.72和Nishina et al.,Molecular Therapy,2008,16,734-740)、或GalNAc簇(如WO2014/179620)。
1.缀合部分
缀合部分包括但不限于嵌入剂、报道分子、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物(如GalNAc)、维生素部分、聚乙二醇、硫醚、聚醚、胆固醇、巯基胆固醇、胆酸部分、叶酸、脂质、磷脂、生物素、吩嗪(phenazine)、啡啶(phenanthridine)、蒽醌、金刚烷、吖啶、荧光素、若丹明、香豆素、荧光团和染料。
在某些实施方案中，缀合部分包括活性药物，例如阿司匹林、华法林、苯基丁氮酮、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)-(+)-普拉洛芬、卡洛芬、丹磺酰肌氨酸、2,3,5-三碘苯甲酸、芬戈莫德、氟芬那酸、亚叶酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮杂草(diazepine)、吲哚美辛(indo-methicin)、巴比妥酸盐、头孢菌素、磺胺类药、抗糖尿病药、抗菌药或抗生素。
2.缀合接头
缀合部分通过缀合接头附于小分子或寡核苷酸。在某些小分子或寡聚化合物中，缀合接头是单化学键(即缀合部分经缀合接头通过单键附于小分子或寡核苷酸)。在某些实施方案中，缀合接头包括链结构，如烃链，或诸如乙二醇、核苷或氨基酸单元的重复单元的寡聚物。
在某些实施方案中，缀合接头包含一个或多个选自以下的基团：烷基、氨基、氧代、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚和羟基氨基。在某些这类实施方案中，缀合接头包含选自烷基、氨基、氧代、酰胺和醚基的基团。在某些实施方案中，缀合接头包含选自烷基和酰胺基的基团。在某些实施方案中，缀合接头包含选自烷基和醚基的基团。在一些实施方案中，缀合接头包含至少一个磷部分。在某些实施方案中，缀合接头包含至少一个磷酸基。在某些实施方案中，缀合接头包含至少一个中性连接基团。
在某些实施方案中，包括上述缀合接头的缀合接头是双官能连结部分，例如，本领域已知用于将缀合基团附于小分子或寡聚化合物的那些，如本文所提供的寡核苷酸。一般地，双官能连接部分包含至少2个官能团。一个官能团选择成结合寡聚化合物上的特定位点，而另一个选择成结合缀合基团。用于双官能连接部分的官能团的实例包括但不限于亲电体和亲核体，前者用于与亲核基团反应，后者用于与亲电基团反应。在某些实施方案中，双官能连接部分包含一个或多个选自以下的基团：氨基、羟基、羧酸、巯基、烷基、烯基和炔基。
接头的实例包括但不限于吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-l-羧酸盐(SMCC)和6-氨基己酸(AHEX或AHA)。其他接头包括但不限于取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C2-C10烯基或者取代或未取代的C2-C10炔基，其中优选取代基的非限制性列表包括羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、巯基、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。
在某些实施方案中，缀合接头包含1-10个接头-核苷。在某些实施方案中，这类接头-核苷是修饰的核苷。在某些实施方案中，这类接头-核苷包含经修饰的糖部分。在某些实施方案中，接头-核苷是未修饰的。在某些实施方案中，接头-核苷包含任选受保护的杂环基，其选自：嘌呤、取代的嘌呤、嘧啶或取代的嘧啶。在某些实施方案中，可剪切部分是核苷，其选自：尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、4-N-苯甲酰胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、4-N-苯甲酰-5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤、6-N-苯甲酰腺嘌呤、鸟嘌呤和2-N-异丁酰鸟嘌呤。通常期望接头-核苷在其到达靶组织后从寡聚化合物中切割。因此，接头-核苷通常通过可剪切键彼此连接以及与寡聚化合物剩余部分连接。在某些实施方案中，这类可剪切键是磷酸二酯键。
接头-核苷在本文中不视作寡核苷酸的一部分。因此，在寡聚化合物包含寡核苷酸且寡聚化合物也包含缀合基团的实施方案中，所述寡核苷酸由指定数目或范围的连接的核苷和/或指定百分比的参照核酸的互补物组成，所述缀合基团包含含接头-核苷的缀合物接头，这些接头-核苷不针对寡核苷酸长度计数且不用于确定寡核苷酸对参照核酸的百分比互补性。例如，寡聚化合物可包含(1)由8-30个核苷组成的修饰的寡核苷酸，和(2)包含1-10个接头-核苷的缀合基团，接头-核苷与修饰的寡核苷酸的核苷相邻。这种化合物中连续的相连核苷的总数为30以上。或者，寡聚化合物可包含由8-30个核苷组成的修饰的寡核苷酸，并且不包含缀合基团。这种化合物中连续的相连核苷的总数不大于30。除非另有说明，缀合接头包含不超过10个接头-核苷。在某些实施方案中，缀合接头包含不超过5个接头-核苷。
在某些实施方案中，缀合接头包含不超过3个接头-核苷。在某些实施方案中，缀合接头包含不超过2个接头-核苷。在某些实施方案中，缀合接头包含不超过1个接头-核苷。
在某些实施方案中，期望缀合基团从小分子或寡核苷酸中切割。例如，在某些情况下，特定细胞类型对含特定缀合部分的小分子或寡聚化合物的吸收更好，但一旦化合物被吸收，则期望切割缀合基团以释放未缀合的小分子或寡核苷酸。因此，某些缀合物可以包含一个或多个可剪切部分，通常在缀合接头内。在某些实施方案中，可剪切部分是可剪切键。在某些实施方案中，可剪切部分是包含至少一个可剪切键的原子的组。在某些实施方案中，可剪切部分包含具有1、2、3、4个或4个以上可剪切键的原子的组。在某些实施方案中，可剪切部分在细胞或亚细胞区室如溶酶体内选择性切割。在某些实施方案中，可剪切部分通过内源酶如核酸酶选择性切割。
在某些实施方案中，可剪切键选自：酰胺、酯、醚、磷酸二酯的一个或两个酯、磷酸酯、氨基甲酸酯或二硫化物。在某些实施方案中，可剪切键是磷酸二酯的一个或两个酯。在某些实施方案中，可剪切部分包括磷酸酯或磷酸二酯。在某些实施方案中，可剪切部分是寡核苷酸与缀合部分或缀合基团之间的磷酸酯或磷酸二酯键。
在某些实施方案中，可剪切部分包含一个或多个接头-核苷或者由其组成。在某些这类实施方案中，一个或多个接头-核苷通过可剪切键彼此连接和/或与寡聚化合物剩余部分连接。在某些实施方案中，这类可剪切键是未修饰的磷酸二酯键。在某些实施方案中，可剪切部分是包含2'-脱氧呋喃糖基的核苷，其通过磷酸二酯核苷间连接附于寡核苷酸的3'或5'末端核苷并通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键共价附于缀合接头或缀合部分的剩余部分。在某些这类实施方案中，可剪切部分是包含2’-β-D-脱氧核糖基糖部分的核苷。在某些这类实施方案中，可剪切部分是2'-脱氧腺苷。
3.某些细胞靶向缀合部分
在某些实施方案中，缀合基团包含细胞靶向的缀合部分。在某些实施方案中，缀合基团具有通式：
Figure BDA0003956144350000641
其中n是1-约3，当n为1时，m是0，当n为2或更大时，m是1，j是1或0，并且k是1或0。
在某些实施方案中，n是1，j是1且k是0。在某些实施方案中，n是1，j是0且k是1。在某些实施方案中，n是1，j是1且k是1。在某些实施方案中，n是2，j是1且k是0。在某些实施方案中，n是2，j是1且k是1。在某些实施方案中，n是3，j是1且k是0。在某些实施方案中，n是3，j是0且k是1。在某些实施方案中，n是3，j是1且k是1。
在某些实施方案中，缀合基团包含具有至少一个束缚(tethered)配体的细胞靶向部分。在某些实施方案中，细胞靶向部分包含2个共价附于分支基团的束缚配体。在某些实施方案中，细胞靶向部分包括3个共价附于分支基团的束缚配体。
在某些实施方案中，细胞靶向部分包含分支基团，其包含一个或多个选自以下的基团：烷基、氨基、氧代、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚和羟基氨基。在某些实施方案中，分支基团包含分支脂肪族基团，其包含选自以下的基团：烷基、氨基、氧代、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚和羟基氨基。在某些这类实施方案中，分支脂肪族基团包含选自烷基、氨基、氧代、酰胺和醚的基团。在某些这类实施方案中，分支脂肪族团包含选自烷基、氨基和醚的基团。在某些这类实施方案中，分支脂肪族团包含选自烷基和醚的基团。在某些实施方案中，分支基团包含单或多环体系。
在某些实施方案中，细胞靶向部分的各系绳(tether)包含一个或多个选自以下的基团：烷基、取代烷基、醚、硫醚、二硫化物、氨基、氧代、酰胺、磷酸二酯和聚乙二醇，采用任意组合。在某些实施方案中，各系绳是线性脂肪族基团，其包含一个或多个选自以下的基团：烷基、醚、硫醚、二硫化物、氨基、氧代、酰胺和聚乙二醇，采用任意组合。在某些实施方案中，各系绳是线性脂肪族基团，其包含一个或多个选自以下的基团：烷基、磷酸二酯、醚、氨基、氧代和酰胺，采用任意组合。在某些实施方案中，各系绳是线性脂肪族基团，其包含一个或多个选自以下的基团：烷基、醚、氨基、氧代和酰胺，采用任意组合。在某些实施方案中，各系绳是线性脂肪族基团，其包含一个或多个选自以下的基团：烷基、氨基和氧代，采用任意组合。在某些实施方案中，各系绳是线性脂肪族基团，其包含一个或多个选自以下的基团：烷基和氧代，采用任意组合。在某些实施方案中，各系绳是线性脂肪族基团，其包含一个或多个选自以下的基团：烷基和磷酸二酯，采用任意组合。在某些实施方案中，各系绳包括至少一个磷连接基团或中性连接基团。在某些实施方案中，各系绳包括长度为约6-约20个原子的链。在某些实施方案中，各系绳包括长度为约10-约18个原子的链。在某些实施方案中，各系绳包括长度为约10个原子的链。
在某些实施方案中，细胞靶向部分的各配体具有对靶细胞上至少一类受体的亲和性。在某些实施方案中，各配体具有对哺乳动物肺细胞表面上至少一类受体的亲和性。
在某些实施方案中，细胞靶向部分的各配体是碳水化合物、碳水化合物衍生物、修饰的碳水化合物、多糖、修饰的多糖或多糖衍生物。在某些这类实施方案中，缀合基团包括碳水化合物簇(参见，例如Maier et al.,“Synthesis of Antisense OligonucleotidesConjugated to a Multivalent Carbohydrate Cluster for Cellular Targeting,”Bioconjugate Chemistry,2003,14,18-29或Rensen et al.,“Design and Synthesis ofNovel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting ofLipoproteins to the Hepatic Asiaglycoprotein Receptor,”J.Med.Chem.2004,47,5798-5808，其整体援引加入本文)。在某些这类实施方案中，各配体是氨基糖或硫糖。例如，氨基糖可以选自本领域已知的任意数目的化合物，如唾液酸、α-D-乳糖胺、β-胞壁酸、2-脱氧-2-甲氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-双脱氧-4-甲酰氨-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖和N-磺基-D-葡萄糖胺和N-乙醇酰基-α-神经氨酸。例如，硫糖可以选自5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、甲基2,3,4-三-O-乙酰-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖和乙基3,4,6,7-四-O-乙酰-2-脱氧-l,5-二硫代-α-D-葡糖-庚吡喃糖苷(heptopyranoside)。
在某些实施方案中，本文所述的寡聚化合物或寡核苷酸包含下列任何参考文献中发现的缀合基团：Lee,Carbohydr Res,1978,67,509-514；Connolly et al.,J Biol Chem,1982,257,939-945；Pavia et al.,Int J Pep Protein Res,1983,22,539-548；Lee etal.,Biochem,1984,23,4255-4261；Lee et al.,Glycoconjugate J,1987,4,317-328；Toyokuni et al.,Tetrahedron Lett,1990,31,2673-2676；Biessen et al.,J Med Chem,1995,38,1538-1546；Valentijn et al.,Tetrahedron,1997,53,759-770；Kim et al.,Tetrahedron Lett,1997,38,3487-3490；Lee et al.,Bioconjug Chem,1997,8,762-765；Kato et al.,Glycobiol,2001,11,821-829；Rensen et al.,JBiol Chem,2001,276,37577-37584；Lee et al.,Methods Enzymol,2003,362,38-43；Westerlind et al.,Glycoconj J,2004,21,227-241；Lee et al.,Bioorg Med Chem Lett,2006,16(19),5132-5135；Maierhofer et al.,Bioorg Med Chem,2007,15,7661-7676；Khorev et al.,BioorgMed Chem,2008,16,5216-5231；Lee et al.,Bioorg Med Chem,2011,19,2494-2500；Kornilova etal.,Analyt Biochem,2012,425,43-46；Pujol et al.,Angew Chemie IntEd Engl,2012,51,7445-7448；Biessen et al.,J Med Chem,1995,38,1846-1852；Sliedregt et al.,J Med Chem,1999,42,609-618；Rensen et al.,J Med Chem,2004,47,5798-5808；Rensen et al.,Arterioscler Thromb Vase Biol,2006,26,169-175；vanRossenberg et al.,Gene Ther,2004,11,457-464；Sato et al.,J Am Chem Soc,2004,126,14013-14022；Lee et al.,J Org Chem,2012,77,7564-7571；Biessen et al.,FASEBJ,2000,14,1784-1792；Rajur et al.,Bioconjug Chem,1997,8,935-940；Duff etal.,Methods Enzymol,2000,313,297-321；Maier et al.,Bioconjug Chem,2003,14,18-29；Jayaprakash et al.,Org Lett,2010,12,5410-5413；Manoharan,Antisense NucleicAcid Drug Dev,2002,12,103-128；Merwin et al.,Bioconjug Chem,1994,5,612-620；Tomiya et al.,Bioorg Med Chem,2013,21,5275-5281；国际申请WO1998/013381；WO2011/038356；WO1997/046098；WO2008/098788；WO2004/101619；WO2012/037254；WO2011/120053；WO2011/100131；WO2011/163121；WO2012/177947；WO2013/033230；WO2013/075035；WO2012/083185；WO2012/083046；WO2009/082607；WO2009/134487；WO2010/144740；WO2010/148013；WO1997/020563；WO2010/088537；WO2002/043771；WO2010/129709；WO2012/068187；WO2009/126933；WO2004/024757；WO2010/054406；WO2012/089352；WO2012/089602；WO2013/166121；WO2013/165816；美国专利4,751,219；8,552,163；6,908,903；7,262,177；5,994,517；6,300,319；8,106,022；7,491,805；7,491,805；7,582,744；8,137,695；6,383,812；6,525,031；6,660,720；7,723,509；8,541,548；8,344,125；8,313,772；8,349,308；8,450,467；8,501,930；8,158,601；7,262,177；6,906,182；6,620,916；8,435,491；8,404,862；7,851,615；发表的美国专利申请公开US2011/0097264；US2011/0097265；US2013/0004427；US2005/0164235；US2006/0148740；US2008/0281044；US2010/0240730；US2003/0119724；US2006/0183886；US2008/0206869；US2011/0269814；US2009/0286973；US2011/0207799；US2012/0136042；US2012/0165393；US2008/0281041；US2009/0203135；US2012/0035115；US2012/0095075；US2012/0101148；US2012/0128760；US2012/0157509；US2012/0230938；US2013/0109817；US2013/0121954；US2013/0178512；US2013/0236968；US2011/0123520；US2003/0077829；US2008/0108801；和US2009/0203132。
适体
在一些实施方案中，本文所述特异性结合靶内源蛋白的双官能分子中的第三结构域是适体。
常规方法能用于设计和选择以足够特异性结合靶蛋白的适体。在一些实施方案中，用于本方法目的的适体结合靶蛋白(如受体)。蛋白实现期望效果，如增强细胞对合成双官能分子的摄取，且有足够程度的特异性以避免序列与非靶蛋白在需要特异性结合的条件下的非特异性结合，如在体内试验或治疗性处理情况下、在体外试验情况下的生理条件，在试验于适当严紧情况下进行的条件。
在一些实施方案中，适体结合蛋白或多肽。在一些实施方案中，适体结合内源蛋白或多肽。在一些实施方案中，适体结合外源蛋白或多肽。在一些实施方案中，适体结合重组蛋白或多肽。在一些实施方案中，适体结合人工蛋白或多肽。在一些实施方案中，适体结合融合蛋白或多肽。在一些实施方案中，适体结合细胞受体。在一些实施方案中，适体结合参与内吞作用或胞饮作用的细胞受体。在一些实施方案中，适体结合用于内吞作用或胞饮作用的细胞膜。在一些实施方案中，适体结合酶。在一些实施方案中，适体结合酶调节蛋白。在一些实施方案中，适体结合受体。在一些实施方案中，适体结合信号蛋白或肽。在一些实施方案中，适体结合转录因子。在一些实施方案中，适体结合转录调节物或介体。
在一些实施方案中，适体通过共价键特异性结合靶蛋白。在一些实施方案中，适体通过非共价键特异性结合靶蛋白。在一些实施方案中，适体通过不可逆结合特异性结合靶蛋白。在一些实施方案中，适体通过可逆结合特异性结合靶蛋白。在一些实施方案中，小分子通过与靶蛋白侧链相互作用来特异性结合靶蛋白。在一些实施方案中，适体特异性结合靶内源蛋白上的活性位点或别构位点。
在一些实施方案中，适体特异性结合靶蛋白序列的特定区域。例如，能靶向特定功能区，如区域，包括催化结构域、激酶结构域、蛋白-蛋白相互作用结构域、蛋白-DNA相互作用结构域、蛋白-RNA相互作用结构域、调节结构域、信号结构域、核定位结构域、核输出结构域、跨膜结构域、糖基化位点、修饰位点或磷酸化位点。或者或另外地，能靶向高保守区，如通过对齐来自不同物种的序列并寻找有高度相同性的区域而鉴定的区域，所述物种如灵长类(例如人)和啮齿动物(例如小鼠)。
多个第三结构域
在一些实施方案中，本文所提供合成双官能分子包含第一结构域、一个或多个第二结构域以及一个或多个第三结构域。在一些实施方案中，双官能分子具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多第三结构域。在一些实施方案中，一个或多个第三结构域各自特异性结合靶内源蛋白。
一方面，合成双官能分子包含特异性结合靶RNA序列的第一结构域、多个第二结构域以及多个第三结构域，其中多个第二结构域各自特异性结合靶内源蛋白，其中多个第三结构域各自特异性结合靶内源蛋白以增强细胞对合成双官能分子的摄取。在一些实施方案中，双官能分子还包含缀合第一结构域与多个第二结构域的接头。在一些实施方案中，双官能分子还包含缀合第一结构域与多个第三结构域的接头，缀合第二结构域与多个第三结构域的接头，或其组合。
在一些实施方案中，第一结构域包含小分子或ASO。在一些实施方案中，双官能分子包含多个第二结构域。多个第二结构域各自包含小分子或适体。在一些实施方案中，双官能分子包含多个第三结构域。多个第三结构域各自包含小分子或适体。在一些实施方案中，多个第三结构域各自包含小分子。在一些实施方案中，多个第三结构域各自包含适体。
在一些实施方案中，双官能分子包含多个第二结构域，如2、3、4、5、6、7、8、9或10个第二结构域。在一个实施方案中，双官能分子具有2个第三结构域。在一个实施方案中，双官能分子具有3个第三结构域。在一个实施方案中，双官能分子具有4个第三结构域。在一个实施方案中，双官能分子具有5个第三结构域。在一个实施方案中，双官能分子具有6个第三结构域。在一个实施方案中，双官能分子具有7个第三结构域。在一个实施方案中，双官能分子具有8个第三结构域。在一个实施方案中，双官能分子具有9个第三结构域。在一个实施方案中，双官能分子具有10个第三结构域。在一个实施方案中，双官能分子具有10个以上的第三结构域。
在一些实施方案中，多个第三结构域是相同的结构域。在一些实施方案中，多个第三结构域是不同的结构域。在一些实施方案中，多个第三结构域结合相同的靶标。在一些实施方案中，多个第三结构域结合不同的靶标。
第三结构域的靶蛋白
在一些实施方案中，靶蛋白可以是内源蛋白或多肽。在一些实施方案中，靶蛋白可以是外源蛋白或多肽。在一些实施方案中，靶蛋白可以是重组蛋白或多肽。在一些实施方案中，靶蛋白可以是人工蛋白或多肽。在一些实施方案中，靶蛋白可以是融合蛋白或多肽。在一些实施方案中，靶蛋白可以是酶。在一些实施方案中，靶蛋白可以是受体。在一些实施方案中，靶蛋白可以是信号蛋白或肽。在一些实施方案中，靶蛋白可以是转录因子。在一些实施方案中，靶蛋白可以是转录调节物或介体。
在一些实施方案中，靶蛋白的活性或功能如增强双官能分子的细胞摄取，可通过结合本文所提供双官能分子的第三结构域来调节。在一些实施方案中，靶蛋白参与内吞作用或胞饮作用。
靶蛋白(效应物)功能
在一些实施方案中，双官能分子包含特异性结合靶蛋白的第二结构域。在一些实施方案中，靶蛋白是效应物。在一些实施方案中，靶蛋白是内源蛋白。在其他实施方案中，靶蛋白是胞内蛋白。在另一实施方案中，靶蛋白是内源和胞内蛋白。在一些实施方案中，靶内源蛋白是酶或调节蛋白。在一些实施方案中，第二结构域特异性结合靶内源蛋白上的活性位点或别构位点。
转录：上调
在一些实施方案中，本文所提供双官能分子的第二结构域靶向蛋白，其增加表4中基因的转录。在一些实施方案中，本文所提供双官能分子的第一结构域靶向核糖核酸序列，其增加表4中基因的转录。在一些实施方案中，本文所提供双官能分子的第一结构域靶向核糖核酸序列，其在增加表4中基因的转录的序列近侧或附近。
表4.通过双官能分子增加表达的示例性基因
Figure BDA0003956144350000681
Figure BDA0003956144350000691
在一些实施方案中，基因的转录上调/增加。在一些实施方案中，基因的转录上调。在一些实施方案中，基因的转录增加。
在一些实施方案中，RNA人工定位到细胞的定义基因座，并且定位的RNA通过缀合小分子抑制剂的ASO靶向。本文所提供双官能分子募集蛋白到基因组位点并实现潜在基因表达的变化。在一些实施方案中，特定RNA可区分基因组中的每一个基因。通过靶向这些RNA以募集转录修饰酶，基因附近转录修饰酶的局部浓度增加，从而提高潜在基因的转录(阻遏或激活转录)。在一些实施方案中，通过本文所提供双官能分子募集组蛋白脱乙酰酶到基因，可引起局部组蛋白脱乙酰化和遏制基因表达。
在一些实施方案中，靶蛋白可以是酶。在一些实施方案中，靶蛋白可以是受体。在一些实施方案中，靶蛋白可以是信号蛋白或肽。在一些实施方案中，靶蛋白可以是转录因子。在一些实施方案中，靶蛋白可以是转录调节物或介体。在一些实施方案中，靶蛋白可以是参与或调节转录后修饰的蛋白或肽。在一些实施方案中，靶蛋白可以是参与或调节翻译后修饰的蛋白或肽。在一些实施方案中，靶蛋白可以是结合RNA的蛋白或肽。
在一些实施方案中，靶蛋白包括转录修饰酶。在一些实施方案中，靶蛋白包括组蛋白脱乙酰酶。在一些实施方案中，靶蛋白包括组蛋白脱甲基酶。在一些实施方案中，靶蛋白包括转录激活因子。在一些实施方案中，靶蛋白包括转录抑制因子。在一些实施方案中，靶蛋白是转录修饰酶。在一些实施方案中，靶蛋白是组蛋白脱乙酰酶。在一些实施方案中，靶蛋白是组蛋白脱甲基酶。在一些实施方案中，靶蛋白是转录激活因子。在一些实施方案中，靶蛋白是转录抑制因子。
在一些实施方案中，第一结构域通过结合靶RNA或基因序列而募集本文所述双官能分子到靶位点，其中第二结构域与靶蛋白相互作用并增加基因的转录。在一些实施方案中，靶蛋白通过结合本文所提供双官能分子的第二结构域而募集本文所述双官能分子，其中第一结构域特异性结合靶RNA序列并增加基因的转录。在一些实施方案中，靶蛋白在与本文所提供双官能分子的第二结构域相互作用后，进一步募集参与调节转录的蛋白或肽或者通过与蛋白或肽相互作用来增加转录。
药物组合物
在一些方面，本文所述双官能分子包括药物组合物或含本文所述双官能分子的组合物。
在一些实施方案中，药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂。药物组合物可以是无菌和/或无热原的。在配制和/或生产药剂方面的一般考虑，可参见例如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy 21st ed.,Lippincott Williams&Wilkins,2005(援引加入本文)。
尽管本文所提供药物组合物的描述主要针对适合给予人的药物组合物，技术人员应理解这些组合物一般适合给予任何其他动物，如非人动物，例如非人哺乳动物。改良适合给予人的药物组合物以提供适合给予多种动物的组合物是熟知的，并且普通熟练的兽医药理学家能设计和/或进行这类改良，仅需要普通(如果有)实验。给予药物组合物的受试者考虑包括但不限于：人和/或其他灵长类；哺乳动物，包括商业相关哺乳动物，例如宠物和家畜，如牛、猪、马、羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或禽类，包括商业相关禽类，如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
本文所述药物组合物的制剂可通过药物学领域已知或之后开发的任何方法制备。一般地，这类制备方法包括这样的步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他助剂相联，随后若必需和/或期望，将产品分开、成型和/或包装。
术语“药物组合物”也意在公开药物组合物内包含的本文所述双官能分子，能用于治疗人或动物体。其因而意味着等同于“本文所述双官能分子用于治疗”。
递送
例如，本文所述药物组合物能配制成包含药物赋形剂。药物载体可以是膜、脂质双层和/或聚合物载体，例如脂质体或颗粒如纳米粒子，例如脂质纳米粒子，并通过已知方法递送给需要的受试者(例如，人或非人农业动物或家畜，如牛、狗、猫、马、家禽)。这类方法包括但不限于转染(例如脂质介导、阳离子聚合物、磷酸钙)、电穿孔或其他膜破裂方法(例如核转染)、融合和病毒递送(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、AAV)。
在一些方面，所述方法包括递送本文所述双官能分子、包含本文所述双官能分子的组合物或者包含本文所述双官能分子的药物组合物，给需要的受试者。
递送方法
将本文所述双官能分子、包含本文所述双官能分子的组合物或者包含本文所述双官能分子的药物组合物递送给细胞、组织或受试者的方法，包括向细胞、组织或受试者给药本文所述双官能分子、包含本文所述双官能分子的组合物或者包含本文所述双官能分子的药物组合物。
在一些实施方案中，本文所述双官能分子、包含本文所述双官能分子的组合物或者包含本文所述双官能分子的药物组合物经肠胃外给药。在一些实施方案中，本文所述双官能分子、包含本文所述双官能分子的组合物或者包含本文所述双官能分子的药物组合物经注射给药。给药可以是全身给药或局部给药。在一些实施方案中，本文所述双官能分子、包含本文所述双官能分子的组合物或者包含本文所述双官能分子的药物组合物经静脉内、动脉内、腹膜内、皮内、颅内、鞘内、淋巴内、皮下或肌肉内给药。
在一些实施方案中，细胞是真核细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是动物细胞。
使用双官能分子的方法
增加转录的方法
在一些实施方案中，本文所提供双官能分子的第二结构域靶向蛋白，其增加表4的基因的转录。
在一些实施方案中，本文所提供双官能分子的第一结构域靶向核糖核酸序列，其增加表4的基因转录。
在一些实施方案中，基因的转录上调/增加。在一些实施方案中，基因的转录上调。在一些实施方案中，基因的转录增加。
一方面，增加细胞中基因的转录的方法包括向细胞给予合成双官能分子，其包含第一结构域、第二结构域以及接头，所述第一结构域包含特异性结合靶核糖核酸序列的反义寡核苷酸(ASO)，所述第二结构域特异性结合靶内源蛋白，所述接头缀合第一结构域与第二结构域，其中所述靶内源蛋白增加细胞中的基因的转录。
在一些实施方案中，第二结构域包含小分子或适体。
在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，人细胞感染有病毒。在一些实施方案中，细胞是癌细胞。在一些实施方案中，细胞是细菌细胞。
在一些实施方案中，第一结构域通过接头分子缀合第二结构域。
在一些实施方案中，第一结构域是反义寡核苷酸。
在一些实施方案中，第一结构域是小分子。在一些实施方案中，小分子选自表2。在一些实施方案中，第二结构域是小分子。在一些实施方案中，小分子选自表3。
在一些实施方案中，第二结构域是适体。在一些实施方案中，适体选自表3。
在一些实施方案中，合成双官能分子还包含缀合第一结构域的第三结构域、接头、第二结构域，或其组合。在一些实施方案中，第三结构域包含小分子。在一些实施方案中，第三结构域增强细胞对合成双官能分子的摄取。
在一些实施方案中，合成双官能分子还包含一个或多个第二结构域。在一些实施方案中，一个或多个第二结构域各自特异性结合单一靶内源蛋白。
一方面，增加细胞中基因的转录的方法向细胞给予合成双官能分子，其包含第一结构域、多个第二结构域以及接头，所述第一结构域特异性结合靶RNA序列，所述多个第二结构域特异性结合单一靶内源蛋白，所述接头缀合第一结构域与多个第二结构域，其中所述靶内源蛋白增加细胞中的基因的转录。
在一些实施方案中，第一结构域包含小分子或反义寡核苷酸(ASO)。在一些实施方案中，多个第二结构域各自包含小分子或适体。在一些实施方案中，多个第二结构域各自包含小分子。在一些实施方案中，多个第二结构域是2、3、4或5个第二结构域。
在一些实施方案中，本文所提供合成双官能分子还包含第三结构域，其缀合第一结构域、接头、第二结构域或其组合。在一些实施方案中，第三结构域包含小分子。在一些实施方案中，第三结构域增强细胞对合成双官能分子的摄取。
在一些实施方案中，靶内源蛋白是胞内蛋白。在一些实施方案中，靶内源蛋白是酶或调节蛋白。在一些实施方案中，第二结构域特异性结合靶内源蛋白上的活性位点或别构位点。
本文所用术语“转录”指基于DNA的基因表达的数个步骤中的第一个，其中特定DNA区段通过RNA聚合酶拷贝成RNA(特别是mRNA)。在一些实施方案中，例如在转录期间，DNA序列由RNA聚合酶读取，其生成互补的反平行的RNA链，称为初级转录物。本文所提供方法可在起始步骤、启动子解脱步骤、延伸步骤或终止步骤中增加转录。
分子增加可通过本领域技术人员已知的常规试验测量，包括但不限于测量RNA水平，通过例如定量实时RT-PCR(qRT-PCR)，RNA FISH，测量蛋白水平，通过例如免疫印迹。
在一些实施方案中，基因的转录上调/增加。在一些实施方案中，基因的转录上调。在一些实施方案中，基因的转录增加。
在一些实施方案中，RNA人工定位到细胞的定义基因座，并且定位的RNA通过缀合小分子抑制剂的ASO靶向。抑制剂募集蛋白到基因组位点并实现潜在基因表达的变化。在一些实施方案中，特定RNA可区分基因组中的每一个基因。通过靶向这些RNA以募集转录修饰酶，基因附近转录修饰酶的局部浓度增加，从而提高潜在基因转录(阻遏或激活转录)。在一些实施方案中，募集组蛋白脱乙酰酶到基因可引起局部组蛋白脱乙酰化和遏制基因表达。
在一些实施方案中，基因的转录相较未处理对照细胞、组织或受试者，或相较同一类型细胞、组织或受试者在用本文所述合成双官能分子处理前的对应活性，如通过任意标准技术测量的，上调或增加至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％、至少1000％、至少2000％、至少3000％、至少4000％、至少5000％、至少6000％、至少7000％、至少8000％、至少9000％、至少10000％、至少20000％、至少30000％、至少40000％、至少50000％、至少60000％、至少70000％、至少80000％、至少90000％或至少100000％。在一些实施方案中，基因的转录相较未处理对照细胞、组织或受试者，或相较同一类型细胞、组织或受试者在用本文所述合成双官能分子处理前的对应活性，如通过任意标准技术测量的，上调或增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍、至少1000倍、至少2000倍、至少3000倍、至少4000倍、至少5000倍、至少6000倍、至少7000倍、至少8000倍、至少9000倍或至少10000倍。
治疗方法
本文所述合成双官能分子可以用于治疗有需要的受试者的方法。例如，有需要的受试者患有疾病或病况。在一些实施方案中，疾病是癌症、代谢病、炎性疾病、心血管疾病、感染性疾病、遗传病或神经系统疾病(neurological disease)。在一些实施方案中，疾病是癌症且其中靶基因是致癌基因。在一些实施方案中，转录由本文所提供双官能分子或包含本文所提供双官能分子的组合物增加的基因与表5的疾病相关联。
表5.用双官能分子治疗的示例性疾病(和相关基因)
Figure BDA0003956144350000731
Figure BDA0003956144350000741
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在一些方面，治疗有需要的受试者的方法包括向受试者给药本文所提供双官能分子、或包含本文所提供双官能分子的组合物、或包含本文所提供双官能分子的药物组合物，其中给药有效治疗受试者。
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人。
在一些实施方案中，所述方法还包括联合给药第二治疗剂或第二疗法以及本文所提供双官能分子。在一些实施方案中，所述方法包括给药包含本文所提供双官能分子的第一组合物和包含第二治疗剂或第二疗法的第二组合物。在一些实施方案中，所述方法包括给药包含本文所提供双官能分子的第一药物组合物和包含第二治疗剂或第二疗法的第二药物组合物。在一些实施方案中，包含本文所提供双官能分子的第一组合物或第一药物组合物以及包含第二治疗剂或第二疗法的第二组合物或第二药物组合物，同时或分别或连续给予有需要的受试者。
术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”等在本文中一般用于指获得期望药理和/或生理效果。所述效果在防止或部分防止疾病、症状或其病况方面是可以是预防性的，和/或在部分或完全治愈疾病、病况、症状或疾病引起的副作用方面可以是治疗性的。本文所用术语“治疗”涵盖哺乳动物尤其是人中的任何疾病治疗，并且包括：(a)防止疾病在易受疾病影响，但尚未诊断患有该疾病的受试者中出现；(b)抑制疾病，即停滞其发展；或(c)缓解疾病，即减轻或改善疾病和/或其症状或病况。术语“预防”在本文中用于指防止或部分防止疾病或病况而采用的措施或多种措施。
“治疗或预防疾病或病况”指改善与疾病相关、在其出现之前或之后的任何病况或征兆或症状。相较等同未治疗对照，这类预防的降低程度为至少3％、5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％或100％，如通过任意标准技术所测量。治疗疾病或病况的患者是医师诊断为有这类疾病或病况的患者。诊断可以是任何合适方式。疾病或病况发展得到预防的患者可以接受或未接受这种诊断。本领域技术人员应理解这些患者可经历上述相同的标准测试或可以无需检查而鉴定为高风险，这归因于存在一个或多个风险因子(如家族史或遗传易感性)。
疾病和病症
在一些实施方案中，要通过本文所提供双官能分子或者包含本文所提供双官能分子的组合物或药物组合物治疗的受试者的示例性疾病包括但不限于癌症、代谢病、炎性疾病、心血管疾病、感染性疾病、遗传病或神经系统疾病。
例如，癌症的实例包括但不限于恶性、恶化前或良性癌。用所公开方法待治疗的癌症包括例如实体瘤、淋巴瘤或白血病。在一个实施方案中，癌症可以是例如脑瘤(如恶性、恶化前或良性脑瘤，例如胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤、成神经管细胞瘤或周围神经外胚层瘤)、癌(如胆囊癌、支气管癌、基底细胞癌、腺癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、大细胞未分化癌、腺瘤、囊腺瘤等)、基底细胞癌、畸胎瘤、视网膜母细胞瘤、脉络膜黑色素瘤、精原细胞瘤、肉瘤(如尤文肉瘤、横纹肌肉瘤、颅咽管瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、平滑肌肉瘤、Askin瘤、淋巴肉瘤、神经肉瘤、卡波西肉瘤、皮肤纤维肉瘤、血管肉瘤等)、浆细胞瘤、头颈肿瘤(如口腔、喉、鼻咽、食管等)、肝肿瘤、肾肿瘤、肾细胞癌、鳞状细胞癌、子宫肿瘤、骨肿瘤、前列腺肿瘤、乳腺肿瘤，包括但不限于Her2-和/或ER-和/或PR-的乳腺肿瘤、膀胱肿瘤、胰腺肿瘤、子宫内膜肿瘤、鳞状细胞癌、胃肿瘤、神经胶质瘤、结直肠肿瘤、睾丸肿瘤、结肠肿瘤、直肠肿瘤、卵巢肿瘤、宫颈癌、眼部肿瘤、中枢神经系统肿瘤(如原发性CNS淋巴瘤、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤等)、甲状腺肿瘤、肺肿瘤(如非小细胞肺癌(NSCLC)或小细胞肺癌)、白血病或淋巴瘤(如皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、非皮肤外周T细胞淋巴瘤、与人T细胞淋巴营养病毒(HTLV)相关的淋巴瘤如成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、B细胞淋巴瘤、急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、成人T细胞白血病淋巴瘤、急性髓系白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)或肝细胞癌等)、多发性骨髓瘤、皮肤肿瘤(如基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑素瘤如恶性黑素瘤、皮肤黑色素瘤或眼内黑色素瘤、隆突性皮肤纤维肉瘤、Merkel细胞癌或卡波西肉瘤)、妇科肿瘤(如子宫肉瘤、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌等)、霍奇金病、小肠癌、内分泌系统癌(如甲状腺、甲状旁腺或肾上腺的癌等)、间皮瘤、尿道癌、阴茎癌、戈林综合症相关肿瘤(如髓母细胞瘤、脑膜瘤等)、未知来源的肿瘤；或其任何转移。在一些实施方案中，癌症是肺肿瘤、乳腺肿瘤、结肠肿瘤、结直肠肿瘤、头颈肿瘤、肝肿瘤、前列腺肿瘤、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、卵巢肿瘤或甲状腺肿瘤；或其任何转移。在一些其他实施方案中，癌症是子宫内膜肿瘤、膀胱肿瘤、多发性骨髓瘤、黑素瘤、肾肿瘤、肉瘤、宫颈癌、白血病和神经母细胞瘤。
又例如，代谢病的实例包括但不限于糖尿病、代谢综合征、肥胖症、高脂血症、高胆固醇、动脉硬化、高血压、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝病、肝脂肪变性和其任意组合。
例如，炎性病症部分或完全由肥胖症、代谢综合征、免疫病症、肿瘤、感染性疾病、化学剂、炎性肠道病症、再灌注损伤、坏死或其组合引起。在一些实施方案中，炎性病症是自身免疫病症、过敏、白细胞缺乏、移植物抗宿主疾病、组织移植排斥或其组合。在一些实施方案中，炎性病症是细菌感染、原虫感染、原虫感染、病毒感染、真菌感染或其组合。在一些实施方案中，炎性病症是急性播散性脑脊髓炎；艾迪生病；强直性脊柱炎；抗磷脂抗体综合征；自身免疫性溶血性贫血；自身免疫性肝炎；自身免疫性内耳病；大疱性类天疱疮；恰加斯病；慢性阻塞性肺疾病；乳糜泄；皮肌炎；1型糖尿病；2型糖尿病；子宫内膜异位症；肺出血肾炎综合症；格雷夫斯病；吉兰-巴雷综合征；桥本病；特发性血小板减少性紫癜；间质性膀胱炎；全身性红斑狼疮(SLE)；代谢综合征、多发性硬化；重症肌无力；心肌炎、发作性睡病；肥胖症；寻常型天疱疮；恶性贫血；多发性肌炎；原发性胆汁性肝硬化；类风湿性关节炎；精神分裂症；硬皮病；
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综合征；脉管炎；白癜风；韦格纳肉芽肿；过敏性鼻炎；前列腺癌；非小细胞肺癌；卵巢癌；乳腺癌；黑素瘤；胃癌；结直肠癌；脑癌；转移性骨病；胰腺癌；淋巴瘤；鼻息肉；胃肠癌；溃疡性结肠炎；克罗恩病；胶原性结肠炎；淋巴细胞性结肠炎；缺血性结肠炎；改道性结肠炎；白塞综合征；感染性结肠炎；未确定型结肠炎；炎症性肝病、内毒素休克、类风湿性脊椎炎、强直性脊柱炎、痛风性关节炎、风湿性多肌痛、阿尔茨海默病、帕金森病、癫痫、AIDS痴呆、哮喘、成人呼吸窘迫综合征、支气管炎、囊性纤维化、急性白细胞介导肺损伤、远端直肠炎、韦格纳肉芽肿、纤维肌痛、支气管炎、囊性纤维化、葡萄膜炎、结膜炎、银屑病、湿疹、皮炎、平滑肌增殖障碍、脑膜炎、带状疱疹、脑炎、肾炎、结核病、视网膜炎、特应性皮炎、胰腺炎、牙周龈炎、凝固性坏死、液化性坏死、纤维素样坏死、超急性移植排斥反应、急性移植排斥、慢性移植排斥、急性移植物抗宿主病、慢性移植物抗宿主病、腹主动脉瘤(AAA)；或其组合。
又例如，神经系统疾病的实例包括但不限于：奥斯科格综合征、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化(卢伽雷氏病)、失语症、贝耳氏麻痹、克雅氏症、脑血管疾病、多毛畸形综合征、癫痫和其他严重的癫痫病症、齿状核红核苍白球路易体萎缩症、脆性X综合征、伊藤色素减少症、朱伯特综合症、肯尼迪病、马查多-约瑟夫病、偏头痛、Moebius综合征、强直性肌营养不良、神经肌肉障碍、吉兰-巴雷综合征、肌营养不良、神经肿瘤病症、神经纤维瘤病、神经免疫病症、多发性硬化、疼痛、小儿神经病学、孤独症、阅读障碍、神经耳科病症、梅尼埃病、帕金森病和运动障碍、苯丙酮尿症、鲁宾斯坦-泰比综合征、睡眠障碍、脊髓小脑性共济失调I、史-莱-奥综合征、索托斯综合征、脊髓延髓萎缩、1型显性小脑共济失调、图雷特综合征、结节性硬化症和威廉氏综合征。
本文所用术语“心血管疾病”指心脏和血管的病症，包括动脉、静脉、小动脉、小静脉和毛细血管的病症。心血管疾病的非限制性实例包括冠状动脉疾病、脑卒中(脑血管障碍)、周围血管疾病、心肌梗死和心绞痛、脑梗死、脑出血、心脏肥大、动脉硬化和心力衰竭。
本文所用术语“感染性疾病”指由生物体如朊病毒、细菌、病毒、真菌和寄生虫导致的任何疾病。感染性疾病的实例包括但不限于：细菌导致的脓毒性咽喉炎、尿路感染或结核病，病毒导致的普通感冒、麻疹、水痘或AIDS，真菌导致的皮肤疾病如癣和脚癣、肺感染或神经系统感染，以及寄生虫导致的疟疾。可以导致感染性疾病的病毒的实例包括但不限于：腺相关病毒、爱知病毒、澳大利亚蝙蝠狂犬病毒、BK多瘤病毒、版纳病毒、巴马森林病毒、布尼奥罗病毒、拉克鲁斯布尼亚病毒、雪兔布尼亚病毒、Cercopithecine疱疹病毒、金迪普拉病毒、基孔肯亚病毒、冠状病毒、Cosavirus A、牛痘病毒、柯萨奇病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、登革病毒、多里病毒、Dugbe病毒、Duvenhage病毒、东方马脑炎病毒、埃博拉病毒、艾柯病毒、脑心肌炎病毒、EB病毒、欧洲蝙蝠狂犬病毒、GB病毒C/庚型肝炎病毒、汉坦病毒、亨德拉病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、马痘病毒、人腺病毒、人星状病毒、人冠状病毒、人巨细胞病毒、人肠道病毒68、70、人疱疹病毒1、人疱疹病毒2、人疱疹病毒6、人疱疹病毒7、人疱疹病毒8、人免疫缺陷病毒、人乳头状癌病毒1、人乳头状癌病毒2、人乳头状癌病毒16,18、人副流感病毒、人细小病毒B19、人呼吸道合胞病毒、人鼻病毒、人SARS冠状病毒、人泡沫逆转录病毒、人T淋巴细胞病毒、人凸隆病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、伊斯法罕病毒、JC多瘤病毒、日本脑炎病毒、Junin沙粒病毒、KI多瘤病毒、昆津病毒、拉各斯蝙蝠病毒、维多利亚湖马尔堡病毒、Langat病毒、拉沙病毒、Lordsdale病毒、羊跳跃病病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、马丘波病毒、马雅罗病毒、MERS冠状病毒、麻疹病毒、门戈脑心肌炎病毒、梅克尔细胞多瘤病毒、莫科拉病毒、传染性软疣病毒、猴痘病毒、腮腺炎病毒、墨累山谷脑炎病毒、纽约病毒、尼帕病毒、诺沃克病毒、诺如病毒、阿良良病毒、羊口疮病毒、Oropouche病毒、Pichinde病毒、脊髓灰质炎病毒、Punta toro白蛉病毒、普马拉病毒、狂犬病病毒、裂谷热病毒、Rosavirus A、罗斯河病毒、轮状病毒A、轮状病毒B、轮状病毒C、风疹病毒、鹭山病毒、Salivirus A、白蛉热西西里病毒、扎幌病毒、塞姆利基森林病毒、汉城病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒2、猿猴泡沫病毒、猿猴病毒5、辛德比斯病毒、南安普敦病毒、圣路易斯脑炎病毒、蜱传波瓦桑病毒、Torqueteno病毒、托斯卡纳病毒、尤库尼米病毒、牛痘病毒、水痘带状疱疹病毒、天花病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、水疱性口炎病毒、西方马脑炎病毒、WU多瘤病毒、西尼罗病毒、亚巴猴肿瘤病毒、亚巴样病病毒、黄热病病毒和寨卡病毒。寄生虫导致的感染性疾病的实例包括但不限于：棘阿米巴感染、棘阿米巴角膜炎感染、非洲睡眠病(非洲锥虫病)、泡型包虫病(包虫病、棘球蚴病)、阿米巴病(溶组织内阿米巴感染)、美洲锥虫病(恰加斯病)、钩虫病(钩虫)、血管圆线虫病(血管圆线虫感染)、异尖线虫病(异尖线虫感染、Pseudoterranova感染)、蛔虫病(蛔虫感染、肠道蛔虫)、巴贝斯虫病(巴贝斯虫感染)、小袋纤毛虫病(小袋纤毛虫感染)、Balamuthia、Baylisascariasis(Baylisascaris感染、浣熊蛔虫)、床虱、血吸虫(血吸虫病)、人芽囊原虫感染、体虱感染(虱病)、毛细线虫病(毛细线虫感染)、尾蚴性皮炎(游泳者痒疹)、恰加斯病(美洲锥虫病)、迈氏唇鞭毛虫感染(非致病性[无害]肠道原虫)、华支睾吸虫病(华支睾吸虫感染)、CLM(皮肤幼虫移行症、钩虫病、钩虫)、“蟹(Crabs)”(阴虱)、隐孢子虫病(隐孢子虫感染)、皮肤幼虫移行症(CLM、钩虫病、钩虫)、圆孢球虫病(环孢子虫感染)、囊尾幼虫病(神经囊尾蚴病)、囊等孢虫感染(Cystoisosporiasis)，之前的等孢子球虫感染、脆弱双核阿米巴感染、裂头绦虫病(裂头绦虫感染)、犬复孔绦虫感染(狗或猫绦虫感染)、恶丝虫病(恶丝虫感染)、DPDx、麦地那龙线虫病(几内亚线虫病)、狗绦虫病(犬复孔绦虫感染)、包虫病(囊性、泡状棘球蚴病)、象皮肿(丝虫病、淋巴丝虫病)、微小内蜒阿米巴感染(非致病性[无害]肠道原虫)、结肠内阿米巴感染(非致病性[无害]肠道原虫)、迪斯帕内阿米巴感染(非致病性[无害]肠道原虫)、哈氏内阿米巴感染(非致病性[无害]肠道原虫)、溶组织内阿米巴感染(阿米巴病)、波列基内阿米巴、蛲虫病(蛲虫感染)、片形吸虫病(片吸虫感染)、姜片虫病(姜片虫感染)、丝虫病(淋巴丝虫病、象皮肿)、贾第虫病(贾第虫感染)、颚口线虫病(颚口线虫感染)、几内亚线虫病(麦地那龙线虫病)、头虱感染(虱病)、异形吸虫病(异形吸虫感染)、钩虫感染、人、钩虫感染、动物感染性疾病(钩虫病、皮肤幼虫移行症[CLM])、包虫病(囊性、泡状棘球蚴病)、膜壳绦虫病(膜壳绦虫感染)、肠道蛔虫(蛔虫病、蛔虫感染)、布氏嗜碘阿米巴感染(非致病性[无害]肠道原虫)、等孢子球虫感染(参见囊等孢虫感染)、黑热病(利什曼病、利什曼原虫感染)、角膜炎(棘阿米巴感染)、利什曼病(黑热病、利什曼原虫感染)、虱子感染(身体、头或阴虱、虱病、Pthiriasis)、肝吸虫(华支睾吸虫病、后睾吸虫病、片形吸虫病)、罗阿丝虫病(罗阿丝虫感染)、淋巴丝虫病(丝虫病、象皮肿)、疟疾(疟原虫感染)、微孢子虫病(微孢子虫感染)、螨感染(疥疮)、蝇蛆病、纳氏虫感染、神经囊尾蚴病(囊尾幼虫病)、眼幼虫移行症(弓蛔虫病、弓蛔虫感染、内脏幼虫移行症)、盘尾丝虫病(河盲症)、后睾吸虫病(后睾吸虫感染)、肺吸虫病(并殖吸虫感染)、虱病(头虱或体虱感染)、Pthiriasis(阴虱感染)、蛲虫感染(蛲虫病)、疟原虫感染(疟疾)、肺孢子菌肺炎、Pseudoterranova感染(异尖线虫病、异尖线虫感染)、阴虱感染(“蟹”、Pthiriasis)、浣熊蛔虫感染(Baylisascariasis、Baylisascaris感染)、河盲症(盘尾丝虫病)、Sappinia、肉孢子虫病(肉孢子虫感染)、疥疮、血吸虫病(裂体吸虫病)、睡眠病(非洲锥虫病；非洲睡眠病)、土源性蠕虫病、类圆线虫病(类圆线虫感染)、游泳者痒疹(尾蚴性皮炎)、绦虫病(条虫感染、绦虫感染)、绦虫感染(绦虫病、条虫感染)、弓蛔虫病(弓蛔虫感染、眼幼虫移行症、内脏幼虫移行症)、弓形体病(弓形体感染)、旋毛虫病(毛线虫病)、毛线虫病(旋毛虫病)、滴虫病(滴虫感染)、鞭虫病(鞭虫感染、鞭虫属感染)、非洲锥虫病(非洲睡眠病、睡眠病)、美洲锥虫病(恰加斯病)、内脏幼虫移行症(弓蛔虫病、弓蛔虫感染、眼幼虫移行症)、鞭虫感染(鞭虫病、鞭虫属感染)、人畜共患疾病(疾病从动物扩散到人)和人畜共患钩虫感染(钩虫病、皮肤幼虫移行症[CLM])。真菌导致的感染性疾病的实例包括但不限于：Apergillosis、Balsomycosis、念珠菌病、Cadidia auris、球孢子菌病、新型隐球菌感染、C gattii感染、真菌性眼部感染、真菌性指甲感染、组织胞浆菌病、毛霉菌病、足分支菌病、Pneuomcystis肺炎、癣、孢子丝菌病、cyrpococcosis和Talaromycosis。能导致感染性疾病的细菌的实例包括但不限于鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、放线杆菌属(Actinobacillus sp.)、放线菌(Actinomycetes)、放线菌属(Actinomyces sp.)(如衣氏放线菌(Actinomyces israelii)和内氏放线菌(Actinomyces naeslundii))、气单胞菌属(Aeromonas sp.)(如嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、凡隆气单胞菌温和生物型(Aeromonas veronii biovarsobria)(温和气单胞菌(Aeromonas sobria))和豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)、边缘无浆体木糖氧化产碱菌(Anaplasmamarginale Alcaligenes xylosoxidans)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)(如炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus))、拟杆菌属(Bacteroides sp.)(如脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis))、巴尔通氏体属(Bartonella sp.)(如杆菌样巴尔通体(Bartonella bacilliformis)和汉氏巴尔通体(Bartonella henselae)、双歧杆菌属(Bifidobacterium sp.)、鲍特菌属(Bordetella sp.)(如百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)、副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)和支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica))、包柔氏螺旋体属(Borrelia sp.)(如回归热包柔氏螺旋体(Borrelia recurrentis)和伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi))、布鲁氏菌属(Brucella sp.)(如流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、犬布鲁氏菌(Brucella canis)、羊布鲁氏菌(Brucella melintensis)和猪布鲁氏菌(Brucella suis))、伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)(如假鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)和洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia))、弯曲杆菌属(Campylobacter sp.)(如空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)和胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus))、嗜二氧化碳噬细胞菌属(Capnocytophaga sp.)、人心杆菌(Cardiobacterium hominis)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydophila psittaci)、柠檬酸杆菌属伯氏立克次氏体(Citrobacter sp.Coxiellaburnetii)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)(如白喉杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、杰氏棒杆菌(Corynebacterium jeikeum)和棒状杆菌(Corynebacterium))、梭菌属(Clostridium sp.)(如产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、艰难梭菌(Clostridium dificile)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)和破伤风梭菌(Clostridium tetani))、侵蚀艾肯菌(Eikenella corrodens)、肠杆菌属(Enterobactersp.)(如产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、集聚肠杆菌(Enterobacteragglomerans)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)和大肠杆菌(Escherichia coli)，包括伺机性大肠杆菌(opportunistic Escherichia coli)如产肠毒素大肠杆菌(E.coli)、肠侵袭性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠聚集性大肠杆菌和尿道致病性大肠杆菌)、肠球菌属(Enterococcus sp.)(如粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和屎肠球菌(Enterococcus faecium))、埃立克体属(Ehrlichia sp.)(如查菲埃立克体(Ehrlichia chafeensia)和犬埃立克体(Ehrlichia canis))、絮状表皮癣菌(Epidermophyton floccosum)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、真杆菌属(Eubacterium sp.)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、阴道加德菌(Gardnerella vaginalis)、麻疹挛生球菌(Gemella morbillorum)、嗜血杆菌属(Haemophilus sp.)(如流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、埃及嗜血杆菌(Haemophilusaegyptius)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、溶血嗜血杆菌(Haemophilus haemolyticus)和副溶血嗜血杆菌(Haemophilus parahaemolyticus)、螺杆菌属(Helicobacter sp.)(如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、同性恋螺杆菌(Helicobacter cinaedi)和芬纳尔螺杆菌(Helicobacter fennelliae))、金氏杆菌(Kingella kingii)、克雷伯菌属(Klebsiella sp.)(如肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、肉芽肿克雷伯菌(Klebsiella granulomatis)和产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca))、乳杆菌属(Lactobacillus sp.)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、肾脏钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)、肾脏钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、消化链球菌属(Peptostreptococcus sp.)、溶血性曼氏杆菌(Mannheimia hemolytica)、犬小孢子菌(Microsporum canis)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、摩根氏菌属(Morganellasp.)、动弯杆菌属(Mobiluncus sp.)、微球菌属(Micrococcussp.)、分支杆菌属(Mycobacterium sp.)(如麻风分支杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、副结核分支杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)、胞内分支杆菌(Mycobacterium intracellulare)、鸟分支杆菌(Mycobacterium avium)、牛分支杆菌(MMycobacterium bovis)和海鱼分支杆菌(Mycobacterium marinum))、支原体(Mycoplasm sp.)(如肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、人支原体(Mycoplasmahominis)和生殖支原体(Mycoplasma genitalium))、诺卡氏菌属(Nocardia sp.)(如星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)、盖尔森基兴诺卡氏菌(Nocardia cyriacigeorgica)和巴西诺卡氏菌(Nocardia brasiliensis))、奈瑟氏菌属(Neisseria sp.)(如淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)和脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis))、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、正圆瓶形酵母(Pityrosporum orbiculare)(糠秕马拉色菌(Malassezia furfur))、类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)、普氏菌属(Prevotella sp.)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas sp.)、产黑普氏菌(Prevotellamelaninogenica)、变形杆菌属(Proteus sp.)(如普通变形杆菌(Proteus vulgaris)和奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、普罗维登斯菌属(Providencia sp.)(如产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)和斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii))、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、马红球菌(Rhodococcus equi)、立克次氏体(Rickettsia sp.)(如立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)、小株立克次体(Rickettsia akari)和普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)、恙虫病东方体(Orientiatsutsugamushi)(之前：恙虫病立克次体(Rickettsia tsutsugamushi)和斑疹伤寒立克次体(Rickettsia typhi))、红球菌属(Rhodococcus sp.)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、沙门氏菌属(Salmonella sp.)(如肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerasuis)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌属(Serratia sp.)(如粘质沙雷氏菌(Serratiamarcesans)和液化沙雷氏菌(Serratia liquifaciens))、志贺氏菌属(Shigella sp.)(如痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)和宋内志贺氏菌(Shigella sonnei))、葡萄球菌属(Staphylococcussp.)(如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus hemolyticus)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、链球菌属(Streptococcus sp.)(如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(例如耐氯霉素4血清型肺炎链球菌(chloramphenicol-resistant serotype 4Streptococcus pneumoniae)、耐壮观霉素6B血清型肺炎链球菌(spectinomycin-resistant serotype 6B Streptococcus pneumoniae)、耐链霉素9V血清型肺炎链球菌(streptomycin-resistant serotype 9V Streptococcus pneumoniae)、耐红霉素14血清型肺炎链球菌(erythromycin-resistant serotype 14Streptococcuspneumoniae)、耐奥普托欣14血清型肺炎链球菌(optochin-resistant serotype14Streptococcus pneumoniae)、耐利福平18C血清型肺炎链球菌(rifampicin-resistantserotype 18C Streptococcus pneumoniae)、耐四环素19F血清型肺炎链球菌(tetracycline-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae)、耐青霉素19F血清型肺炎链球菌(penicillin-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae)和耐甲氧苄啶23F血清型肺炎链球菌(trimethoprim-resistant serotype 23FStreptococcus pneumoniae)、耐氯霉素4血清型肺炎链球菌(chloramphenicol-resistantserotype 4Streptococcus pneumoniae)、耐壮观霉素6B血清型肺炎链球菌(spectinomycin-resistant serotype 6B Streptococcus pneumoniae)、耐链霉素9V血清型肺炎链球菌(streptomycin-resistant serotype 9V Streptococcus pneumoniae)、耐奥普托欣14血清型肺炎链球菌(optochin-resistant serotype 14Streptococcuspneumoniae)、耐利福平18C血清型肺炎链球菌(rifampicin-resistant serotype 18CStreptococcus pneumoniae)、耐青霉素19F血清型肺炎链球菌(penicillin-resistantserotype 19F Streptococcus pneumoniae)或耐甲氧苄啶23F血清型肺炎链球菌(trimethoprim-resistant serotype 23F Streptococcus pneumoniae))、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、酿脓链球菌A组链球菌(Streptococcus pyogenes,GroupAstreptococci)、酿脓链球菌B组链球菌(Streptococcus pyogenes,Group B streptococci)、无乳链球菌C组链球菌(Streptococcus agalactiae,Group C streptococci)、咽峡炎链球菌(Streptococcusanginosus)、马链球菌D组链球菌(Streptococcus equismilis,Group D streptococci)、牛链球菌F组链球菌(Streptococcusbovis,Group F streptococci)和咽峡炎链球菌G组链球菌(Streptococcus anginosus Group G streptococci)、小螺菌(Spirillum minus)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformi)、密螺旋体属(Treponema sp.)(如斑点密螺旋体(Treponema carateum)、细弱密螺旋体(Treponema petenue)、梅毒螺旋体(Treponemapallidum)和地方性螺旋体(Treponema endemicum)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、须毛癣菌(T.mentagrophytes)、惠普尔养障体(Tropheryma whippelii)、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)、韦永氏球菌属(Veillonella sp.)、弧菌属(Vibrio sp.)(如霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibriovulnificus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、模拟弧菌(Vibrio mimicus)、霍氏弧菌(Vibrio hollisae)、河流孤菌(Vibrio fluvialis)、麦氏弧菌(Vibrio metchnikovii)、美人鱼弧菌(Vibrio damsela)和弗氏弧菌(Vibrio furnisii))、耶尔森氏菌属(Yersiniasp.)(如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)和假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis))以及嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia)。
本文所用术语“遗传病”指基因组中一种或多种异常导致的健康问题。其可以由单一基因(单基因)或多个基因(多基因)的突变或者染色体异常引起。单基因疾病可涉及常染色体显性、常染色体隐性、X连锁显性、X连锁隐性、Y连锁或线粒体突变。遗传病的实例包括但不限于：1p36缺失综合征、18p缺失综合征、21-羟化酶缺乏症、47,XXX(三X综合征)、AAA综合征(贲门失弛缓性–阿狄森氏病–无泪综合征)、Aarskog–Scott综合征、ABCD综合征、无铜蓝蛋白血症、无手足畸形、II型软骨成长不全、软骨发育不全、急性间歇性卟啉症、腺苷酸琥珀酸裂解酶缺乏症、肾上腺脑白质营养不良、ADULT综合征、Aicardi–Goutières综合征、Alagille综合征、白化病、亚历山大症、尿黑酸尿症、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、奥尔波特综合征、
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综合征、儿童交替性偏瘫、阿尔茨海默病、釉质发育不全、氨基酮戊酸脱水酶缺乏性卟啉病、肌萎缩侧索硬化–额颞叶痴呆、雄激素不敏感综合征、快乐木偶综合征、阿佩尔综合征、关节弯曲–肾功能不全–胆汁淤积综合征、毛细血管扩张性共济失调、阿克森费尔德综合征、Beare–Stevenson皮肤状综合征、贝克威思–维德曼综合症、体质性贫血综合征、生物素酶缺乏症、Birt–Hogg–Dubé综合征、
Figure BDA0003956144350000831
综合征、布卢姆综合征、布罗迪肌病、Brunner综合征、CADASIL综合征、躯干发育异常、卡纳万病、CARASIL综合征、卡朋特综合征、大脑发育不全–神经病–鱼鳞病–皮肤角化综合征(SEDNIK)、夏科–马里图思病、CHARGE综合征、Chédiak–Higashi综合征、慢性肉芽肿病、颅骨锁骨发育不良、科凯恩综合征、Coffin–Lowry综合征、Cohen综合征、II型和XI型胶原病、先天性无痛无汗症(CIPA)、先天性肌营养不良、Cornelia de Lange综合征(CDLS)、考登综合征、CPO缺乏症(粪卟啉症)、颅-豆纹动脉-骨缝发育不全、猫叫综合症、克罗恩病、克鲁宗综合征、克鲁宗皮肤骨骼综合征(克鲁宗综合征伴黑棘皮症)、囊性纤维化、达里埃氏病、德格鲁希综合征、登特病(遗传性高钙尿症)、德尼–德拉什综合征、迪格奥尔格综合征、远端遗传性运动神经病、多类型、远端型肌营养不良、唐氏综合征、Dravet综合征、杜氏肌营养不良、爱德华兹综合征、Ehlers–Danlos综合征、Emery–Dreifuss综合征、大疱性表皮松解症、红细胞生成性原卟啉病、法布里病、因子V莱登易栓症、家族性腺瘤性息肉病、家族性克雅病、家族性自主神经功能障碍、范科尼贫血(FA)、致死性家族性失眠症、Feingold综合征、FG综合征、脆性X综合征、弗里德赖希共济失调、G6PD缺乏症、半乳糖血症、戈谢病、Gerstmann–
Figure BDA0003956144350000832
–Scheinker综合征、吉勒斯皮氏综合征、I型和2型戊二酸尿症、GRACILE综合征、格里塞利综合征、家族性良性天疱疮、斑色鱼鳞癣、血色素沉着病、遗传性、血友病、肝红细胞生成性卟啉病、遗传性粪卟啉病、遗传性出血性毛细血管扩张症(Osler–Weber–Rendu综合征)、遗传性包涵体肌病、遗传性多发性外生骨疣、遗传性压力易感性神经病(HNPP)、遗传性痉挛性截瘫(婴幼儿发病的上升型遗传性痉挛性麻痹)、Hermansky–Pudlak综合征、内脏异位、高胱氨酸尿症、亨特综合征、亨廷顿病、胡尔勒综合征、哈钦森–吉尔福德早老症综合征、高赖氨酸血症、高草酸尿症、高苯丙氨酸血症、低α脂蛋白血症(丹吉尔病)、软骨发育不全、软骨发育不良、免疫缺陷–着丝粒不稳定–面部异常综合征(ICF综合征)、色素失调症、坐骨髌骨发育不良、15号等臂双着丝粒染色体综合征(Isodicentric 15)、Jackson–Weiss综合征、朱伯特综合症、青少年原发性侧索硬化症(JPLS)、瘢痕疙瘩病症、克尼斯特发育不良、Kosaki过度生长综合征、克拉伯病、Kufor–Rakeb综合征、LCAT缺乏症、莱施–奈恩综合征、利–弗劳梅尼综合征、肢带型肌营养不良、脂蛋白脂酶缺乏症、林奇综合症、恶性高热、枫糖尿病、马方综合征、马罗托–拉米综合征、McCune–Albright综合征、麦克劳德综合征、地中海热、家族性MEDNIK综合征、门克斯病、高铁血红蛋白血症、甲基丙二酸血症、Micro综合征、小头畸形、莫基奥综合征、莫厄特–威尔逊综合征、Muenke综合征、1型多发性内分泌瘤病(韦尔默氏综合征)、2型多发性内分泌瘤病、肌营养不良、Duchenne和Becker型肌营养不良、肌肉生长抑制素相关的肌肉肥大、强直性肌营养不良、Natowicz综合征、I型神经纤维瘤病、II型神经纤维瘤病、尼曼–皮克病、非酮症性高甘氨酸血症、非综合征性耳聋、努南综合征、Norman–Roberts综合征、Ogden综合征、Omenn综合征、成骨不全、泛酸激酶相关性神经退行性疾病、帕陶综合征(13-三体综合征)、PCC缺乏症(丙酸血症)、彭德莱综合征、Peutz–Jeghers综合征、Pfeiffer综合征、苯酮酸尿症、哌可酸血症、Pitt–Hopkins综合征、多囊肾病、多囊卵巢综合征(PCOS)、卟啉症、迟发性皮肤卟啉症(PCT)、普拉德-威利综合征、原发性纤毛运动障碍(PCD)、原发性肺动脉高压、蛋白C缺乏症、蛋白S缺乏症、假戈谢病、弹性纤维假黄瘤、视网膜色素变性、雷特综合征、罗伯茨综合征、鲁宾斯坦-泰比综合征(RSTS)、桑德霍夫病、圣菲利波综合征、Schwartz–Jampel综合征、Shprintzen–Goldberg综合征、镰状细胞贫血、Siderius型X连锁精神发育迟缓综合征、铁粒幼红细胞性贫血、舍格伦-拉松综合征、Sly综合征、史-莱-奥综合征、史密斯-马盖尼斯综合征、斯奈德-罗宾逊综合征、脊髓性肌萎缩、脊髓小脑性共济失调(1–29型)、先天性脊柱骨骺发育不良(SED)、SSB综合征(SADDAN)、Stargardt病(黄斑变性)、斯蒂克勒综合征(多型)、Strudwick综合征(脊椎骨骺发育不良，Strudwick型)、泰-萨克斯病、四氢生物蝶呤缺乏症、致死性骨发育不良、特雷彻-柯林斯综合征、结节性硬化症(TSC)、特纳综合征、Usher综合征、不定性卟啉病、希佩尔-林道病、瓦登伯格综合征、Weissenbacher–Zweymüller综合征、威廉姆斯综合征、威尔逊病、Wolf–Hirschhorn综合征、Woodhouse–Sakati综合征、X连锁智力障碍和巨睾症(脆性X综合征)、X连锁严重联合免疫缺陷病(X-SCID)、X连锁铁粒幼细胞贫血(XLSA)、X连锁脊髓延髓肌萎缩症(脊髓延髓肌萎缩症)、着色性干皮病、Xp11.2重复综合征、XXXX综合征(48,XXXX)、XXXXX综合征(49,XXXXX)、XYY综合征(47,XYY)、泽尔韦格综合征。
本说明书提及的所有参考文献、出版物、专利和专利申请援引加入本文，就如同各单独出版物、专利和专利申请特定且分别援引加入本文。
上述实施方案可以组合以实现前述功能特性。这也通过下面就示例性组合和所实现功能特性设置的实施例阐述。
实施例
提供下列实施例以进一步阐明本公开的一些实施方案，但不意在限制本公开的范围；通过其示例性性质应理解，可替代使用本领域技术人员已知的其他方法、过程或技术。
实施例1：产生ASO与RNA靶标的结合
开发了针对PVT1、MYC和SCN1A设计反义寡核苷酸的方法。
PVT1、MYC和SCN1序列用公开可得的程序(sfold,sfold.wadsworth.org)运行以鉴定适合高结合能ASO的区域，通常低于-8kcal，使用20核苷酸的序列长度。排除带有3个以上连续G核苷酸的ASO。具有最高结合能的ASO随后通过BLAST处理以基于核苷酸序列检查其潜在结合选择性，并且保留与其他序列有至少2个错配的那些。选定的ASO随之如下合成：
5’-氨基ASO合成
5’-氨基ASO用经典逐步固相寡核苷酸合成法在Dr.Oligo 48(Biolytic LabPerformance Inc.)合成仪上根据厂商操作合成。1000nmol规模的通用CPG柱(BiolyticLab Performance Inc.，零件编号168-108442-500)用作固体支撑物。单体是经修饰RNA亚磷酰胺，带有保护基(5'-O-(4,4'-二甲氧三苯甲基)-2'-O-甲氧乙基-N6-苯甲酰-腺苷-3'-O-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5'-O-(4,4'-二甲氧三苯甲基)-2'-O-甲氧乙基-5-甲基-N4-苯甲酰-胞啶-3'-O-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5'-O-(4,4'-二甲氧三苯甲基)-2'-O-甲氧乙基-N2-异丁酰-鸟苷-3'-O-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5'-O-(4,4'-二甲氧三苯甲基)-2'-O-甲氧乙基-5-甲基-尿苷-3'-O-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)，购自Chemgenes Corporation。5’-氨基修饰需要在最终合成步骤中使用TFA-氨基C6-CED亚磷酰胺(6-(三氟乙酰氨基)-己基-(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺)。所有单体用无水乙腈(Fisher Scientific BP 1170))稀释到0.1M，然后用于合成仪。
用于寡核苷酸合成仪上合成的商业试剂购自ChemGenes Corporation，其包括含3％三氯乙酸的二氯甲烷(DMT清除剂，RN-1462)、含0.3M苄硫基四氮唑的乙腈(激活剂，RN-1452)、含0.1M((二甲氨基亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑啉-3-硫酮的9:1吡啶/乙腈(硫化剂，RN-1689)、0.2M碘/吡啶/水/四氢呋喃(氧化液，RN-1455)、乙酸酐/吡啶/四氢呋喃(CAP A溶液，RN-1458)、含10％N-甲基咪唑的四氢呋喃(CAP B溶液，RN-1481)。无水乙腈(洗涤试剂，BP1170)，购自Fisher Scientific以用于合成仪。所有溶液和试剂保持无水，使用购自ChemGenes Corporation的干燥容器(trap)(DMT-1975,DMT-1974,DMT-1973,DMT-1972)。
氰乙基保护基移除
为了防止在伯胺上形成丙烯腈加合物，在胺脱保护前移除2’-氰乙基。按需向柱加入含10％二乙胺的乙腈溶液，维持与柱接触5分钟。将柱随后用500uL乙腈洗涤5次。
脱保护和剪切
寡核苷酸从支撑物中裂解，同时脱保护其他保护基。将柱转移到带有减压盖的螺口小瓶(ChemGlass Life Sciences CG-4912-01)。向小瓶加入1mL氢氧化铵且将小瓶加热到55℃，持续16小时。使小瓶冷却到室温且氨溶液移至1.5mL微量离心管。将CPG支撑物用200uL无RNAse分子生物学级水洗涤，向氨溶液加入水。将所得溶液在离心蒸发器(SpeedVacSPD1030)中浓缩。
沉淀
将残留物溶于360uL无RNAse分子生物学级水，加入40uL 3M乙酸钠缓冲溶液。为移出杂质，将微量离心管以高速(14000g)离心10分钟。将上清移到配衡的2mL微量离心管。向澄清溶液加入1.5mL乙醇，将管涡旋且随后在-20℃下保存1小时。然后，将微量离心管以高速(14000g)在5℃离心15分钟。小心移除上清，而不使团块破裂，将团块在SpeedVac中干燥。寡核苷酸收率通过质量计算预估，将团块重悬于无RNAse分子生物学级水以产生用于后续步骤的8mM溶液。
设计靶向特定RNA靶标的ASO并根据此实施例成功合成。
实施例2：缀合ASO与小分子
开发了缀合PVT1、MYC和SCN1A ASO与小分子的方法。
为靶向PVT1、MYC和SCN1A，使用双官能形式。该形式包含2个结构域，即靶向区分基因的RNA的第一结构域(这可以是RNA结合蛋白、ASO、小分子)以及结合/募集转录修饰酶的第二结构域(这可以是蛋白、适体、小分子/抑制剂等)，2个结构域由接头连接。
用于此实施例的形式是PVT1、MYC或SCN1A特异性ASO，其连接结合/募集含布罗莫结构域蛋白4(BRD4)的小分子JQ1或iBET762。
将实施例1的合成5’-氨基ASO用于遵循以下方案(接头2作为代表)制备ASO-小分子缀合物。
Figure BDA0003956144350000861
下列操作用于从5’-氨基-ASO制备5’-叠氮-ASO。
将5’-氨基-ASO(2mM,15μL,30nmole)溶液与硼酸钠缓冲液(pH 8.5,75μL)混合。然后，加入N3-PEG4-NHS酯(DMSO中10mM,30μL,300nmol)溶液，将混合物在室温绕轨道振荡16小时。将溶液用SpeedVac干燥过夜。将所得残留物再溶于水(20μL)并经反相HPLC纯化以提供5’-叠氮-ASO(12-21nmol，通过nanodrop UV-VIS定量)。将此5’-叠氮-ASO水溶液(水中2mM,7μL)在PCR管中与DBCO-PEG4-JQ1(合成自DBCO-PEG4-NHS和氨基-PEG3-JQ1，并由反相HPLC纯化，DMSO中2mM,28μL)混合，并在室温下绕轨道振荡16小时。将反应混合物用SpeedVac干燥过夜。将所得残留物再溶于水(20μL)，离心提供澄清上清，其由反相HPLC纯化以提供ASO-接头-JQ1缀合物，为位置异构体的混合物(4.2-9.8nmol，通过nanodrop UV-VIS定量)。将缀合物通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)鉴定。
缀合小分子JQ1或iBET762的ASO用上述方法成功合成。
实施例3：体外形成RNA-双官能-蛋白三元复合物
开发了形成RNA-双官能-蛋白三元复合物的方法。
双官能设计：
三元复合物是含3种结合在一起的不同分子的复合物。双官能分子显示与靶RNA(通过ASO)相互作用，并靶向蛋白(通过小分子)。如图1所示，将抑制剂-缀合反义寡核苷酸(下文称为依鲁替尼-ASOi)与抑制剂的蛋白靶标和ASO的RNA靶标一起混合，允许与蛋白反应并与RNA靶标杂交以形成含所有3种分子的三元复合物。依鲁替尼-ASOi与靶蛋白的结合引起蛋白在聚丙烯酰胺凝胶上迁移到更高位置(上移)，这是因为其分子量增加。靶RNA与ASOi-蛋白复合物的额外杂交通过观察在凝胶上甚至更高的“超移(supershift)”蛋白条带确定，表明所有3种组分在复合物中稳定缔合。此外，用荧光染料标记靶RNA用于超移的蛋白复合物中靶RNA的直接显像。
实施例3a：形成依鲁替尼-ASO
抑制剂依鲁替尼共价结合布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)蛋白的ATP结合袋(doi.org/10.1124/mol.116.107037)，并因而缀合ASO。
为产生缀合物，将10uL 50mM二苯并环辛炔-PEG4-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Sigma-Aldrich)在DMSO中的溶液加入15uL 50mM依鲁替尼-MPEA(Chemscene)在DMSO中的溶液与15uL DMSO中的50mM二异丙基乙胺的混合物中。将混合物在室温下绕轨道振荡4小时，使用产物，而不需在下一步中进一步分析或纯化。将10ul的先前溶液加入10nmol叠氮-ASO(2mM水溶液)，并将30uL DMSO加入混合物。将混合物在室温下绕轨道振荡过夜。将混合物随之转移到0.5mL amicon柱(3kDa)并在10g下离心。将残留物接着用水稀释并离心。将此过程重复3次以产生预期ASO-依鲁替尼缀合物，其通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)表征。
实施例3b：体外三元复合物形成测定
在一个反应(#5)中，将在5’末端与依鲁替尼缀合的序列5’CGUUAACUAGGCUUUA3’的5pmol反义RNA寡聚物(下文称为N33-ASOi)在在PBS中与以下混合：1pmol纯化的BTK蛋白(活性基序#81083)、200pmol酵母rRNA(作为非特异阻断剂)以及序列5’CCUUGAAAUCCAUGACGCAGGGAGAAUUGCGUCAUUUAAAGCCUAGUUAACGCAUUUACUAAACGCAGACGAAAAUGGAAAGAUUAAUUGGGAGUGGUAGGAUGAAACAAUUUGGAGAAGAUAGAAGUUUGAAGUGGAAAACUGGAAGACAGAAGUACGGGAAGGCGAA3’(SEQ ID NO:51)的10pmol Cy5标记IVTRNA。
作为对照，将下列反应在PBS中与200pmol酵母tRNA和以下组分混合：
(#1)仅10pmol Cy5-IVTRNA(以鉴定RNA转录物凝胶上的条带大小。图1，箭头D)；
(#2)仅1pmol纯化的BTK蛋白(以鉴定非复合蛋白凝胶上的条带大小。图1，箭头C)；
(#3)1pmol纯化的BTK蛋白和10pmol Cy5-IVTRNA(以测试靶RNA是否与BTK蛋白直接相互作用)；
(#4)1pmol纯化的BTK蛋白和10pmol N33-ASOi(以鉴定2组分迁移条带的大小，图1，箭头B)；
(#6)在5’末端与依鲁替尼缀合的序列5’AGAGGUGGCGUGGUAG3’的5pmol非互补RNA寡聚物(下文称为SCR-ASOi)、10pmol Cy5-IVTRNA和1pmol纯化的BTK蛋白(以测试三元复合物的形成是否需要互补ASO序列)；和
(#7)1pmol纯化的BTK蛋白和5pmol SCR-ASOi(以显示依鲁替尼修饰的杂乱ASO能够使BTK蛋白条带大小迁移)。
(#8)5pmol N33-ASOi和10pmol Cy5-IVTRNA(以显示靶RNA与ASO之间的结合)
(#9)5pmol SCR-ASOi和10pmol Cy5-IVTRNA(以显示ASO–RNA相互作用需要互补序列)
将所有反应室温避光孵育90分钟，随后与包含最终0.5％SDS和10％甘油的加样缓冲液混合，复合物通过PAGE在Bis-Tris4-12％凝胶上分离，所述凝胶包含IRDye700预染色的蛋白分子量标记(LiCor)。电泳后，将凝胶立即用带700nm通道的LiCor Odyssey系统成像，以鉴定Cy5-IVT-RNA条带和MW标记的位置。然后，将凝胶中的蛋白用考马斯亮蓝胶体快速染色法(Expedeon)染色，用透射光再成像。将2个图像用大小标记物和泳道位置对准以鉴定BTK蛋白条带和Cy5-IVT靶RNA的相对位置(图1)。
观察到与N33-ASOi反应时BTK蛋白条带的MW增加(样品2和3比4，箭头C和B)，指示二元复合物形成，且用N33-ASOi观察到Cy5-IVTRNA存在时有进一步超移(样品5，箭头A)，但用SCR-ASOi没有(样品6，复合物停留于箭头B水平)，证明所有3种组分存在于复合物中，且该形成对杂交互补序列而言是特异性的。此复合物通过与超移BTK蛋白条带重叠的Cy5-IVT-RNA荧光信号进一步证明。
双官能分子显示经ASO和靶蛋白通过小分子与靶RNA相互作用。
实施例4：用内源因子(RNA和效应物)增加基因表达
基因表达通过内源因子(RNA和效应物)提高。
开发了用双官能分子通过靶向内源RNA和效应蛋白来增加基因表达的方法。
特定RNA可区分基因中的每个基因。通过靶向这些RNA以募集转录修饰酶，基因附近转录修饰酶的局部浓度增加，从而提高潜在基因转录(阻遏或激活转录)。
实施例4a：双官能分子的设计
实施例1和2描述了ASO及ASO-接头2-JQ1合成。ASO-接头1-JQ1如实施例1和2所述合成，使用6-叠氮基己酸NHS酯代替N3-PEG4-NHS酯。
ASO-JQ1缀合物以下列一般化学结构产生。本文的ASO-接头2-JQ1缀合物从表1B的所有ASO中产生，除了SCN1A-ASO1制备为SCN1A-ASO1-接头1-JQ1。除了PVT1-ASO1-接头2-JQ1之外，PVT1-ASO1-接头1-JQ1也制备为以下化学结构。
ASO-接头1-JQ1(异构体的混合物)的简化一般化学结构
Figure BDA0003956144350000891
ASO-接头2-JQ1(异构体的混合物)的简化一般化学结构
Figure BDA0003956144350000892
PVT1-ASO1-接头1-JQ1(异构体1)的化学结构
Figure BDA0003956144350000901
PVT1-ASO1-接头1-JQ1(异构体2)的化学结构
Figure BDA0003956144350000911
PVT1-ASO1-接头2-JQ1(异构体1)的化学结构
Figure BDA0003956144350000921
PVT1-ASO1-接头2-JQ1(异构体2)的化学结构
Figure BDA0003956144350000931
实施例4b：双官能分子的转染
开发了用双官能ASO小分子转染细胞的方法。
将HEK293T细胞在转染前一天以30k细胞/孔接种于96孔组织培养容器中。第二天，将细胞用400、200、100、50nM的PVT1 ASO1-JQ1通过Lipofectamine RNAiMax(ThermoFisherCat#13778150)转染。转染中PVT1 ASO1-JQ1:RNAiMAX比例是400nM:1.2ul、200nM:0.6ul、100nM:0.3ul、50nM:0.15ul。转染细胞允许回收并在24小时后收获。
实施例4c：MYC基因表达的检测
开发了检测MYC表达水平的方法。预期递送JQ1到基因启动子附近会募集BRD4蛋白，引起基因表达增加。
在用各双官能分子或对照分子转染后，MYC表达通过RNA水平用qPCR分析检测。
用于qPCR分析的细胞样品通过Cells to Ct 1Step TaqMan试剂盒(ThermoFisherA25602)根据厂商推荐制备。qPCR试验用Cells to Ct qPCR反应混合物、基因特异TaqMan探针(ThermoFisher)和Cells to Ct细胞裂解物进行。将MYC的相对水平根据作为稳定表达对照的β-肌动蛋白标准化。MYC TaqMan探针：ThermoFisher Assay ID Hs00153408_m1；ACTBTaqMan探针：ThermoFisher Assay ID Hs01060665_g1。在qPCR扩增期间，各靶基因的FAM荧光强度通过QuantStudio7 qPCR仪器(ThermoFisher Scientific)记录，作为各PCR循环中生成的双链DNA量的量度。各样品中各基因的Ct值通过仪器软件基于扩增曲线计算，并用于确定各样品中靶标和β-肌动蛋白的相对表达值。
作为PVT1 ASO1-JQ1治疗的结果，观察到MYC表达约4倍的增加，而对照分子没有观察到MYC表达提高(图2)。结果证明ASO-小分子形式能靶向lncRNA(长非编码RNA)且操纵另一基因的表达。
实施例5：PVT1 ASO1-JQ1增加MYC表达的特异性
实施例5a：不靶向PVT1的ASO在缀合JQ1时未增加MYC表达。
非PVT1靶向的ASO和其化学修饰ASO根据实施例1合成为对照(表6A和6B)或如所示购自IDT。
表6A非PVT1靶向的ASO(NPT ASO)和杂乱的ASO序列
Figure BDA0003956144350000941
表6B非PVT1靶向的ASO和杂乱ASO的化学修饰
Figure BDA0003956144350000951
表6A显示非PVT1靶向对照ASO和杂乱的ASO序列及其在人基因组中的坐标。表6B显示各ASO的化学修饰。Mod代码遵循IDT Mod代码：+＝LNA，*＝硫代磷酸酯键，“r”表示核糖核苷酸，i2MOErA ＝内部2’-甲氧基乙氧基A，i2MOErC＝内部2’-甲氧基乙氧基MeC，32MOErA＝3’-羟基-2’-甲氧基乙氧基A等。
缀合上面2种杂乱序列和8种非PVT1靶向序列的JQ1根据实施例2合成，以100nM用0.3ul RNAiMax转染至HEK293T细胞。细胞在转染后24小时收获且MYC表达变化通过qPCR监测。测试结果显示10个JQ1缀合物中没有一个诱导高于背景水平的MYC表达(图3A)。
实施例5b：证明PVT1 ASO1与JQ1的共价连接对于增加MYC表达是必需的，用PVT1ASO1降解剂处理细胞不增加MYC表达
(PVT1 ASO1+游离JQ1)和PVT1 ASO1降解剂(LNA/DNA gapmer，具有3-13-3基序和硫代磷酸酯骨架修饰，购自Qiagen，具有下列序列：+G*+T*+A*A*G*T*G*G*A*A*T*T*C*C*A*G*+T*+T*+G)以100nM用RNAiMax转染至HEK293T细胞。将0.3ul RNAiMax用于各细胞的转染。细胞在转染后24小时收获且MYC表达变化通过qPCR监测。测试结果显示(PVT1 ASO1+JQ1)和PVT1 ASO1降解剂对增加MYC表达而言都无活性(图3B)。
实施例5c：证明小分子抑制剂JQ1在增加MYC表达中的关键作用。
(-)JQ1是JQ1的对映异构体，且相较JQ1具有>100x的较弱生化活性(thesgc.org/ chemical-probes/JQ1)。将PVT1 ASO1-(-)JQ1以100nM通过RNAiMax转染至HEK293T细胞。0.3ul RNAiMax用于各细胞的转染。细胞在转染后24小时收获且MYC表达变化通过qPCR监测。测试结果显示PVT1 ASO1-(-)JQ1没有增加MYC表达高于背景的活性(图4)。
实施例5d：证明在PVT1 ASO1-JQ1滴定后MYC表达的剂量依赖性响应。
将PVT1 ASO1-JQ1和对照分子以200、100、50、25、12.5、6.25及3.125nM通过RNAiMax转染至HEK293T细胞。转染中的PVT1 ASO1-JQ1:RNAiMAX比例是200nM:0.6ul、100nM:0.3ul、50nM和低于:0.15ul。细胞在转染后24小时收获且MYC表达变化通过qPCR监测。测试结果显示MYC表达变化的剂量依赖性响应(图5)。双官能化合物处理中观察到的200nM处MYC响应轻微下降可能是钩状(hook)效应的结果(EBioMedicine.2018Oct；36:553–562)。
实施例5e：证明诱导MYC表达中对PVT1 ASO1序列的要求。
下表7列出此实施例所合成PVT1 ASO1和8种PVT1杂乱ASO的核苷酸序列及化学修饰，根据实施例1合成。Mod代码遵循IDT Mod代码：+＝LNA，*＝硫代磷酸酯键，“r”表示核糖核苷酸，i2MOErA＝内部2’-甲氧基乙氧基A，i2MOErC＝内部2’-甲氧基乙氧基MeC，32MOErA＝3’-羟基-2’-甲氧基乙氧基A等。
表7 PVT1-ASO1和PVT1-杂乱ASO序列及核苷酸修饰
Figure BDA0003956144350000971
将PVT1 ASO1序列内的2-5个核苷酸交换以产生8种部分杂乱PVT1 ASO1序列(表7)。将杂乱PVT1 ASO1-JQ1分子以100nM通过0.3ul RNAiMax/96孔转染至HEK293T细胞。细胞在转染后24小时收获且MYC表达变化通过qPCR监测。测试结果显示在PVT1-ASO1两个末端交换核苷酸对PVT1 ASO1-JQ1活性影响较小，而中间10个核苷酸内交换少至2个核苷酸会显著降低活性(图6和7)。
实施例6：此实施例证明PVT1 ASO1-JQ1处理增加细胞中的MYC基因转录物(图7)以及MYC蛋白(图8)。
将PVT1 ASO1-JQ1和对照分子以400、200、100及50nM通过RNAiMax转染至HEK293T细胞。转染中的PVT1 ASO1-JQ1:RNAiMAX比例是400nM:1.2ul、200nM:0.6ul、100nM:0.3ul、50nM:0.15ul。细胞在转染后24小时收获且MYC表达变化通过qPCR和酶联免疫吸附试验(ELISA)监测。qPCR测试结果显示MYC RNA转录物增加(图7)。对于基于荧光共振能量转移(FRET)的ELISA试验，细胞样品通过基于人c-Myc细胞的试剂盒(Cisbio#63ADK053PEH)根据厂商推荐制备。MYC蛋白在夹心试验中用2种特异性抗体检测，所述抗体标记有铕穴状化合物(Europium Cryptate)(供体)和d2(受体)。FRET信号用Varioskan LUX多功能酶标仪(ThermoFisher)读取，采用6小时动态读取。ELISA试验结果显示在200nM PVT1 ASO1-JQ1下，MYC蛋白水平于24小时增加约2倍(图8)。
实施例7：使用不同化学接头以共价缀合JQ1和PVT1 ASO1，同时维持化合物活性
PVT1 ASO1-接头1-JQ1根据实施例1和实施例2合成，使用6-叠氮基己酸NHS酯代替N3-PEG4-NHS酯。PVT1-ASO1-接头2-JQ1根据实施例1和实施例2合成。
将PVT1-ASO1-接头1-JQ1(V1-PVT1 ASO1-JQ1)和PVT1-ASO1-接头2-JQ1(V2-PVT1ASO1-JQ1)以400、200、100、50、25、12.5、6.25及3.125nM通过RNAiMax转染至HEK293T细胞。转染中的PVT1 ASO1-JQ1:RNAiMAX比例是400nM:1.2ul、200nM:0.6ul、100nM:0.3ul、50nM和低于:0.15ul。细胞在转染后24小时收获且MYC表达变化通过qPCR监测。测试结果显示用V1和V2接头的分子都具有活性且提高MYC表达到类似水平(图9)。
实施例8：额外BET抑制剂以取代PVT1 ASO-JQ1分子中的JQ1
PVT1 ASO1-接头1-iBET762根据实施例1和实施例2合成，使用DBCO-PEG4-iBET762(合成自DBCO-PEG4-NHS和氨基-PEG3-iBET762)，以400、200、100和50nM通过RNAiMax转染至HEK293T细胞。转染中的PVT1 ASO1-iBET762:RNAiMAX比例是400nM:1.2ul、200nM:0.6ul、100nM:0.3ul、50nM:0.15ul。细胞在转染后24小时收获且MYC表达变化通过qPCR监测。测试结果显示PVT1 ASO1-iBET762处理也增加MYC表达(图10)。
PVT1-ASO1-接头1-iBET762(位置异构体1)的化学结构是
Figure BDA0003956144350000991
PVT1-ASO1-接头1-iBET762(位置异构体2)的化学结构是
Figure BDA0003956144350001001
实施例9：缀合JQ1时，用额外PVT1 ASO 3’至ASO1的MYC表达增加
用接头2缀合JQ1的PVT1 ASO2-ASO20的合成根据实施例1和实施例2所述方法完成。
PVT1 ASO2-ASO20设计到VT1 ASO1的3’，或离PVT1转录物上PVT1 ASO1退火位点更上游的位置(图11A)。PVT1 ASO2-接头2-JQ1-PVT1 ASO20-接头2-JQ1以400、133、44和15nM通过RNAiMax转染至HEK293T细胞。转染中的PVT1 ASO-JQ1:RNAiMAX比例是400nM:1.2ul、133nM:0.4ul、44nM:0.13ul、15nM:0.13ul。细胞在转染后24小时收获且MYC表达变化通过qPCR监测。测试结果证明在133nM下，PVT1 ASO3-JQ1–PVT1 ASO16-JQ1显示与PVT1 ASO1-JQ1类似水平的活性(图11B)。
实施例10：缀合iBET762时，用额外PVT1 ASO的MYC表达增加
用接头2缀合iBET762的PVT1 ASO2-ASO20的合成根据实施例1和实施例2所述方法完成，使用DBCO-PEG4-iBET762(合成自DBCO-PEG4-NHS和氨基-PEG3-iBET762)。
将PVT1 ASO2-接头2-iBET762至PVT1 ASO20-接头2-iBET762以400、133、44和15nM通过RNAiMax转染至HEK293T细胞。转染中的PVT1 ASO-iBET762:RNAiMAX比例是400nM:1.2ul、133nM:0.4ul、44nM:0.13ul、15nM:0.13ul。细胞在转染后24小时收获且MYC表达变化通过qPCR监测。测试结果证明PVT1 ASO3—接头2-iBET762–PVT1 ASO16-接头2-iBET762显示与PVT1 ASO1-接头2-JQ1类似水平的活性(图12)。
实施例11：缀合JQ1情况下，在范围内设计的ASO有活性以增加MYC表达时，PVT1上确定的活性袋
用接头2缀合JQ1的PVT1 ASO30-ASO33的合成根据实施例1和实施例2所述方法完成。
将PVT1 ASO30-接头2-JQ1至PVT1 ASO33-接头2-JQ1 2-iBET762以400、133、44和15nM通过RNAiMax转染至HEK293T细胞。转染中的PVT1 ASO-JQ1:RNAiMAX比例是400nM:1.2ul、133nM:0.4ul、44nM:0.13ul、15nM:0.13ul。细胞在转染后24小时收获且MYC表达变化通过qPCR监测。测试结果证明PVT1 ASO30-JQ1至PVT1 ASO33-JQ1对增加MYC表达是惰性的(图13A)。组合实施例9和11的结果，沿着PVT1基因外显子区鉴定了约51个核苷酸(Chr8:127796018-127796068)的活性袋，其中在133nM下，所有靶向该区域的ASO使MYC表达提高超过2倍(图13A、图13B和图11B)。
实施例12：缀合JQ1时用，额外PVT1 ASO 5’到ASO1的MYC表达增加
用接头2缀合JQ1的PVT1 ASO21-ASO29的合成根据实施例1和实施例2所述方法完成。
显示PVT1 ASO21-ASO29的基因组定位(图14A)。将PVT1 ASO21-接头2-JQ1至PVT1ASO29-接头2-JQ1以400、133、44和15nM通过RNAiMax转染至HEK293T细胞。转染中的PVT1ASO-JQ1:RNAiMAX比例是400nM:1.2ul、133nM:0.4ul、44nM:0.13ul、15nM:0.13ul。细胞在转染后24小时收获且MYC表达变化通过qPCR监测。测试结果证明PVT1 ASO24-JQ1和PVT1ASO25-JQ1提高的MYC表达水平与PVT1 ASO1-JQ1类似，并确定PVT1基因最后一个外显子内大小约65个核苷酸的第二活性袋(Chr8:128186661-128186726)，当针对此区域设计ASO时，其支持操纵MYC表达(图14B)。鉴定的活性袋(活性袋2)如图14C所示。
实施例13：通过用MYC ASO-JQ1靶向MYC前mRNA来操纵MYC表达
用接头2缀合JQ1的MYC-ASO1-ASO6的合成根据实施例1和实施例2所述方法完成。
表1A所示MYC-ASO 1到6针对MYC前mRNA的内含子区域设计。将MYC-ASO1-接头2-JQ1至MYC-ASO6-接头2-JQ1以400、133、44和15nM通过RNAiMax转染至HEK293T细胞。转染中的PVT1 ASO-JQ1:RNAiMAX比例是400nM:1.2ul、133nM:0.4ul、44nM:0.13ul、15nM:0.13ul。细胞在转染后24小时收获且MYC表达变化通过qPCR监测。测试结果证明在133nM下，MYCASO3-JQ1、MYC ASO4-JQ1和MYC ASO6-JQ1分子使MYC表达提高超过2倍(图15)。结果证明ASO-SM形式能靶向前mRNA的内含子区域以操纵自身基因表达。
实施例14：通过用MYC ASO-iBET762靶向MYC前mRNA来操纵MYC表达
用接头2缀合iBET762的MYC ASO1-ASO6的合成根据实施例1和实施例2所述方法完成，使用DBCO-PEG4-iBET762(合成自DBCO-PEG4-NHS和氨基-PEG3-iBET762)代替DBCO-PEG4-JQ1。
将MYC ASO1-接头2-iBET762至MYC ASO6-接头2-iBET762以400、133、44和15nM通过RNAiMax转染至HEK293T细胞。转染中的PVT1 ASO-iBET762:RNAiMAX比例是400nM:1.2ul、133nM:0.4ul、44nM:0.13ul、15nM:0.13ul。细胞在转染后24小时收获且MYC表达变化通过qPCR监测。测试结果证明在133nM下，MYC ASO3-iBET762、MYC ASO4-iBET762和MYC ASO6-iBET762分子使MYC表达提高超过2倍(图16)。
实施例15：通过用SCN1A ASO-JQ1靶向SCN1A mRNA来操纵SCN1A表达
SCN1A ASO1购自IDT，作为5’叠氮化物-N修饰的LNA mixmer(A*+G*+T*A*A*G*+A*C*+T*G*G*G*G*+T*T*+G*+T*+T)。其根据实施例2所述方法缀合JQ1。
表5A所示SCN1A-ASO1针对SCN1A前mRNA的外显子区域设计。将SCN1A ASO1-接头1-JQ1以100、50、25、12.5、6.25和3.125nM通过RNAiMax转染至SK-N-AS细胞。转染中的SCN1AASO1-JQ1:RNAiMAX比例是100nM:0.3ul、50nM和低于:0.15ul。细胞在转染后48小时收获且SCN1A表达变化通过qPCR监测。用于定量试验的TaqMan探针：SCN1A Hs00374696_m1(ThermoFisher)、GAPDH Hs02786624_g1(ThermoFisher)。测试结果显示SCN1A ASO1-JQ1使SCN1A表达提高约2倍(图17)。结果证明ASO-SM形式能靶向mRNA外显子区以操纵自身基因表达。
实施例16：通过用SCN1A ASO-iBET762靶向SCN1A mRNA来操纵SCN1A表达
SCN1A-ASO1购自IDT，作为5’叠氮化物-N修饰的LNA mixmer LNA/DNA mixmer，具有硫代磷酸酯骨架(A*+G*+T*A*A*G*+A*C*+T*G*G*G*G*+T*T*+G*+T*+T)。其根据实施例2所述方法缀合iBET762，使用DBCO-PEG4-iBET762(合成自DBCO-PEG4-NHS和氨基-PEG3-iBET762)代替DBCO-PEG4-JQ1。
将SCN1A ASO1-接头1-iBET762以100、50、25、12.5、6.25和3.125nM通过RNAiMax转染至SK-N-AS细胞。转染中的SCN1A ASO1-iBET762:RNAiMAX比例是100nM:0.3ul、50nM和低于:0.15ul。细胞在转染后48小时收获且SCN1A表达变化通过qPCR监测。用于定量试验的TaqMan探针：SCN1A Hs00374696_m1(ThermoFisher)、GAPDH Hs02786624_g1(ThermoFisher)。测试结果显示SCN1A ASO1-接头1-iBET762使SCN1A表达提高近2倍(图18)。SCN1A编码电压门控钠通道的α-1亚基(Na(V)1.1)，并且SCN1A功能丧失突变的患者患有Dravet综合征，这是一种神经系统病症。
实施例17：用于BTK的RIP试验
方法
为表达BTK，表达质粒如下产生：克隆编码具有下列氨基酸序列的BTK的DNA片段(通过Integrated DNA Technologies合成)：
KNAPSTAGLGYGSWEIDPKDLTFLKELGTGQFGVVKYGKWRGQYDVAIKMIKEGSMSEDEFIEEAKVMMNLSHEKLVQLYGVCTKQRPIFIITEYMANGCLLNYLREMRHRFQTQQLLEMCKDVCEAMEYLESKQFLHRDLAARNCLVNDQGVVKVSDFGLSRYVLDDEYTSSVGSKFPVRWSPPEVLMYSKFSSKSDIWAFGVLMWEIYSLGKMPYERFTNSETAEHIAQGLRLYRPHLASEKVYTIMYSCWHEKADERPTFKILLSNILDVMDEES(SEQ ID NO:71)
将编码BTK的基因直接融合编码3个FLAG亲和性标签的序列，其具有下列氨基酸序列：DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK(SEQ ID NO:72)
对于RNA免疫沉淀试验(RIP)，将三百万HEK293细胞在第0天接种于6孔细胞培养板。在第1天(细胞接种后24小时)，将20微克FLAG-BTK表达质粒(如上所述)通过Lipofectamine 2000(ThermoFisher Scientific)根据厂商说明转染入细胞(45微升脂质体混合20微克DNA，用于6孔板的6个孔)。在第2天(DNA转染后24小时)，将靶向MALAT1和HSP70 RNA转录物的依鲁替尼缀合的反义寡聚物(ASO-接头1-Ib)以150nM终浓度根据厂商推荐转染入细胞，使用Lipofectamine RNAiMAX(ThermoFisher Scientific)(45微升脂质体RNAiMAX，用于一个6孔培养板)。
ASO序列如下：
MALAT1 ASO序列：CGTTAACTAGGCTTTA (SEQ ID NO:5)
MALAT1 ASO修饰(i2MOEr："i"表示内部碱基，"2MOE"指示2′-O-甲氧乙基(2′-MOE)
修饰，"r"表示核糖核苷酸。*指示硫代磷酸酯键)：
/i2MOErC/*/i2MOErG/*/i2MOErT/*/i2MOErT/*/i2MOErA/*/i2MOErA/*/i2MOErC/*/i2MOErT/*/i2MOErA/*/i2MOErG/*/i2MOErG/*/i2MOErC/*/i2MOErT/*/i2MOErT/*/i2MOErT/*/32MOErA/
HSP70 ASO：TCTTGGGCCGAGGCTACTGA(SEQ ID NO:6)
HSP70 ASO修饰(i2MOEr："i"表示内部碱基，"2MOE"指示2′-O-甲氧乙基(2′-MOE)
修饰，"r"表示核糖核苷酸。*指示硫代磷酸酯键)：
*/i2MOErT/*/i2MOErC/*/i2MOErT/*/i2MOErT/*/i2MOErG/*/i2MOErG/*/i2MOErG/*/i2MOErC/*/i2MOErC/*/i2MOErG/*/i2MOErA/*/i2MOErG/*/i2MOErG/*/i2MOErC/*/i2MOErT/*/i2MOErA/*/i2MOErC/*/i2MOErT/*/i2MOErG/*/32MOErA/
在第3天(依鲁替尼ASO转染后24小时)，核如下提取：将600万转染的细胞悬浮在低渗缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 7.4，10mM NaCl，3mM MgCl2)中，然后离心(500g，4℃下，5分钟)。核裂解物如下制备：将沉淀的核重悬浮在RIP缓冲液(150mM KCl，25mM Tris pH 7.4，5mM EDTA，0.5mM DTT，0.5％NP40，100U/ml RNAase抑制剂和蛋白酶抑制剂)中。将裂解物分成2个部分且各部分用1微克抗FLAG抗体(Sigma)或对照非特异IgG(Cell SignalingTechnology)在旋转器上4℃孵育4小时。将40微升蛋白G磁珠(ThermoFisher Scientific)随后加入裂解物，并在旋转器上4℃孵育额外1小时。将磁珠用RIP缓冲液洗3次。如下根据厂商说明提取RNA：在1毫升Trizol试剂(ThermoFisher Scientific)中重悬浮洗涤的磁珠，然后加入200ul氯仿，离心(10,000g)，以及异丙醇沉淀。互补DNA(cDNA)通过iScript cDNA合成试剂盒(BioRad)从RNA生成。对应RNA水平的cDNA水平通过定量PCR(qPCR)(ThermoFisherScientific)量化。MALAT1 TaqMan探针：ThermoFisher Assay ID Hs00273907_s1；HSPA4/HSP70 TaqMan探针：ThermoFisher Assay ID Hs00382884_m1；ACTB TaqMan探针：ThermoFisher Assay ID Hs01060665_g1。
qRT-PCR显示BTK蛋白的RNA免疫沉淀(RIP)后，细胞中HSP70、MALAT1和ACTB的RNA水平，所述细胞转染有BTK以及靶向HSP70和MALAT1的依鲁替尼缀合的ASO(图19)。在样品中观察到HSP70和MALAT1转录物富集，其中BTK由抗FLAG抗体特异性下拉(pulled-down)，但用非特异IgG没有，表明BTK与靶标(MALAT1和HSP70)的密切关系，这是通过其与依鲁替尼缀合的ASO的相互作用。
实施例18：通过用SYNGAP1 ASO-JQ1靶向SYNGAP1 mRNA来增加SYNGAP1表达
5’氨基修饰的SYNGAP1 ASO根据实施例2合成，SYNGAP1 ASO1-JQ1至SYNGAP1ASO4-JQ1用接头2根据实施例2所述方法合成。SYNGAP1 ASO序列及其修饰形式如表1A和1B所示。
将SYNGAP1 ASO1-JQ1至SYNGAP1 ASO4-JQ1以200和67nM通过RNAiMax转染至HEK293T细胞。转染中的SYNGAP1 ASO-JQ1:RNAiMax比例是200nM:0.6ul、67nM:0.2ul。细胞在转染后48小时收获且SYNGAP1表达变化通过qPCR监测。用于定量试验的TaqMan探针：SYNGAP1:Assay ID Hs00405348_m1(ThermoFisher)，ACTB Assay ID Hs01060665_g1(ThermoFisher)。测试结果显示在200nM下，SYNGAP1 ASO2-JQ1使SYNGAP1表达增加约2倍(图20)。
Figure IDA0004049401630000011
Figure IDA0004049401630000021
Figure IDA0004049401630000031
Figure IDA0004049401630000041
Figure IDA0004049401630000051
Figure IDA0004049401630000061
Figure IDA0004049401630000071
Figure IDA0004049401630000081
Figure IDA0004049401630000091
Figure IDA0004049401630000101
Figure IDA0004049401630000111
Figure IDA0004049401630000121
Figure IDA0004049401630000131
Figure IDA0004049401630000141

Claims (45)

1.一种增加细胞中基因的转录和/或所述基因的RNA水平的方法，所述方法包括：
向细胞施用合成双官能分子，所述合成双官能分子包括：
第一结构域，其包含第一小分子或反义寡核苷酸(ASO)，其中所述第一结构域特异性结合靶核糖核酸(RNA)序列；
第二结构域，其包含第二小分子或适体，其中所述第二结构域特异性结合靶内源蛋白；和
接头，其将所述第一结构域与所述第二结构域缀合；
其中所述靶内源蛋白增加所述细胞中基因的转录和/或所述基因的RNA水平。
2.权利要求1所述的方法，其中，
所述方法增加所述基因的转录，并且所述靶内源蛋白增加细胞中的所述基因的转录。
3.权利要求1所述的方法，其中，
所述方法增加所述基因的RNA水平，并且所述靶内源蛋白增加细胞中所述基因的RNA水平。
4.权利要求3所述的方法，其中，
增加RNA水平增加细胞中的蛋白水平。
5.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，
所述细胞是人细胞。
6.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，
所述靶内源蛋白是胞内内源蛋白。
7.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，
所述靶内源蛋白是BRD4。
8.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，
所述第一结构域包含ASO。
9.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，
所述第一结构域包含ASO，并且所述ASO包含一种或多种锁核酸(LNA)、一种或多种修饰的核碱基或其组合。
10.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，
所述第一结构域包含ASO，并且所述ASO包含5’锁末端核苷酸、3’锁末端核苷酸或者5’和3’锁末端核苷酸。
11.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，
所述第一结构域包含ASO，并且所述ASO包含在ASO内部位置的锁核苷酸。
12.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，
所述第一结构域包含ASO，并且所述ASO包含序列，所述序列包含30％-60％的GC含量。
13.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，
所述第一结构域包含ASO，并且所述ASO包括8-30个核苷酸的长度。
14.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，
所述第一结构域包含所述第一小分子。
15.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，
所述第二结构域包含所述第二小分子。
16.权利要求15所述的方法，其中，
所述第二小分子是分子量为900道尔顿或更小的有机化合物。
17.权利要求15所述的方法，其中，
所述第二小分子包括JQ1。
18.权利要求15所述的方法，其中，
所述第二小分子包括iBET762。
19.权利要求15所述的方法，其中，
所述第二小分子包括依鲁替尼。
20.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，
所述第二结构域包括所述适体。
21.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，
所述接头在所述ASO的5’末端或3’末端缀合。
22.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，
所述接头包括至少一种选自以下的分子：
Figure FDA0003956144340000031
Figure FDA0003956144340000041
23.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，
所述靶核糖核酸序列是核RNA或胞质RNA。
24.权利要求23所述的方法，其中，
所述核RNA或胞质RNA是长非编码RNA(lncRNA)、前mRNA、mRNA、微小RNA、增强子RNA、转录的RNA、新生RNA、染色体富集RNA、核糖体RNA、膜富集RNA或线粒体RNA。
25.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，
所述基因与疾病或病症相关。
26.一种合成双官能分子，其包含：
第一结构域，其包含第一小分子或反义寡核苷酸(ASO)，其中所述第一结构域特异性结合靶核糖核酸(RNA)序列；和
第二结构域，其包含第二小分子或适体，其中所述第二结构域特异性结合靶内源蛋白；
其中所述第一结构域与所述第二结构域缀合。
27.权利要求26所述的方法，其中，
所述靶内源蛋白是胞内内源蛋白。
28.权利要求26或27所述的方法，其中，
所述靶内源蛋白是BRD4。
29.权利要求26-28中任一项所述的合成双官能分子，其中，
所述第一结构域通过接头分子与所述第二结构域缀合。
30.权利要求29所述的合成双官能分子，其中，
所述接头分子在所述ASO的5’末端或3’末端缀合。
31.权利要求29或30所述的方法，其中，
所述接头分子包含至少一种选自以下的分子：
Figure FDA0003956144340000051
Figure FDA0003956144340000061
Figure FDA0003956144340000071
32.权利要求26-31中任一项所述的合成双官能分子，其中，
所述第一结构域包含所述ASO。
33.权利要求26-32中任一项所述的合成双官能分子，其中，
所述第一结构域包含ASO，并且所述ASO包含一种或多种锁核酸(LNA)、一种或多种修饰的核碱基或其组合。
34.权利要求26-33中任一项所述的合成双官能分子，其中，
所述第一结构域包含ASO，并且所述ASO包含5’锁末端核苷酸、3’锁末端核苷酸或者5’和3’锁末端核苷酸。
35.权利要求26-34中任一项所述的合成双官能分子，其中，
所述第一结构域包含ASO，并且所述ASO包含在ASO内部位置的锁核苷酸。
36.权利要求26-35中任一项所述的合成双官能分子，其中，
所述第一结构域包含ASO，并且所述ASO包含序列，所述序列包含30％-60％的GC含量。
37.权利要求26-36中任一项所述的合成双官能分子，其中，
所述第一结构域包含ASO，并且所述ASO包括8-30个核苷酸的长度。
38.权利要求26-37中任一项所述的合成双官能分子，其中，
所述第一结构域包含所述第一小分子。
39.权利要求26-38中任一项所述的合成双官能分子，其中，
所述第二结构域包含所述第二小分子。
40.权利要求39所述的合成双官能分子，其中，
所述第二小分子包括JQ1。
41.权利要求39所述的合成双官能分子，其中，
所述第二小分子包括iBET762。
42.权利要求39所述的合成双官能分子，其中，
所述第二小分子包括依鲁替尼。
43.权利要求26-42中任一项所述的合成双官能分子，其中，
所述第二结构域包含适体。
44.权利要求26-43中任一项所述的合成双官能分子，其中，
所述靶核糖核酸序列是核RNA或胞质RNA。
45.权利要求44所述的合成双官能分子，其中，
所述核RNA或胞质RNA是长非编码RNA(lncRNA)、前mRNA、mRNA、微小RNA、增强子RNA、转录的RNA、新生RNA、染色体富集RNA、核糖体RNA、膜富集RNA或线粒体RNA。
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