CN115996711A - 稳定的甘油二酯乳液和治疗器官损伤的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于急性疗法的涉及稳定的ω‑3甘油二酯水包油乳液的组合物和方法，以治疗和/或预防组织或器官损伤。所述组合物提供免于细胞死亡的保护，并且用于需要神经保护的患者。例如，所述组合物用于治疗缺血再灌注损伤，诸如缺血性卒中。所述组合物进一步用于治疗跌打损伤，诸如创伤性脑损伤或脊髓损伤等。所述组合物具有大的时间窗，通过该时间窗它们在跌打损伤或缺血性损伤发作后(例如，在卒中发作后)是有效的，并且可以与其他疗法联合给药。
Description
背景技术
卒中是美国长期残疾的主要原因，也是死亡的第5大主要原因。迄今为止，组织型纤溶酶原激活物(t-PA)仍然是FDA批准的唯一的用于急性缺血性卒中治疗的药。然而，它的使用受限于3到4.5小时的狭窄时间窗。
ω-3(n-3)脂肪酸(FA)是卒中后用于急性神经保护的候选者。有证据表明，n-3FA充当具有多效性的生物活性不饱和脂质，并在卒中动物模型中显示出神经保护特性。许多生物学机制可能会受到n-3FA的影响，包括(i)线粒体活性氧物种(ROS)生成减少；(ii)线粒体Ca2+摄取和稳态的保存；(iii)调节受体介导的信号转导和抑制凋亡途径；(iv)有效的n-3FA衍生的消退素和保护素的增加，以及(v)炎症响应的减少。单独或协同工作，这些机制可能有助于缺血性损伤中的n-3FA神经保护，减少细胞死亡，同时加速修复过程。
然而，为了对神经保护有效，必须将足够水平的n-3FA快速递送至处于细胞死亡或损伤风险的细胞。本公开在某些方面提供了用于急性递送n-3FA的组合物和方法，以治疗器官损伤，包括神经保护。本发明可用作治疗卒中、心肌梗死、创伤性脑损伤和缺血性器官损伤等的急救药物。
发明内容
本发明提供了用于急性疗法的涉及稳定的n-3甘油二酯(DG)水包油乳液的组合物和方法，以治疗和/或预防器官损伤。该组合物提供免于细胞死亡的保护，并且用于需要神经保护或器官保护的患者，包括用于缺血性卒中、心肌梗死和创伤性脑损伤等。组合物具有大的时间窗，通过该时间窗，在损伤发作后(例如，在卒中发作后)给药是有效的。组合物可以与其他疗法联合给药，并且组合物可以在恢复期给药以进一步改善结果。
在各种方面和实施方式中，组合物是稳定的乳液，其可以以稳定的形式储存以用于紧急情况。例如，在各种实施方式中，组合物将由急诊医学专业人员现场递送。本文所述的乳液至少六个月、或至少一年、或至少24个月基本上稳定。该组合物适用于肠胃外递送，诸如静脉内(i.v.)或动脉内递送，以及经由胃内或十二指肠管内，并且乳液的物理特性促进n-3FA的快速递送以被受损组织包括脑组织摄取。
根据本发明，DG的酯化FA可以主要是n-3FA。例如，在一些实施方式中，DG包括至少约50％的n-3FA、或至少约75％的n-3FA、或至少约90％的n-3FA、或约100％的n-3FA。在一些实施方式中，n-3FA是长链n-3FA，包括二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳五烯酸(DPA)中的一种或多种。在一些实施方式中，n-3脂肪酸是DHA和EPA。
在各种实施方式中，稳定的乳液具有200nm或更小的平均粒度和约-30mV或比-30mV更负的ζ电位(ZP)。在一些实施方式中，乳液的平均粒度为约190nm或更小、或约180nm或更小、或约160nm或更小、或约140nm或更小。在各种实施方式中，多分散性指数(PDI)为0.3或更小。在各种实施方式中，乳液的ζ电位至少为负约-45mV、或至少为负约-50mV、或至少为负约-55mV、或至少为负约-60mV。
稳定的乳液适用于肠胃外或肠内给药，例如，以将n-3FA快速递送至受损细胞和组织，包括在一些实施方式中的脑。乳液的脂质组分通常为组合物的按重量计约10％至约50％。在一些实施方式中，组合物的按重量计至少约20％是DG油，并且在一些实施方式中，组合物是按重量计约23％至约30％的DG油。组合物还将包括如本文所述的乳化剂和任选的助乳化剂。
组合物将包括一种或多种乳化剂以获得所需的物理特征。在各种实施方式中，乳化剂可以包括磷脂乳化剂、磷酸甘油酯乳化剂以及中和/或长链脂肪酸乳化剂中的一种或多种。在各种实施方式中，组合物包括小于按重量计约1％的乳化剂。
根据本公开的示例性组合物是适用于静脉内或动脉内注射的组合物，其中该组合物包括稳定的甘油二酯(DG)水包油乳液。乳液包括按重量计至少20％的DG油，该DG油的酯化脂肪酸是至少约90％的n-3脂肪酸并且包括DHA和EPA，并且其中该乳液具有200nm或更小的平均粒度、0.3或更小的多分散性指数以及约-40mV或比-40mV更负的ζ电位。
在各种实施方式中，组合物与人血大致等渗，并且任选地包括一种或多种多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、木糖醇和/或葡萄糖。在一些实施方式中，组合物包括一种或多种抗氧化剂，诸如α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和抗坏血酸酯中的一种或多种。在示例性实施方式中，抗氧化剂包括α-生育酚和/或抗坏血酸酯，其任选地为抗坏血酸棕榈酸酯。在一些实施方式中，组合物包括金属螯合剂，其任选地为乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇-双-(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)。
乳液还可以与其他亲脂活性剂共同配制，以增强这些否则难以递送的疗法的递送，并且其可以提供与其他作用机制的协同结果。例如，在一些实施方式中，乳液与格列本脲或他汀共同配制。DG组合物可以与一种或多种额外的神经保护剂一起给药。在其他实施方式中，这些额外的剂与乳液分开给药作为联合疗法。
在其他方面，本发明提供了一种治疗需要免于细胞死亡的患者的方法，所述细胞死亡包括对各种器官或组织诸如脑、脊髓和新移植的器官等的急性和慢性损伤。在一些实施方式中，患者需要治疗缺血性器官损伤，或需要免于缺血性器官损伤的损害的保护。
因此，在一些实施方式中，患者正在经历卒中。本文所述的组合物可在卒中发作后给药以提供神经保护，即抑制导致细胞死亡的细胞过程。乳液的物理和化学特性使它们有效，即使在卒中发作后递送的晚于所需的。例如，在各种实施方式中，在卒中发作约十二小时内向患者给药所述组合物。
组合物可用于治疗缺血性和出血性卒中，并因此可以由急救人员给药，即在脑成像之前以检测或可视化凝块或潜在出血。在没有出血的情况下，患者可以接受溶栓疗法以溶解凝块(例如，t-PA)。虽然通常在卒中发生后的约前4.5小时内向卒中受害者给药t-PA，但根据本公开，患者在卒中发作约4.5小时后接受这种溶栓疗法。通过在紧急情况下尽快给药乳液组合物，可以获得更多时间来确定溶栓疗法是否合适。在其他实施方式中，进行血栓切除术。本文所述的组合物可以扩大血栓切除术成功的治疗窗。
在一些实施方式中，在缺血性卒中的情况下，受试者可以在卒中发作后尽快接受一剂量的DG乳液，并且通常在约24小时内、或约12小时内、或约10小时内、或约8小时内、或约6小时内。患者可以在接下来的几天、几周或几个月内接受后续剂量的DG乳液和/或口服补充n-3DG和/或n-3甘油三酯(TG)以帮助恢复。
在其他实施方式中，患者患有创伤性脑损伤(TBI)或处于创伤性脑损伤的风险中。例如，可以在脑损伤后1至24小时内向患者给药组合物，以减少来自TBI的长期组织损害。在一些实施方式中，在初始给药后，以约每四小时一次至约每周一次的频率向患者给药组合物以帮助恢复。患者可以任选地在接下来的几天、几周或几个月内接受口服补充n-3DG和/或n-3TG以帮助恢复。
在其他实施方式中，患者患有创伤后应激障碍(PTSD)。例如，可以在一段时间内以至少约每周一次的频率向患者给药组合物以促进恢复。患者可以任选地接受口服补充n-3DG和/或n-3TG以支持恢复。
本发明提供保护其他器官或组织，包括缺血性和创伤性组织损伤，包括脊髓损伤(SCI)。在这种实施方式中，可以在紧急情况下在损伤后不久向患者给药组合物。在一些实施方式中，在初始给药后，以至少每天一次至每周一次的频率向患者给药组合物。患者可以任选地在接下来的几周或几个月内接受口服补充n-3DG和/或n-3TG以帮助恢复。例如，患者可以每天至少一次接受口服补充。
此外，在一些实施方式中，患者是器官移植诸如肝、肾、心脏、肠或肺移植的接受者。在一些实施方式中，在围手术期期间向患者给药组合物至少一次。在围手术期之后，可以以约每四小时一次至每周一次的频率向患者给药组合物以帮助恢复。在其他实施方式中，治疗患者的急性器官衰竭，包括急性肾、肝或心力衰竭。患者可以任选地在移植后接受口服补充n-3DG和/或n-3TG持续一周或多周至一个月或多个月以支持恢复。
在一些实施方式中，患者患有神经退行性疾病。例如，每周至少一次向有神经退行性疾病的患者给药组合物以减缓疾病进展，和/或在疾病复发后给药组合物。
本发明的其他方面和实施方式将从以下实施例中显而易见。
附图说明
图1显示了根据本公开制备的并且包含DHA和EPA两者的DG乳液的以及甘油三酯(TG)乳液的物理特征。图1，左，显示了平均粒度(直径)。图1(右)显示了ζ电位(ZP)。
图2A和图2B显示了通过比色测定法测量的并以纳摩尔表示的200μg的DG或TG乳液的水解释放的总游离脂肪酸(FFA)。(图2A)Tri-DHA 10％PL 1.2％对比DG 10％ PL 1.2％。(图2B)Tri-DHA 20％ PL 1.2％对比DG 20％PL 1.2％。
图3显示了n-3DG油的TLC分析，以测试纯度和完整性并识别1,2-1,3DG种类。
图4A和图4B显示了(图4A)患有HI损伤的并用作为载体的生理盐水(黑色条)或乳液：n-3TG(灰色条)、n-3DG(深灰色条)或n-6DG(浅灰色条)治疗的新生小鼠(10日龄)的梗死体积。N＝15-17。值是平均值±SD；(图4B)TTC染色的脑切片。*p<0.05；与生理盐水相比，**<0.01(方差分析)。剂量＝0.375mg/g体重。
图5A和图显示了(图5A)患有大脑中动脉闭塞(MCAo)的并用生理盐水或n-3DG乳液治疗的成年小鼠的梗死体积。值是平均值±SEM。N＝5(图5B)TTC染色的脑切片。与生理盐水组相比，*p<0.05(学生t检验)。每只小鼠的剂量＝100mg。
图6A和图6B显示了(图6A)患有MCAo的并在缺血后6和8小时用生理盐水或n-3TG乳液治疗的大鼠的治疗时间窗。值是平均值±SEM。N＝6；(图6B)TTC染色的脑切片。与生理盐水组相比，*p<0.05(方差分析)。每只大鼠的剂量＝150mg。
图7显示了在缺血性损伤后立即用生理盐水、DHA、EPA、DHA-EPA或ARA(所有DG乳液的剂量为0.375g DG/Kg)治疗的小鼠的平均梗死体积。
具体实施方式
本发明提供了用于急性疗法的涉及稳定的n-3DG水包油乳液的组合物和方法，以治疗和/或预防组织或器官损伤。组合物提供免于细胞死亡的保护，并且用于需要神经保护或器官保护的患者。例如，组合物用于治疗缺血再灌注损伤，诸如缺血性卒中和心肌梗死。所述组合物进一步用于治疗跌打损伤，诸如创伤性脑损伤或脊髓损伤等。所述组合物具有大的时间窗，通过该时间窗它们在跌打损伤或缺血性损伤发作后(例如，在卒中发作后)是有效的，并且可以与其他疗法联合给药。
在各种方面和实施方式中，组合物是稳定的乳液，其可以以稳定的形式储存以用于紧急情况。例如，在各种实施方式中，组合物将由急诊医学专业人员现场递送。在各种实施方式中，本文所述的乳液至少六个月、或至少一年、或至少18个月、或至少两年基本上稳定。组合物适用于肠胃外递送途径，诸如静脉内或动脉内递送。此外，在一些实施方式中，乳液的物理特性，诸如200nm或更小的平均粒径，促进n-3脂肪酸递送至脑组织和/或被脑组织摄取。不受理论的束缚，据信这种小粒度将改善快速递送至脑，这对于病症诸如卒中中神经保护至关重要。
乳液本质上是不稳定的，并因此不会自发形成。需要通过例如摇动、搅拌、均质来输入能量以形成乳液。随着时间，乳液趋于回复到包括乳液的相的稳定状态。然而，纳米乳液可以是动力学稳定的。
如果乳液液滴的大小和分散在所需时间范围内(诸如至少约六个月)没有大量地或显著地变化，则称乳液是稳定的。也就是说，乳液稳定性是指乳液随时间抵抗其特性的能力。可以观察到乳液中的不稳定性，例如，絮凝、乳析(creaming)/沉降、和合并。当液滴之间存在吸引力时发生絮凝，因此它们形成絮凝物。当液滴结合形成更大的液滴时发生合并，因此平均液滴大小随时间而增加。乳液也可以发生乳析，其中例如，液滴在浮力的影响下上升至乳液的顶部。沉降是乳析的相反现象，并通常在油包水乳液中观察到。当分散相比连续相更致密并且重力将更致密的小球拉向乳液底部时，沉降发生。与乳析类似，沉降遵循斯托克斯定律。
乳化剂是一种通过增加乳液的动力学稳定性来稳定乳液的物质。乳化剂包括表面活性剂(surface active agent)或表面活性剂(surfactant)。表面活性剂可以增加乳液的动力学稳定性，从而使液滴的大小不随时间显著地变化。乳液的稳定性可以用ζ电位来评估，它表示液滴或颗粒之间的排斥力。乳化剂是通常具有极性或亲水性(即水溶性)部分和非极性(即疏水性或亲脂性)部分的化合物。清洁剂是一种乳化剂，并会与油和水两者发生物理相互作用，从而稳定悬浮液中油和水液滴之间的界面。
本发明将n-3FA作为稳定的DG乳液递送至细胞。术语“n-3FA”是指多不饱和FA，其中碳-碳双键之一位于从烃链末端的第三个和第四个碳原子之间。n-3FA的实例包括α-亚麻酸(18:3n-3；α-ALA；Δ3,6,9)、二十碳五烯酸(20:5n-3；EPA；Δ5,8,11,14,17)、二十二碳六烯酸(22:6n-3；DHA；Δ4,7,10,13,16,19)和二十二碳五烯酸(22:5n-3；DPA；Δ7,10,13,16,19)。具有至少20个碳原子的n-3FA被称为“长链n-3FA”。n-3FA的来源可以来自任何合适的来源，诸如来自鱼油、藻油和其他油，或者可以是合成的。
许多生物学机制受到n-3FA的影响，这在急性损伤中是有益的，包括(i)线粒体ROS生成减少；(ii)线粒体Ca2+摄取和稳态的保存；(iii)调节受体介导的信号转导和抑制凋亡途径；(iv)有效的n-3FA衍生的消退素和保护素的增加，以及(v)炎症反应的减少。单独或协同工作，这些机制可以有助于缺血性损伤中的n-3FA神经保护，减少细胞死亡，同时加速修复过程。
DG由酯化为三元醇甘油的两种FA组成。用于合成DG分子的示例性方法是通过与n-3长链FA的脂肪酶催化的甘油解(即，酯交换)。在各种实施方式中，本文所述的组合物基本上是DG，即这种组合物不含大量的甘油三酯。在一些实施方式中，相对于存在于所述组合物中的DG和TG的总量，乳液组合物是至少约75％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％的DG乳液。
根据本发明，DG的FA可以主要是n-3FA。在各种实施方式中，DG包括至少约50％的n-3FA、或至少约75％的n-3FA、或至少约90％的n-3FA、或至少95％的n-3FA、或约100％的n-3FA。在一些实施方式中，n-3FA是长链n-3FA，包括DHA、EPA和DPA中的一种或多种。
在各种实施方式中，n-3FA包括DHA、EPA和/或DPA。例如，在一些实施方式中，n-3FA包括DHA。在一些实施方式中，n-3FA是至少约50％的DHA、或至少约60％的DHA、或至少约75％的DHA、或至少约90％的DHA。在一些实施方式中，n-3FA包括EPA。例如，n-3FA可以是至少约50％的EPA、或至少约60％的EPA、或至少约75％的EPA、或至少约90％的EPA。在一些实施方式中，n-3FA包括DPA。例如，n-3FA可以是至少约50％的DPA、或至少约60％的DPA、或至少约75％的DPA、或至少约90％的DPA。在一些实施方式中，n-3FA包括DHA和EPA，它们任选地以约2:1至约1:2(例如，约1:1)的比率存在。如本文所证明的，具有小粒度和携带DHA+EPA的DG乳液在神经保护方面显示出异常高的特性。参见图7。
在各种实施方式中，DG分子包括1,3-DG和1,2-DG。在一些实施方式中，DG主要是1,3-DG。
在各种实施方式中，乳液具有200nm或更小的平均粒度和约-30mV或比约-30mV更负的ζ电位。在一些实施方式中，乳液的平均粒度为约190nm或更小、或约180nm或更小、或约170nm或更小、或为约160nm或更小、或为约150nm或更小、或为约140nm或更小、或为约120nm或更小、或约100nm或更小、或约90nm或更小、或约80nm或更小。在一些实施方式中，平均粒度为约140nm、约120nm、或约110nm、或约100nm，并且具有小于约0.3、或小于约0.25、或小于约0.2的多分散性指数。在一些实施方式中，平均粒度为约110nm至约180nm、或约120nm至约180nm，多分散性指数小于约0.3。在各种实施方式中，乳液的ζ电位至少为负约-35mV、或至少为负约-40mV、或至少为负约-50mV、或至少为负约-55mV。根据这些实施方式的乳液是稳定的，这意味着这些参数维持至少六个月、或在一些实施方式中至少一年、至少18个月、或至少两年。根据本公开，稳定性是在4℃下储存来确定的。
稳定的乳液适用于静脉内给药例如，将n-3FA快速递送至受损组织，包括在一些实施方式中的脑。因此，在这种实施方式中，组合物是可注射的组合物。脂质组分通常为组合物的按重量计约10％至约50％。在一些实施方式中，组合物的脂质组分为约10％至约30％、或约15％至约25％。在一些实施方式中，脂质组分为组合物的按重量计20％至约40％、或约20％至约30％。例如，脂质组分可以是按重量计组合物的至少约10％、或至少约15％、或至少约20％，或按重量计组合物的至少约25％，或按重量计组合物的至少约30％。在这种实施方式中，按重量计至少约10％的组合物是DG油，或按重量计至少约15％的组合物是DG油，或按重量计至少约20％的组合物是DG油，或按重量计至少约23％的组合物是DG油，或按重量计至少约25％的组合物是DG油，或按重量计至少约27％的组合物是DG，或按重量计至少约30％的组合物是DG油。在一些实施方式中，组合物是约10wt.％的DG油。在一些实施方式中，组合物是22至27wt.％的DG油。
多分散性指数(PDI)是给定样品中粒度分布的一种度量。PDI的数值范围从0.0(对于具有完全均匀粒度分布的样品)至1.0(对于具有多种粒度群体的高度多分散样品)。在基于脂质的载体诸如乳液中，需要0.3的PDI，表明足够均匀的粒度分布。在一些实施方式中，乳液的PDI小于约0.30，诸如约0.25或更小、0.20或更小、或约0.15或更小。
组合物将包括一种或多种乳化剂以获得所需的物理特征。在各种实施方式中，乳化剂可以包括磷脂乳化剂、磷酸甘油酯乳化剂以及中和/或长链脂肪酸乳化剂中的一种或多种。在各种实施方式中，组合物包括按重量计约0.5％至约2.4％的乳化剂(例如，磷脂乳化剂)，诸如按重量计约0.5％至约2％并且任选地小于约1.0％的乳化剂，和任选地按重量计0.5％至0.8％的乳化剂(例如，磷脂乳化剂)。
在一些实施方式中，乳液包括一种或多种磷脂乳化剂和/或一种或多种磷酸甘油酯乳化剂。磷酸甘油酯乳化剂可以选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和磷脂酸。在一些实施方式中，组合物包括磷脂酰胆碱乳化剂。在各种实施方式中，磷脂和/或磷酸甘油酯乳化剂与DG的比率(按重量计)为1:8或更小、或1:10或更小、或1:12或更小、或1:15或更小。在一些实施方式中，乳化剂包括至少约70％的磷脂酰胆碱，或包括至少约80％的磷脂酰胆碱。例如，乳化剂(与任何助乳化剂一起)可以包含约60％至约80％的磷脂酰胆碱。
组合物可以进一步包括一种或多种中链或长链FA作为助乳化剂。例如，组合物可以包括长链FA，任选地选自C16至C24 FA，并且其任选地是C18 FA。在一些实施方式中，助乳化剂包括饱和FA，任选地选自月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸。在一些实施方式中，助乳化剂包括不饱和FA，任选地选自油酸或亚麻酸。助乳化剂可以作为碱金属盐添加，其任选地包括油酸钠。在示例性实施方式中，助乳化剂以组合物总重量的约0.01％至5％存在。例如，助乳化剂可以以组合物总重量的约0.01％至2％、或组合物总重量的约0.01％至约1％、或组合物的按重量计约0.01％至约0.05％存在。
在各种实施方式中，组合物与人血大致等渗，并且任选地包括一种或多种多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、木糖醇和/或葡萄糖。例如，组合物可以包括占组合物的按重量计约2％至约10％、或组合物的按重量计约2％至约7％的甘油。
在一些实施方式中，组合物包括一种或多种抗氧化剂，诸如α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和抗坏血酸酯中的一种或多种。在示例性实施方式中，抗氧化剂包括α-生育酚和/或抗坏血酸酯，其任选地为抗坏血酸棕榈酸酯。
在一些实施方式中，组合物包括金属螯合剂，其任选地为EDTA或EGTA。例如，乳液可以包含约5mM至约15mM EDTA或EGTA。例如，在一些实施方式中，乳液包含约10mM EDTA。
在各种实施方式中，可以根据包括以下的工艺制备稳定的乳液：(1)制备温度为约50℃至约80℃(例如，约60℃)的水、甘油和EDTA的混合物；(2)加入磷脂酰胆碱乳化剂(例如至少约75％的PC，其可以来自蛋黄卵磷脂)、助乳化剂(例如油酸钠)和DG油；(3)在约50℃至约80℃(例如约60℃)的温度下均质化；(4)通过微流化器或更大体积的高压均质器(即高剪切流体处理器)进行处理。在该工艺期间施加的压力范围可以从300到2000巴，并且在一些实施方式中，从约500到约1000巴，诸如从约600到约1000巴。例如，混合物可以通过微流化器在约950巴压力下在约60℃下处理。乳液可以在满足目标粒度所需的条件下处理持续一段时间。该工艺可以包括如下所述的其他亲脂剂的共同配制。
乳液也可以与其他亲脂活性剂共同配制，以增强它们的递送并提供与其他作用机制的协同结果。例如，在一些实施方式中，乳液与格列本脲共同配制。Simard等人,Glibenclamide in cerebral ischemia and stroke.Neurocrit care 2014 20(2):319-333。然而，格列本脲被低效地递送至脑，并且鉴于其亲脂性，通常难以递送。因此，本公开提供了DG乳液以改善格列本脲的递送用于神经保护。因为格列本脲是一种亲脂活性剂，它很容易掺入乳液中，并且可以以低于没有乳液的递送量递送，因此该活性剂在其治疗窗内递送。
乳液还可以与其他亲脂剂诸如他汀共同配制，从而扩大这些乳液的益处，以帮助恢复和预防和/或治疗慢性疾病状态，包括患者有缺血性损伤风险的那些状态，诸如动脉粥样硬化和有心肌梗死风险的那些。亲脂性他汀的实例包括阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀和西立伐他汀。
在一些实施方式中，乳液进一步包括一种或多种神经保护剂。在一些实施方式中，一种或多种神经保护剂作为联合疗法单独给药。示例性的神经保护剂包括谷氨酸拮抗剂。示例性的神经保护剂包括17β-雌二醇、人参皂苷、黄体酮、辛伐他汀和美金刚。可以将亲脂性神经保护剂(例如，17β-雌二醇、辛伐他汀或黄体酮)掺入乳液中。
在一些实施方式中，乳液进一步包括EPA、DHA和/或DPA的一种或多种代谢物，诸如一种或多种消退素或保护素。消退素是衍生自ω-3脂肪酸包括EPA、DHA和DPA的多不饱和脂肪酸(PUFA)代谢物。消退素(诸如RvD和/或RvE)可以促进组织炎症后正常细胞功能的恢复。保护素，诸如神经保护素D1(NPD1)，也是PUFA代谢物，其具有强的抗炎、抗凋亡和神经保护活性。在一些实施方式中，乳液包括DHA和EPA(如所述)和NPD1。
在各种实施方式中，组合物的pH为约6至约10，任选约6.5至约10，任选约9至约10(例如，9.5)。
在各种实施方式中，组合物具有约500mL或更小的体积，或约300mL或更小的体积，或约100mL或更小的体积，或约50mL或更小的体积，或约25mL或更小的体积。在各种实施方式中，组合物包含在预填充注射器中，任选地具有约1mL至约50mL的注射体积。在一些实施方式中，组合物以约25mL至约100mL的体积包装在小瓶中。
在其他方面，本发明提供了一种治疗需要免于细胞死亡的患者的方法，所述细胞死亡包括对各种器官或组织诸如脑、脊髓和肾等的急性和慢性损伤。在一些实施方式中，患者需要治疗缺血性器官损伤或创伤性器官损伤。所述方法通常包括向有需要的患者给药有效量的本文所述的组合物。
在各种实施方式中，患者需要神经保护。在一些实施方式中，患者处于缺血再灌注损伤的风险中。缺血再灌注损伤是在缺血或缺氧一段时间后，血液供应恢复到组织时引起的组织损害。缺血期间血液中氧气和营养物质的缺乏造成一种病症，在其中，循环的恢复通过诱导氧化应激导致炎症和氧化损害。
例如，持续时间足以耗尽神经细胞中高能量储备的脑缺氧缺血(或“卒中”)在再灌注的数小时至数天内引发一连串事件，最终导致广泛死亡，包括坏死和凋亡。这些事件包括ROS的生成和对细胞的氧化损害、炎症介质的释放和长期炎症反应的开始、以及可以持续数周至数月的持续存在的细胞凋亡。
因此，在一些实施方式中，患者正在经历卒中。卒中是生命周期各个阶段发病和死亡的主要原因，包括对于早产婴儿、对于重症监护室中的儿童、以及对于患有脑血管意外的老年人。在一些实施方式中，卒中是缺血性卒中。然而，本发明也可用于治疗出血性卒中以及新生儿卒中。在一些实施方式中，受试者患有缺氧缺血性脑病(HIE)或处于缺氧缺血性脑病的风险中，这是一种由缺氧和血流受限引起的新生儿脑损害。在HIE中幸存的婴儿和儿童表现出终生的神经功能障碍，包括大脑性瘫痪、智力落后、癫痫和学习无能。Vannucci,R.C.(2000),Hypoxic-ischemic encephalopathy,American Journal of Perinatology 17(3):113-120。脑缺氧缺血常见于危重病儿，最明显与心肺骤停有关。
本文所述的组合物可在卒中发作后给药以提供神经保护，即抑制导致细胞死亡的细胞过程。乳液的物理和化学特性使它们有效，即使在卒中发作后递送的晚于所需的。例如，在各种实施方式中，在卒中发作的约1至约24小时内向患者给药组合物。例如，在一些实施方式中，在卒中发作约6小时后，或卒中发作约8小时后，或卒中发作约10小时后，或卒中发作约12小时后，或卒中发作约15小时后给药组合物。在一些实施方式中，在卒中发作约10小时后但在卒中发作的24小时内给药组合物。组合物可以防止大量细胞死亡，尽管在紧急治疗中有延迟。在一些实施方式中，在卒中发作的约2小时内或在卒中发作的约4小时内向患者给药组合物，这提供了免于细胞损害和/或死亡的实质性保护。
组合物可用于治疗缺血性和出血性卒中，并因此可以由急救人员给药，即在脑成像之前以检测或可视化血栓或潜在出血。在没有出血的情况下，患者可以接受溶栓疗法以溶解凝块(例如，t-PA)。t-PA催化纤溶酶原转化为纤溶酶，纤溶酶是负责凝块分解的主要酶。通常在卒中发生后的约前4.5h内向卒中受害者给药t-PA。在一些实施方式中，患者在卒中发作约4.5小时后、或卒中发作约6小时后、或卒中发作后约8小时后接受这种溶栓疗法，通过与DG乳液一起递送t-PA来增加溶栓治疗窗。通过在紧急情况下尽快给药乳液组合物，可以获得更多时间来确定溶栓疗法是否合适。溶栓疗法不能施用于经历出血性卒中的患者，因为该疗法会加剧出血。
在其他实施方式中，进行血栓切除术。血栓切除术是从血管中去除血凝块(血栓)的介入治疗。它通常在脑动脉中进行(介入神经放射学)。本文所述的组合物可以扩大血栓切除术成功的窗。例如，可以在卒中发作约10小时后或卒中发作约12小时后进行血栓切除术。在一些实施方式中，在卒中发作约18小时后或约24小时后进行血栓切除术。
在一些实施方式中，患者可以在前24小时内接受1至5剂量的组合物，其中在溶栓疗法或血栓切除术之前接受至少一剂量，并且在溶栓疗法或血栓切除术之后接受至少一剂量。
组合物通常肠胃外诸如静脉内或动脉内递送。在一些实施方式中，组合物通过鞘内递送来递送。在一些实施方式中，组合物经鼻内给药，允许快速递送至脑。在一些实施方式中，组合物通过动脉内递送选择性地给药至先前灌注不足的脑。
在一些实施方式中，在缺血性卒中的情况下，受试者可以在卒中发作后尽快接受一剂量的DG乳液，并且通常在卒中发作的约24小时内、或约15小时内、或约12小时内、或约10小时内、或约8小时内、或约6小时内。患者可以在接下来的几天或几周内接受后续剂量，以帮助恢复。例如，患者可以接受至少4次稳定的DG乳液的给药，或者可以接受至少8次稳定的DG乳液的给药。在一些实施方式中，患者在卒中后一周至一个月内接受1至10次或1至4次给药以帮助恢复。
在其他实施方式中，患者患有创伤性脑损伤(TBI)或处于创伤性脑损伤的风险中。创伤性脑损伤通常是由于头部或身体受到猛烈打击或震动所致。穿透脑组织的物体，诸如子弹或颅骨碎片，也可以导致创伤性脑损伤。轻度创伤性脑损伤可以暂时影响脑细胞。更严重的创伤性脑损伤可以导致脑部瘀伤、组织撕裂、出血和其他物理损害。这些损伤可以导致长期并发症或死亡。在一些实施方式中，在脑损伤的1至5小时内或脑损伤的1至2小时内向患者给药组合物，以减少来自TBI的长期组织损害。在一些实施方式中，在脑损伤的约12小时内或脑损伤的约24小时内向患者给药组合物。在一些实施方式中，患者接受至少4次稳定的DG乳液的给药，或可以接受至少8次稳定的DG乳液的给药。在一些实施方式中，在初始给药后，以约每4小时一次至每周一次的频率向患者给药组合物至少4次或至少10次以帮助恢复。
在其他实施方式中，患者患有创伤后应激障碍(PTSD)。PTSD是在一个人经历或目睹发生严重身体伤害或受到威胁的创伤性或可怕事件后发展的一种严重病症。PTSD是创伤性折磨的持久后果，其导致强烈的恐惧、无助或恐怖，诸如性或身体攻击、亲人的意外死亡、事故、战争或自然灾害。在各种实施方式中，本文所述的组合物为PTSD提供治疗价值。在一些实施方式中，在一段时间内至少每周一次向患者给药组合物以促进恢复。
本发明提供了用于保护其他器官或组织包括脊髓损伤(SCI)的用途。在这种实施方式中，可以在损伤的约24小时内、或损伤的约15小时内、或损伤的约12小时内、或损伤的约6小时内、或损伤的约2小时内、或损伤的约1小时内向患者给药组合物。在一些实施方式中，在初始给药后，至少每天一次或每周一次向患者给药组合物。在一些实施方式中，患者接受至少4次稳定的DG乳液的给药，或可以接受至少8次稳定的DG乳液的给药。在一些实施方式中，在初始给药后，以每4小时一次至每周一次的频率向患者给药组合物(例如，持续至少四周)以帮助恢复。
此外，在一些实施方式中，患者是器官移植诸如肝、肾、心脏或肺的接受者。在一些实施方式中，在围手术期期间(例如，移植手术前约24小时内，和/或移植手术后约24小时内)向患者给药组合物。在一些实施方式中，患者接受至少4次稳定的DG乳液的给药，或可以接受至少8次稳定的DG乳液的给药。在一些实施方式中，在初始给药后，以约每四小时一次至约每周一次的频率向患者给药组合物以帮助恢复。
在一些实施方式中，患者有急性器官衰竭，诸如急性肾、肝或心力衰竭。在一些实施方式中，以约每4小时一次至每周一次的频率向患者给药组合物1至10次或1至4次以减少器官损害和/或衰退。
在一些实施方式中，患者患有神经退行性疾病，诸如ALS、多发性硬化、帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿病。例如，每周至少一次向患者给药组合物以减缓疾病进展，和/或在疾病复发时(例如，在MS的情况下)给药组合物以降低复发的严重性和持续时间和/或减缓疾病进展。
在这些和其他实施方式中，需要神经保护的患者可以另外或在一些实施方式中替代地接受口服补充n-3脂肪酸，其可以任选地为DG或n-3TG的形式。口服补充可以给药每天至少一次以及每天最多三次。可以根据需要提供一周或数周或数月的口服补充以支持从急性事件中恢复，或者可以无限期地给药以帮助恢复并防止病症复发或再次发生。在一些实施方式中，口服补充是用可以以胶囊形式给药的n-3DG油。在一些实施方式中，口服补充是膳食补充，例如通过提供n-3DG油作为食物产品的组分。在一些实施方式中，口服补充是用n-3DG乳液。
需要神经保护的患者可以进一步接受用一种或多种神经保护剂的疗法，例如作为联合疗法。示例性的神经保护剂包括谷氨酸拮抗剂。示例性的神经保护剂包括17β-雌二醇、人参皂苷、黄体酮、辛伐他汀和美金刚。这些疗法与如本文所述的n-3DG乳液疗法和/或与n-3DG口服补充一起可以提供免于脑损伤的协同保护。
如本文所用，术语“约”是指相关数值的±10％。
本发明的其他方面和实施方式将从以下实施例中显而易见。
实施例
ω-3(n-3)脂肪酸(FA)是卒中后用于急性神经保护的候选者。许多生物学机制可能会受到n-3FA的影响，包括(i)线粒体活性氧物种(ROS)生成减少；(ii)线粒体Ca2+摄取和稳态的保存；(iii)调节受体介导的信号转导和抑制凋亡途径；(iv)有效的n-3FA衍生的消退素和保护素的增加，以及(v)炎症响应的减少。单独或协同工作，这些机制可以有助于缺血性损伤中的n-3FA神经保护，减少细胞死亡，同时加速修复过程。
然而，为了对神经保护有效，必须将足够水平的n-3FA快速递送至处于细胞死亡或损伤风险的细胞，并因此必须以有效穿过血脑屏障(BBB)的方式递送。BBB对纳米颗粒的摄取可以通过两种主要的胞吞机制，即网格蛋白和小窝蛋白介导的胞吞作用。具有200nm或更小的直径的乳液纳米颗粒应通过这些胞吞过程更有效地穿过BBB。此外，增加小粒度乳液中n-3FA的水平(例如，与PC乳化剂有关)可以进一步增强n-3FA向脑以及其他组织的直接递送。
本公开提供了用于急性递送n-3脂肪酸以治疗缺血性卒中、创伤性脑损伤和如本申请别处详述的其他急性器官损伤的耐贮存组合物和方法。具体地，以下实验提供了获得用于治疗和/或预防器官损伤的急性疗法的稳定的ω-3甘油二酯(DG)水包油乳液的组合物和方法。
n-3甘油二酯乳液的制备与表征
开发了DG乳液制剂以制备具有小粒度以及增加的n-3FA有效载荷的稳定的乳液。如表1中详述的，通过将溶解的蛋黄磷脂酰胆碱(PC)与DG油混合来制备稳定的DG乳液。DG油包含至少90％的FA如DHA和/或EPA。制备了与n-3FA组合物不同的油-纯DG-DHA、纯DG-EPA、或DHA和EPA的混合物。还制备了含有n-6AA的DG乳液。通过薄层色谱法(TLC)分析每种油，以确定样品的纯度和完整性。TG乳液也用相同的工艺制备，使用豆油或含有仅含有甘油三酯的DHA(Tri-DHA)的鱼油的乳液作为其脂肪酸。
表1：脂质乳液方案
该乳液制备方案涉及在60℃下混合H2O(含有0.25mM EDTA)和甘油。接下来，使用非常温和的涡旋将PC(Lipoid E80)和油酸钠适度搅拌持续2min。在60℃下将DG油添加到水相中。然后用均质器将该预乳液在60℃下混合持续3min。最后的步骤包括通过高剪切流体处理器(Microfluidizer，LV1型号)在965巴(等于14000-psi)压力下在60℃下3-5次处理预乳液。按照这种方法，我们为每个程序获得了最高达8ml的体积。对于更大的体积，可以使用更高的压力。乳液的外观为白色/乳白色液体。制备后，将乳液在4℃的氩气下储存持续超过14个月。使用PC乳化剂，该工艺用于成功地制备稳定的10％乳液(10g DG/100ml)以及稳定的20％和24％乳液(20g DG/100ml和24g DG/100ml)。如下文详述，使用0.6-0.8wt％PC乳化剂以及10％和20％ DG油也获得了具有小粒度的稳定的乳液。具有高于20％ DG油的乳液尤其具有显著提高n-3FA有效载荷的潜力。
通过动态激光散射(DLS)评估粒度和多分散性指数(PDI)。根据颗粒分布的组成、平均值和均匀性分析数据。代表性的DG乳液如图1(左)所示，其中n-3DG具有基本上小于200nm(～110nm)的粒度，而TG乳液要大得多，其在本实施例中约为240nm。我们还分析了ζ电位，显示对DG乳液的高排斥力(其基本上高于TG)，这导致了更稳定的系统(图1，右)。所用的DG油包含约等量的1,2和1,3DG(基于脂肪酸位置)如TLC(图3)所示。
14个月后，对相同的样品进行分析，PDI和平均大小值没有变化，证明在这段时间内DG乳液的高稳定性。
我们假设DG可能有助于它们自身的乳化，并且由于更大的亲水性，DG也可能比TG更多地掺入生物膜。为了测试这一点，我们比较了以DG或TG作为载体递送的脂肪酸对生物膜相互作用模型的影响。我们评估了DG和TG在磷脂酰胆碱(PC)膜系统中的溶解度，并通过NMR分析研究了DG或TG如何掺入脂质混合物并可能改变PC膜的特性。我们发现，与ω-3TG相比，ω-3DG在模型膜中的掺入要高得多，这可能有助于它们与TG相比有多种和优越的生物效应。重要的是，这些结果表明，与TG形成鲜明对比的是，n-3DG与PC一起部分促进了它们自身的乳化。
基于这些结果，然后我们决定将PL乳化剂的量从我们初始制备时的乳化剂的按重量计1.2％降低到0.8-0.6％(即添加DG油之前按组合物的重量计)。这是为了证明即使PL量较低，DG是否稳定。通过目视检查，DG乳液显示表面上没有油滴，而TG乳液则观察到油滴。这些观察结果与DG本身作为乳化剂的假设一致，因此，具有较高DG油百分比的稳定的乳液似乎是可行的。我们建议至少高达25wt.％的DG乳液是可行的。此外，当降低PL时，观察到相同的小粒度和等于或小于0.220的PDI。重要的是，通过降低乳液中PL的量，可以增加每剂量n-3FA的有效载荷，其可以带来神经保护中的重要改进。
为了确定快速水解促进DG乳液的清除，进行了体外脂解研究。通过脂蛋白脂肪酶(LpL)介导的n-3DG与n-3TG的水解来评估FA释放。纯化的LpL的活性为300-400U/mg蛋白质。LpL在pH为8.6的0.9％ NaCl中1:20稀释，紧接着与乳液一起孵育。在固定时间(30min)内增加LpL的量(0-20μL的1:20稀释)进行实验。我们观察到，与n-3TG相比，n-3DG乳液(10％和20％两者乳液)具有更有效的水解(参见代表性实验，图2A、2B)。这些结果强调，DG结构促进乳液在体内转化为残粒样颗粒，有助于n-3FA的更快的释放和摄取。乳液中较高百分比的n-3FA可以将较高水平的这些剂递送至细胞和组织(比较图2A和2B中释放的FFA)。
细胞通过不涉及常规细胞受体的吸附胞吞途径内化大量n-3TG[31、35、36]；而n-6TG摄取的机制涉及apoE-和LDL受体(LDLr)-依赖性途径[31、37-39]。TG组成、粒度和亲水性的差异可能部分解释了不同的摄取过程[34、39、40]。全部DG颗粒穿过血脑屏障(BBB)的能力可能取决于它们的物理化学特性以及特定的转运蛋白。本公开预计，在DG乳液的PL表面处无序动力学的增加以及小粒度将促进部分通过“非经典”途径更快速和更大程度地体外摄取n-3FA。
神经保护的动物模型
初始探索性数据显示，用n-3DG乳液(含有>90％的总FA如EPA和DHA，～10wt.％DG油)治疗的新生小鼠在缺血性损伤后24小时表现出脑梗死体积的显著减少，并且n-3DG乳液比n-3TG乳液有效得多。图4(A、B)。n-6DG治疗在缺血性损伤后没有发挥神经保护。我们接下来使用60min的短暂性右大脑中动脉闭塞(MCAo)确定n-3DG乳液是否保护卒中成年小鼠模型(C57Bl/6品系，10-14周龄)中的脑免于缺血。在MCAo后和再灌注开始时立即用n-3DG乳液(～10wt.％DG油)治疗的成年小鼠具有比对照小鼠显著小的梗死。图5(A、B)。通过快速弹丸式注射用DG乳液治疗的小鼠没有显示出不良反应，由于DG下游通路的过度激活，没有报告“信号冲击”。
据报告，在小鼠中，n-3TG乳液具有卒中后2小时的治疗时间窗[23]。然而，我们现在发现，在卒中成年大鼠模型(短暂性右MCAo)中，在缺血后6小时内静脉内注射n-3TG乳液(10wt.％TG油)显著减少了梗死体积，表明在较大的哺乳动物物种中的这些剂的更长的时间窗。图6(A、B)。
总之，我们的探索性数据强调了在DG乳液中递送的n-3FA作为强神经保护剂的潜力，其在我们的啮齿动物卒中模型中提供比n-3TG增加的功效，并潜在地在急性损伤后提供长的治疗窗。
我们还研究了,与n-6DG(AA)相比，由n-3DG乳液(DG-DHA、DG-EPA、DG-EPA+DHA)提供的神经保护作用。乳液包含～10wt.％DG油，并且>90％的脂肪酸是n-3FA。数据显示，用单独的脂肪酸(DHA或EPA)或用DG-DHA+EPA制成的DG乳液治疗的新生小鼠在缺血性损伤后立即给药时表现出脑梗死体积显著减少。与此形成鲜明对比的是，具有AA的n-6DG治疗在缺血性损伤后没有发挥神经保护(图7)。与单独用DHA和EPA的DG乳液相比，用DHA+EPA的DG乳液的梗死体积％甚至更低。对于包含DHA和EPA两者(含有>90％的脂肪酸，10wt.％DG油)以及如本文所示具有小粒度和高负ζ-电位的DG乳液证明的这种改进，可以提供超过甚至我们初始的DG制剂的巨大疗效。增加这些乳液中DG油的水平可能会通过增加以急性方式递送的n-3FA的量来提供甚至进一步的治疗改进。
讨论
卒中是美国长期残疾的主要原因，也是死亡的第5大主要原因。迄今为止，t-PA仍然是FDA批准的唯一一种用于急性缺血性卒中治疗的药；然而，它的使用受限于3到4.5h的狭窄时间窗[2-4]。本文呈现的研究表明，n-3FA充当具有多效性的生物活性不饱和脂质，并在卒中动物模型中显示出神经保护特性。作为TG乳液急性注射的n-3FA可以在缺血性脑损伤后提供神经保护。n-3TG乳液，在缺血性损伤后立即给药，可导致脑的长期神经功能和组织形态学恢复。然而，当n-3FA作为n-3DG携带并在缺血性脑损伤后作为DG脂质乳液急性注射时，可以实现强大得多的神经保护。如本文所述，通过优化这些DG乳液的组成及其物理特征，n-3DG乳液具有为急性器官损伤包括但不限于卒中提供高效且耐贮存的治疗的潜力。
足够水平的n-3FA使神经元膜更加流动，并促进受体、离子通道和蛋白质复合物的活性相互作用[10、11]。本公开评估了包含EPA和DHA两者的n-3DG的增强的神经保护，作为具有小粒度和高负ζ电位的静脉内脂质乳液给药以进一步增强在缺血性卒中中的n-3FA脑递送和功效。DG由甘油主链和两个脂肪酰基基团组成，具有小的电中性极性头；这赋予了明显的锥形形状和进行快速跨双层运动的高能力。DG的生物物理特性和生理效应受其脂肪酰基基团的组成调节。作为细胞膜和脂质滴的完整组分，DG可以作为细胞信号转导中的第二信使发挥关键作用[12-16]。磷脂已显示掺入少量长链FATG(LCT)乳液(2.6摩尔％)，羰基基团的优先取向位于水-磷脂界面[17、18]。很少有物理研究强调了对膜双层组织和移动性的DG特性[19-22]。本文实验显示，与n-3TG相比，n-3DG乳液具有更有效的水解(图2A、2B)。这些结果强调，DG结构将促进乳液在体内转化为残粒样颗粒和游离脂肪酸，有助于n-3FA的更快的摄取并增强细胞保护作用的发生。
在缺血性损伤后立即用以TG乳液给药的DHA进行急性治疗显著地减弱脑损害[5、23]。数据证明，n-3DG乳液比n-3TG乳液显示出更强大的神经保护，表明DG与TG颗粒的代谢不同，并且n-3DG具有不同的生物学特性，并特异性触发和加速在卒中的初始阶段中至关重要的神经保护途径。这也应该有助于延长n-3DG乳液的治疗时间窗。由于DG可能影响磷脂双层中的结构和移动性动力学，DG乳液可能代表了用于n-3FA的“改进的”载体，以增加其对脑的生物利用度并加速其在调节神经保护途径中的分子作用。
尽管n-3FA可以通过大量合理的途径降低心血管疾病的发病率和死亡率，但使用长期补充的临床n-3FA试验结果好坏参半且存在争议[24-27]。本公开通过在损伤例如缺血性脑和心脏损伤后急性提供n-3FA来挑战现有的临床范例。口服补充后，n-3FA(例如，EPA和DHA)组织富集的速率很慢，在脑中尤其低。此外，游离FA不应直接通过肠胃外途径给药，因为它们可能充当清洁剂并具有毒副作用，诸如脑病[29]。根据本公开，将n-3FA(理想地包含DHA和EPA)掺入n-3FA DG中，作为具有小粒度和高负ζ电位的稳定的静脉内脂质乳液。
平均粒度影响乳液的稳定性和体内天数。ζ电位，作为流动颗粒与其周围分散剂层之间的电位电荷差，用作乳液稳定性的指标。根据本公开，据信减小的平均粒度和ζ电位将通过降低分离和聚集现象来增强DG相对于TG乳液的稳定性。使用n-3DG油(DHA/EPA～1.3/1,w/w)并将其掺入乳液中。如图1所示，与TG乳液(～240nm)相比，对于n-3DG(～110nm)观察到更小的平均粒径，这可以通过胞吞作用提供这些n-3DG乳液的更快和更高的摄取并递送至脑，以及更高的表面与核心DG比率以实现更快速的水解。参见图2(A、B)。在图1中，TG的ζ电位为-35mV，而DG的ζ电位为-51mV。两种乳液中界面处的净负电荷足以通过强静电排斥力防止絮凝和聚集；然而，DG中较低的负性应转化为DG乳液的更高稳定性。
DG乳液制剂的优化通过平均粒度、作为均匀性指标的PDI、ζ电位和电子显微镜进行筛选。油-水界面优势可能对本文所示的n-3DG乳液与细胞胞吞和分解代谢途径的相互作用产生积极影响。事实上，我们的研究显示，与TG相比，DG具有快得多的脂解。参见图2(A、B)。
注射后，n-3FA比较短链FA更有效地被摄取到脑中[10]。然而，没有关于作为n-3DG乳液注射的DHA或EPA的脑递送的信息。先前的数据显示，在注射放射性标记的n-3TG乳液后，血浆TG水平在30min内显著增加[23]，<0.5％的颗粒进入脑。观察到线粒体而非全脑中n-3FA水平的显著增加[5]。肝占n-3TG颗粒的最高器官摄取(>50％)[31]。这表明观察到的n-3TG乳液的神经保护可能取决于其在脑中的直接作用之前在其他器官中的其递送、“重新包装”和新陈代谢。据信，本文公开的DG乳液包含>90％的FA如DHA和EPA，并且具有小于200nm的小粒度，将允许更快的分解代谢摄取，并且应该具有额外的摄取途径，包括直接到脑。预计在急性给药后，n-3DG部分被肝摄取，并然后重新包装成游离FA或成肝脏产生的脂蛋白并直接运输到脑。然而，脑对完整乳液颗粒的摄取也可以有助于体内DG乳液的清除。预计本文所述的DG乳液代表用于n-3FA进入脑的更有效的载体，为卒中提供替代和/或附加治疗方法。
根据本公开，预计本文所述的DG乳液，与具有较大粒度(例如，大于200nm)或仅包含DHA或EPA的TG乳液或DG乳液相比，将增加n-3FA清除以及在脑中的掺入。我们预计缺血后，完整的全部DG颗粒也将穿过BBB，促进脑对n-3FA的摄取。我们预计，与n-3TG乳液相比，以及与具有较大粒度或仅包含DHA或EPA的DG乳液相比，本文所述的n-3DG乳液具有更大的神经保护。因此，我们预计，本文所述的n-3DG乳液将在缺血性损伤后显示延长的神经保护时间窗，例如，在大鼠中>6小时，证明了这些n-3DG乳液的优越性。
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Claims (95)
1.一种组合物，包括稳定的甘油二酯(DG)水包油乳液，其中，所述乳液具有200nm或更小的平均粒度和约-30mV或比-40mV更负的ζ电位(ZP)。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述DG包括至少约50％的ω(n-3)脂肪酸(FA)、或至少约75％的n-3FA、或至少约90％的n-3FA、或约100％的n-3FA。
3.如权利要求2所述的组合物，其中，所述n-3FA包括二十二碳六烯酸(DHA)和/或二十碳五烯酸(EPA)和/或二十二碳五烯酸(DPA)。
4.如权利要求3所述的组合物，其中，所述n-3FA包括DHA和EPA。
5.如权利要求4所述的组合物，其中，所述n-3FA是至少约50％的DHA、或至少约60％的DHA、或至少约75％的DHA。
6.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中，DG分子包括1,3DG和1,2DG。
7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是可注射的组合物。
8.如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包括所述组合物的按重量计约10％至约50％的脂质。
9.如权利要求8所述的组合物，其中，所述组合物包括所述组合物的按重量计约20％至约40％的脂质。
10.如权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中，所述乳液的平均粒度为约180nm或更小、或约150nm或更小、或约120nm或更小。
11.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中，所述乳液的ζ电位至少为负约-45mV、或至少为负约-50mV、或至少为负约-55mV。
12.如权利要求10或11所述的组合物，其中，所述乳液的多分散性指数(PDI)为约0.3或更小。
13.如权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中，按重量计至少约20％的所述组合物是DG油，或按重量计至少约25％的所述组合物是DG油，或按重量计至少约30％的所述组合物是DG油。
14.如权利要求13所述的组合物，其中，DG油按重量计占所述组合物的23％至30％。
15.如权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中，所述乳液包括一种或多种磷脂乳化剂。
16.如权利要求15所述的组合物，包括按重量计约0.5％至约2.4％的磷脂乳化剂。
17.如权利要求16所述的组合物，包括按重量计小于约1.0％的磷脂乳化剂。
18.如权利要求15至17中任一项所述的组合物，其中，所述磷脂乳化剂包括一种或多种磷酸甘油酯乳化剂。
19.如权利要求18所述的组合物，其中，所述一种或多种磷酸甘油酯乳化剂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和磷脂酸。
20.如权利要求19所述的组合物，包括磷脂酰胆碱乳化剂。
21.如权利要求15至20中任一项所述的组合物，包括一种或多种中链或长链FA作为助乳化剂。
22.如权利要求21所述的组合物，包括长链FA，任选地选自C16至C24 FA，并且其任选地是C18 FA。
23.如权利要求21或22所述的组合物，其中，所述助乳化剂包括饱和FA，任选地选自月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸。
24.如权利要求21至23中任一项所述的组合物，其中，所述助乳化剂包括不饱和FA，任选地选自油酸或亚麻酸。
25.如权利要求24所述的组合物，其中，所述助乳化剂是油酸，其任选地作为油酸钠添加。
26.如权利要求21至25中任一项所述的组合物，其中，所述助乳化剂以所述组合物总重量的约0.01％至约0.1％存在。
27.如权利要求26所述的组合物，其中，所述助乳化剂以所述组合物的按重量计约0.01％至约0.05％存在。
28.如权利要求1至27中任一项所述的组合物，其中，所述组合物与人血大致等渗，并且任选地包括一种或多种多元醇。
29.如权利要求28所述的组合物，其中，所述组合物包括甘油、山梨糖醇、木糖醇和葡萄糖中的一种或多种。
30.如权利要求29所述的组合物，包括占所述组合物的按重量计约1.5％至约5％的甘油。
31.如权利要求1至30中任一项所述的组合物，进一步包括一种或多种抗氧化剂。
32.如权利要求31所述的组合物，其中，所述抗氧化剂包括α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和抗坏血酸酯中的一种或多种。
33.如权利要求32所述的组合物，其中，所述抗氧化剂包括α-生育酚。
34.如权利要求32所述的组合物，其中，所述抗氧化剂包括抗坏血酸酯，其任选地为抗坏血酸棕榈酸酯。
35.如权利要求1至34中任一项所述的组合物，进一步包括金属螯合剂，其任选地为EDTA或EGTA。
36.如权利要求1至33中任一项所述的组合物，其中，按重量计乳化剂与DG的比率小于约1:8、或小于约1:10、或小于约1:12、或小于约1:15。
37.如权利要求1至36中任一项所述的组合物，其中，所述组合物的pH为约6至约10。
38.如权利要求1至37中任一项所述的组合物，包括约100mL或更小的体积、或约50mL或更小的体积、或约25mL或更小的体积。
39.如权利要求38所述的组合物，其中，所述组合物包含在预填充注射器中，任选地具有约1mL至约50mL的注射体积。
40.如权利要求1至39中任一项所述的组合物，其中，所述乳液至少约6个月、或至少约1年、或至少约18个月、或至少约2年基本上稳定。
41.如权利要求1至40中任一项所述的组合物，适用于静脉内或动脉内递送。
42.如权利要求1至40中任一项所述的组合物，适用于肠内递送，任选地通过胃内或十二指肠管内。
43.一种适用于静脉内或动脉内注射的组合物，所述组合物包括稳定的甘油二酯(DG)水包油乳液；
其中，所述乳液包括按重量计至少10％的DG油，所述DG油的酯化脂肪酸是至少约90％的n-3脂肪酸并且包括DHA和EPA；
其中所述乳液具有200nm或更小的平均粒度、0.3或更小的多分散性指数以及约-30mV或比-30mV更负的ζ电位(ZP)。
44.如权利要求43所述的组合物，其中，所述乳液包括按重量计至少约20％的DG油。
45.如权利要求44所述的组合物，其中，所述乳液包括按重量计23％至约30％的DG油，或包括按重量计约25％至约30％的DG油。
46.如权利要求43所述的组合物，其中，所述乳液进一步包括磷脂乳化剂，其任选地为磷脂酰胆碱。
47.如权利要求46所述的组合物，其中，所述磷脂乳化剂以所述组合物的按重量计1.0％或更少存在，或以所述组合物的按重量计0.75％或更少存在。
48.如权利要求47所述的组合物，其中，按重量计磷脂乳化剂与DG的比率小于约1:10、或小于约1:12、或小于约1:15。
49.如权利要求46至48中任一项所述的组合物，包括油酸助乳化剂，其任选地以按重量计约0.01％至约0.1％存在。
50.如权利要求43至49中任一项所述的组合物，其中，所述乳液具有的平均粒度为180nm或更小、或160nm或更小、或140nm或更小。
51.如权利要求48所述的组合物，其中，所述多分散性指数为0.25或更小。
52.如权利要求43至51中任一项所述的组合物，其中，所述粒度和/或多分散性指数稳定至少一年。
53.如权利要求52所述的组合物，其中，所述组合物包含在预填充注射器中，任选地具有约1mL至约50mL的注射体积。
54.如权利要求52所述的组合物，其中，所述组合物包装在小瓶中，任选地以每小瓶约25mL至约100mL的体积。
55.如权利要求1至54中任一项所述的组合物，其中，所述乳液与一种或多种其他亲脂剂共同配制。
56.如权利要求55所述的组合物，其中，所述亲脂剂是格列本脲。
57.如权利要求55所述的组合物，其中，所述亲脂剂是他汀，其任选地选自阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀和西立伐他汀。
58.如权利要求55所述的组合物，其中，所述亲脂剂是神经保护剂，其任选地选自17β-雌二醇、人参皂苷、黄体酮、辛伐他汀和美金刚。
59.如权利要求55所述的组合物，其中，所述亲脂剂是EPA、DHA或DPA的代谢物。
60.如权利要求59所述的组合物，其中，所述代谢物是消退素或保护素。
61.如权利要求60所述的组合物，其中，所述乳液包括NPD1。
62.一种治疗需要免于细胞死亡的患者的方法，包括向有需要的所述患者给药有效量的权利要求1至61中任一项所述的组合物。
63.如权利要求62所述的方法，其中，所述患者需要神经保护。
64.如权利要求62或63所述的方法，其中，所述患者处于缺血再灌注损伤的风险中。
65.如权利要求64所述的方法，其中，所述患者正在经历卒中。
66.如权利要求65所述的方法，其中，所述卒中是缺血性卒中。
67.如权利要求65所述的方法，其中，所述患者正在经历出血性卒中。
68.如权利要求65所述的方法，其中，所述患者正在经历新生儿卒中。
69.如权利要求68所述的方法，其中，受试者患有缺氧缺血性脑病(HIE)或处于缺氧缺血性脑病的风险中。
70.如权利要求62至69中任一项所述的方法，其中，在损伤发作的约20小时内向所述患者给药所述组合物。
71.如权利要求70所述的方法，其中，在卒中发作约6小时后，或卒中发作约8小时后，或卒中发作约10小时后，或卒中发作约12小时后，向所述患者给药所述组合物。
72.如权利要求70所述的方法，其中，在卒中发作的约2小时内或在卒中发作的约6小时内向所述患者给药所述组合物。
73.如权利要求62至72中任一项所述的方法，其中，在脑成像之前向所述患者给药所述组合物。
74.如权利要求73所述的方法，其中，所述患者随后接受溶栓疗法。
75.如权利要求74所述的方法，其中，所述患者在卒中发作约4.5小时后、或卒中发作约6小时后、或卒中发作约8小时后接受溶栓疗法。
76.如权利要求73所述的方法，其中，进行血栓切除术。
77.如权利要求76所述的方法，其中，在卒中发作约10小时后、或卒中发作约12小时后、或卒中发作后最多达24小时进行所述血栓切除术。
78.如权利要求62至77中任一项所述的方法，其中，所述患者在24小时内接受1至5剂量的所述组合物，任选地在溶栓疗法或血栓切除术之前接受至少一剂量，并且在溶栓疗法或血栓切除术之后接受至少一剂量。
79.如权利要求62至78中任一项所述的方法，其中，所述组合物静脉内或动脉内递送。
80.如权利要求62至78中任一项所述的方法，其中，所述组合物鞘内递送。
81.如权利要求62至78中任一项所述的方法，其中，所述组合物通过胃内或十二指肠管内递送。
82.如权利要求79所述的方法，其中，所述组合物通过动脉内递送选择性地给药至先前灌注不足的脑。
83.如权利要求62所述的方法，其中，所述患者患有创伤性脑损伤或处于创伤性脑损伤的风险中。
84.如权利要求83所述的方法，其中，在脑损伤的约1小时内、或脑损伤的约2小时内、或脑损伤的约12小时内、或脑损伤的约24小时内向所述患者给药所述组合物。
85.如权利要求84所述的方法，其中，以约每四小时一次至约每周一次的频率向所述患者给药所述组合物1至10次。
86.如权利要求62所述的方法，其中，所述患者患有创伤后应激障碍(PTSD)。
87.如权利要求86所述的方法，其中，约每周一次向所述患者给药所述组合物。
88.如权利要求62所述的方法，其中，所述患者患有脊髓损伤。
89.如权利要求88所述的方法，其中，在损伤的约1小时内或约2小时内向所述患者给药所述组合物。
90.如权利要求88或89所述的方法，其中，每周至少一次向所述患者给药所述组合物进行至少四周。
91.如权利要求62所述的方法，其中，所述患者患有急性器官损伤。
92.如权利要求62所述的方法，其中，所述患者患有神经退行性疾病。
93.如权利要求62所述的方法，其中，所述神经退行性疾病是ALS、多发性硬化、帕金森病、阿尔茨海默病或亨廷顿病。
94.如权利要求92或93所述的方法，其中，每周至少一次向所述患者给药所述组合物，和/或在复发期间给药。
95.如权利要求62至94中任一项所述的方法，其中，所述患者进一步接受用n-3FA任选地为DG或TG的口服补充疗法。
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