CN115980340A - 基于生物免疫传感器对微生物进行检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物免疫传感器领域，特别涉及基于生物免疫传感器对微生物进行检测的方法。本发明提供了一种生物免疫传感器以及基于生物免疫传感器对微生物进行检测的方法，基于磁力(10^‑5pN)的偏转模式相比于分子间作用力，不仅在力的数量级上有了很大提升，而且施加的磁力大小方向可控，磁力带动的微梁偏转使检测灵敏度降低6个数量级；与现有检测方法相比，检测灵敏度最高，操作简便，易发展成为一种适用于现场检测的仪器。

Description

基于生物免疫传感器对微生物进行检测的方法

技术领域

本发明涉及生物免疫传感器领域，特别涉及基于生物免疫传感器对微生物进行检测的方法。

背景技术

人民的生命健康问题一直是社会关心的热点问题，而随着全球化食品流动的加速，让对食品污染的控制变得日益困难，世界范围内因食入感染疾病的发生率居高不下，逐渐成为了各国的公共难题。造成食品污染的原因有很多，其中细菌是常见的罪魁祸首之一。部分细菌在果汁、牛奶以及水等液态样本中比较常见。其中，金黄色葡萄球菌可引起许多疾病，例如皮肤感染，脓肿，脓疱病，坏死性肺炎，败血病，导管诱发的心内膜炎，动脉硬化，以及骨髓炎等。在医院中约有20％的手术部位感染是由金黄色葡萄球菌引起的。而且约有30％的健康人被金黄色葡萄球菌感染后成为无症状感染者。而沙门氏杆菌引起的发热性疾病伤寒，在全世界每年约造成2000万病例和20万人死亡。2018年全球食品安全检测市场约为170亿美元。到2023年底，预计会达到约246亿美元，年增长速度约为7.7％，显然全世界食源性疾病的威胁正推动着食品检测行业的高速发展。

生物性污染物的危害与化学性的危害是不一样的。致病微生物能不断增殖，即使食品中浓度很低的时候不会致病，但是随着时间的推移其不断增殖的特性会使其含量不断增多从而致病。当致病微生物入侵人体感染后，临床病状上的表现比较复杂，有的疾病并不会立刻爆发，而是在人体内进行一段时间的潜伏。而且这些微生物是有生命的，他们依靠宿主能够长时间生存，如果不及时处理，可能存在扩散危险。另外，针对不同宿主，微生物还会使其展现出不同程度的症状。因此，需要发展有效的手段，在微生物浓度很低的时候能够实现对其进行检测从而完成早期预防。

在食品被生物性污染的早期，其含有的生物性污染物含量是较低或极低的，这导致食品安全部门在利用传统的方法检测食品是否被生物性污染时，某些被污染的食品可能蒙混过关，贴上了安全食用的标签。而这些食品中的生物性污染物得以不断繁殖，传播，甚至发生变异，对人体的健康和社会的稳定带来极大的危害和不确定性。传统的检测方法如琼脂培养基法，不仅灵敏度有限，而且需要数天对细菌进行培养扩增。侧流免疫测定法(Lateral flow immunoassay，LFIA)和ELISA，通过修饰固体基底上的抗体来检测目标污染物。两种方法皆需对细菌进行一天培养，使用的抗体制备过程复杂、周期长，并且很多抗体的获取难度大。同时需要对抗体进行标记，这还会损伤抗体活性。最重要的是这两种检测方法的检测灵敏度对于被早期低浓度生物性污染物污染的食品是无法完成筛选的。核酸法即聚合酶链式反应(PCR)，对通过对微生物的遗传物质扩增达到检测目的。此方法虽一定程度上提高了检测灵敏度，但还是不够的，而且扩增步骤复杂耗时，需要添加适当的标记。针对于被细菌毒素，霉菌毒素污染的食品更无法使用此方法检测，可检测的目标物质具有局限性。现有的检测方法耗时，需标记，被检测物质有局限性，且灵敏度难以满足食品生物性污染物的低浓度(100cfumL^-1)或极低浓度(10cfu mL^-1)的快速检测，即生物性污染物的早期发现。尽管已经有些工作对细菌开发了高度灵敏的检测方法，但是其敏感性仍然受到食品样品中病原体浓度低的限制。很多生物性污染物，如细菌，病毒等，在感染早期很难被发现，很大程度的原因是现有技术的检测灵敏度不够，面对低浓度细菌(<10cfumL^-1)时，检测会呈现出假阴性的结果，但实际上极少量的细菌病毒就会呈指数型无限扩增，造成不可挽回的危害。因此研发克服病原体浓度低限制的新检测方法，提出提高微生物病原体检测灵敏度的新策略将具有巨大的价值。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了基于生物免疫传感器对微生物进行检测的方法。本发明提供了一种基于磁增强的微梁免疫传感快速检测微生物的方法。本发明通过实验发现本发明中微生物检测方法及生物免疫传感器与现有生物传感器相比，检测灵敏度高，操作简便，易发展成为一种适用于现场检测的仪器。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种生物免疫传感器，其包括富集浓缩元件和检测元件；

所述富集浓缩元件包括磁颗粒、第一特异性探针分子和氧化石墨烯；

所述磁颗粒与所述氧化石墨烯结合；

所述第一特异性探针分子与所述氧化石墨烯结合；

所述检测元件包括第二特异性探针分子和悬臂梁；

所述悬臂梁的部分梁修饰有所述第二特异性探针分子；

所述第一特异性探针分子和所述第二特异性探针分子可以相同，也可以不同。

在本发明的一些具体实施方案中，所述第一特异性探针分子或所述第二特异性探针分子独立包括适配体。

在本发明中，适配体只是特异性探针分子的一种，其他的特异性探针分子例如抗体、PNA均可以替换适配体。凡是能够与待测样本特异性结合的物质均在本发明的保护范围之内，本发明在此不做限定。

在一些具体实施方案中，所述磁颗粒包括MNP；所述MNP的粒径包括250nm。

在一些具体实施方案中，所述第一适配体(aptamer)序列如SEQ ID NO:1所示，具体为：5’NH2 C6-ATC CGT CAC ACC TGC TCT ACG GCG CTCCCA ACA GGC TC TCC TTA CGGCAT ATT ATG GTG TTG GCT CCC GTA TTTTTT-3’；所述第二适配体(aptamer)序列如SEQ IDNO:2所示，具体为：5'SH C6-ATC CGT CAC ACC TGC TCT ACG GCG CTC CCA ACA GGC CTCTCC TTA CGG CAT ATT ATG GTG TTG GCT CCC GTA TTT TTT-3'。

在本发明的一些具体实施方案中，所述修饰包括：

(I)、所述悬臂梁的第2n-1号梁修饰有所述第二特异性探针分子；所述悬臂梁的第2n号梁不修饰所述第二特异性探针分子；或

(II)、所述悬臂梁的第2n号梁修饰有所述第二特异性探针分子；所述悬臂梁的第2n-1号梁不修饰所述第二特异性探针分子；

所述n为自然整数。

在本发明的一些具体实施方案中，所述修饰包括：

(I)、所述悬臂梁长度的三分之二修饰有所述第二特异性探针分子；或

(II)、所述悬臂梁长度的三分之一前端修饰有所述第二特异性探针分子。

具体地，当微生物浓度不低于10²cfu/mL时，所述悬臂梁长度的三分之二修饰有所述第二特异性探针分子；当微生物浓度低于10²cfu/mL时，所述悬臂梁长度的三分之一修饰有所述第二特异性探针分子。

本发明还提供了所述生物免疫传感器的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、取所述磁颗粒、所述第一特异性探针分子和所述氧化石墨烯偶联，获得所述富集浓缩元件；

步骤2、取所述悬臂梁经所述第二特异性探针分子修饰，获得所述检测元件；

所述第一特异性探针分子和所述第二特异性探针分子可以相同，也可以不同。

本发明还提供了如下任意项在制备检测装置中的应用：

(I)、所述的生物免疫传感器；和/或

(II)、所述制备方法制得的生物免疫传感器。

本发明还提供了一种检测装置，其包括如下任意项，以及可接受的部件：

(I)、所述生物免疫传感器；和/或

(II)、所述制备方法制得的生物免疫传感器。

本发明还提供了一种检测方法，基于如下任意项对待测样本进行检测：

(I)、所述生物免疫传感器；和/或

(II)、所述制备方法制得的生物免疫传感器；和/或

(III)、所述检测装置；

所述待测样本包括微生物。

所述微生物包括细菌和/或病毒；所述细菌包括大肠杆菌E.coli DH5α；所述病毒包括新冠病毒或猴痘病毒。

在本发明的一些具体实施方案中，所述检测方法包括如下步骤：

步骤1、取所述富集浓缩元件对待测样本进行浓缩富集，得到浓缩富集后的待测样本；所述第一特异性探针分子与所述待测样本结合；

步骤2、经所述检测元件对所述浓缩富集后的待测样本进行检测；所述第二特异性探针分子与所述浓缩富集后的待测样本结合。

在本发明到的一些具体实施方案中，被MNP@aptamer捕获的细菌形成的MNP@aptamer@bacteria复合物磁场中受磁力作用逐渐都富集在试管底部，并团聚成一小团肉眼可见的黑色颗粒。此时将试管与磁力架整体从冰箱中取出并保持试管位置稳定，轻轻打开试管口，用移液枪沿着管壁慢慢吸走上清液，保留底部磁场束缚住的黑色颗粒。待上清液清除完毕后，可将试管从磁力架上取下，再加入200μL 1×PBS吹打均匀使聚集在一起的MNP@aptamer@bacteria重新分散到缓冲液中。到此完成MNP对细菌的富集浓缩操作。

所述检测包括：定性检测和/或定量检测；

所述检测包括：取所述浓缩富集后的待测样本，与所述检测元件混合，静置，在磁场作用下，悬臂梁发生偏转，获得偏转信号；

所述定性检测包括：根据预设的偏转信号阈值和所述偏转信号判断所述待测样本中是否包含所述微生物；和/或

所述定量检测包括：取已知浓度的待测样本与其产生的偏转信号建立标准偏转曲线，根据待测样本的所述偏转信号获得其浓度。

在本发明的一些具体实施方案中，取阵列用“piranhadip”在微孔板孔中浸泡10分钟，然后用无菌水洗三次。再将干燥处理后的阵列固定在毛细管差分修饰装置的固定装置中，通过位移平台将四条毛细管与阵列的1、3、5、7号悬臂梁慢慢对准，最终使1、3、5、7号悬臂梁长度的三分之二分别进入相应的毛细管；在毛细管的另一端注入用1×PBS稀释的5μM的第二特异性探针分子溶液(200μL)，在室温(25℃)下对阵列进行1.5小时的部分修饰。在细菌浓度较高(不低于10²cfu/mL)时，阵列梁区别修饰区域接近整个悬臂梁的金表面(图12a)，在细菌浓度极低(不低于10²cfu/mL)时，区别修饰时，只修饰微悬臂梁的前三分之一段(图12b)，这样控制多数细菌可以在梁的前端区域结合，产生更大的磁力。随后取出阵列，用1×PBS洗涤三次并干燥后，放置于微孔板中；将富集浓缩后的200μL MNP@GO@aptamer@bacteria溶液注入微孔板孔中，在室温下静置1～2h，使液体中的MNP@GO@aptamer@bacteria充分被微梁上的特异性探针分子捕获。取出微梁阵列，用1×PBS充分冲洗，洗除非特异性吸附在微梁表面的MNP；阵列固定于微梁检测平台的反应池中，开启蠕动泵流动1×PBS，排尽气泡后停止蠕动泵。在悬臂梁达到一个恒定的漂移，在阵列下方放置垂直方向的钕磁铁，悬臂梁将在磁场中发生弯曲。

本发明包括但不限于取得如下有益效果：

(1)检测灵敏度降低了。传统的微梁检测方法是利用目标分子与特异性探针分子之间的亲和力(分子间作用力10^-12pN)改变了微梁的表面应力状态，这种分子间作用力不仅力的数量级比较小，而且这种力的方向随机大小不可控。本技术提出的基于磁力(10^-5pN)的偏转模式相比于分子间作用力，不仅在力的数量级上有了很大提升，而且施加的磁力大小方向可控，磁力带动的微梁偏转使检测灵敏度降低6个数量级(图7和图10)。

(2)磁颗粒对检测样本(如细菌)的浓缩富集，可以不用洗脱，继续结合到微悬臂梁上，达到在磁场中受磁力的效果。这样本技术中的磁颗粒起到了两种作用，浓缩富集和磁力放大。

(3)本发明提供的基于磁增强的微梁免疫传感快速检测细菌的方法，与现有的生物传感器相比，检测灵敏度最高，操作简便，易发展成为一种适用于现场检测的仪器。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示富集和E.coli DH5α微梁检测流程示意图；

图2示E.coli DH5α培养与计数过程；

图3示涂覆氧化石墨烯的磁颗粒的制备；

图4示涂覆氧化石墨烯且偶联适配体的磁颗粒的制备；

图5示MNP@aptamer与MNP@GO@aptamer的透射电镜表征图；

图6示基于磁力的微梁检测；

图7示基于应力模式的适配体检测E.coli DH5α；

图8示MNP@aptamer富集E.coli DH5α前后对比；

图9示MNP@aptamer对E.coli DH5α的磁力检测结果；

图10示MNP@GO@aptamer对E.coli DH5α的磁力检测结果；

图11示三种检测模式的拟合曲线，其中，插图为虚线框中的两条曲线放大图；

图12示适配体的区别修饰；其中，(a)示毛细管修饰顶面的全部金表面及其偏转量；(b)示毛细管仅修饰金表面前端及其偏转量。

具体实施方式

本发明公开了一种基于生物免疫传感器对微生物进行检测的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的目的在于提供一种微生物检测方法，提出一种全新的基于氧化石墨烯复合磁颗粒的磁力模式的微悬臂梁传感器，以应对早期细菌、病毒等物质检测不出来的窘境。

本发明的目的还在于提供一种氧化石墨烯复合磁微粒。

为了实现上述目的，技术方案如下：本发明提供了一种磁颗粒富集浓缩复杂样本中细菌并利用磁场装置进一步放大微悬臂梁传感器响应信号的方法，结合光杠杆原理的读出方式检测偏转信号。首先，合成第一适配体(aptamer)、磁颗粒(MNP)和氧化石墨烯(GO)的偶联物(MNP@GO@aptamer)，将其与细菌溶液混合，形成MNP@GO@aptamer@bacteria，利用磁颗粒的磁性，施加外界磁场将复合物MNP@GO@aptamer@bacteria吸收到一侧管壁，用移液枪吸走剩余液体，获得浓缩提纯后的细菌磁颗粒复合物。接着，在悬臂梁表面区别修饰(1、3、5、7号梁修饰适配体，2、4、6、8号梁不修饰)可以特异性捕获细菌的第二适配体，将MNP@GO@aptamer@bacteria与修饰的微悬臂梁混合，结合一段时间后，清洗悬臂梁，将其装进密闭容器内，两端连接导管，接通蠕动泵，流动缓冲液，使整个密闭容器充满液体，待微梁稳定后，在容器后方加入磁场装置，使磁颗粒在磁场作用下带动微梁发生偏转，软件记录与待检测物质的浓度相关的偏转信号。整体检测的流程示意图如图1所示。

本发明取得的有益效果如下：

(1)检测灵敏度降低了。传统的微梁检测方法是利用目标分子与特异性探针分子之间的亲和力(分子间作用力10^-12pN)改变了微梁的表面应力状态，这种分子间作用力不仅力的数量级比较小，而且这种力的方向随机大小不可控。本技术提出的基于磁力(10^-5pN)的偏转模式相比于分子间作用力，不仅在力的数量级上有了很大提升，而且施加的磁力大小方向可控，磁力带动的微梁偏转使检测灵敏度降低6个数量级(图7和图10)。

(2)磁颗粒对检测样本(如细菌)的浓缩富集，可以不用洗脱，继续结合到微悬臂梁上，达到在磁场中受磁力的效果。这样本技术中的磁颗粒起到了两种作用，浓缩富集和磁力放大。

(3)本发明提供的基于磁增强的微梁免疫传感快速检测细菌的方法，与现有的生物传感器相比，检测灵敏度最高，操作简便，易发展成为一种适用于现场检测的仪器。

本发明采用的第一适配体(aptamer)序列如SEQ ID NO:1所示，具体为：5’NH2 C6-ATC CGT CAC ACC TGC TCT ACG GCG CTCCCA ACA GGC TC TCC TTA CGG CAT ATT ATG GTGTTG GCT CCC GTA TTTTTT-3’。

本发明采用的第二适配体(aptamer)序列如SEQ ID NO:2所示，具体为：5'SH C6-ATC CGT CAC ACC TGC TCT ACG GCG CTC CCA ACA GGC CTC TCC TTA CGG CAT ATT ATGGTG TTG GCT CCC GTA TTT TTT-3'。

如无特殊说明，本发明提供的基于生物免疫传感器对微生物进行检测的方法中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

制备例1大肠杆菌(E.coli DH5α)原液的制备与计数

全程在无菌室内操作，使用的试管，移液枪，枪头，培养皿(直径10cm)等耗材在高温灭菌锅内进行0.1MPa，121℃，20分钟高压蒸汽灭菌。如图2所示，将大肠杆菌(E.coli DH5α)接种在含有10mL LB肉汤培养液的试管中，在37℃的恒温摇动培养箱上以220rpm的速度培养12h。得到大肠杆菌(E.coli DH5α)原液。

取无菌培养皿30套，分别用记号笔标10¹～10¹⁰(稀释度)各3套。再取30支盛有90μL无菌水的试管，依次用记号笔标10¹～10¹⁰各3支。然后，从扩增后的10mL E.coli DH5α原液中取30μL，3等份加入3个标有10¹的试管中，此为10倍稀释，并用此溶液多次冲洗枪头使之充分混匀。再从3份10¹的试管中分别吸取10μL准确注入标有10²的3个试管中，此为100倍稀释。以此类推完成接下来的稀释操作。其余E.coli DH5α原液暂存于4℃冰箱保存。将30支试管中的E.coli DH5α样品用移液枪依次均匀的加入到相应稀释度的培养皿中，每操作一次换一个枪头。将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在45℃下分别注入培养皿中，转动使菌液在平板上铺展开。凝固后把平板倒过来放置于恒温培养箱，在30℃下进行12～16h的培养后将其取出。观察并挑选菌落密度便于计数的稀释梯度，使用细菌计数器分别计算出此稀释浓度的3个平板中的E.coli DH5α菌落个数，再通过稀释倍数计算E.coli DH5α原液中E.coli DH5α的总个数。

制备例2大肠杆菌特异性适配体偶联磁颗粒(MNP@aptamer)的制备

使用E.coli DH5α特异性适配体可特异性识别E.coli DH5α细胞膜蛋白。因此，将适配体偶联至MNP表面即可实现MNP对细菌的识别。E.coli DH5α的尺寸约为2～3μm，此处选择粒径为250nm的MNP进行适配体的偶联。取50mg 250nm羧基化MNP至100KD超滤管，进行4000g高速离心。把上清液去除，加入100mmol/L MES充分洗涤两次，再加入3.8125mL MES重新溶解MNP颗粒形成悬液。将MNP悬液置于涡旋振荡器中，依次加入7.5OD第一适配体(约937.5μL第一适配体母液)、50mg EDC(250μL，200mg/mL)。随即迅速颠倒使悬液混合均匀后置于恒温振荡器中以37℃震荡反应过夜20h(转速150rpm)。适配体在5’端修饰有氨基基团，与表面羧基化的MNP在上述操作下，使羧基与氨基反应形成酰胺键，得到适配体与磁颗粒的复合物溶液。反应结束后，将反应液取出，再用高速离心机充分离心，收集上清液用作偶联率的测试，偶联率为89.3％。使用纯化水超滤洗涤颗粒3次，并最终定容至5mL，即为偶联了aptamer的MNP，电镜表征如图5，获得的MNP@aptamer放置于4℃冰箱备用。

制备例3涂覆氧化石墨烯(GO)的磁颗粒偶联适配体(MNP@GO@aptamer)的制备

MNP表面涂覆GO可以增大MNP的表面积与活性位点并增强MNP的顺磁性，从而有望提升适配体的偶联效率与MNP复合物在磁场中所受磁力的大小。此处选择粒径为250nm的MNP进行GO的涂覆及适配体的偶联。取20mg GO采用15mmol/L MES充分洗涤两次，定容至9mL。取50mg 250nm氨基化MNP用15mmol/L MES清洗一次后，用高速离心机4000g离心完全，去除上清液，加入9mL GO(20mg)，再加入10mg EDC(50μL，200mg/mL)将总体积定容至10mL。将混合均匀的溶液放置在37℃条件下过夜，离心后把上清液弃除，用纯化水充分洗涤颗粒5次，即为涂覆了GO的MNP(MNP@GO)(图3)。

取制备的MNP@GO混悬液50mg离心弃除上清液，加入15mmol/L MES充分洗涤两次，并用MES重悬液定容至4.0375mL。将MNP@GO悬液置于涡旋振荡器中，分别加入7.5OD第一适配体(约937.5μL第一适配体母液)、5mg EDC(25μL，200mg/mL)，立刻颠倒使悬液混合均匀后置于恒温振荡器中以37℃震荡反应过夜20h(转速150rpm)。GO表面有羧基功能团，与表面氨基化的MNP在上述操作下，可以形成酰胺键从而使GO涂覆在MNP表面得到MNP@GO。同时氨基化的适配体也能通过酰胺键偶联至GO表面，形成MNP@GO@aptamer。过夜后，将反应液取出进行离心处理，收集的上清液用作适配体偶联率的测试，偶联率为99.5％。颗粒用纯化水超滤洗涤3次，并最终定容至5mL，即为涂覆了GO且偶联了aptamer的MNP(图4)。获得的MNP@GO@aptamer放置于4℃冰箱备用，电镜表征如图5，可以明显看到氧化石墨烯薄膜上有一些偶联上的磁颗粒。

实施例1磁颗粒与E.coli DH5α的浓缩富集过程

MNP@aptamer与E.coli DH5α的浓缩富集：

(1)用制备例1制得的E.coli DH5α原液、制备例2制得的MNP@aptamer和1×PBS缓冲液在灭菌处理的试管中配置成需检测的E.coli DH5α浓度和20μg/mL的MNP@aptamer，并最终定容至4mL；

(2)将试管在室温下静置1～2h，使得MNP@aptamer尽量与E.coli DH5α充分结合。为抑制E.coli DH5α的增殖速度，将试管在磁力架上固定，置于4℃冰箱中过夜；

(3)被MNP@aptamer捕获的E.coli DH5α形成的MNP@aptamer@bacteria复合物磁场中受磁力作用逐渐都富集在试管底部，并团聚成一小团肉眼可见的黑色颗粒。此时将试管与磁力架整体从冰箱中取出并保持试管位置稳定，轻轻打开试管口，用移液枪沿着管壁慢慢吸走上清液，保留底部磁场束缚住的黑色颗粒。

(4)待上清液清除完毕后，可将试管从磁力架上取下，再加入200μL1×PBS吹打均匀使聚集在一起的MNP@aptamer@bacteria重新分散到缓冲液中。到此完成MNP对E.coliDH5α的富集浓缩操作。

MNP@GO@aptamer与E.coli DH5α的浓缩富集：

(1)用制备例1制得的E.coli DH5α原液、制备例3制得的MNP@GO@aptamer和1×PBS缓冲液在灭菌处理的试管中配置成需检测的E.coli DH5α浓度和20μg/mL的MNP@GO@aptamer，并最终定容至4mL；

(2)将试管在室温下静置1～2h，使得MNP@GO@aptamer尽量与E.coli DH5α充分结合。为抑制E.coli DH5α的增殖速度，将试管在磁力架上固定，置于4℃冰箱中过夜；

(3)被MNP@GO@aptamer捕获的E.coli DH5α形成的MNP@GO@aptamer@bacteria复合物磁场中受磁力作用逐渐都富集在试管底部，并团聚成一小团肉眼可见的黑色颗粒。此时将试管与磁力架整体从冰箱中取出并保持试管位置稳定，轻轻打开试管口，用移液枪沿着管壁慢慢吸走上清液，保留底部磁场束缚住的黑色颗粒；

(4)待上清液清除完毕后，可将试管从磁力架上取下，再加入200μL1×PBS吹打均匀使聚集在一起的MNP@GO@aptamer@bacteria重新分散到缓冲液中。到此完成MNP@GO对E.coli DH5α的富集浓缩操作。

实施例2氧化石墨烯结合磁颗粒的磁增强检测过程

(1)取阵列用“piranhadip”在微孔板孔中浸泡10分钟，然后用无菌水洗三次。再将干燥处理后的阵列固定在毛细管差分修饰装置的固定装置中，通过位移平台将四条毛细管与阵列的1、3、5、7号悬臂梁慢慢对准，最终使1、3、5、7号悬臂梁长度的三分之二分别进入相应的毛细管；

(2)在毛细管的另一端注入用1×PBS稀释的5μmol/L的第二适配体溶液(200μL)，在室温(25℃)下对阵列进行1.5h的部分修饰。在细菌浓度较高时，阵列梁区别修饰区域接近整个悬臂梁的金表面(图12a)，在细菌浓度极低时，区别修饰时，只修饰微悬臂梁的前端区域(图12b)，这样控制多数细菌可以在梁的前端区域结合，产生更大的磁力。随后取出阵列，用1×PBS洗涤三次并干燥后，放置于微孔板中；

(3)将实施例1中富集浓缩后的200μL MNP@GO@aptamer@bacteria溶液注入微孔板孔中，在室温下静置1～2h，使液体中的MNP@GO@aptamer@bacteria充分被微梁上的适配体捕获。取出微梁阵列，用1×PBS充分冲洗，洗除非特异性吸附在微梁表面的MNP；

(4)阵列固定于微梁检测平台的反应池中，开启蠕动泵流动1×PBS，排尽气泡后停止蠕动泵。在悬臂梁达到一个恒定的漂移，在阵列下方放置垂直方向的钕磁铁，悬臂梁将在磁场中发生弯曲(图6)。

效果例1基于应力模式的直接检测E.coli DH5α

微梁阵列的1、3、5、7号梁修饰了可以特异性捕获E.coli DH5α的第二适配体作为实验梁，2、4、6、8号悬臂梁仅用MCH小分子封闭作为对照梁。依据光杠杆法，入射激光打在微悬臂梁的尖端，反射激光被光位置敏感探测器(PSD)接收，分别在PSD的四个象限产生与光强对应的电流信号，以此判定梁尖端的位移量。用上述的光杠杆法分别得到八根梁的位移变化曲线，对四根实验梁和四根对照梁分别求平均，将两者的平均值相减，得到差分偏转信号。微梁装进反应池并在1×PBS缓冲液中稳定，依次加入不同浓度的E.coli DH5α样本溶液。当加入10⁹cfumL^-1的E.coli DH5α溶液后，微梁在60分钟时就出现了高达564nm的差分偏转。继续尝试对相对低浓度的E.coli DH5α的检测，依次加入的10⁸cfumL^-1和10⁷cfu mL^-1的E.coli DH5α溶液分别引起了微梁在60分钟时250nm和42nm的差分偏转。然而当10⁶cfu mL^-1的E.coli DH5α溶液注入后，微梁在60分钟时仅显示出了约8nm的差分偏转，特异性信号显然已经不太明显了(图7)。考虑到方法在测试中的信噪比为2nm，三倍信噪比作为检测限，因此可以看出使用普通的基于适配体的微梁生化传感方法直接检测E.coli DH5α的检测极限只能达到10⁶cfumL^-1。

效果例2基于磁颗粒富集的磁力检测模式检测大肠杆菌DH5α

首先使用制备例2中制备的MNP@aptamer对E.coli DH5α进行富集与浓缩，配置的4mL试管溶液在磁力架上固定后放置于4℃冰箱中过夜。可明显发现富集前的溶液是较为清澈的，溶液中肉眼无法观察到明显的磁颗粒团聚。而过夜富集后在磁力架上靠近磁铁的位置出现了一团肉眼可见的黑色团聚物，这就是在磁力作用下团聚在一起的MNP@aptamer@bacteria复合物(图8)。这一现象表明，MNP@aptamer是可以在液体溶液中特异性识别E.coli DH5α并在磁力的作用下向试管底部定向运动，实现了对E.coli DH5α的富集。将黑色团聚物保留吸走清液，再注入200μL 1×PBS就配置成了浓缩的E.coli DH5α溶液。成功浓缩的E.coli DH5α溶液为在复杂样品中的检测提供了可行性。

浓缩的E.coli DH5α与修饰了第二适配体的阵列在酶孔板中完成结合反应。将阵列清洗，干燥，固定于反应池，用1×PBS排尽气泡后即停止液体流动。在观察到阵列处于平衡状态时，在阵列的垂直下方放置磁铁装置开始施加磁场。在一个二维位移平台上固定了个钕磁铁作为磁场发生器。当10⁵cfu mL^-1的E.coli DH5α被MNP@aptamer提纯，与区别修饰了E.coli DH5α特异性第二适配体的阵列反应后，磁场的加入使得修饰了适配体的梁在磁力的作用下迅速背向金面偏转，最终在60分钟时达到56nm的差分偏转。

然而，基于适配体的微梁传感方法在对10⁶cfumL^-1的E.coli DH5α直接检测时，微梁阵列就已经几乎没有明显的差分偏转(约8nm)了。通过磁颗粒的富集浓缩及检测时磁颗粒产生磁力的放大作用，微梁对10⁵cfumL^-1的E.coli DH5α样品依然是有显著响应的，这表明借助磁力是可以显著提升悬臂梁表面的应力的，从而提升微梁生化传感方法对E.coliDH5α的检测性能。因此继续降低E.coli DH5α样品浓度，以探索磁颗粒富集及增强检测法的检测极限。以十倍稀释为梯度，分别配置了10⁴cfumL^-1、10³cfumL^-1和10²cfumL^-1的E.coliDH5α样品溶液。经过测试，发现这3中浓度的E.coli DH5α分别能引起微梁阵列50nm、22nm和7nm的差分偏转(图9)。考虑到方法在测试中的信噪比为2nm，三倍信噪比作为检测限，磁颗粒富集及增强检测法对E.coli DH5α的检测极限应为10²cfumL^-1。

显然，与效果例中基于基于应力模式的直接检测大肠杆菌DH5H的微梁生化传感方法相比，提出的磁颗粒富集及增强一体化的微梁生化传感方法将对E.coli DH5α的检测性能提升了高达4个数量级，在低浓度的E.coli DH5α溶液(100cfumL^-1左右)中依然实现了灵敏、定量且快速的检测。这说明有效的利用磁力可在微梁表面产生比分子间作用力更大的应力变化，从而发展更高性能的检测方法。

效果例3氧化石墨烯修饰的磁颗粒富集及磁力检测大肠杆菌DH5α

使用制备例3制备的MNP@GO@aptamer对E.coli DH5α进行富集与浓缩,得到浓缩的E.coli DH5α溶液。浓缩的E.coli DH5α与修饰了第二适配体的阵列在酶孔板中完成结合反应。在进行完处理步骤及阵列平衡后，施加磁场。当对10²cfumL^-1的E.coli DH5α浓缩且与阵列反应后，磁场的加入使得修饰了第二适配体的梁在磁力的作用下迅速背向金面偏转，最终在60分钟时达到90nm的差分偏转。而磁颗粒增强的微梁生化传感方法在对10²cfumL^-1的E.coli DH5α检测时，悬臂梁仅仅只有7nm的差分偏转。这证明涂覆了GO的MNP可以进一步提升MNP在磁场中受到的磁力大小，从而进一步增大悬臂梁的偏转。当继续降低E.coli DH5α样品浓度时，10cfumL^-1和1cfumL^-1的E.coli DH5α仍然能分别引起悬臂梁45nm和9nm的差分偏转(图10)。这说明对于样品溶液中单个存在的E.coli DH5α，此方法依然能准确的识别出来，灵敏度极低。MNP@GO增强的微悬臂梁生化传感方法相比于MNP增强的微梁生化传感方法对E.coli DH5α的检测性能再次提升了2个数量级。这使得微梁生化传感方法实现了对极低浓度E.coli DH5α样品(1cfumL^-1)的灵敏检测，可应用于某些细菌不好检出的需求场景中。

图11将效果例1(基于应力模式的直接检测)、效果例2(基于磁颗粒富集的磁力检测模式检测)和效果例3(基于氧化石墨烯修饰的磁颗粒富集的磁力检测模式检测)的结果拟合并比较，得出将氧化石墨烯偶联上磁颗粒后的效果远好于其他两种方案。

效果例4氧化石墨烯修饰的磁颗粒富集及磁力检测病毒

将修饰在梁上的探针分子换成肽核酸(PNA)，与新冠病毒或猴痘病毒的核酸序列一端结合，另一端与氧化石墨烯修饰的磁颗粒结合，利用磁力检测模式，也可实现病毒核酸序列的高灵敏检测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.生物免疫传感器，其特征在于，其包括富集浓缩元件和检测元件；

所述富集浓缩元件包括磁颗粒、第一特异性探针分子和氧化石墨烯；

所述磁颗粒与所述氧化石墨烯结合；

所述第一特异性探针分子与所述氧化石墨烯结合；

所述检测元件包括第二特异性探针分子和悬臂梁；

所述悬臂梁的部分梁修饰有所述第二特异性探针分子；

所述第一特异性探针分子和所述第二特异性探针分子可以相同，也可以不同。

2.如权利要求1所述的生物免疫传感器，其特征在于，所述修饰包括：

(I)、所述悬臂梁的第2n-1号梁修饰有所述第二特异性探针分子；所述悬臂梁的第2n号梁不修饰所述第二特异性探针分子；或

(II)、所述悬臂梁的第2n号梁修饰有所述第二特异性探针分子；所述悬臂梁的第2n-1号梁不修饰所述第二特异性探针分子；

所述n为自然整数。

3.如权利要求1或2所述的生物免疫传感器，其特征在于，所述修饰包括：

(I)、所述悬臂梁长度的三分之二修饰有所述第二特异性探针分子；或

(II)、所述悬臂梁长度的三分之一修饰有所述第二特异性探针分子。

4.如权利要求1至3任一项所述生物免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1、取所述磁颗粒、所述第一特异性探针分子和所述氧化石墨烯偶联，获得所述富集浓缩元件；

步骤2、取所述悬臂梁经所述第二特异性探针分子修饰，获得所述检测元件；

所述第一特异性探针分子和所述第二特异性探针分子可以相同，也可以不同。

5.如下任意项在制备检测装置中的应用：

(I)、如权利要求1至3任一项所述的生物免疫传感器；和/或

(II)、如权利要求4所述制备方法制得的生物免疫传感器。

6.检测装置，其特征在于，其包括如下任意项，以及可接受的部件：

(I)、如权利要求1至3任一项所述的生物免疫传感器；和/或

(II)、如权利要求4所述制备方法制得的生物免疫传感器。

7.检测方法，其特征在于，基于如下任意项对待测样本进行检测：

(I)、如权利要求1至3任一项所述的生物免疫传感器；和/或

(II)、如权利要求4所述制备方法制得的生物免疫传感器；和/或

(III)、如权利要求6所述的检测装置；

所述待测样本包括微生物。

8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述微生物包括细菌和/或病毒；所述细菌包括大肠杆菌E.coli DH5α；所述病毒包括新冠病毒或猴痘病毒。

9.如权利要求7或8所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1、取所述富集浓缩元件对待测样本进行浓缩富集，得到浓缩富集后的待测样本；所述第一特异性探针分子与所述待测样本结合；

步骤2、经所述检测元件对所述浓缩富集后的待测样本进行检测；所述第二特异性探针分子与所述浓缩富集后的待测样本结合。

10.如权利要求7至9任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测包括：定性检测和/或定量检测；

所述检测包括：取所述浓缩富集后的待测样本，与所述检测元件混合，静置，在磁场作用下，悬臂梁发生偏转，获得偏转信号；

所述定性检测包括：根据预设的偏转信号阈值和所述偏转信号判断所述待测样本中是否包含所述微生物；和/或

所述定量检测包括：取已知浓度的待测样本与其产生的偏转信号建立标准偏转曲线，根据待测样本的所述偏转信号获得其浓度。

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