CN115974998A - 一种TNF-α拮抗肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于多肽技术领域，公开了一种TNF‑α拮抗肽及其应用，所述TNF‑α拮抗肽氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。该TNF‑α拮抗肽的稳定性好，且具有显著的消炎、调节免疫、TNF‑α拮抗功效，可用于制备治疗炎症性和自身免疫疾病的药物。

Description

一种TNF-α拮抗肽及其应用

技术领域

本发明属于多肽技术领域，具体涉及一种TNF-α拮抗肽及其应用。

背景技术

肿瘤坏死因子α(TNF-α)是一种对各种细胞类型具有多效性作用的细胞因子，已被确定为炎症反应的主要调节剂，涉及炎症、细胞凋亡、免疫稳态和自身免疫等生理和病理过程，参与病原微生物感染、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性的皮肤病(包括银屑病)、炎症性肠病(溃疡性结肠炎)、自身免疫性血液系统疾病、强直性脊柱炎和非感染性葡萄膜炎等多种炎症和自身免疫疾病的发病过程。TNF-α活性的水平和持续时间在病原微生物感染和免疫生理学中起重要作用。血清TNF-α水平升高与自身免疫病的病理生理密切相关，因此中和TNF-α已成为治疗这些疾病的主要策略。

已在临床上使用的TNF-α拮抗剂主要有抗TNF-α抗体(英夫利昔单抗)和可溶性TNF-α受体(依那西普)。然而，这些药物的使用存在一些局限性，包括稳定性差、生产成本高、安全性不足等缺陷，因此开发更为安全且效果良好的新型TNF-α拮抗药物已迫在眉睫。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种TNF-α拮抗肽及其应用，所述TNF-α拮抗肽的稳定性好，且具有显著的消炎、调节免疫、TNF-α拮抗功效，可用于制备治疗炎症性和自身免疫疾病的药物。

本发明提供一种TNF-α拮抗肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

TPCGLGCKIEKVKQKIKQKIRAKTEAVIGKIRERLG(SEQ ID NO：1)。

中国博大的多物种天然生物资源是结构多样性小分子有机化合物的重要来源。花姬蛙(Microhyla pulchra)广泛栖息于中国南方，雌性平均长33毫米，雄性平均长30毫米。本发明从花姬蛙皮肤中发现了上述新的TNF-α拮抗肽(命名为MP-CATH)，经测试，所述MP-CATH肽的分子量为4020.54Da，等电点为10.24。所述MP-CATH肽与TNF-α的结合常数KD为6.36e^-6±26.2e^-6M。

本发明还提供了一种可编码上述TNF-α拮抗肽的核酸分子。

优选地，所述核酸分子包含如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

5’-ACTCCCTGCGGACTTGGCTGTATCGGGAAGATCCGTGAGCGCTTGGGATGAGCG GTCTCGGCATCCATCGCTGGATATGACAGATGCTCTTTATTTGATGCGCTTGCT-3’(SEQ ID NO：7)。

本发明通过构建花姬蛙皮肤cDNA文库，通过生信分析和活性预测确定了编码上述TNF-α拮抗肽的核苷酸序列。

更优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

5’-ATGGGGGGCTGCTTCTGGTGGGGGGCGCTGCTGCTCTCTGCAGTCACATTACAG CTCAGCCTGTGTCAGATACCCGGCACTGACTCCTCGGGGGAGGGGCTGATCAGCGAGGCTGTGGAGCTGTACAACCAGAGAGACAATGGGGAATACTTATTCCAGTTCCTGACCCAACTTCCCACCACCCTGCTGGAGGAGGGGGAAGATTCTCCGGCCGTCGTCTTCTTGATAAAGGAGACCGGATGCCTGAAATCTGAAGACAAAGCCTCTGAGGAGTGTGACTACACGGAGGACGGGGCGGTGAAGATCTGTGGATTGTACCCTGAGGAGGATGAAGAGGGGATTTCTCTGAAATGTGTCGACTTCTCGCAGGAGTCACGCCCCCGCAGAGCCACTGAGGGCACTCCCTGCGGACTTGGCTGTATCGGGAAGATCCGTGAGCGCTTGGGATGAGCGGTCTCGGCATCCATCGCTGGATATGACAGATGCTCTTTATTTGATGCGCTTGCTTGTTTATCTACCTTGTAAAAAAAAAAAAAAAA-3’(SEQ ID NO：2)。

本发明还提供了上述TNF-α拮抗肽的制备方法，采用以下(1)-(3)的任一种方式制得：

(1)从花姬蛙或近源蛙种中分离制得；

(2)化学合成；

(3)采用上述核酸分子进行重组表达。

本发明还提供了一种生物材料，所述生物材料为表达盒、重组载体或重组菌，所述生物材料含有上述核酸分子。

本发明还提供了上述TNF-α拮抗肽在制备抗炎药物中的应用。

本发明还提供了上述TNF-α拮抗肽在制备化妆品中的应用。

本发明还提供了上述TNF-α拮抗肽在制备食品中的应用。

本发明还提供了上述TNF-α拮抗肽或其改造物/组合物在制备治疗/预防自身免疫疾病的药物中的应用。

试验表明，上述TNF-α拮抗肽对于咪喹莫特诱导的小鼠银屑病模型，葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎模型以及高表达TNF-α转基因关节炎小鼠模型，均具有良好的治疗效果，表明上述TNF-α拮抗肽具备治疗多种自身免疫疾病的作用。

优选地，所述自身免疫疾病包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性的皮肤病(包括银屑病)、炎症性肠病(包括克罗恩病和溃疡性结肠炎)、自身免疫性血液系统疾病、非感染性葡萄膜炎中的至少一种。

优选地，所述TNF-α拮抗肽的改造物/组合物包括TNF-α拮抗肽的多肽物、截断物、类似物、组合物，以及药学上可接受的载体。

本发明还提供了一种药物，包括上述TNF-α拮抗肽和药学上可接受的辅料。

优选地，所述药物的剂型包括片剂、颗粒剂、分散剂、胶囊剂、滴丸、注射剂、粉针剂或气雾剂。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

本发明所述TNF-α拮抗肽(MP-CATH)具有较强的拮抗TNF-α和受体TNFR结合的能力，通过控制游离TNF-α活性水平和持续时间，减缓自身免疫疾病的发病进程。TNF-α拮抗肽(MP-CATH)对正常细胞和红细胞的影响相对较小，高剂量盐浓度、温度条件下二级结构变化小，药理活性稳定。特别地，本发明研究结果显示TNF-α拮抗肽(MP-CATH)在治疗银屑病、炎症性肠病和类风湿性关节炎小鼠模型中均展现出较好疗效。此外，具有消炎和调节免疫活性的MP-CATH肽适合制备食品和保健品。

附图说明

图1为花姬蛙MP-CATH肽的HPLC纯化鉴定结果。

图2为花姬蛙MP-CATH肽的质谱鉴定结果。

图3为花姬蛙MP-CATH肽与TNF-α的结合作用的ITC分析结果。

图4为花姬蛙MP-CATH肽竞争抑制TNF-α与细胞结合结果；B为A平均荧光强度的统计值，###表示MP-CATH组与对照组相比，有极显著性差异(p<0.01)；***表示mTNF组(1500pg/mL)与MP-CATH组相比，有极显著性差异(p<0.01)；**表示mTNF组(1000pg/mL)与MP-CATH组相比，有极显著性差异(p<0.01)；*表示mTNF组(500pg/mL)与MP-CATH组相比，有显著性差异(p<0.05)；ns表示mTNF组(100pg/mL)与MP-CATH组相比，无显著性差异(p>0.05)。D为C平均荧光强度的统计值，***表示hTNF组(1000pg/mL)与MP-CATH组相比，有极显著性差异(p<0.01)；*表示hTNF组(200或500pg/mL)与MP-CATH组相比，有显著性差异(p<0.05)；ns表示hTNF组(100pg/mL)与MP-CATH组相比，无显著性差异(p>0.05)。

图5为花姬蛙MP-CATH肽细胞毒性和拮抗TNF-α诱导的巨噬细胞内的促炎细胞因子生成的结果；A图中ns表示多肽组与对照组(0μM)相比，无显著性差异(p>0.05)。B图中###表示TNF-α诱导模型组与对照组相比，有极显著性差异(p<0.01)；***表示MP-CATH多肽组与TNF-α诱导模型组相比，有极显著性差异(p<0.01)；ns表示MP-CATH组与TNF-α诱导模型组相比，无显著性差异(p>0.05)。

图6为花姬蛙MP-CATH肽对脾细胞增殖和对刀豆蛋白A(ConA)诱导的细胞因子IL-2释放的影响。

图7为花姬蛙MP-CATH肽处理小鼠银屑病模型PASI的评分结果；###表示在高峰期(3d)模型组与对照组相比，有极显著性差异(p<0.01)；***表示在高峰期实验组与模型组相比，有极显著性差异(p<0.01)。

图8为花姬蛙MP-CATH肽处理小鼠炎症性肠病模型结肠长度的实验结果；##表示在模型组与对照组相比，有极显著性差异(p<0.01)；*表示实验组与模型组相比，有显著性差异(p<0.05)。

图9为花姬蛙MP-CATH肽处理小鼠类风湿关节炎模型关节肿胀的实验结果；*表示在终点(21d)实验组与对照组相比，有极显著性差异(p<0.05)；ns表示多肽组与对照组1相比，无极显著性差异(p>0.05)。

图10为花姬蛙MP-CATH肽对人红细胞的溶血毒性影响图。

图11为花姬蛙MP-CATH肽经不同盐浓度和温度处理后圆二色谱的结果。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

以下实施例中所用花姬蛙不属于保护物种，无需特定许可，采集自广东省广州市白云区乡野(23.12°N，113.28°E)；所用RAW264.7细胞，Jurkat T细胞均购自南方医科大学药学院细胞保藏中心。

实施例1：TNF-α拮抗肽(MP-CATH)及其编码基因

I、花姬蛙皮肤总RNA提取：

活体花姬蛙用水清洗干净，处死后放入液氮中速冻4h，取约300mg花姬蛙皮肤组织，加入10mL总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，购自GIBCOBRL)，于玻璃匀浆器中匀浆30min。加入等体积酚/氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10min，在4℃、12000rpm条件下离心10min，弃沉淀。向上清中加入等体积的异丙醇，室温放置10min，在4℃、12000rpm条件下离心10min，弃上清。沉淀用75％乙醇洗涤一次，干燥后的沉淀物即为花姬蛙皮肤总RNA。

II、花姬蛙皮肤mRNA的纯化：

使用

mRNAIsolation Systems试剂盒(购自PROMEGA)对步骤I中得到的花姬蛙皮肤总RNA进行分离纯化。具体步骤如下：

取步骤I中得到的花姬蛙皮肤总RNA500μg溶于500μL DEPC水中，65℃水浴10min，然后加入3μL生物素化Oligo(dT)探针和13μL 20×SSC溶液(来自

mRNAIsolation Systems试剂盒)，混匀，放置室温冷却，称为A液。

将磁珠(来自

mRNA Isolation Systems试剂盒)轻弹混匀，至磁力架吸附30s，弃上清。随后向磁珠中加入0.3mL 0.5×SSC溶液，至磁力架吸附30s，弃上清。最后用0.1mL 0.5×SSC溶液重悬磁珠，称为B液。

将A液加入B液中，室温放置10min，至磁力架吸附30s，弃上清，用0.2mL 0.1×SSC溶液洗涤4次，弃上清，随后加入0.15mL DEPC水重悬沉淀，至磁力架吸附30s，将上清移至新的试管中，称为C液。再向沉淀中加入0.15mL DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30s，移上清至C液中，该混合液称为D液(D液中含纯化后的花姬蛙皮肤mRNA)。

向D液中加入1/10体积3M乙酸钠(pH＝5.2)和等体积异丙醇，于-70℃放置30min后，于4℃、12000rpm条件下离心10min，弃上清，将沉淀溶解于10μL DEPC水中得到花姬蛙皮肤mRNA。

III、花姬蛙皮肤cDNA文库构建：

使用Creator^TM SMART^TM cDNA Library Construction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒(购自CLONTECH)合成cDNA双链(包括以下步骤a和b)，使用

SV Gel and PCRClean-Up System试剂盒(购自PROMEGA)抽提回收PCR产物(包括以下步骤c)，使用pMDTM818-VcoT Vector Cloning Kit试剂盒(购自Takara)将纯化后的cDNA产物连接到pMD18-T载体上。具体步骤如下：

a.cDNA第一链合成(mRNA反转录)：

在0.5mL无菌的离心管加入1μL SMART IV寡聚核苷酸、1μL CDS III/3’PCR引物(来自Creator^TM SMART^TM cDNA Library Construction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒)、1μL步骤II得到的花姬蛙皮肤mRNA和2μL去离子水，混匀后，12000rpm离心15s，72℃保温2min。将离心管在冰上孵育2min。随后向离心管中加入2.0μL 5×第一链缓冲液、1.0μL 20mM二硫苏糖醇、1.0μL 10mM dNTP混合物、1.0μL PowerScript反转录酶(来自Creator^TM SMART^TMcDNA Library Construction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒)，混匀后，12000rpm离心15s，42℃保温1h。将离心管置于冰上以中止cDNA第一链的合成。上述离心管中的液体含有合成的cDNA第一链。

b.采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链：

95℃预热PCR仪。将2μL步骤a中得到的cDNA第一链与80μL去离子水、10μL10×Advantage 2PCR缓冲液、2μL 50×dNTP混合物、2μL 5’PCR引物、2μL CDS III/3’PCR引物以及2μL大肠杆菌聚合酶(来自Creator^TM SMART^TM cDNA Library Construction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒)混匀。在PCR仪中按以下程序扩增：95℃20s，95℃5s，68℃6min，22个循环。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链进行抽提。

c.抽提回收PCR产物：

向步骤b中得到的cDNA双链中加入等体积的膜结合缓冲液(来自

SV Geland PCR Clean-Up System试剂盒)，颠倒混匀，然后将混合液转入离心纯化柱(来自

SV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒)，室温静置5min，使DNA充分与硅胶膜结合。12000rpm离心30s，弃去收集管中的废液。向离心纯化柱中加入700μL膜洗脱液(含五倍体积95％乙醇，来自

SV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒)，12000rpm离心30s，弃去收集管中的废液。重复步骤上述步骤1次。随后再次12000rpm离心5min后，将离心纯化柱置于新的离心管中。向柱中心加入30μL超纯水，室温静置5min后，12000rpm离心30s，离心管底溶液即为纯化后的cDNA双链。

d.酶切、连接以及连接产物的转化：

在微量离心管中加入4μL步骤c中得到的cDNA双链、1μL pMD18-T载体和5μLSolution I(来自pMD^TM 818-VcoT Vector Cloning Kit试剂盒)(全量10μL)，于16℃反应2h。将上述10μL反应液加入至100μL DH5α感受态细胞中，冰中放置30min后，于42℃加热90s，再于冰中放置1min。随后向上述感受态细胞中加入890μL 37℃预热后的LB培养基，37℃缓慢振荡培养60min。取200μL菌液涂布于含有X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)、IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基的培养皿上，于37℃培养16h，形成单菌落。每个培养皿用5mL LB液体培养基洗涤菌落，加30％甘油冻存备用。

对构建的cDNA进行检测，发现其大约含1×10⁶个单独克隆。

Ⅳ、花姬蛙皮肤基因克隆筛选：

对步骤III构建的细菌cDNA文库进行滴定，然后用含100μg/mL氨苄西林的LB培养基稀释细菌cDNA文库至适当的浓度(约5000个细菌/mL和30个细菌/mL，其中，5000个细菌/mL浓度用于首轮筛选，30个细菌/mL浓度用于第二轮筛选)。在96孔培养板上按8×8矩阵铺板(共64孔，每孔100μL)，37℃过夜培养。

按行、列分别合并细菌培养液，使用下述引物组进行PCR扩增。

其中，扩增引物的核苷酸序列为：

PF1：5’-AGATGTTSACCWTGAAGAAATC-3’(SEQ ID NO：3)；

PR1：5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3’(SEQ ID NO：4)；

其中，S＝G/C；W＝A/T。

其中，如SEQ ID NO：3所示的引物序列含22个核苷酸，如SEQ ID NO：4所示的引物序列含27个核苷酸(为CLONTECH公司SMART^TM cDNA Library Construction Kit中的3’PCRPrimer引物)。按以下程序扩增：94℃30s，50℃45s，72℃2.5min，35个循环。

交叉阳性孔细菌样品进入第二轮筛选(方法同首轮筛选)。

Ⅴ、MP-CATH肽基因序列测定和结果：

取步骤IV中第二轮筛选结果为阳性的孔中的细菌样品，提取质粒DNA，用双脱氧法测定核苷酸序列(使用Applied Biosystems 373A全自动核苷酸序列测定仪)。

测序引物为BcaBEST^TM Sequencing Primer RV-M和BcaBEST^TM SequencingPrimer M13-47。

其中，BcaBEST^TM Sequencing Primer RV-M的核苷酸序列为：5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’(SEQ ID NO：5)；

BcaBEST^TM Sequencing Primer M13-47的核苷酸序列为：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’(SEQ ID NO：6)。

基因测序结果自5’端至3’端序列如SEQ ID NO：2所示，测序结果具体如下：

5’-ATGGGGGGCTGCTTCTGGTGGGGGGCGCTGCTGCTCTCTGCAGTCACATTACAG CTCAGCCTGTGTCAGATACCCGGCACTGACTCCTCGGGGGAGGGGCTGATCAGCGAGGCTGTGGAGCTGTACAACCAGAGAGACAATGGGGAATACTTATTCCAGTTCCTGACCCAACTTCCCACCACCCTGCTGGAGGAGGGGGAAGATTCTCCGGCCGTCGTCTTCTTGATAAAGGAGACCGGATGCCTGAAATCTGAAGACAAAGCCTCTGAGGAGTGTGACTACACGGAGGACGGGGCGGTGAAGATCTGTGGATTGTACCCTGAGGAGGATGAAGAGGGGATTTCTCTGAAATGTGTCGACTTCTCGCAGGAGTCACGCCCCCGCAGAGCCACTGAGGGCACTCCCTGCGGACTTGGCTGTATCGGGAAGATCCGTGAGCGCTTGGGATGAGCGGTCTCGGCATCCATCGCTGGATATGACAGATGCTCTTTATTTGATGCGCTTGCTTGTTTATCTACCTTGTAAAAAAAAAAAAAAAA-3’(SEQ ID NO：2)。

该花姬蛙MP-CATH肽基因核苷酸序列的长度为599个碱基。

根据花姬蛙MP-CATH肽的基因推断，编码具有实质功能的成熟肽花姬蛙MP-CATH肽的编码基因为该段序列(SEQ ID NO：7)的第460-567位核苷酸，其核苷酸序列如下：5’-ACTCCCTGCGGACTTGGCTGTATCGGGAAGATCCGTGAGCGCTTGGGATGAGCG GTCTCGGCATCCATCGCTGGATATGACAGATGCTCTTTATTTGATGCGCTTGCT-3’(SEQ ID NO：7)；

根据SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列翻译得到的氨基酸序列为：Thr Pro Cys GlyLe u Gly Cys Lys Ile Glu Lys Val Lys Gln Lys Ile Lys Gln Lys Ile Arg Ala LysThr Glu Al a Val Ile Gly Lys Ile Arg Glu Arg Leu Gly。其单字母氨基酸序列为：TPCGLGCKIEKVK QKIKQKIRAKTEAVIGKIRERLG(SEQ ID NO：1)。

实施例2：花姬蛙MP-CATH肽的制备

根据实施例1中得到的花姬蛙MP-CATH肽的编码基因，使用自动多肽合成仪合成多肽。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。其中，二硫键的形成采用空气氧化法，具体步骤包括：在烧瓶中将多肽溶解于0.1％醋酸溶液中，用氢氧化铵滴定至pH7.8，室温搅拌过夜。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。纯化时水相为0.1％ TFA +100％ CH₃CN，有机相为0.1％TFA，水相浓度梯度为25min内27-52％，检测波长为220nm。检测结果如图1所示。

由图1可知，纯化的花姬蛙MP-CATH肽出现在8.108min。

进一步对纯化后的花姬蛙MP-CATH肽用快原子轰击质谱法(Fast atombombardment mass spectrometry,FAB-MS)测定其分子量，以甘油:间硝基苄醇:二甲亚砜(1:1:l，V:V:V，体积比)为底物，Cs+作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25Kv。测定结果如图2所示。

由图2可见，根据质谱图计算得到本发明实施例中的花姬蛙MP-CATH肽的分子量为4020.54Da。

进一步利用ExPASy生物信息学资源门户网站(http://www.expasy.org/tools/)对花姬蛙MP-CATH肽的等电点进行预测。

预测得到本发明实施例中的花姬蛙MP-CATH肽的等电点为10.24。

综上所述，本发明实施例中获得的花姬蛙MP-CATH肽来源于中国两栖类动物花姬蛙，其分子量为4020.54Da，等电点为10.24。

实施例3：花姬蛙MP-CATH肽和TNF-α的结合效果

花姬蛙MP-CATH肽和TNF-α的结合能力通过等热滴定仪进行测定，具体步骤如下：

(1)提前准备已超声脱气的PBS缓冲液(pH＝6.0)，人源重组蛋白TNF-α(0.1μM)和实施例1制得的花姬蛙MP-CATH肽(0.25mM)。在上样前进行二次脱气处理。

(2)根据仪器说明在样品池和注射器中分别装载样品。取40μL实施例1制得的花姬蛙MP-CATH肽置于滴定针内，280μL人源重组蛋白TNF-α置于样品池内。

(3)设置仪器参数：设定初始时间间隔为60s，温度25℃，上样针的转速为1000rpm，参考功率5μCal/s，高反馈模式。上样针内每次滴定1.0μL至反应池中，间隔60s，总计滴定17次。ITC配套仪器将检测整个滴定过程中热量变化。检测结果如图3所示。

由图3可知，花姬蛙MP-CATH肽与TNF-α的结合导致焓降低以及ITC曲线的降低趋势，表明反应中放热；结合饱和发生在约11min，结合常数KD为6.36e^-6±26.2e^-6。这表明花姬蛙MP-CATH肽能够中和TNF-α。

实施例4：花姬蛙MP-CATH肽在拮抗TNF结合细胞表面受体的研究

1.RAW264.7和Jurkat T细胞的培养

小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7细胞培养于含100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、10％胎牛血清的DMEM培养基(Gibco公司产品)，置于37℃，5％CO₂环境中培养。人急性T淋巴细胞白血病细胞Jurkat T细胞培养条件同上。

2.细胞竞争结合实验

不同浓度的鼠源重组表达TNF-α(0、500、1000和1500pg/mL)与FITC标记的花姬蛙MP-CATH肽(10μM)共孵育10min，接着将混合物直接加入含1×10⁵个RAW264.7细胞的离心管中；或者不同浓度的人源重组表达TNF-α(0、200、500和1000pg/mL)与FITC标记的MP-CATH肽(10μM)共孵育10min，接着将混合物直接加入含1×10⁵个Jurkat T细胞的离心管中。混合物在37℃条件下继续孵育5min，离心后弃去培养基，使用PBS完全洗涤后用200μL的PBS重悬细胞待测。所有收集的细胞使用流式细胞仪(BD FACSCanto II，美国)测量荧光强度，Flow Jo软件进行数据处理，检测结果如图4所示。

由图4中A可知，花姬蛙MP-CATH肽可以拮抗鼠源重组表达TNF-α与小鼠巨噬细胞的结合并呈浓度依赖性；图4中B为A中平均荧光强度的统计值；由图4中C可知，花姬蛙MP-CATH肽可以拮抗人源重组表达TNF-α与人急性T淋巴细胞白血病细胞的结合并呈浓度依赖性，图4中D为C中平均荧光强度的统计值。

实施例5：花姬蛙MP-CATH肽在控制炎症因子释放的应用的研究

1.细胞毒性作用

RAW264.7细胞以2×10⁴个细胞/孔的密度接种到96孔板中。培养过夜后，用不同浓度的MP-CATH肽(1.25μM、2.5μM、5μM、10μM和20μM)处理细胞24h，然后加入CCK8试剂后继续孵育2h后检测450nm处吸光度。细胞活力％的计算公式＝(A样品组-A空白对照组)/(A对照组-A空白对照组)×100％。

2.MP-CATH肽对TNF-α诱导的细胞因子IL-6释放的影响

RAW264.7细胞以2×10⁴个细胞/孔的密度接种到96孔板中并培养过夜。用不同浓度的MP-CATH肽(2.5、5、10和20μM)预处理细胞1h，然后用200pg/mL鼠源重组表达的TNF-α刺激细胞24h。未添加肽和/或TNF-α的细胞用作阴性对照。收集上清使用商业试剂盒(Beyotime Biotechnology，中国上海；Thermo Fisher Scientific Inc，美国)检测IL-6水平。在450nm处测量吸光度。实验重复三次。

检测结果如图5所示。由图5中A可知，20μM MP-CATH肽对巨噬细胞仍无显著抑制作用，说明其对正常细胞毒性低，成药应用较为安全。由图5中B可知，极低剂量的MP-CATH肽(2.5μM)可以抑制TNF-α刺激巨噬细胞释放的细胞因子IL-6，表明该肽能够显著拮抗TNF-α与TNFR受体识别，发挥抗炎和免疫调节的效果。

实施例6：花姬蛙MP-CATH肽免疫调节活性的研究

1.MP-CATH肽对脾细胞增殖的影响

将4-6周龄的雌性BALB/c小鼠脾脏无菌获取，清除脾脏粘附的多余组织后，使用40μm的细胞筛将脾细胞分散。加入红细胞裂解液裂解2min，接着继续加入8mL PBS，用70μm的细胞筛过筛，除去絮状物。将滤过细胞液转移到离心管内。1500rpm，离心5min,弃上清。用6mL的RPMI1640培养基(含10％FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)重悬后计数，以20万/孔密度接种在96孔板中。采用CCK8法测定MP-CATH肽对脾细胞毒性。细胞铺板后6h，不同浓度的MP-CATH肽(0、2.5、5和10μM)在存在0.5μg/mL ConA的条件下加入细胞，继续37℃孵育48h，然后加入CCK8试剂(Beyotime Biotechnology，中国上海)后继续孵育2h后检测450nm处吸光度。

2.MP-CATH肽对ConA诱导的细胞因子IL-2释放的影响

脾细胞获取方式同上，不同浓度的MP-CATH肽(0、2.5、5和10μM)在存在或不存在0.5μg/mL ConA的条件下处理48h后离心，收集上清使用商业试剂盒(Thermo Fisher Scientific Inc，美国)测量IL-2水平。

检测结果如图6所示。由图6中A可知，花姬蛙MP-CATH肽可以抑制ConA诱导的小鼠脾细胞增殖且呈浓度依赖效应；进一步地，由图6中B可知，花姬蛙MP-CATH肽可以抑制ConA诱导的小鼠脾细胞释放细胞因子IL-2。以上均说明MP-CATH肽的免疫调节功能可以影响免疫细胞增殖和因子释放，有助于免疫性疾病治疗的应用。

实施例7：花姬蛙MP-CATH肽对银屑病模型小鼠治疗作用的研究

将8-10周龄的雌性BALB/c小鼠称重后随机分组，使用剃毛器和脱毛膏剔除和脱去小鼠正中背部约3cm*5cm范围的毛发。脱毛后第二日，除对照组外，其他小鼠背部涂抹62.5mg咪喹莫特乳膏(丽科杰)，然后使用棉签将乳膏涂抹至均匀覆盖整个裸露区域，待药膏吸收后再将小鼠放回笼中，对照组涂抹等量凡士林。MP-CATH肽治疗组在6小时后背部皮下注射1mg/kg的MP-CATH肽(溶于生理盐水)，相应的模型组和对照组皮下注射等体积生理盐水。造模和给药步骤需重复7天。

从首次造模日起，每天称重和PASI评分。以对照小鼠背部无毛区颜色和银屑程度为基础值(0)，分别对所有小鼠背部的红斑程度、银屑出现程度进行评分，分值范围为0-4；另外，使用游标卡尺测量小鼠背部无毛区的皮肤厚度作为小鼠皮肤浸润程度的分值。检测结果如图7所示。

由图7可知，咪喹莫特乳膏处理后模型组小鼠背部皮肤出现红斑和鳞屑，皮肤厚度也显著增加，而MP-CATH肽治疗组可以有效逆转上述皮损改变，降低皮肤厚度。银屑病PASI评分结果与上述皮肤外观改变保持一致。

实施例8：花姬蛙MP-CATH肽对炎症性肠病模型小鼠治疗作用的研究

将4-6周龄的雌性BALB/c小鼠称重后随机分组，称取适量DSS，用超纯水配置成4％的DSS水溶液(w:v)，于4℃避光保存。将动物水瓶内的水溶液更换为DSS水溶液，隔两天后更换新的DSS溶液，第7天将DSS溶液更换为不含DSS的超纯水。造模后持续观察动物状态，通过DAI评分判定动物成模情况，并且每日进行称重和观察粪便状态。MP-CATH肽治疗组从第一日开始每日腹腔注射1mg/kg的MP-CATH肽(溶于生理盐水)，相应的模型组和对照组皮下注射等体积生理盐水。造模和给药步骤需重复7天。检测结果如图8所示。

由图8可知，DSS诱导的炎症性肠炎模型组小鼠表现为体重减轻和结肠明显缩短，而MP-CATH肽治疗组可以减缓肠炎进展，没有导致显著的体重改变并且结肠长度维持在正常水平。

实施例9：花姬蛙MP-CATH肽对关节炎模型小鼠治疗作用的研究

转基因小鼠能够表现出与人类相似的类风湿性关节炎症状，将断奶后(3周龄)的雌性转基因小鼠(过表达人肿瘤坏死因子α转基因关节炎小鼠模型)称重后随机分组，MP-CATH肽治疗组以1mg/kg剂量开始每周腹腔注射给药1次(biw)或每周腹腔注射给药2次(qw)，连续给药4周，每周记录小鼠体重和测量足踝直径。对照组注射等量生理盐水。第4周拍摄小鼠关节情况。检测结果如图9所示。

由图9可知，随着时间的增加转基因小鼠的体重稳定增加，而关节发生肿胀或变形，表现为足踝直径的增加，甚至到第4周观察到关节发生严重畸形、活动障碍，全足趾挛缩等情况。MP-CATH肽治疗组以两种给药频率对关节炎进行干预，结果表明MP-CATH肽可以显著改善关节肿胀和炎症反应，延缓关节炎发病进展且药物维持时间较长，一周一次给药与一周两次给药频率下对关节炎的治疗作用无显著性差异。

实施例10：花姬蛙MP-CATH肽对红细胞的溶血毒性研究

取小鼠新鲜全血加入等体积的无菌的阿氏液，2000rpm，离心5min，用0.9％的生理盐水洗涤细胞至上清液不再呈现红色，将上述洗涤好的压积红细胞用0.9％的生理盐水稀释成2％红细胞悬液；将上述红细胞悬液与溶解于生理盐水不同浓度的MP-CATH肽(0μM、0.625μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM和40μM)37℃保温30min，室温静置于U型板中，放置2h后观察并拍照记录。由于溶血活性与540nm吸收值成正比，按上述方法处理后2000rpm，离心5min并检测上清在540nm处吸收值。0.1％Triton X-100作为阳性对照，使用生理盐水作为阴性对照。溶血率％＝[(OD样品-OD阴性)/(OD阳性–OD阴性)]×100％。检测结果如图10所示。

由图10可知，对照组红细胞悬液静置后自然沉降，在U型板底部形成一个红色斑点；阳性对照组可以诱导红细胞发生溶血，表现为红色斑点变小或消失，上清呈清澈的淡红色。40μM及更低浓度的MP-CATH肽处理后的小鼠红细胞未发生溶血或凝血反应，说明该肽对红细胞毒性较低，为其在临床使用方面安全性得到保证。

实施例11：花姬蛙MP-CATH肽对盐浓度和温度的稳定性研究

蛋白质是具有特定结构的生物大分子，因为其固有的结构不对称性决定了蛋白质圆二色性。蛋白质的圆二色谱光谱一般分为远紫外区和近紫外区，波长范围分别为178～250nm和250～320nm。远紫外区圆二色谱光谱反映肽键的圆二色性。根据这一特性，本实施例考察不同浓度的盐溶液以及不同温度处理多肽后的圆二色谱结果的变化。

多肽盐稳定性试验：MP-CATH肽(50μM)溶解在60mM十二烷基硫酸钠溶液中，然后在测量之前，分别与不同浓度的氯化钠(0、100、200和400mM)混合，室温孵育1h。

多肽温度稳定性实验：MP-CATH肽(50μM)溶解在60mM十二烷基硫酸钠溶液中，然后在测量之前，混合物分别在25℃、37℃、50℃、70℃和90℃条件下孵育1h。

将上述样品分别加入检测皿中，仪器检测设置参数为样品池路径长度0.1cm，25℃，距色谱柱1nm，扫描波长180～260nm。调节带宽1nm，响应时间1sec和扫描速度100nm/min。

如图11中A所示，在不同的氯化钠溶液中，随着盐浓度的增加，在195nm处的大正峰减少，α-螺旋构象的比例稍有下降；如图11中B所示，温度变化对其圆二色谱结果几乎没有影响。大多数多肽类物质在高温环境中容易发生氢键的断裂，从而导致变性，因此在生产、贮存和使用方面会受到诸多限制。而MP-CATH肽却能够在高温环境和高盐溶液中保持结构稳定，这不光说明该肽易于保存，还预示着该肽在进入生物体后有极大可能发挥其原本的抑制活性。另外，耐高温的特性也让其在临床使用方面能够进行更多的除菌操作，保证药物的安全性。

上面结合附图对本申请实施例作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种TNF-α拮抗肽，其特征在于，所述TNF-α拮抗肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子可编码权利要求1所述的TNF-α拮抗肽。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

4.权利要求1所述的TNF-α拮抗肽的制备方法，其特征在于，采用以下(1)-(3)的任一种方式制得：

(1)从花姬蛙或近源蛙种中分离制得；

(2)化学合成；

(3)采用权利要求2或3中所述的核酸分子进行重组表达。

5.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料为表达盒、重组载体或重组菌，所述生物材料含有权利要求2或3所述的核酸分子。

6.权利要求1所述的TNF-α拮抗肽在制备抗炎药物中的应用。

7.权利要求1所述的TNF-α拮抗肽或其改造物/组合物在制备治疗/预防自身免疫疾病的药物中的应用，其特征在于，所述自身免疫疾病包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性的皮肤病、炎症性肠病、自身免疫性血液系统疾病、非感染性葡萄膜炎中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述TNF-α拮抗肽的改造物/组合物包括TNF-α拮抗肽的多肽物、截断物、类似物、组合物，以及药学上可接受的载体。

9.一种药物，其特征在于，包括权利要求1所述的TNF-α拮抗肽和药学上可接受的辅料。

10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型包括片剂、颗粒剂、分散剂、胶囊剂、滴丸、注射剂、粉针剂或气雾剂。

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