CN115960841A - 分泌抗李属坏死环斑病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分泌抗李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ring‑spot virus，PNRSV)单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用。以原核表达的PNRSV衣壳蛋白(coat protein,CP)为抗原免疫BALB/c小鼠，经杂交瘤技术获得1株能分泌抗PNRSV单抗的杂交瘤细胞株9E1，其保藏号为CGMCC No.45329。该细胞株分泌单抗腹水间接ELISA效价达10^‑7，抗体类型及亚类为IgG2b、κ轻链，该单抗与PNRSV有特异性免疫反应，而不与李痘病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、苹果茎沟病毒、苹果坏死花叶病毒感染病叶和健康植物组织发生免疫反应。利用9E1单抗建立多种检测方法，其中ACP‑ELISA和dot‑ELISA方法检测病叶的灵敏度分别达到1:10240和1:1280倍稀释(w/v,g/mL)。该细胞株的创制及其血清学检测方法的建立为PNRSV检测诊断、流行病学调查、科学防控提供检测技术和检测试剂支持。

Description

分泌抗李属坏死环斑病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗李属坏死环斑病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术

李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ring-spot virus，PNRSV)属于雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus)。PNRSV的粒体形态为等轴对称多面体，直径约为22～23nm，有三种大小的粒子。其病毒基因组由3条正义单链RNA组成，RNA1和RNA2分别编码复制酶蛋白P1和P2，RNA3编码运动蛋白和外壳蛋白。

PNRSV是一种在世界范围内广泛发生的病毒病原物，可危害多种植物，自然寄主主要有樱桃、桃、杏、李、苹果、啤酒花和月季，其它寄主包括烟草、西瓜、甜瓜、南瓜、西葫芦、菜豆、豇豆、豌豆、莴苣、向日葵等。PNRSV最早发现于李和桃树上，主要分布在欧洲、美洲、大洋洲等温带地区。PNRSV在国内的初次报道是在陕西省的西安被自然侵染的秋海棠上。随后又有多个地区相继报道了PNRSV的发生。

被PNRSV感染的桃树有些在春季幼叶表现出褪绿环斑、坏死斑，但在夏季症状不易识别，有些在春季也无明显症状，有些表现为果实缝合线处有小裂口。PNRSV可引起植株表现出多种不同的症状，其症状与病毒株系、寄主品种的感病性以及环境条件有关。常见症状包括碎叶、带状叶、线纹、坏死环斑、粗花叶和叶片脱落，甚至全株枯死。其还可与苹果花叶病毒、苹果褪绿病斑病毒混合侵染果树。

迄今为止，植物病毒病缺乏有效的防治药剂，而简单快速、灵敏特异、准确实用的检测技术是病毒病监测、预警和开展绿色防控的关键。为了强化我国PNRSV的检验检疫技术，急需建立检测PNRSV简单快速、经济有效、高通量的实用检测技术。与常规的指示植物接种、电镜观察、分子检测等方法相比，血清学方法具有简单、经济、易操作、可高通量检测等优点，是植物病毒检测和调查最实用的方法。但血清学的方法的建立依赖于特异性高质量的病毒抗体。本发明以原核表达的PNRSV衣壳蛋白(coat protein,CP)作为抗原，通过杂交瘤技术制备了1株分泌PNRSV特异性单抗的杂交瘤细胞株，以分泌的单抗为检测抗体建立检测PNRSV的血清学方法及试剂盒，从而为我国PNRSV的口岸检验检疫、流行病学的调查、病毒基因组功能分析、抗性育种、科学防范建立等提供试剂和技术支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗李属坏死环斑病毒单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用。

本发明具体采用的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种分泌抗李属坏死环斑病毒单抗的杂交瘤细胞株9E1，它能分泌抗李属坏死环斑病毒的特异性单抗，杂交瘤细胞株9E1于2022年11月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.45329。

第二方面，本发明提供了一种上述第一方面所述的杂交瘤细胞分泌的抗李属坏死环斑病毒单克隆抗体。该单抗腹水间接ELISA效价达10^-7，抗体类型及亚类为IgG2b、κ轻链，与李属坏死环斑病毒30kDa左右的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用该单抗建立ACP-ELISA和dot-ELISA方法检测感染PNRSV病叶组织粗提液的灵敏度分别达到1:10240和1:1280倍稀释(w/v,g/mL)。

所述的抗李属坏死环斑病毒单克隆抗体能与李属坏死环斑病毒有特异性免疫反应，而不与李痘病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、苹果茎沟病毒、苹果坏死花叶病毒和健康植物组织发生免疫反应。

第三方面，本发明提供了一种如上述第二方面所述的抗李属坏死环斑病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用，它是以单抗为检测抗体建立的各种免疫学检测方法和检测试剂盒。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：1)提供的杂交瘤细胞株分泌大量抗PNRSV特异性单克隆抗体，以该单抗为检测抗体建立的ACP-ELISA、dot-ELISA和Tissueprint-ELISA血清学检测方法及其检测试剂盒能快递、特异、灵敏、准确地检测PNRSV；2)利用本发明所制备的单克隆抗体检测PNRSV病毒，对操作人员的技术要求低，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本发明所制备的单克隆抗体可有效地用于田间PNRSV的检测诊断及口岸检验检疫，也可用于该病毒病的流行病学调查、病毒基因组功能分析、抗性育种、科学防控等方面。

附图说明

图1PNRSV CP基因的RT-PCR克隆(A)及其重组蛋白的表达纯化(B)结果；

(1B)M：蛋白Marker；1-3：100mM咪唑、200mM咪唑、50mM咪唑洗脱的重组蛋白。

图2Western blot实验分析9E1单克隆抗体的特异性结果

图3dot-ELISA方法的特异性(A)和灵敏度(B)分析结果

图4Tissue print-ELISA方法的特异性分析结果

生物保藏

分泌抗李属坏死环斑病毒单抗杂交瘤细胞株9E1于2022年11月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCC No.45329。

具体实施方式

分泌抗李属坏死环斑病毒单抗杂交瘤细胞株9E1于2022年11月7日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.45329，它能分泌抗李属坏死环斑病毒的单抗。

一种上述杂交瘤细胞株9E1分泌的抗李属坏死环斑病毒单克隆抗体，该单抗腹水间接ELISA效价达10^-7，抗体类型及亚类为IgG2b、κ轻链，与李属坏死环斑病毒30kDa左右的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用该单抗建立ACP-ELISA和dot-ELISA方法检测感染PNRSV病叶组织粗提液的灵敏度分别达到1:10240和1:1280倍稀释(w/v,g/mL)。

上述抗李属坏死环斑病毒单克隆抗体能与李属坏死环斑病毒有特异性免疫反应，而不与李痘病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、苹果茎沟病毒、苹果坏死花叶病毒和健康植物组织发生免疫反应。

上述抗李属坏死环斑病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单抗为检测抗体建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。

本发明提供的杂交瘤细胞株能大量分泌抗李属坏死环斑病毒单抗，且其分泌的单抗特异性强、灵敏度好、效价高、稳定性好。以该单抗为检测抗体建立检测PNRSV的高通量的血清学方法可应用于口岸检验检疫及田间植物样品中PNRSV的检测诊断，从而为我国PNRSV的口岸检验检疫及田间样品检测诊断和该病毒病害的科学防控提供检测试剂和技术支持。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

一、杂交瘤细胞创制及其单克隆抗体的制备

1免疫原及检测抗原的制备

1.1 PNRSV CP基因克隆及其原核表达载体的构建：

1.1.1 Trizol法提取感染PNRSV植物总RNA

1)将0.1g感染PNRSV的叶片用液氮在研钵上研成粉末后转入离心管中，加入1mLTrizol抽提液，涡旋混匀，通风橱内放置5-10min；

2)将0.2mL氯仿加入，剧烈涡旋15s，在室温放置5-10min；

3)在4℃，12,000rpm条件下，离心15min，之后把上清少量多次取到离心管中，加入同体积的异丙醇颠倒混匀，在-20℃条件下沉淀20-60min；

4)在4℃，12,000rpm条件下，离心10min，用移液枪小心吸除上清，留下沉淀；

5)在得到的白色羽毛状沉淀中将1mL 75％乙醇加入，轻弹离心管洗涤沉淀，在12,000rpm条件下离心5min，倒去上清；

6)重复步骤5一次；

7)在4℃条件下12,000rpm离心5min后去除上清，放置于通风橱中干燥，再用30μLDEPC水将RNA溶解，取1μL RNA样品在Nanodrop紫外分光光度仪上测定RNA的含量和纯度，并保存于-80℃冰箱备用。

1.1.2 RT-PCR

根据已报道的PNRSV编码外壳蛋白基因序列设计一对特异引物：

PNRSV

CP-F:5’-CAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGGTTTGCCGAATTTGCAA-3’和PNRSV CP-R:5’-TGCGGCCGCAAGCTTGTCGACCTAGATCTCAAGCAGGTCTTC-3’。BamHⅠ酶切位点在PNRSV CP-F上用下划线标注，SalⅠ酶切位点在PNRSV CP-R上用下划线标注。擎科生物技术有限公司进行引物合成。

用南京诺唯赞公司生产的HiScript II Reverse Transcriptase试剂盒进行反转录，PCR反应是用日本东洋纺公司生产的KOD One^TM PCR Master Mix。将提取的RNA 放置于65℃金属浴中加热预变性5-10min，取出放置于冰上5min，然后加入反转录体系中，反转录体系为10μL。

反转录扩增体系如下：

反转录PCR仪程序设置：

在-30℃冰箱将反转录获得的cDNA进行保存备用。之后使用东洋纺的KOD One^TMPCR Master Mix进行PCR反应，扩增到大小约为在723bp左右的条带(图1A)。

PCR反应体系如下：

PCR仪程序设置：

1.1.3目的片段连接载体

用Axygen公司割胶回收试剂盒将PCR产物纯化后，用Axygen公司质粒提取试剂盒提取pET-28a质粒，接着通过与酶切质粒的同源重组克隆将目的片段连接到pET-28a载体中，4℃冰箱备用。

1.1.4连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α

1)取一管低温保存的大肠杆菌感受态DH5α，在冰上逐渐融化后，加入10μL pET-28a-PNRSV CP重组质粒，手指轻弹离心管底部使其混匀，在冰盒中静置20-40min；

2)42℃热击混有pET-28a-PNRSV CP的大肠杆菌感受态DH5α90s，然后在冰上或4℃放置5-7min；

3)将热击后的菌体37℃恢复培养1h；之后在8,000rpm离心2min，去除大部分培养基，并利用剩余培养基悬浮菌体；

4)菌体涂布于固体LB培养基(含100μg/L卡那霉素)，在37℃条件下，倒置过夜培养。

1.1.5菌落PCR鉴定及阳性克隆保存

过夜培养后用牙签轻轻挑取单菌落，进行菌落PCR。

反应体系：

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，阳性克隆的目的基因条带大小在723bp左右；将阳性克隆挑取少量到含有卡纳霉素的LB培养基扩繁12h，提取质粒，一部分送至生物公司测序，另外的保存至冰箱待用。将测序结果进行blast序列比对，验证表达载体中PNRSV CP基因序列无误且阅读框架准确后，将事先保存的重组质粒热击转化感受态细胞BL21(DE3)，进行恢复培养，涂板培养及单菌落PCR验证，阳性菌落进行基因的诱导表达。同时，将OD₆₀₀值为0.8-1.0的阳性菌菌液加入15％甘油后进行80℃冰箱保存及备份。

1.2 PNRSV CP蛋白的原核表达及纯化

1.2.1诱导表达PNRSV CP

1)将分别含pET-28a-PNRSV CP和pET-28a空载的表达菌株各自接种在2管5mL含卡那霉素(100μg/mL)的液体LB中，在37℃振荡培养过夜；

2)将过夜培养的菌液按1:100倍比例，转接到含卡那霉素(100μg/mL)的200mL液体LB中，在37℃摇床中，继续振荡培养至OD₆₀₀＝0.4-0.6；

3)将含pET-28a-PNRSV CP的表达菌株的菌液取1mL菌液离心，用ddH₂O悬浮菌体后与适量的5×SDS样品缓冲液混匀，100℃变性10min；

4)向步骤2)菌液中加入IPTG至浓度为0.5mmol/L，在16℃摇床诱导表达12h；将诱导后的菌液各取1mL菌液离心，ddH₂O悬浮菌体后与适量的5×SDS样品缓冲液混匀，100℃变性10min；

5)将变性后的样品在4℃，8,000rpm条件下离心3min，取上清进行SDS-PAGE电泳，检验PNRSV CP的表达情况，发现PNRSV CP成功表达。

1.2.2盐酸胍法纯化PNRSV CP

1)配置缓冲液1：50mM pH7.4的PBS缓冲液。配制：0.5M NaH₂PO₄ 19mL，0.5MNa₂HPO₄ 81mL，6M盐酸胍，NaCl 29.3g,加适量水溶解后定容到1000mL。

缓冲液2：50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.5MNaH₂PO₄ 19mL，0.5M Na₂HPO₄ 81mL，6M盐酸胍，NaCl 29.3g和咪唑34g,加适量水溶解后定容到1000mL；

缓冲液3：不同咪唑浓度的缓冲液B配制：

对应关系：

2)接种表达菌株的200mL LB培养液经IPTG 16℃诱导表达12h后，8,000rpm离心弃去上清，收集菌体；

3)用30mL的PBS缓冲液，重新悬浮细菌沉淀；将悬浮的菌液置冰上，用超声波破碎仪超声破碎30min至菌液澄清，8,000rpm离心10min取上清；PBS缓冲液悬浮离心后的沉淀，取少量加SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(标号)待SDS-PAGE电泳检测；

4)向上清中加入500μl镍离子胶(Ni²⁺-NTA Agarose)，4℃缓慢转动孵育2h；

5)将Ni²⁺-NTA Agraose与上清的混合液倒入专用的塑料纯化柱中，使其依靠重力缓慢流出，将洗脱液再次倒回纯化柱，使其依靠重力缓慢流出，取少量(标号)加蛋白上样缓冲液待SDS-PAGE电泳检测；

6)用缓冲液1平衡1-2个柱体积，直至无液体流出；

7)分别用含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液B进行阶段洗脱，每个阶段至少洗1个柱体积(视具体情况而定)，收集各阶段洗脱峰；

8)洗脱完毕后用缓冲液1冲洗2个柱体积，再用蒸馏水冲洗5个柱体积，4℃保存，可重复使用。

9)将各浓度洗脱液进行SDS-PAGE电泳，检查蛋白纯化情况，如图1B所示，PNRSV CP重组蛋白被成功纯化。

2 PNRSV CP单克隆抗体的制备

2.1免疫小鼠

用纯化并透析后的表达蛋白免疫8周龄BALB/c雌性小鼠：初免用生理盐水将纯化后的蛋白适当稀释，吸取100μL/只(含50μg蛋白抗原)与等体积的弗氏完全佐剂(Freund’scomplete djuvant,FCA)进行混合，充分乳化后经腹腔加皮下注射200μL每只，间隔3周，取与初免等量抗原和等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔加皮下注射200μL每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。

2.2细胞融合

取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按8:1的比例在无血清的RPMI1640(Gibco)培养基中混匀，1,500rpm离心5min后去除培养基，含有细胞的离心管在37℃水浴中加入1mL 50％PEG(分子量1500)融合剂，融合2min，用无血清的RPMI 1640培养基终止融合后1,500rpm离心5min，吸去上清后沉淀用含HAT、胎牛血清、青链霉素的RPMI 1640培养基悬浮，分装到96孔细胞板中，于37℃5％CO₂的细胞培养箱中筛选培养。

2.4杂交瘤细胞的筛选及细胞克隆

细胞培养箱中培养7天后用含HT、胎牛血清、青链霉素的RPMI 1640培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底15％以上时，用适宜浓度PNRSV CP重组蛋白包被ELISA板，用间接ELISA方法筛选阳性孔，经检测后筛选到的阳性孔加上适量含HT、胎牛血清、青链霉素的RPMI 1640培养基，1-2d后利用dot-ELISA分析阳性细胞株分泌抗体的特异性情况，鉴定到特异性好的杂交瘤细胞。

将特异性针对蛋白和病叶组织液的杂交瘤细胞进行有限稀释法细胞克隆。克隆细胞株时，将特异性好的杂交瘤细胞从阳性孔中吸出，在细胞培养板中进行梯度稀释，在显微镜中找到大约有100个细胞的孔，用培养基将细胞悬浮起来，吹打后分装到96个细胞板孔中。培养5-6d后，挑选出只有单个细胞团的孔，并且加入适量培养基，3-4d后对这些含有单克隆细胞的孔继续进行抗体阳性检测和抗体特异性检测。连续克隆3-4次直至克隆的每个单克隆细胞孔都分泌抗体为止。

最终获得1株能分泌PNRSV高度特异和灵敏单抗的杂交瘤细胞株9E1，即前述保藏号为CGMCC No.45329的杂交瘤细胞株。经3个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和细胞冻存。

2.6单克隆抗体腹水制备及纯化

取14周龄左右BALB/c雄性小鼠，腹腔注射0.3-0.5mL降植烷，7-10天后腹腔注入约7×10⁵个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，用针头采取腹水，8,000rpm离心3min，收集上清液即为单抗腹水。

取1倍体积腹水加2倍体积0.85％生理盐水稀释，室温下边搅拌边滴加饱和硫酸铵溶液(pH 7.0)，4℃过夜，12,000rpm离心10min，2mL 0.85％生理盐水悬浮沉淀，在4℃0.85％生理盐水中透析24h后即获纯化的单抗，-80℃保存。

2.6单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定

单克隆抗体类型和亚类鉴定使用Sigma公司的免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒，具体步骤参照说明书进行。结果分析9E1单抗亚类为IgG2b、κ轻链。以PNRSV CP重组蛋白为抗原，用间接ELISA方法检测单抗腹水效价，分析结果表明单抗腹水效价达10^-7。

3单克隆抗体的Western blot特异性分析

1)样品制备：各自称取0.1g健康叶片和感染PNRSV病叶在研钵中用液氮速冻，充分研磨后加入1mL 2×SDA-PAGE蛋白上样缓冲液，混匀后转移到1.5mL离心管中，在100℃金属浴中放置10min让蛋白充分变性，然后迅速置于冰上5min，置于离心机12,000rpm离心5min，上清液即为蛋白样品；取适量浓度的PNRSV CP重组蛋白20μL，加入5μL 5×蛋白缓冲液，在100℃金属浴中放置10min让蛋白充分变性后备用。

2)上样及SDS-PAGE电泳：将制备好的SDS-PAGE胶，架于胶架上，然后置于正负电极对应的位置，加入足量的蛋白电泳缓冲液，各取20μL蛋白样品上样，并加上蛋白Marker，采用恒压法进行蛋白电泳，先用80V电泳0.5h，然后110V电泳1.5h；

3)湿转法转膜：待电泳结束后取出胶板中的SDS-PAGE胶，浸泡于湿转buffer中，将SDS-PAGE胶与一张和SDS-PAGE胶大小一致的NC膜紧密贴合，小心去除气泡，胶和膜的两边都用滤纸和海绵垫贴合，转膜夹子夹紧，然后放入电泳槽中，凝胶置于阴极一侧，300mA恒流转膜50min；

4)Western blot：蛋白转膜结束后取出NC膜，并用PBST缓冲液进行冲洗，去除湿转buffer；将膜置于含5％脱脂奶粉的PBST中，然后置于37℃恒温箱30min或者4℃冰箱中过夜封闭；然后将封闭后的膜取出，放置于5,000倍稀释的单克隆抗体(一抗)中37℃孵育1h，用PBST洗涤4次，每次2min；然后将膜置于8,000倍稀释的酶标二抗中，37℃孵育1h，用PBST洗涤5次，每次2min，再用PBS将膜冲洗一次；10mL AP酶底物缓冲液中加入33μL BCIP和66μLNBT即为显色液，在室温下，将处理好的NC膜放入显色液中，使膜完全被显色液淹没，然后用锡箔纸遮光，待特异性条带逐渐显现至清晰时将膜取出，然后用PBS洗去多余的显色液，用滤纸吸干后拍照记录，结果如图2所示，9E1单抗特异性识别重组PNRSV CP和病叶中的PNRSVCP蛋白。

4 ACP-ELISA方法分析单克隆抗体的特异性

用感染李痘病毒(PPV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)、苹果坏死花叶病毒(ApNMV)、苹果茎沟病毒(ASGV)的病叶粗提液包被ELISA板，以健康叶片粗提液为阴性对照，感染PNRSV的病叶粗提液为阳性对照，用ACP-ELISA方法分析单抗的特异性。ACP-ELISA方法的步骤如下：上述病毒感染的病叶和健康叶片分别在研钵中研磨，按1:20比例(w/v,g/mL)加入ELISA包被液匀浆，8,000rpm离心3min后上清100μL/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃4h；PBST洗涤3次后用3％的脱脂奶粉封闭30-60min；加入1:5000倍稀释的单抗100μL/孔，37℃孵育1-2h；PBST洗涤3次后加1:8000倍稀释的碱性磷酸脂酶(AP)标记羊抗鼠IgG二抗(Sigma公司)100μL/孔，37℃孵育1-2h；PBST洗涤4次后用PNPP底物显色30-60min，2mol/L氢氧化钠终止反应后，用酶标仪读取OD₄₀₅的值，与阴性OD₄₀₅比值大于3.0的样品为阳性。结果发现，9E1单抗对PNRSV有免疫反应，而与感染PPV、CGMMV、ApNMV、ASGV和健康植物组织粗提液均无任何免疫反应。

二、检测血清学方法的建立

2.1 ACP-ELISA检测方法的建立

2.1.1 ACP-ELISA检测方法的步骤

1)叶片在研钵中研磨后按1:20比例(w/v,g/mL)加入ELISA包被液继续匀浆3min，8,000rpm离心3min后上清100μL/孔包被ELISA板，以感染PNRSV的叶片组织作为阳性对照，以健康叶片组织作阴性对照，4℃包被过夜或37℃包被2h；

2)包被后用含有PBST的洗板机(Microplate Washers,ELX405)将酶标板洗干净，洗板机循环数设置为3，每孔加入250μL封闭液(含3％脱脂奶的PBS)，37℃封闭0.5-1h；

3)弃ELISA板中封闭液，用装PBST的洗板机洗涤3次后，用封闭液适当稀释一抗后加入100μL/孔，37℃孵育1-2h；

4)弃ELISA板中一抗稀释液，装PBST的洗板机洗涤3次后加入适当稀释的AP标记羊抗鼠IgG二抗(Sigma)100μL/孔，37℃孵育1-2h；

5)装PBST的洗板机洗涤4次，每次3min。加PNPP底物于37℃显色30min，肉眼观察底物颜色变成黄色的孔为阳性，或2M氢氧化钠终止反应后用Bio-Rad 680酶标仪测OD₄₀₅，以P/N>3.0作为阳性判断标准。

2.1.2检测PNRSV的ACP-ELISA方法的建立

采用方阵试验确定ACP-ELISA方法中抗体的最适工作浓度，即用1:20倍稀释的(w/v,g/mL)PNRSV病叶粗提液作为抗原包被ELISA板；ELISA板横向每列分别加入1:1000-1:512000倍比稀释的PNRSV单抗并反应1h，PBST洗涤后ELISA板纵向每行分别加入1:1000-1:512000倍比稀释的AP标记的羊抗鼠IgG二抗，健康植物稀释粗提液作为阴性对照，每个处理设3次重复，确定ACP-ELISA中抗体的最适工作浓度。结果显示9E1单抗以1:5000倍稀释和AP标记的羊抗鼠IgG二抗以1:8000倍稀释为最适工作浓度，根据最适工作浓度建立检测PNRSV的ACP-ELISA方法。

2.1.3检测PNRSV的ACP-ELISA方法的特异性和灵敏度分析

以感染PNRSV的病叶和健康叶片组织粗提液分别为阳性对照和阴性对照，取感染PPV、CGMMV、ApNMV、ASGV病叶粗提液作为检测样品，加到ELISA板中，重复实验三次，分析PNRSV单抗及建立的ACP-ELISA方法的特异性。在最适抗体工作浓度下，该方法检测感染PNRSV的病叶均呈阳性反应，而检测感染PPV、CGMMV、ApNMV、ASGV和健康植物叶片粗提液呈阴性反应，且与阳性样品的OD值差异极显著，说明该方法和单抗的特异性好。

将感染PNRSV的病叶和健康叶片分别用PBS缓冲液从1:20倍(w/v,g/mL)开始梯度稀释，梯度稀释的粗提液依次加到ELISA板，分析ACP-ELISA方法检测感染PNRSV病叶的灵敏度，实验重复三次。结果表明，ACP-ELISA检测病叶的灵敏度达到1:10240倍稀释(w/v,g/mL)。

2.2 dot-ELISA检测方法的建立

2.2.1 dot-ELISA检测方法的步骤

1)在研钵中研磨植物组织，按1:20(w/v,g/mL)比例加入0.01M PBS缓冲液匀浆，8,000rpm离心3min，上清即为植物组织粗提液；

2)点样：取2μL粗提液点到硝酸纤维素(NC)膜上，同时设置健康和感染PNRSV的叶片粗提液分别作为阴性和阳性对照，37℃恒温箱烘干10min；

3)封闭、一抗孵育：NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01MPBS)封闭液中37℃封闭30min；然后，NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育1h；

5)洗膜：用PBST洗膜3次，每次3min；

6)二抗孵育：NC膜放入适度稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育1h后洗膜4次，每次3min；

7)显色：66μL NBT和33μL BCIP底物加入到10ml底物缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1MNaCl、0.025M MgCl、pH9.5)混匀，用吸水纸把膜吸干，膜放入底物液中反应，室温避光显色15-20min。肉眼观察结果，当阳性对照显现紫色斑点，而阴性对照无变化时膜在去自来水中漂洗终止反应，拍照并记录结果。

2.2检测PNRSV的dot-ELISA方法的建立

从1:1000倍开始分别进行倍比稀释PNRSV单克隆抗体和AP标记的羊抗鼠IgG二抗，用方阵实验确定dot-ELISA方法中单抗和酶标二抗的最适工作浓度。实验结果表明，单抗和酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5000和1:8000倍稀释，以上述抗体的最适工作浓度建立检测植物中PNRSV的dot-ELISA方法。

2.3检测PNRSV的dot-ELISA方法的特异性和灵敏度分析

以感染PNRSV的病叶和健康叶片组织粗提液分别为阳性对照和阴性对照，取感染PPV、CGMMV、ApNMV、ASGV病叶粗提液作为检测样品，进行dot-ELISA方法的特异性分析。结果发现，该方法检测感染PNRSV的病叶粗提液呈阳性反应，而检测感染PPV、CGMMV、ApNMV、ASGV和健康叶片粗提液均呈阴性反应(图3A)，说明该方法和单抗的特异性非常好。

取感染PNRSV的病叶在研钵中研磨匀浆，用0.01M PBS从1:10倍(w/v,g/mL)开始梯度稀释，同样对健康叶片粗提液作相同处理。用dot-ELISA方法检测感染PNRSV病叶的灵敏度。灵敏度分析表明，当PNRSV病叶粗提液稀释到1:1280倍(w/v,g/mL)时，用建立的dot-ELISA检测仍呈现紫色的阳性斑点(图3B)，即其检测病叶的灵敏度达到1:1280倍稀释。

2.3 Tissue print-ELISA检测方法的建立

2.3.1 Tissue print-ELISA检测方法的步骤:

1)样品准备：将检测植物的叶子卷成圆筒状或者茎秆用刀片切出平整的横切面；

2)点样：将横切面在NC膜上按压3sec，同时将健康和感染PNRSV植物组织分别作为阴性和阳性对照，37℃烘箱干燥5min；

3)封闭：NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01MPBS)封闭液中室温封闭1h；

4)一抗孵育：NC膜放入适当稀释的PNRSV单抗中室温孵育1h；

5)二抗孵育：用PBST洗膜3次后NC膜放入适当稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG中室温孵育1h；

6)PBST洗膜4次，每次3min；

7)加底物显色：10ml显色缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl、pH9.5)中加入66μl NBT和33μl BCIP底物(Promega)混匀，将膜浸入显色液中进行显色反应，直至阳性显色明显、阴性对照未显色时将膜在去自来水中漂洗终止反应，记录显色结果。

2.3.2检测PNRSV的Tissue print-ELISA方法的建立

通过方阵实验确定Tissue print-ELISA中单抗和酶标二抗的最适工作浓度。选择检测灵敏度和特异性最高时一抗、酶标二抗稀释度组合为Tissue print-ELISA的最适工作浓度。结果发现单抗9E1和AP标记的羊抗鼠二抗分别稀释1:5000和1:8000倍时Tissueprint-ELISA方法的检测灵敏度和特异性最佳，根据抗体最适工作浓度建立Tissue print-ELISA方法。

2.3.3检测PNRSV的Tissue print-ELISA方法的特异性分析

用分别感染了PPV、CGMMV、ApNMV、ASGV病叶粗提液作为检测样品，以感染PNRSV的病叶和健康叶片组织粗提液分别为阳性对照和阴性对照，用建立的Tissue print-ELISA血清学方法进行检测，分析该血清学方法检测PNRSV的特异性。结果发现，该方法检测感染PNRSV的病叶粗提液呈阳性反应，而检测感染PPV、CGMMV、ApNMV、ASGV和健康叶片粗提液均呈阴性反应(图4)。三、李属坏死环斑病毒dot-ELISA检测试剂盒

三、李属坏死环斑病毒dot-ELISA检测试剂盒

1)试剂盒主要成分：

以上试剂均保存于4℃

硝酸纤维素膜(NC)10张

脱脂奶粉30g

10X PBST 1瓶 100mL

底物缓冲液1瓶 100mL

2)检测样品的操作步骤：

a.植物组织称重、在研钵中研磨，按1:20-50比例(w/v,g/mL)加入0.01MPBS(pH7.4)后匀浆；

b.匀浆液8,000rpm离心3min；

c.取2.0μL上清点样于NC膜上，同时设置健康和感染PNRSV的组织分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20min；

d.NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％ Tween-20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭30min；

e.NC膜放入1:5000倍稀释的单抗中室温孵育60min；

f.用PBST洗膜3-4次，每次3min；NC膜放入1:8000稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育60min；

g.PBST洗膜4次，每次3min；

h.66μL NBT和33μL BCIP底物加入到10mL底物缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1MNaCl、0.025M MgCl₂、pH9.5)中，混匀后膜放入底物液中显色，肉眼观察结果，待阳性对照显明显紫色而阴性对照没有任何显色时自来水漂洗膜终止反应，拍照记录结果。

3)保存及有效期：

于2-8℃避光保存，有效期12个月。

4)磷酸盐缓冲液(0.01M PBS，pH7.4)配方：

加蒸馏水950mL溶解后调pH至7.4，定容至1,000mL

四、李属坏死环斑病毒Tissue print-ELISA检测试剂盒

1)试剂盒主要成分：

以上试剂均保存于4℃

硝酸纤维素膜(NC)10张

脱脂奶粉30g

10X PBST 1瓶 100mL

底物缓冲液1瓶 100mL

2)检测样品的操作步骤：

a.样品准备：取感病的叶片或茎，将嫩叶卷成圆筒状用刀片切一个横断面，嫩茎直接切成横断面；

b.点样：将横断面在NC膜上按压3sec，同时将健康和感染PNRSV组织分别作为阴性和阳性对照，37℃烘箱干燥5min；

c.NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％ Tween-20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭30min；

d.NC膜放入1:5000倍稀释的单抗中室温孵育60min；

e.用PBST洗膜3次，每次3min；NC膜放入1:8000稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育60min；

f.PBST洗膜4次，每次3min；

g.66μL NBT和33μL BCIP底物加入到10mL底物缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1MNaCl、0.025M MgCl、pH9.5)中，混匀后膜放入底物液中显色，肉眼观察结果，待阳性对照显明显紫色而阴性对照没有任何显色时去离子水漂洗膜终止反应，拍照记录结果。

3)保存及有效期：

于2-8℃避光保存，有效期12个月。

4)磷酸盐缓冲液(0.01M PBS，pH7.4)配方：

加蒸馏水950mL溶解后调pH至7.4，定容至1,000mL。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种分泌抗李属坏死环斑病毒单抗杂交瘤细胞株9E1，其特征在于能分泌抗李属坏死环斑病毒单抗，所述的杂交瘤细胞株9E1于2022年11月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.45329。

2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株9E1分泌的抗李属坏死环斑病毒单抗。

3.如权利要求2所述的抗李属坏死环斑病毒单抗，其特征在于该单抗腹水间接ELISA效价达10^-7，抗体类型及亚类为IgG2b、κ轻链，该单克隆抗体与李属坏死环斑病毒30kDa左右的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用该单抗建立ACP-ELISA和dot-ELISA方法检测感染PNRSV病叶组织粗提液的灵敏度分别达到1:10240和1:1280倍稀释，单位为重量/体积，g/mL。

4.如权利要求2所述的抗李属坏死环斑病毒单抗，其特征在于所述的单抗能与李属坏死环斑病毒有特异性免疫反应，而不与李痘病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、苹果茎沟病毒、苹果坏死花叶病毒和健康植物组织发生免疫反应。

5.一种如权利要求2所述的抗李属坏死环斑单抗在该病毒检测上的应用，其特征在于所述应用为以抗李属坏死环斑单抗为检测抗体建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。

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