CN115957384A - 一种仿生型关节超润滑剂及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种仿生型关节超润滑剂及其制备方法、应用，通过将壳聚糖和磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯进行聚合反应制备得到。其采用壳聚糖(CS)和磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(SBMA)为原料制备。经体外实验证明，该润滑剂可对Ti₆Al₄V合金基材实现摩擦系数(COF)≤10^‑2且持久稳定的超润滑效果，同时对骨关节炎模拟软骨以及其他人工关节材料如超高分子聚乙烯和氧化铝都能实现明显的润滑效果。在骨关节炎模型小鼠中，注射该超润滑剂对由于关节疼痛引起的异常步态表现出改善作用。具有应用于骨关节炎软骨的润滑修复以及人工关节材料的润滑保护的前景。

Description

一种仿生型关节超润滑剂及其制备方法、应用

技术领域

本申请涉及一种仿生型关节超润滑剂及其制备方法、应用，属于生物医用材料领域。

背景技术

骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是全球最常见的一种以关节软骨退行性病变为主要特征的全关节异质性疾病。关于OA的一个显著特点就是因关节软骨损伤而导致的关节润滑性能的下降。如果不及时采取措施来修复关节软骨的润滑性能，关节软骨的摩擦增加将会导致软骨碎片的生成。这些碎片又会促进蛋白水解酶的分泌，加速软骨胶原蛋白网络的降解，产生更多的软骨碎片，由此形成恶性循环持续加重OA，最终可能导致残疾。因此，修复关节软骨的润滑性能在OA的治疗中具有非常重要的意义。

目前，临床上常采取向关节腔内注射高分子量的透明质酸(HA)来治疗OA，也被称为“粘弹剂补充疗法”。这主要是因为HA可作为软骨基质的补充成分，可以改善软骨的润滑性能。此外，HA溶液也可作为粘弹性流体，通过润滑关节软骨减轻磨损。然而，HA在体内的快速降解和价格高昂的问题一直没能得到很好的解决。并且，单一的HA也难以实现超润滑的效果(摩擦系数(Coefficient of Friction,COF)≤10^-2)。

正常人体关节软骨具有优异的润滑效果，跟其表面存在着的关节润滑复合物密不可分。研究证实，关节润滑复合物为一种刷状的大分子，是由高分子量的HA作为主链，润滑素和磷脂(Phospholipids，PLs)分别作为侧链组成的复杂体系。关节润滑复合物能结合在软骨表面，利用PLs的超亲水性形成致密的水化层，可以为关节软骨提供强大的边界润滑作用，使其COF可降低至0.0005–0.04。

目前，有许多研究通过模拟关节润滑复合物的结构和机理进行材料的仿生设计，以开发有效的关节润滑剂来实现软骨的润滑修复。

迄今为止，仿生型润滑剂的报道主要可分为两类，即半合成型润滑剂和全合成型润滑剂。然而，目前的润滑剂都存在着一些弊端，例如半合成型润滑剂常用到HA等生物大分子，其在体内快速清除的问题没能得到根源上的解决；全合成型润滑剂则常常需要严格的反应条件，包括剧毒催化剂和有机溶剂的使用，影响着生产和应用的安全性。除此之外，润滑剂能否在不同压强条件下仍保持优异且稳定的润滑性能也是值得关注的，因为润滑剂分子可能在剪切力的作用下从软骨表面剥离，丧失润滑效果。

发明内容

为克服现有报道的仿生关节润滑剂体内快速降解，制备条件严苛以及润滑稳定性不足的问题，本发明利用两种具有成本优势的原料，以绿色安全的反应条件聚合生成一种嵌段共聚物。该共聚物溶液可作为一种仿生型关节超润滑剂，对基材具有优异的润滑效果，并具备突出的润滑稳定性能。

本发明以壳聚糖(Chitosan，CS)和磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(Sulfobetainemethacrylate，SBMA)作为原料，在稀醋酸溶液中，用引发剂引发聚合生成嵌段共聚物CS-b-pSBMA。其溶液具有突出的润滑性能，通过在基材表面形成一层稳定并且具备水合功能的分子刷，可以实现对Ti6Al4V合金基材优异稳定的超润滑效果(COF≤10^-2)；同时，对其他人工关节材料如氧化铝和超高分子聚乙烯以及模拟OA的软骨都能实现显著的润滑效果，并具备良好的生物相容性。在OA模型小鼠实验中，展现出对疾病异常步态的改善作用。

根据本发明的第一方面，提供了一种仿生型关节超润滑剂，通过将壳聚糖和磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯进行聚合反应制备得到。

可选地，所述壳聚糖的六元糖环单元和磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯的摩尔比为1:(1-15)。

可选地，所述壳聚糖的六元糖环单元和磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯的摩尔比上限独立地选自1：1、1：5、1：7、1：10、1：12、1：14，下限独立地选自1：15、1：5、1：7、1：10、1：12、1：14。

可选地，所述仿生型关节超润滑剂润滑后的Ti6Al4V合金与聚二甲基硅氧烷(PDMS)摩擦副间的COF≤10^-2。

本申请中的所述仿生型关节超润滑剂具有抵抗不同压力，不同溶剂以及不同酶处理条件下的摩擦润滑稳定性能。

可选地，所述仿生型关节超润滑剂通过静电吸附作用锚固在软骨表面提供润滑作用。

本申请中仿生型关节超润滑剂对于骨关节炎模型动物的异常步态具有改善效果。

根据本申请的第二方面，提供了一种上述仿生型关节超润滑剂的制备方法，所述制备方法包括：

将含有壳聚糖的溶液在引发剂作用后，与磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯发生聚合反应，得到所述仿生型关节超润滑剂。

可选地，所述引发剂选自过硫酸铵、过硫酸钾中的至少一种。

可选地，每500mg壳聚糖加入100-200mg引发剂。

可选地，所述制备方法包括：

将壳聚糖用稀醋酸溶液溶解完全，在引发剂作用后，加入磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯水溶液发生聚合反应，得到所述仿生型关节超润滑剂。

可选地，每500mg壳聚糖中加入20-30ml体积分数为1％的稀醋酸溶液。

可选地，所述聚合反应的条件为：温度为50-70℃，时间为6-8h。

根据本申请的第三方面，提供了一种上述仿生型关节超润滑剂、根据上述方法制备得到的仿生型关节超润滑剂中的至少一种在骨关节炎以及人工关节材料中的应用。

可选地，所述人工关节材料选自Ti6Al4V合金基材、氧化铝、超高分子聚乙烯、模拟骨关节炎的软骨中的至少一种。

本发明中CS是由甲壳素经脱乙酰化获得的，自然界中甲壳素来源丰富，所以CS相比HA具有巨大成本优势。关节软骨因为富含糖胺聚糖，在众多SO₄ ^2-和COO^-官能团作用下，所以整体显电负性。而CS是天然多糖中为数不多的阳离子型聚合物，因为其结构中含有氨基(—NH₂)，水化后带正电荷，所以可促进CS与带负电荷关节软骨的锚固结合，使CS稳定在软骨表面。

上述中关于CS的生物降解性，大量研究表明，CS及其衍生物在体内主要是被溶菌酶所降解的，但人体中缺乏溶菌酶，所以CS理论上能在体内长期稳定地存在。此外，CS已被广泛用于生物医用材料领域研究，被证明是具有优异生物相容性的。

上述中SBMA的自聚物——聚磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(Poly sulfobetainemethacrylate,pSBMA)，是一种超亲水和超低生物黏附的两性离子聚合物材料，目前被广泛应用于抗细菌、细胞或蛋白黏附材料的开发。这个性能主要归因于其超强的水合能力，具体是由该分子上的磺基甜菜碱结构和水分子相互之间的强静电吸引力所形成的。在天然的关节润滑复合物中，PLs也是因为其磷酰胆碱结构可在关节软骨表面形成稳定的水合层，防止软骨的相互接触从而起到关节边界润滑的作用。

因此，本发明利用pSBMA的强大水合能力，来模拟PLs在关节软骨中的“水合润滑”功能，通过与CS的嵌段共聚，实现对多种基材的“锚固——润滑”效果。

本申请能产生的有益效果包括：

本发明利用CS和SBMA制备的仿生型超润滑剂解决了现有提出的仿生型润滑剂体内快速降解，制备条件严苛的问题，也实现了润滑剂持久稳定的润滑效果，并提出“锚固——润滑”机制模型加以理论说明；同时，其对常见的人工关节材料也具有明显的润滑效果，以及对OA模型动物的步态具有明显改善作用，使得其在OA治疗中具有应用前景。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1是本发明的润滑剂制备反应原理图。

图2为不同浓度下润滑剂COF的测试结果。

图3示出了润滑剂分别在0.5N，5N，10N，20N，50N压力的条件下COF的测试结果。

图4是单体投料比分别为1：1，1：5，1：10和1：15时制备的润滑剂性能的测试结果。

图5为润滑剂单体以及单体混合物与润滑剂对比的COF测试结果。

图6表现了润滑剂在生理盐水，PBS缓冲液以及牛血清蛋白溶液中COF的测试结果。

图7展示了润滑剂在溶菌酶以及透明质酸酶处理后COF的测试结果。

图8则是生理盐水，HA和润滑剂在模拟OA软骨润滑中COF的测试结果。

图9示出了HA与润滑剂分别对钛合金，玻璃，氧化铝和超高分子聚乙烯的润滑测试结果。

图10为含不同浓度润滑剂的培养基与兔软骨细胞共培养3天后的毒性试验结果。

图11a、b分别为FITC与润滑剂的结合原理示意图和FITC标记润滑剂后对软骨结合的荧光信号情况。

图12a、b、c分别为小鼠右后脚掌印的记录实况以及足印面积和信号强度的统计情况。

具体实施方式

下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买。

图1是本发明的润滑剂制备反应原理图。

【实施例1】

仿生型超润滑剂制备：首先，500mg的CS完全溶于1％(体积含量)稀醋酸溶液(30ml醋酸溶液)中并保持反应温度60℃，通入氮气除氧30分钟；随后加入100mg过硫酸铵(APS)作用30min，过硫酸根不稳定易生成硫酸根自由基，通过进攻壳聚糖的β-1，4-糖苷键，切断壳聚糖分子链，可以生成短链壳聚糖自由基；然后，30分钟内匀速加入20ml含4.57g SBMA的水溶液(按CS中六元糖环单元与SBMA摩尔比1：5投料)，壳聚糖自由基进攻SBMA中的C＝C键，引发链式聚合反应；保持温度和氮气继续反应6小时，生成CS与pSBMA的线性共聚物。最后，体系溶液用分子量8000-14000的透析袋在流动去离子水中连续透析72小时，冷冻干燥得到嵌段产物CS-b-pSBMA——本发明中仿生型超润滑剂的固体形式。将CS-b-pSBMA按1mg/ml的浓度溶解在去离子水或其他生理介质溶液中，即可得到本发明的仿生型超润滑剂。

【实施例2】

分别配制浓度为100mg/ml，10mg/ml，1mg/ml，0.1mg/ml，0.01mg/ml的CS-b-pSBMA溶液以及质量分数为1％的HA(Mw＝1800-2200kDa)溶液。使用直径为6mm的PDMS半球和43mm*30mm的抛光Ti₆Al₄V合金组成摩擦副，分别添加上述的溶液作为润滑剂，利用摩擦磨损试验机(BRUKER，UMT Tribolab)通过线性往复运动的摩擦形式进行COF的测定，使用分析软件(Viewer)处理并求出平均COF值，每组重复3次试验。

试验参数设置：压力F＝10N，速率V＝10mm/s，单次行程S＝10mm，运行时间T＝3600s。

试验结果如图2所示，CS-b-pSBMA润滑剂浓度在低至1mg/ml的时候就可以实现超润滑效果，相比较1％ HA拥有更加优异的润滑性能。与此同时，润滑剂在3600s内的摩擦测试期间(等效1800次摩擦循环)都能维持住超低的摩擦系数，体现了其稳定的润滑性能。

【实施例3】

使用1mg/ml的CS-b-pSBMA润滑剂，参考实施例2的试验形式，分别设置压力F为0.5N，5N，10N，20N，50N进行测试，取900s内的COF测试结果，以评估润滑剂在不同压力强度下的润滑效果。

根据赫兹接触理论计算得到，上述压力在本摩擦测试模型中分别对应0.38MPa，0.82MPa，1.03MPa，1.30MPa，1.76MPa的压强。试验结果在图3中，润滑剂在多个压强环境下都能保证COF≤10^-2。即使在压强高达1.76MPa的情况下，润滑剂仍能维持超润滑效果，并表现出良好的趋势，这说明润滑剂能抵抗高压强带来的高剪切作用，推测CS的锚固作用对润滑剂的稳定润滑性能具有重要作用。

【实施例4】

参考实施例1的操作，分别合成CS的六元糖环单元与SBMA摩尔投料比为1：1，1：5，1：10和1：15的CS-b-pSBMA嵌段共聚物。参考实施例2的试验条件，试验参数设置为压力F＝10N，速率V＝10mm/s，单次行程S＝10mm，运行时间T＝900s，用来进行COF测试，以确定润滑剂最优的合成投料比例。

从图4可知，CS与SBMA不同的摩尔投料比都能表现出优异的润滑效果，即都可以保证COF≤10^-2。当反应的摩尔投料比为1：5时，润滑剂能发挥出最优的润滑性能。

【实施例5】

参考实施例1，用APS引发SBMA自聚合成均聚物pSBMA，并分别配制1mg/ml的CS(1％乙酸溶解)，pSBMA，CS+pSBMA(CS和pSBMA比例按六元糖环单元和SBMA单元摩尔比1：5添加)以及CS-b-pSBMA的溶液。同样利用摩擦磨损试验机进行COF的测试，参照实施例4的试验条件和测试参数，以验证润滑剂的润滑作用。

试验结果如图5所示，CS，pSBMA以及二者的混合物均不能发挥出可媲美CS-b-pSBMA的润滑性能。同时，也可以注意到pSBMA因为没有CS上氨基的锚固作用，不足以抵抗摩擦剪切力的作用，故未能达到CS-b-pSBMA的润滑效果。

【实施例6】

分别使用生理盐水，PBS缓冲液(10mM，pH＝7.2-7.4)，0.1mg/ml的牛血清蛋白溶液配制1mg/ml的CS-b-pSBMA溶液，参照实施例4实验参数设置进行COF测定，以考察润滑剂在不同生理介质溶剂中的稳定性。

从图6得知，润滑剂在上述溶剂中都能实现超润滑效果，并且在生理盐水中表现出最出色的润滑性能，COF可低至0.008，初步说明了润滑剂在体内环境中应用的可行性。

【实施例7】

分别使用0.1mg/ml的溶菌酶和100u/ml的透明质酸酶与润滑剂溶液37℃摇床反应48h，1％的HA溶液用透明质酸酶处理作为对照，以验证润滑剂在酶环境中的稳定性能。

试验结果如图7示，润滑剂在溶菌酶和透明质酸酶中都能保持稳定的润滑效果，显示出可靠的酶环境稳定性。相反，HA在透明质酸酶处理后的润滑性能则急剧下降，这更加突出了润滑剂稳定的润滑性能。

【实施例8】

取新鲜猪膝关节头，使用内径为4mm的取骨钻获取软骨样品。将所得样品生理盐水洗涤2次后放入0.25％胰酶消化1h。随后去除胰酶，生理盐水洗涤3次获得模拟OA的软骨测试样品。使用定制的软骨夹具固定软骨样品，与抛光的Ti₆Al₄V合金组成摩擦副，分别使用生理盐水，HA和润滑剂参照实施例4的测试参数进行COF测定，评估润滑剂对离体软骨的润滑效果。

从图8可得知，润滑剂表现出了三者中最佳的软骨润滑效果，证明了润滑剂对软骨的润滑性能具有改善的作用，展示了润滑剂应用OA治疗的潜力。

【实施例9】

分别使用光滑的玻璃，超高分子聚乙烯以及氧化铝板与PDMS球组成摩擦副，以润滑剂为实验组，HA溶液为对照组，参照实施例4试验参数进行COF的测试，考察润滑剂对多种基材的润滑效果。

试验结果见图9，可知润滑剂对上述几种基材都能实现明显优于HA的润滑效果，这进一步拓展了润滑剂使用范围，如人工关节的润滑保护。

【实施例10】

细胞毒性：分别配制含10mg/ml，1mg/ml，0.1mg/ml，0.01mg/ml CS-b-pSBMA的DMEM完全培养基。于96孔板中种植5000个关节软骨细胞(新西兰大白兔)，待细胞贴壁后加入不同浓度的CS-b-pSBMA完全培养基培养72h。随后加入CCK-8试剂孵育3h，450nm波长检测吸光度以考察润滑剂的细胞毒性。

结果如图10所示，虽然润滑剂在高浓度情况即10mg/ml时，表现了细胞抑制作用，但在低浓度范围如0.01—1mg/ml浓度时表现出了与对照组相近的细胞活性。因本研究结果表明润滑剂达到有效润滑的使用浓度不超过1mg/ml，在安全的浓度范围里，所以可以认为润滑剂具有良好的细胞相容性。

【实施例11】

将少量异硫氰酸荧光素(FITC)与CS-b-pSBMA(按1：10质量比，以保证CS-b-pSBMA上保留氨基与软骨表面结合)在水溶液中反应6小时，去离子水透析72小时后获得FITC标记的CS-b-pSBMA衍生物——FITC-CS-b-pSBMA(反应原理见图11a)。参考实施例8的方法取下关节软骨样品，生理盐水清洗干净后浸入FITC-CS-b-pSBMA溶液中1min，随后立即用超纯水泡洗3遍，以去除多余的FITC-CS-b-pSBMA。另外，对泡洗后的软骨样品按实施例8进行摩擦实验，结束时再用超纯水泡洗3次，使用激光共聚焦显微镜进行荧光观察。

图11b展示了对照组及摩擦前后软骨样品的荧光信号情况。空白组的软骨因为没有经过任何处理，所以未能观察到荧光信号。而经过FITC-CS-b-pSBMA溶液浸泡并清洗后的软骨样品有少量荧光，证明FITC-CS-b-pSBMA结合到软骨表面。经过摩擦实验后，软骨样品表面可观察到增强的荧光信号，表明FITC-CS-b-pSBMA在摩擦力作用下被吸附到软骨表面，并可以抵抗摩擦剪切力的作用，证明了润滑剂的“锚固——润滑”模型。

【实施例12】

骨关节炎模型动物试验：使用骨关节炎小鼠模型评估润滑剂对OA的治疗效果。对15只小鼠右后膝关节腔内注射0.1mg/10μl的碘乙酸钠溶液，一周后获得OA模型小鼠，使用CatWalk XT步态分析系统(Noldus Inc.,Wageningen,The Netherlands)记录小鼠的步态信息，包括右后脚掌(RH)的足印面积和足印信号强度。随后，小鼠右膝关节腔内注射0.01mg/10μl的润滑剂溶液，2周后再次记录小鼠的步态信息，对比治疗前后的脚印面积和脚印信号强度。

结果如图12a-c所示，在经过注射润滑剂2周后小鼠右后脚的脚印面积和信号强度都有明显上升。可看出润滑剂注射对于OA小鼠的步态具有改善功能，说明润滑剂在OA治疗中能发挥积极的作用。

以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (10)

1.一种仿生型关节超润滑剂，其特征在于，通过将壳聚糖和磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯进行聚合反应制备得到。

2.根据权利要求1所述的仿生型关节超润滑剂，其特征在于，所述壳聚糖的六元糖环单元和磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯的摩尔比为1:(1-15)。

3.根据权利要求1所述的仿生型关节超润滑剂，其特征在于，所述仿生型关节超润滑剂润滑后的Ti6Al4V合金与聚二甲基硅氧烷摩擦副间的COF≤10^-2。

4.根据权利要求1所述的仿生型关节超润滑剂，其特征在于，所述仿生型关节超润滑剂通过静电吸附作用锚固在软骨表面提供润滑作用。

5.权利要求1至4任一项所述的仿生型关节超润滑剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

将含有壳聚糖的溶液在引发剂作用后，与磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯发生聚合反应，得到所述仿生型关节超润滑剂。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述引发剂选自过硫酸铵、过硫酸钾中的至少一种。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，每500mg壳聚糖加入100-200mg引发剂。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

将壳聚糖用稀醋酸溶液溶解完全，在引发剂作用后，加入磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯水溶液发生聚合反应，得到所述仿生型关节超润滑剂；

优选地，所述聚合反应的条件为：温度为50-70℃，时间为6-8h。

9.权利要求1至4任一项所述的仿生型关节超润滑剂、根据权利要求5至8任一项所述方法制备得到的仿生型关节超润滑剂中的至少一种在骨关节炎以及人工关节材料中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述人工关节材料选自Ti6Al4V合金基材、氧化铝、超高分子聚乙烯、模拟骨关节炎的软骨中的至少一种。

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