CN115951487A - 基于多波长点阵并行照明的移频超分辨显微成像系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于多波长点阵并行照明的移频超分辨显微成像系统及方法，属于超分辨显微领域。系统中的照明模块包括位于第一物镜后焦面上的多波长点光源阵列和第一物镜，多波长点光源阵列上的各处点光源具有不同波长且能够同时照明；探测模块包括第二物镜、分光器件、筒镜和成像相机；分光器件在第二物镜后方设有若干个，用于将散射光中不同波长成分离散到不同探测光路上通过筒镜和成像相机实现不同移频图像的并行探测。本发明将FPM移频成像技术的照明方案从单波长光源阵列依次照明拓展至多波长光源阵列并行照明，并相应的在探测端引入多路成像相机实现移频图像的并行采集，最终在不牺牲成像分辨率的情况下，将FPM的成像速度提升了数十倍。

Description

基于多波长点阵并行照明的移频超分辨显微成像系统及方法

技术领域

本发明涉及超分辨显微领域，尤其涉及快速移频超分辨显微成像领域。

背景技术

显微系统的成像通量由其成像分辨率、成像视场和成像速度共同决定，高通量光学显微成像系统能够高效获取观测样品的信息，在生命科学、药物研发和工业半导体检测等诸多领域中都具有很高的应用价值。为了突破光学衍射极限对显微系统成像分辨率的限制，目前出现了多种能够实现亚百纳米分辨率的超分辨成像技术，包括基于点扫描的受激辐射损耗显微技术(STED)、基于单分子定位的随机光学重建显微技术(STORM)、基于移频效应的标记结构光照明显微技术(SIM)和无标记傅里叶叠层显微技术(FPM)等。相较于点扫描方法和单分子定位方法，移频超分辨成像技术采用宽场成像和较少图像采集数量，在成像视场和成像速度方面更具优势，也是目前被研究最多的高通量显微成像技术之一。

不同于传统显微系统中采用垂直宽场照明，无标记傅里叶叠层显微技术中采用多角度倾斜照明，通过在照明场中引入横向光波矢来实现移频效应，将散射光中含有样品细节信息的高空间频率成分移动到成像系统低频通带内来接收，采用不同角度的倾斜照明实现样品频谱中不同方位高频成分(不同移频图像)的接收，最终拼接融合各高频成分获得范围超过系统低频通带的样品频谱，实现超分辨。为了引入不同角度的倾斜照明，现有研究中一般采用单波长LED阵列照明方案，依次点亮阵列中的LED并分别采集移频图像，考虑到一张超分辨图像的重构往往需要采集数十张移频图像，对应的数据采集时间将达到秒量级甚至分钟量级，显然该方案无法满足移动生物样品成像和高效缺陷检测等应用需求。

目前出现了多种提升FPM成像速度的方法：基于单次曝光的FPM，将不同倾角照明下的结果成像到相机上的不同区域，只需要同时点亮所有LED并单次曝光采集就能够获得所有移频图像，但是这种相机空间复用的方式牺牲了成像分辨率；基于LED并行照明的FPM，在单次曝光过程中同时点亮多个LED，因此单次采集的图像中将混叠多个不同移频图像的信息，可通过后期处理算法将它们解调分离，但是增加并行照明的LED数量将使后处理计算量急剧升高；基于深度学习的FPM，这种方法需要事先采集大量数据集来训练优化神经网络模型，且模型泛化性往往不够好。

发明内容

本发明目的在于针对现有技术的不足，提出一种基于多波长点阵并行照明的移频超分辨显微成像系统及方法。本发明主要是通过在FPM成像系统的照明端物镜后焦面引入多波长点光源阵列并行照明，使得不同倾角的照明光具有不同波长，从而在探测端根据波长将不同倾角照明的移频图像分光到多路相机上进行并行采集，实现FPM成像速度的提升。

本发明所采用的具体技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种基于多波长点阵并行照明的移频超分辨显微成像系统，包括置于样品前方的照明模块和置于样品后方的探测模块；

所述照明模块包括位于第一物镜后焦面上的多波长点光源阵列和第一物镜，多波长点光源阵列上的各处点光源具有不同波长且能够同时照明，第一物镜能将各处点光源辐射出的发散光束汇聚形成不同倾角的平行光；所述探测模块包括第二物镜、分光器件、筒镜和成像相机；所述第二物镜用于收集样品的散射光；所述分光器件在第二物镜后方设有若干个，用于将散射光中不同波长成分离散到不同探测光路上；每个所述探测光路上均依次设有筒镜和成像相机，以实现不同移频图像的并行探测。

作为优选，所述移频超分辨显微成像系统基于无标记傅里叶叠层显微技术成像系统实现。

作为优选，所述多波长点光源阵列的产生通过在后焦面上放置LED阵列实现；所述LED阵列中的各处LED具有不同的发射波长，通过控制电路来实现各处LED的并行照明。

作为优选，所述多波长点光源阵列的产生通过二维空间色散器将光频梳光源中的不同波长成分离散聚焦到后焦面上的不同空间位置实现，以直接形成并行照明。

作为优选，所述多波长点光源阵列中点光源的排布方式采用方形阵列或环形阵列。

作为优选，所述第二物镜前焦面与样品平面对齐，形成无限远成像配置。

作为优选，所述分光器件为二向色镜。

作为优选，所述成像相机为CCD或者sCMOS。

第二方面，本发明提供了一种利用第一方面任一所述基于多波长点阵并行照明的移频超分辨显微成像系统的快速成像方法，具体如下：

在第一物镜的后焦面上产生多波长点光源阵列；产生的多波长点光源阵列中，各处点光源具有不同波长且能够同时照明；各点光源辐射出的发散光束被第一物镜汇聚并形成不同倾角的平行光，各束平行光同时照明到待观测的样品上；样品发出的散射光被第二物镜收集；然后使用一系列具有不同反射波长的分光器件，将通过第二物镜的散射光中不同波长的成分离散到不同探测光路上；每条探测光路末端都放置有筒镜和成像相机，通过控制所有成像相机同步曝光以实现不同移频图像的并行探测，进而实现快速成像。

本发明相对于现有技术而言，具有以下有益效果：

本发明将FPM移频成像技术的照明方案从单波长光源阵列依次照明拓展至多波长光源阵列并行照明，并相应的在探测端引入多路成像相机实现移频图像的并行采集，最终在不牺牲成像分辨率的情况下，将FPM的成像速度提升了数十倍。

附图说明

图1是实施例中照明端物镜后焦面上的多波长点光源阵列分布示意图；

图2是实施例中采用多波长点阵并行照明的FPM成像系统光路示意图；

图3是实施例中单波长光源阵列依次照明FPM和多波长光源阵列并行照明FPM(本发明)的成像结果对比，其中图a和d是普通宽场照明下的强度图像和空间频谱，图b和e是单波长光源阵列依次照明FPM技术重构出的强度图像和空间频谱，图c和f是多波长光源阵列并行照明FPM技术重构出的强度图像和空间频谱。

图中附图标记为：1是多波长点光源阵列，2是第一物镜，3是样品，4是第二物镜，5是分光器件，6是筒镜，7是成像相机。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。

本发明提供了一种基于多波长点阵并行照明的移频超分辨显微成像系统，该系统主要包括照明模块和探测模块。其中，照明模块置于样品3前方，探测模块置于样品3后方。

本发明的系统中，照明模块主要包括第一物镜2，位于第一物镜2的后焦面上的多波长点光源阵列1。多波长点光源阵列1上的各处点光源具有不同波长，且各处点光源能够同时照明。第一物镜2能将多波长点光源阵列1上各处点光源辐射出的发散光束汇聚形成不同倾角的平行光。

本发明的系统中，探测模块主要包括第二物镜4、分光器件5、筒镜6和成像相机7。第二物镜4位于样品3后方，用于收集样品3的散射光。分光器件5根据需要设置多个，分别位于第二物镜4后方，用于将散射光中不同波长成分离散到不同探测光路上，以便于后续采集探测。每个探测光路上均依次设有筒镜6和成像相机7，以实现不同移频图像的并行探测。

在一种较佳的实施例中，本发明的移频超分辨显微成像系统可以基于无标记傅里叶叠层显微技术(FPM)成像系统实现。也就是说，通过在FPM成像系统的照明端物镜后焦面引入多波长点光源阵列1并行照明，使得不同倾角的照明光具有不同波长，从而在探测端根据波长将不同倾角照明的移频图像分光到多路相机上进行并行采集，实现FPM成像速度的提升。

在一种较佳的实施例中，多波长点光源阵列1的产生可以采用LED方案或光频梳方案。其中，LED方案是指在照明端后焦面上直接放置一个LED阵列，阵列中各处LED具有不同的发射波长，通过控制电路来实现并行照明；光频梳方案是指利用二维空间色散器将光频梳光源中的不同波长成分离散聚焦到照明端后焦面上的不同空间位置，直接形成并行照明。

对于多波长点光源阵列1而言，点光源的排布方式可以采用方形阵列或环形阵列，具体是可以通过调整LED方案中的电路设计或者光频梳方案中的二维空间色散器设计来实现。点光源照明阵列中的点光源数目、各处点光源间距和各处点光源采用的波长需要综合设计，在引入尽可能大移频量的同时保证图像重构所需的频谱重叠率。

在一种较佳的实施例中，可以将第二物镜4前焦面与样品3平面对齐，形成无限远成像配置，进而方便在后续光路中插入一系列分光器件。具体的，分光器件5可以采用二向色镜，成像相机7可以采用CCD或者sCMOS。

利用上述基于多波长点阵并行照明的移频超分辨显微成像系统的快速成像方法，具体如下：

在第一物镜2的后焦面上产生多波长点光源阵列1；产生的多波长点光源阵列1中，各处点光源具有不同波长且能够同时照明；各点光源辐射出的发散光束被第一物镜2汇聚并形成不同倾角的平行光，各束平行光同时照明到待观测的样品3上；样品3发出的散射光被第二物镜4收集；然后使用一系列具有不同反射波长的分光器件5，将通过第二物镜4的散射光中不同波长(即不同照明倾角)的成分离散到不同探测光路上；每条探测光路末端都放置有筒镜6和成像相机7，通过控制所有成像相机7同步曝光以实现不同移频图像的并行探测，进而实现快速成像。

实施例

本实施例中，采用LED方案产生多波长点光源照明阵列。该照明阵列由25个具有不同发射波长的LED构成，发射波长(λ₁,λ₂λ₃,…,λ₂₅)＝(510nm,520nm,530nm,…,750nm)；该照明阵列布局采用如图1所示的5×5方形阵列，相邻点光源之间的横向和纵向间距均取值19mm；照明端物镜焦距45mm；待观测样品使用ISQ-219-100A标准分辨率测试板；探测端物镜数值孔径NA＝0.25，其后依次放置有25个不同反射波长的二向色镜，将25个不同波长处的散射光分散到25条探测支路中并行采集，每条探测支路都由一个筒镜和一个放置在筒镜焦面处的CCD成像相机组成，如图2所示。

操控电路使光源阵列中的25个LED同时发光照明样品，同时操控探测端的25个成像相机同步曝光，在一次曝光时间内可以并行采集全部25张移频图像，再将这25张移频图像输入FPM重构算法，最终输出如图3c和f所示的超分辨图像和范围拓展的空间频谱。将该成像结果和采用630nm宽场照明的显微成像结果、采用630nm单波长光源阵列依次照明方法的FPM成像结果进行对比，可以发现宽场照明显微图像中仅能分辨出样品最下面一行1～2号光栅，而两种FPM方法获取的超分辨图像中均能比较清晰的分辨出样品最下面一行1～5号光栅，两者相似的空间频谱范围进一步佐证了本发明可以在保证移频超分辨成像效果的同时，将FPM成像速度提升数十倍(本实施例中为25倍)。

需要补充说明的是，成像系统空间频率截止范围和波长有关，不同波长照明下的频谱孔径大小也会稍有不同，因此将它们融合拼接后得到的如图3f所示的空间频谱的轮廓，不像图3e所示的单波长照明FPM的空间频谱那样显得匀称。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种基于多波长点阵并行照明的移频超分辨显微成像系统，其特征在于，包括置于样品(3)前方的照明模块和置于样品(3)后方的探测模块；

所述照明模块包括位于第一物镜(2)后焦面上的多波长点光源阵列(1)和第一物镜(2)，多波长点光源阵列(1)上的各处点光源具有不同波长且能够同时照明，第一物镜(2)能将各处点光源辐射出的发散光束汇聚形成不同倾角的平行光；所述探测模块包括第二物镜(4)、分光器件(5)、筒镜(6)和成像相机(7)；所述第二物镜(4)用于收集样品(3)的散射光；所述分光器件(5)在第二物镜(4)后方设有若干个，用于将散射光中不同波长成分离散到不同探测光路上；每个所述探测光路上均依次设有筒镜(6)和成像相机(7)，以实现不同移频图像的并行探测。

2.根据权利要求1所述的基于多波长点阵并行照明的移频超分辨显微成像系统，其特征在于，所述移频超分辨显微成像系统基于无标记傅里叶叠层显微技术成像系统实现。

3.根据权利要求1所述的基于多波长点阵并行照明的移频超分辨显微成像系统，其特征在于，所述多波长点光源阵列(1)的产生通过在后焦面上放置LED阵列实现；所述LED阵列中的各处LED具有不同的发射波长，通过控制电路来实现各处LED的并行照明。

4.根据权利要求1所述的基于多波长点阵并行照明的移频超分辨显微成像系统，其特征在于，所述多波长点光源阵列(1)的产生通过二维空间色散器将光频梳光源中的不同波长成分离散聚焦到第一物镜(2)后焦面上的不同空间位置实现，以直接形成并行照明。

5.根据权利要求1所述的基于多波长点阵并行照明的移频超分辨显微成像系统，其特征在于，所述多波长点光源阵列中点光源的排布方式采用方形阵列或环形阵列。

6.根据权利要求1所述的基于多波长点阵并行照明的移频超分辨显微成像系统，其特征在于，所述第二物镜(4)前焦面与样品(3)平面对齐，形成无限远成像配置。

7.根据权利要求1所述的基于多波长点阵并行照明的移频超分辨显微成像系统，其特征在于，所述分光器件(5)为二向色镜。

8.根据权利要求1所述的基于多波长点阵并行照明的移频超分辨显微成像系统，其特征在于，所述成像相机(7)为CCD或者sCMOS。

9.一种利用权利要求1～8任一所述基于多波长点阵并行照明的移频超分辨显微成像系统的快速成像方法，其特征在于，具体如下：

在第一物镜(2)的后焦面上产生多波长点光源阵列(1)；产生的多波长点光源阵列(1)中，各处点光源具有不同波长且能够同时照明；各点光源辐射出的发散光束被第一物镜(2)汇聚并形成不同倾角的平行光，各束平行光同时照明到待观测的样品(3)上；样品(3)发出的散射光被第二物镜(4)收集；然后使用一系列具有不同反射波长的分光器件(5)，将通过第二物镜(4)的散射光中不同波长的成分离散到不同探测光路上；每条探测光路末端都放置有筒镜(6)和成像相机(7)，通过控制所有成像相机(7)同步曝光以实现不同移频图像的并行探测，进而实现快速成像。

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