CN115948452A

CN115948452A - 重组质粒、小rna随机过表达质粒文库及其建立方法和应用

Info

Publication number: CN115948452A
Application number: CN202210930894.9A
Authority: CN
Inventors: 李盛本; 陈月
Original assignee: Agricultural Genomics Institute at Shenzhen of CAAS
Current assignee: Agricultural Genomics Institute at Shenzhen of CAAS
Priority date: 2022-08-04
Filing date: 2022-08-04
Publication date: 2023-04-11

Abstract

本发明提供了一种重组质粒、小RNA随机过表达质粒文库及其建立方法和应用，涉及生物技术领域。本发明提供的重组质粒，包括第一表达单元和第二表达单元，其中，第二表达单元从5’至3’依次包括第二启动子和miRNA173编码序列；第一表达单元从5’至3’依次包括第一启动子和TAS1c基因，TAS1c基因中产生成熟tasiRNA的序列替换为ccdB基因，ccdB基因5’端和3’端分别设置酶切位点。采用酶切方法将该重组质粒中的ccdB基因替换为小RNA表达序列，产生的小RNA与内源反式作用小RNA类似、长度为21nt、具有5’尿嘧啶的小RNA，并可以高效对靶基因进行表达调控。

Description

重组质粒、小RNA随机过表达质粒文库及其建立方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种重组质粒、小RNA随机过表达质粒文库及其建立方法和应用。

背景技术

RNA具有丰富的多样性，在整个生命进程中发挥着各种各样的功能。根据RNA编码蛋白质的功能有无，可分为信使RNA(messenger RNA，mRNA)和非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)，小RNA是一类非常重要的ncRNA。小RNA无开放阅读框，但在调节细胞生长和分化的过程中扮演着非常重要的角色，主要通过转录后调控改变靶基因的表达来影响生物体的生长发育和生理代谢，有重要的基因表达调控功能，代表了新的基因表达调控的方式。小RNA参与植物的几乎所有生长发育过程，如种子萌发、根系和叶片发育、花器官的形态建成、生殖、激素信号传导、细胞代谢、诱导器官分化和性别决定等，同时在植物抗病时发挥作用，还能介导植物对干旱、盐碱和低温等非生物胁迫的抗性，是植物正常生长发育所必需的。

水稻和玉米作为世界上最主要的粮食作物，世界上一半以上的人口以水稻和玉米为食，油菜是重要的油料作物，还可当作饲料来使用，这些农作物与我们的正常生活息息相关。然而，目前受各种环境因素的影响，水稻，玉米，油菜每年都遭受大量的损失，而这些农作物本身的内源小RNA在抗病，抵御外界不良环境，提高产量等方面起着重要的作用，越来越多的植物内源小RNA在抗病，抵抗不良环境，提高产量上得到了广泛的应用。

目前小RNA的研究方法主要有四种，过表达的两种：小RNA前体序列的组成型表达和Artificial microRNA，下调表达的两种：short tandem target mimic(STTM)和targetmimicry。这四种方法一次只能对一种小RNA进行表达干预。植物基因组中存在着丰富的不同种类的小RNA，玉米、小麦和大豆等农作物转基因效率低、周期长，利用以上方法对小RNA功能进行逐一研究需要耗费大量的时间和成本，不利于小RNA生物学功能的系统研究和广泛应用。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种重组质粒。

本发明的第二目的在于提供一种小RNA随机过表达质粒文库的建立方法，以解决上述问题中的至少一种。

本发明的第三目的在于提供一种小RNA随机过表达质粒文库。

本发明的第四目的在于提供一种上述重组质粒或者上述小RNA随机过表达质粒文库在植物内源小RNA功能高通量研究中的应用。

本发明的第五目的在于提供一种植物内源小RNA功能高通量研究的方法。

本发明的第六目的在于提供一种miR319a-3p在调控植物分蘖中的应用。

本发明的第七目的在于提供一种小RNA，该小RNA具有调控植物育性或结实率的作用。

本发明的第八目的在于提供一种小RNA在调控植物育性或结实率中的应用。

第一方面，本发明提供了一种重组质粒，包括第一表达单元和第二表达单元；

所述第一表达单元从5’至3’依次包括以下元件：第一启动子和TAS1c基因，所述TAS1c基因中产生成熟tasiRNA的序列替换为ccdB基因，所述ccdB基因5’端和3’端分别设置酶切位点；

所述第二表达单元从5’至3’依次包括以下元件：第二启动子和miRNA173编码序列。

作为进一步技术方案，所述第一启动子包括Ubi、ACT或35S启动子；

所述第二启动子包括Ubi、ACT或35S启动子。

第二方面，本发明提供了一种小RNA随机过表达质粒文库的建立方法，包括如下步骤：

a.提取植物中的小RNA，添加特异接头，然后反转录得到cDNA，再经过PCR扩增后获得DNA文库；

b.分别酶切所述的重组质粒和a步骤获得的DNA文库，连接后建立得到ccdB基因替换为小RNA编码序列的小RNA随机过表达质粒文库。

作为进一步技术方案，所述植物包括玉米、水稻、油菜或烟草；

优选地，a步骤中，提取小RNA的方法还包括采用AGO1抗体进行免疫沉淀的步骤；

优选地，所述小RNA的大小为20-25nt。

第三方面，本发明提供了一种小RNA随机过表达质粒文库，采用所述的建立方法建立得到。

第四方面，本发明提供了一种所述重组质粒或所述的小RNA随机过表达质粒文库在植物内源小RNA功能高通量研究中的应用。

第五方面，本发明提供了一种植物内源小RNA功能高通量研究的方法，包括如下步骤：

c.将所述的小RNA随机过表达质粒文库转染植物，获得不同性状的植株；

d.根据植株性状，获得植株中过表达小RNA的功能。

第六方面，本发明提供了一种miR319a-3p在调控植物分蘖中的应用。

第七方面，本发明提供了一种小RNA，所述小RNA的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

第八方面，本发明提供了上述小RNA在调控植物育性或结实率中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的重组质粒，包括第一表达单元和第二表达单元，其中，第二表达单元从5’至3’依次包括第二启动子和miRNA173编码序列，通过表达miRNA173以激活第一表达单元；第一表达单元从5’至3’依次包括第一启动子和TAS1c基因，TAS1c基因中产生成熟tasiRNA的序列替换为ccdB基因，ccdB基因5’端和3’端分别设置酶切位点。采用酶切方法将该重组质粒中的ccdB基因替换为小RNA表达序列，产生的小RNA与内源反式作用小RNA类似、长度为21nt、具有5’尿嘧啶的小RNA，并可以高效对靶基因进行表达调控。

本发明提供的小RNA随机过表达质粒文库的建立方法，简单方便，构建得到的小RNA随机过表达质粒文库可以通过一次遗传转化过程同时对植物体内的所有小RNA进行随机过表达，从而高效地揭示这些小RNA的生物学功能，同时大大降低转基因成本和周期。

经发明人研究发现，采用上述方法获得了具有分蘖减少性状的水稻株系，该株系过表达miR319a-3p，说明miR319a-3p具有调控植物分蘖的作用；获得了具有育性下降，结实率降低性状的油菜株系，该株系过表达核酸序列如SEQ ID NO.1所示的小RNA，说明该小RNA具有调控植物育性或结实率的作用；获得了具有植株矮化，分蘖数减少，分蘖角度增加性状的水稻株系，该株系过表达miR167a，说明miR167a具有调控植株矮化、分蘖的作用；获得了具有育性下降，种子变小性状的水稻株系，该株系过表达miR172a，说明miR172a具有调控植株育性和种子大小的作用；获得了具有产量增加性状的玉米株系，该株系过表达miR169o，说明miR169o具有调控植物产量的作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为农作物小RNA随机过表达载体结构示意图；

图2为烟草瞬时表达结果；

图3为农作物小RNA随机过表达质粒在玉米原生质体中的检测；

图4为蛋白纯化结果；

图5为水稻和油菜AGO1抗体效价测定结果；

图6为油菜、水稻和玉米AGO1免疫沉淀；

图7为农作物小RNA和microRNA随机过表达文库插入片段长度分布；

图8为玉米部分过表达株系表型图；

图9为水稻部分过表达株系表型图；

图10为油菜部分过表达单株表型图。

具体实施方式

下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

tasiRNA的产生需同时引入激发miRNA和tasiRNA前体双重元件，很多农作物如玉米、水稻和油菜等基因组中没有miR173序列，为了在这些农作物中对小RNA进行随机过表达，本发明提供了一种重组质粒，利用TAS1c骨架产生tasiRNA，引入拟南芥microRNA基因序列，使该重组质粒可在不同植物中使用，并产生tasiRNA。采用酶切方法将该重组质粒中的ccdB基因替换为小RNA表达序列，对于未成功替换为小RNA表达序列的重组质粒，由于ccdB基因的存在，重组质粒转化的细胞无法生长，避免假阳性；对于成功替换为小RNA表达序列的重组质粒产生的小RNA与内源反式作用小RNA类似、长度为21nt、具有5’尿嘧啶的小RNA，并可以高效对靶基因进行表达调控。

在一些优选的实施方式中，所述第一启动子或第二启动子包括但不限于Ubi、ACT或35S启动子，例如对于单子叶植物，可以采用Ubi或ACT启动子，对于双子叶植物还可以采用35s启动子等。

在一些优选的实施方式中，所述植物可以为任意植物，例如可以为但不限于玉米、水稻、油菜或烟草；

在一些优选的实施方式中，a步骤中，提取小RNA的方法还包括采用AGO1抗体进行免疫沉淀的步骤；

优选地，所述小RNA的大小为20-25nt。

AGO1是植物体内RNA诱导的基因沉默复合体(RISC)的主要原件，利用AGO1抗体对农作物组织提取物进行免疫沉淀，能够有效实现对小RNA的富集。

d.根据植株性状，获得植株中过表达小RNA的功能。

本发明提供的植物内源小RNA功能高通量研究的方法将正向遗传学和反向遗传学有机结合起来，既可通过表达库的植株表型来研究未知基因，也可直接通过转化的小RNA来研究相关功能。

采用上述植物内源小RNA功能高通量研究的方法，获得了具有分蘖减少性状的水稻株系，该株系过表达miR319a-3p，说明miR319a-3p能够用于植物分蘖的调控。

第七方面，本发明提供了一种小RNA，所述小RNA的核酸序列如SEQ ID NO.1所示：

CAAAGAGAAGUUGGGGUUUGU(SEQ ID NO.1)。

采用上述植物内源小RNA功能高通量研究的方法，还获得了具有育性下降、结实率降低性状的水稻株系，该株系过表达核酸序列如SEQ ID NO.1所示的小RNA，说明该小RNA能够用于植物育性或结实率的调控。

下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1：农作物小RNA随机过表达载体的构建

很多农作物如玉米、水稻和油菜等基因组中没有miR173序列，为了在这些农作物中对小RNA进行随机过表达，我们在植物双源载体pTF102的多克隆位点中插入拟南芥miRNA173基因序列并在启动子下表达，以miR173-F，miR173-R为引物，利用高保真酶KOD FXNeo，扩增出miR173序列，利用EcoRI和BamHI酶切后与载体pTF102连接构建出中间载体pROE-173。再分别扩增出Ubi，ACT，35S启动子序列，利用PSTI和PmeI酶切后分别连接到中间载体pROE-173上，在同一载体中同时克隆入拟南芥TAS1c基因序列，为了方便载体与不同的小RNA连接，TAS1c骨架中产生成熟tasiRNA序列的位置由自杀基因ccdB代替，ccdB基因两端引入酶切位点，获得最终表达载体pROE-Ubi173，pROE-Act173和pROE-35S173。

引物序列如表1所示，其中，引物BamHI-miR173-F和EcoRI-miR173-R用于扩增miRNA173基因序列，引物PmEI-35S-F和35S-PSTI-R用于扩增35S启动子序列，引物PMEI-ACT1-F和ACT1-PSTI-R用于扩增ACT启动子序列，引物PMEI-UBI-F和UBI-PSTI-R用于扩增Ubi启动子序列。

表1

农作物小RNA随机过表达载体结构示意图如图1所示。

实施例2：载体在烟草中瞬时转化验证

玉米，水稻，油菜等农作物基因组中没有miR173序列，在构建农作物小RNA随机过表达载体时增加了不同启动子驱动的miRNA173元件。为了验证构建的载体能否正常表达miRNA173，并在它的激发下产生预期的tasiRNA，以及对靶基因进行转录后调控，选取烟草外源基因YFP的部分序列合成寡聚核苷酸链，退火结合成双链，分别与酶切后的质粒连接，构建到三个载体pROE-UBI173，pROE-ACT173，pROE-35S173中来表达验证，合成退火用寡聚核苷酸链序列如表2所示。

表2

首先利用烟草叶片瞬时表达系统对这些质粒进行功能验证。对转化以上三种构建的烟草叶片进行了RNA提取和Northern Blot检测。在对miRNA173的表达量进行了检测时发现，pROE-UBI173和pROE-ACT173均未能检测到miRNA173的信号，而pROE-35S173却能够产生正常的miRNA173。由于ACT和UBI均来自单子叶植物的启动子，可能在烟草细胞中不能被正确转录，而35S启动子则来自于双子叶植物，并已经成功应用于烟草瞬时转化试验，因此在本发明中可以顺利表达miRNA173(如图2所示，图2中YFP-AS为检测连入载体中YFP序列的探针；173-AS为检测miR173的探针)。与此结论相一致的是，这三个构建中，TAS1c均由UBI启动子驱动表达，因此均未检测到YFP小RNA的信号。

实施例3：载体在玉米原生质体的瞬时表达验证

UBI和ACT启动子在玉米中均可以高效启动下游基因的转录，将实施例2的构建质粒转化入玉米叶片细胞原生质体中进行瞬时表达，并对小RNA进行表达检测。结果如图3(图中，21N，23N，25N，30N表示第一个碱基不是G开头的不同长度的YFP序列；21G，25G表示第一个碱基是G开头的不同长度的YFP序列；YFP-AS为检测连入载体中YFP序列的探针；173-AS为检测miR173的探针)，玉米细胞对35S、UBI和ACT启动子均可正常识别进行转录，三个构建转化后均可以检测到miRNA173的信号，同样在三个质粒转化后的玉米原生质体中均成功检测到YFP小RNA的产生，表明农作物小RNA过表达系统可以在玉米中产生预期的小RNA，且插入21-30nt的片段经过表达后均产生与21nt插入片段相同大小的YFP小RNA，符合tasiRNA生物合成中的等距切割机制。

实施例4：水稻和油菜AGO1蛋白的表达纯化与抗体制备

玉米、水稻和油菜的AGO1蛋白抗体没有商品化，想利用AGO1抗体获得免疫文库需制备对应的AGO1抗体。其中，玉米的AGO1抗体采用实验室已制备出可用的AGO1多抗。根据http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/和http://www.ricedata.cn/网站分别下载油菜和水稻AGO1蛋白序列，通过序列比对，选取合适的表达序列设计扩增引物，提取RNA反转录，扩增出表达序列构建到表达载体pEGX6P-1和PET60上。将以上表达载体分别转染受体细胞，获得表达菌株，在37℃摇床中以180rpm转速，将表达菌株以1：100比例扩摇至OD600＝0.6，分别通过添加0.1mM和0.6mM IPTG、于28℃和37℃的摇床中160rpm继续培养10h，诱导蛋白表达，分离后获得水稻和油菜的AGO1蛋白抗体。

根据以上蛋白诱导表达条件，对油菜和水稻的AGO1蛋白进行了大量表达，并利用与AGO1融合的GST标签对蛋白进行了亲和纯化。纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳并与已知浓度的BSA蛋白条带进行对比，来估测AGO1蛋白的浓度和总量。电泳结果中油菜和水稻AGO1均在预期位置呈现出一套明显的条带，并没有大于该条带的杂质。在目的条带的下方出现一些比较弱的信号，有可能是纯化过程中目的蛋白降解的产物(图4)。最终我们分别获得了总量约为5mg的油菜AGO1和14mg的水稻AGO1蛋白，达到制备抗体的要求。

利用纯化的AGO1，分别在兔子体内表达了多克隆抗体，并对油菜和水稻叶片蛋白提物中的蛋白进行了Western blot检测，图5：1，2，3，4泳道分别表示抗体的稀释梯度1/250，1/500，1/1000，1/2000。油菜AGO1抗体具有较高的效价，稀释2000倍后仍可在130kDa处清晰检测到目的条带的信号(图5中的B)。水稻AGO1抗体效价较低，使用1：250的比例可以在130kDa处检测到AGO1蛋白信号(图5中的A)，抗体均可以使用。

实施例5：不同农作物AGO1复合物的免疫沉淀

利用制备的水稻和油菜AGO1抗体，以及实验室前期制备的玉米AGO1抗体，分别对水稻、油菜和玉米幼苗的组织提取物进行了免疫沉淀。通过对免疫沉淀前后的样品进行Western blot检测，结果如图6(图中，A：油菜免疫沉淀；B：水稻免疫沉淀；C：玉米免疫沉淀；Input为免疫沉淀实验加抗体的对照组(没有加入AGO1抗体)，IP为加入抗体的实验组。)，我们发现三个抗体可以分别从对应的提取物中纯化到AGO1复合物，制备的多克隆抗体可以用于植物体AGO1复合物的富集和纯化，并进行下一步的农作物microRNA随机过表达研究。

实施例6：农作物不同过表达文库的构建及分析

分别从玉米Q319，油菜中双11(ZS11)和水稻日本晴(NIP)叶片中提取RNA，并进行了农作物小RNA随机过表达文库的制备和测序分析。结果如图7所示，玉米、油菜和水稻文库中比例最大的小RNA长度为24nt，分别占总文库的36％，21％，35％，(图7中的A，C，E)。为了减少文库的脱靶比例，利用玉米、油菜和水稻的AGO1抗体分别对以上三种农作物的RISC复合物进行了富集和纯化，并对其中结合的microRNA进行了建库。对文库分析发现，通过AGO1免疫沉淀后制备的文库中，21nt的reads占据最大比例，分别占总文库的30％，42％，68％，而24nt的小RNA比例则相对较低，分别占总文库的7％，6％，1％(图7中的B，D，F)。因此通过免疫沉淀显著提高了microRNA随机过表达的几率，降低了脱靶风险，增强了农作物小RNA随机过表达系统的效能。

实施例7：不同农作物转基因株系鉴定分析

利用制备的玉米，水稻，油菜的AGO1抗体，分别构建了不同材料不同部位的免疫沉淀文库，同时构建了总小RNA文库。通过转基因创制了玉米，水稻，油菜的小RNA随机过表达突变体库。

实验步骤如下：从不同组织部位的总RNA中提取并纯化玉米、水稻、油菜20-25nt片段，分别在两端安装5’和3’RNA分子接头，反转录后进行低循环数PCR扩增。酶切后连接入图1中的(A)中所述的小RNA随机过表达载体中，即产生含有玉米、水稻、油菜所有小RNA的过量表达质粒文库。

详细步骤如下：

小RNA文库制备方法：

使用TRIzol提取不同材料不同组织的RNA，配置15％聚丙烯酰胺尿素变性胶放置30分钟备用。取30ug的RNA，加入与RNA相同体积的2xSRNA loading dye(80％Formamide+0.1％XyleneFF+1％Brophenol Blue)，75℃变性5min，立即冰浴，上样至配置的变性胶，150v恒压电泳90min。切胶回收15-30nt片段，放入1.5mL无RNA酶的EP管中，捣碎胶块，加入500μL 0.4M NaCl，4℃翻转6h，4℃，12000g离心2min，小心吸取上清转移至新的无RNA酶的EP管中，重复2-3次，除尽胶粒，加入1μL Glycogen,50μL NaAc(3M,pH 5.6)颠倒混匀，再加入500μL异丙醇，颠倒混匀，-20℃静置沉淀6h。放入离心机4℃，12000g离心30min，弃上清，70％乙醇漂洗沉淀2次，超净台吹干。加入3μL无RNA酶水，小心溶解沉淀，加入0.5μL 3’adaptor，小心混匀，75℃变性2-5min，立即冰浴2min，加入5μL 3’Ligation ReactionBuffer，1.5μL 3’Ligation Enzyme Mix，混匀，25℃连接1h。加入2.25μL无RNA酶水，0.5μLSR RT Primer，混匀后PCR仪中按75℃ 5min，37℃ 15min，25℃ 15min反应。取0.8μL 5’adaptor 70℃变性5min，立即冰浴2min备用，待PCR仪程序结束取出样品，加入已变性5’adaptor 0.5μL，0.5μL 5’Ligation Reaction Buffer，1.25μL 5’Ligation Enzyme Mix，混匀瞬离后25℃连接1h。加入8μL First Stand Reaction Buffer，1μL Murine RnaseInhibitor，1μL Protoscript II Reverse Transcriptase，15μL无RNA酶水，混匀后50℃反转录1h，80℃15min灭活酶。反转录产物直接进行PCR扩增，电泳切胶回收140bp－150bp大小片段。回收的片段使用BsaI-HF酶切，与同样使用BsaI-HF酶切的质粒连接，转化DH5α感受态，提取质粒，获得随机过表达质粒文库。

免疫沉淀文库制备方法：

收集20g新鲜材料，倒入预冷的研钵中，加入液氮，用研杵快速研磨至粉末状，转移至新的无RNA酶的50mL离心管中，加入10mL Extraction buffer，20000g，4℃离心35min，吸出上清至50mL新的注射器中，用0.45μM滤膜去除上清中颗粒残渣。取100μL Protein Aagarose beads于1.5mL EP管中，置于磁力架上，待磁珠完全吸附于磁力架小心吸取溶液丢弃，加入1mL Extraction buffer，混匀后置于磁力架，待磁珠完全吸附于磁力架小心吸取上清丢弃，重复洗三次，清洗完成后加入100μL Extraction buffer溶解磁珠，置于冰上备用。滤液中加入100μL Protein A agarose beads，4℃孵育1h，4℃，250g，离心5min，吸上清于1.5mL离心管中，按1:100比例加入AGO1抗体，置于翻转仪中，4℃低速翻转孵育2h。加入120μL Protein A agarose beads，4℃孵育1h，4℃条件下250g，离心5min，小心移除上清，收集磁珠。磁珠中加入10mL Plant extraction buffer(含2mM DTT),置于翻转仪中，4℃低速翻转20min，重复两次。4℃条件下250g，离心5min，吸上清丢弃，磁珠中加入200μL Plantextraction buffer，按照TRIzol法提取RNA，提取的RNA按照小RNA文库制备法直接加接头反转录后PCR，PCR产物回收140bp－150bp大小片段。回收的片段使用BsaI-HF酶切，与同样使用BsaI-HF酶切的质粒连接，转化DH5α感受态，提取质粒，获得免疫沉淀质粒文库。

玉米，水稻，油菜的小RNA随机过表达突变体库的创制：

把获得的小RNA质粒文库和免疫沉淀质粒文库转入到农杆菌EHA105中，利用农杆菌介导的转化法分别转入到对应的水稻、玉米、油菜中。玉米从B104正在发育中的幼穗中剥离幼胚，并在培养基上诱导愈伤组织，水稻和油菜分别使用中花11和Waster的种子在培养基上诱导愈伤组织，利用含有转化质粒的农杆菌对愈伤组织进行侵染，并在抗性培养基上诱导植株再生和选择转化植株。

图8图9图10展示了部分过表达株系的表型图。图8玉米过表达株系QBI与亲本B104对比，籽粒增大，表型为百粒重增加，粒长，粒宽，周长增加，玉米产量增加，经小RNA测序，该过表达株系QBI中miR169o存在过表达。如图9所示，与亲本ZH11(WT)对比，图9中的A中水稻过表达株系的表型为分蘖数减少，经小RNA测序，该过表达株系中mi319a-3p存在过表达；图9中的B中水稻过表达株系的表型为植株矮化，分蘖数减少，分蘖角度增加，经小RNA测序，该过表达株系中miR167a存在过表达；图9中的C中水稻过表达株系的表型为育性下降，种子变小，经小RNA测序，该过表达株系中miR172a存在过表达。图10，与亲本Westar对比，过表达株系Bna-1育性下降，结实率明细降低，经小RNA测序，该过表达株系中某个小RNA存在过表达，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

小结：

本发明在同一载体中同时克隆入拟南芥TAS1c基因序列和microRNA激发子序列。利用该系统在玉米原生质体瞬时表达系统中成功产生YFP小RNA。该小RNA具有与内源反式作用小RNA类似、长度为21nt、具有5’尿嘧啶的小RNA，并可以高效对YFP靶基因进行表达调控。另外本发明建立了一套专门针对microRNA功能的随机过表达体系，利用免疫沉淀技术富集多种植物的microRNA并进行了随机过表达。为此，分别表达了玉米，水稻，油菜的AGO1蛋白，成功制备出了各自的AGO1抗体，通过western blot分别在以上农作物体内检测到大小合乎预期的蛋白条带，说明抗体与抗原的识别具有较高的特异性；利用AGO1抗体对农作物组织提取物进行免疫沉淀，可以检测到明显的AGO1富集效应。由于AGO1是植物体内RNA诱导的基因沉默复合体(RISC)的主要原件，于是对免疫沉淀中的小RNA进行提取，并建立了植物microRNA随机过表达技术体系。本发明可以应用到小麦、高粱、花卉等其他农作物中，特别是对于那些转化成本和难度高的农作物，必将大大促进小RNA的功能研究，为分子育种提供重要工具和新思路。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种重组质粒，其特征在于，包括第一表达单元和第二表达单元；

2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述第一启动子包括Ubi、ACT或35S启动子；

所述第二启动子包括Ubi、ACT或35S启动子。

3.一种小RNA随机过表达质粒文库的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：

b.分别酶切权利要求1或2所述的重组质粒和a步骤获得的DNA文库，连接后建立得到ccdB基因替换为小RNA编码序列的小RNA随机过表达质粒文库。

4.根据权利要求3所述的建立方法，其特征在于，所述植物包括玉米、水稻、油菜或烟草；

优选地，所述小RNA的大小为20-25nt。

5.一种小RNA随机过表达质粒文库，其特征在于，采用权利要求3或4所述的建立方法建立得到。

6.权利要求1或2所述重组质粒或者权利要求5所述的小RNA随机过表达质粒文库在植物内源小RNA功能高通量研究中的应用。

7.一种植物内源小RNA功能高通量研究的方法，其特征在于，包括如下步骤：

c.将权利要求5所述的小RNA随机过表达质粒文库转染植物，获得不同性状的植株；

d.根据植株性状，获得植株中过表达小RNA的功能。

8.miR319a-3p在调控植物分蘖中的应用。

9.一种小RNA，其特征在于，所述小RNA的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

10.权利要求9所述小RNA在调控植物育性或结实率中的应用。