CN115948295A - 一种鼠李糖乳酪杆菌菌株goldgut-m520及用途 - Google Patents

一种鼠李糖乳酪杆菌菌株goldgut-m520及用途 Download PDF

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肖国勋
王卷舒
张思璐
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Abstract

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种鼠李糖乳酪杆菌菌株GOLDGUT‑M520及用途。本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)菌株GOLDGUT‑M520，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.26205，保藏时间2022年12月14日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，所述鼠李糖乳酪杆菌对胃肠消化液具有良好的耐受性，能够以活的状态进入人体肠道，可以降低结肠炎小鼠疾病活动指数评分和脾脏指数，以及提高结肠长度/重量比值，从而达到减轻炎症性肠病的目的。

Description

一种鼠李糖乳酪杆菌菌株GOLDGUT-M520及用途
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种鼠李糖乳酪杆菌菌株GOLDGUT-M520及用途。
背景技术
炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)指的是一系列发生于胃肠道的慢性炎症性疾病。IBD的症状包括体重减轻，失血性腹泻和严重的腹痛。患者可通过粪便检查、结肠镜检查、胃镜检查、血液检查，以及计算机断层扫描、磁共振成像和超声检查进行诊断。IBD最主要和最具有破坏性的并发症之一是结直肠癌。IBD主要包括两种慢性疾病：溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)和克罗恩氏病(Crohn's disease，CD)。UC主要影响结直肠的黏膜内层，主要以连续性的炎症性病变为特征。CD几乎涉及整个胃肠道，其中回肠末端和结肠的黏膜及黏膜下层最常受到影响，通常表现为不连续性的病变，并且伴随着炎症发生。尽管如此，UC和CD具有许多类似的临床特征、病理遗传学特征和流行病学特征，表明这两种疾病的病因可能相似。IBD的病因和发病机理非常复杂，可能受到诸多因素的综合影响，如遗传易感性、环境因素(如肠道菌群)、社会行为(包括饮食、吸烟和抗生素的使用)、肠道屏障功能障碍和免疫系统功能障碍等。
肠道菌群与免疫系统之间微妙平衡的破坏或肠道菌群的紊乱会诱发许多疾病，例如IBD、糖尿病、过敏性反应和癌症等。因此，调节菌群的组成和功能成为疾病预防和治疗的有效途径。IBD是与肠道菌群关联性最为紧密的病理状态之一。IBD发生时，宿主与菌群的共生关系也会发生改变，即正常的肠道菌群组成及功能发生变化。在IBD患者或者IBD的动物模型中，最一致的变化表现为菌群多样性下降。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种鼠李糖乳酪杆菌菌株GOLDGUT-M520及用途。
为此，本发明提供了如下的技术方案：
一种鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)菌株GOLDGUT-M520，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26205，保藏时间2022年12月14日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
所述的鼠李糖乳酪杆菌菌株GOLDGUT-M520具有如下生物学特性：革兰氏阳性菌，无鞭毛、不运动，不形成芽孢，兼性厌氧；菌体呈杆状。最适生长温度为37℃；最适pH值为5.0～7.0。
一种含所述的鼠李糖乳酪杆菌菌株GOLDGUT-M520的产品。
可选的，所述的产品包括生物制品、食品或药品。
可选的，所述生物制品包括鼠李糖乳酪杆菌菌株GOLDGUT-M520的微生物菌剂、传代培养后代、突变株或发酵剂。
可选的，所述食品包括固体饮料、乳饮料、压片糖果、豆制品、乳制品或果蔬制品；
可选的，所述食品包括保健食品。
可选的，所述药品还包括药用辅料，所述药用辅料包括溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂和释放阻滞剂中的至少一种；
可选的，所述药用辅料包括微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素和卵磷脂中的至少一种；
可选的，所述药品的剂型包括颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
可选的，所述的产品中鼠李糖乳酪杆菌菌株GOLDGUT-M520的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
所述的鼠李糖乳酪杆菌菌株GOLDGUT-M520或所述的产品在制备改善或治疗炎症性肠病的产品中的用途。
可选的，所述的用途包括降低疾病活动指数评分、降低脾脏指数和/或提高结肠长度/重量比值来减轻或治疗炎症性肠病。
可选的，所述炎症性肠病为结肠炎；
可选的，所述的产品包括生物制品、食品或药品。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的一种鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)菌株GOLDGUT-M520，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26205，保藏时间2022年12月14日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，所述鼠李糖乳酪杆菌对胃肠消化液具有良好的耐受性，能够以活的状态进入人体肠道。所述鼠李糖乳酪杆菌可以降低结肠炎小鼠疾病活动指数评分和脾脏指数，以及提高结肠长度/重量比值，从而达到减轻或治疗炎症性肠病的目的。
进一步的，所述鼠李糖乳酪杆菌可以应用于食品、药品或生物制品，食品如固体饮料、压片糖果、豆制品、乳制品或果蔬制品等。
鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)菌株GOLDGUT-M520，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26205，保藏时间2022年12月14日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实验例1中各组小鼠进行疾病活动指数评分结果；
图2是本发明实验例1中各组小鼠的结肠长度/重量比值结果；
图3是本发明实验例1中各组小鼠的脾脏指数结果。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例中鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)菌株GOLDGUT-M520，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.26205，保藏时间2022年12月14日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
实施例1鼠李糖乳酪杆菌GOLDGUT-M520的筛选、鉴定、观察和保藏
采集2mL母乳样品放入灭菌小试管中，再取1mL母乳放入装有灭菌CaCO3粉的无菌容积为2mL的采样瓶中，作为备用样品放在冰箱内在4℃条件下冷藏。用灭菌吸管吸取1mL所述采样样品并接种于10mL MRS培养基中。置于30-37℃条件下培养48-72h，形成菌落；用接种环挑去菌落，接种于MRS培养液中，置于30-37℃条件下培养24-48h，使菌株生长；待菌株生长良好后，再次用接种环划线将菌株接种于MRS琼脂培养基中，置于30-37℃条件下培养24-48h，观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，并进行革兰氏阳性、过氧化氢酶试验，分离出在试验中呈阴性的杆菌，所述杆菌为乳杆菌，具有如下生物学特性：革兰氏阳性菌，无鞭毛、不运动，不形成芽孢，兼性厌氧；菌体呈杆状。最适生长温度为37℃；最适pH值为5.0～7.0。将所述乳杆菌进一步纯化培养，并进行低温保存。
采用天根DNA提取试剂盒提取细菌DNA，利用16S rRNA基因的通用引物进行16SrRNA扩增和测序。将PCR扩增产物用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，并将测序结果通过Blast程序与Gen Bank数据库中已知细菌的核酸序列进行同源性比对分析。经比对分析，初步鉴定为鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)，将该菌株命名为鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)菌株GOLDGUT-M520，然后将该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26205，保藏时间2022年12月14日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
实施例2
一种用于改善炎症性肠病的食品，包括如下原料：鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)菌株GOLDGUT-M520和可食性材料；
所述食品中，鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)菌株GOLDGUT-M520的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g；
所述可食性材料为流体乳品(牛乳、流体牛乳)、奶粉、冰淇淋、乳酪或干酪，在本实施例中选择牛乳。
上述的用于改善炎症性肠病的食品的制备方法，包括：将鼠李糖乳酪杆菌GOLDGUT-M520的脱脂乳培养液与经过杀菌浓酸的牛乳成分混匀，再进行真空冷冻升华干燥，制备得到的鼠李糖乳酪杆菌乳粉对改善炎症性肠病具有优异的效果。
实施例3
一种鼠李糖乳酪杆菌冰淇淋的制备方法，用常规方法得到冰淇淋，在分装之前加入实施例2中制备的鼠李糖乳酪杆菌乳粉，搅拌均匀，即可得到鼠李糖乳酪杆菌冰淇淋。所述鼠李糖乳酪杆菌冰淇淋中，所述鼠李糖乳酪杆菌GOLDGUT-M520的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g，对改善炎症性肠病具有良好的作用。
实施例4
一种鼠李糖乳酪杆菌发酵乳制备方法，包括：
使用浓缩脱脂乳或脱脂乳粉强化的脱脂乳，将混合料在98℃温度下加热杀菌40分钟，冷却到35℃，然后在其中添加4％(w/v)的所述鼠李糖乳酪杆菌GOLDGUT-M520发酵剂(活菌数为1×107CFU/g)，在35℃温度条件下培养，使酸度达到2％，培养时间为24小时，其中所述鼠李糖乳酪杆菌GOLDGUT-M520的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。得到所述鼠李糖乳酪杆菌发酵乳，其对改善炎症性肠病具有良好的作用。
实施例5
一种鼠李糖乳酪杆菌胶囊的制备方法，将所述鼠李糖乳酪杆菌GOLDGUT-M520用液体培养液培养，收集和洗涤菌体，添加药用辅料，干燥制备成活性菌粉，用明胶制成囊材，用PVP作底衣，再用蜂蜡进行外层包衣，用胶囊包装，得到鼠李糖乳酪杆菌胶囊。所述鼠李糖乳酪杆菌胶囊中，所述鼠李糖乳酪杆菌GOLDGUT-M520的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
实施例6
一种鼠李糖乳酪杆菌发酵果蔬汁的制备方法，包括：
首先取胡萝卜50公斤，经过分选、清洗、去皮、切分、漂烫、榨汁打浆、配料、匀质以及灭菌步骤得到无菌果蔬汁。
然后将鼠李糖乳酪杆菌GOLDGUT-M520活化，扩大培养，接种到无菌果蔬汁、发酵、取样检测合格、冷却降温和无菌灌装，得到鼠李糖乳酪杆菌发酵果蔬汁，其中所述鼠李糖乳酪杆菌GOLDGUT-M520的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g，对改善炎症性肠病具有良好的作用。
实验例1
实验动物：购入24只6周龄SPF级C57BL/6J小鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)，饲养于内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室。温度为22±2℃，湿度保持在50％左右，光暗循环周期为12h/12h，小鼠预饲养1周后开展实验。
实验分组：随机分为正常组(NC组)、模型组(DSS组)、GOLDGUT-M520组(RM组)。
实验方法：从第1天开始，正常组用生理盐水，RM组和DSS组用2.3％(w/v)葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate，DSS)水溶液连续7天，在第8天改用0.8％(w/v)的DSS水溶液至第21天，小鼠以自由饮水方式摄取。从第1天开始，RM组灌胃0.2ml菌液(4×109CFU/d)，NC组与DSS组给予同体积生理盐水。终点时使用异氟烷麻醉安乐死小鼠，收集样品用于后续实验。饲养期间，小鼠自由饮水和采食。
菌液的配制：将鼠李糖乳酪杆菌GOLDGUT-M520于下表的液体培养基(组分均为市售产品)中37℃培养24h，离心收集菌体，菌体中加入10％(w/v)灭菌脱脂乳，混合均匀后经真快冷冻干燥后制成冻干粉，冻干粉活菌数＞2×1011CFU/g。按照给药剂量，将所述冻干粉加入生理盐水中混匀。
表1、液体培养基组成
组成 重量％(水溶液中)
葡萄糖 4
大豆蛋白胨 1.2
酵母浸粉 1
柠檬酸钠 0.2
乙酸钠 0.6
磷酸氢二钠 0.3
吐温-80 0.08
实验检测和结果：
(1)疾病活动指数(Disease activity index，DAI)评分
疾病活动指数(Disease activity index，DAI)综合评估了小鼠的体重变化率、粪便性状和粪便隐血情况，即DAI得分＝体重变化率得分+粪便性状得分+粪便隐血得分。具体评分标准如下：体重变化率得分：0＝0％-体重增加；1＝0％<体重变化率≤-5％；2＝-5％<体重变化率≤-10％；3＝-10％<体重变化率≤-15％；4＝体重变化率>-15％。粪便性状得分；0＝正常粪便；1＝湿润粪便；2＝稀便；3＝不成形粪便。粪便隐血得分：4＝0s<变紫色时间≤10s；3＝10s<变紫色时间≤30s；2＝30s<变紫色时间≤60s；1＝60s<变紫色时间≤120s；0＝变紫色时间>120s。
在第21天，对各组小鼠进行疾病活动指数评分，数据处理方式为“平均值±标准差”(Means±S.D.)，采用t检验(student’s t-test)分析进行差异显著性分析，结果如图1所示，相较于DSS组，RM组DAI评分显著降低(P<0.05)，结果表明鼠李糖乳酪杆菌GOLDGUT-M520可以明显改善结肠炎临床症状。
(2)结肠长度/重量比值
DSS诱导的结肠炎通常位于结肠，并且伴随发生了结肠长度缩短的病理症状，因此，结肠长度(cm)与重量(g)的比值是衡量小鼠结肠炎严重程度的重要指标。第21天时，收取结肠组织，测量结肠长度，并称量结肠重量。数据处理方式为“平均值±标准差”(Means±S.D.)，采用t检验(student’s t-test)分析进行差异显著性分析。
结果如图2所示，RM组小鼠结肠长度/重量比值相较于DSS组显著升高(P<0.05)，说明鼠李糖乳酪杆菌GOLDGUT-M520有效缓解了由DSS引起的结肠组织炎症性水肿情况。
(3)脾脏指数
脾脏是重要的免疫器官，其重量的增加与炎症程度相关，在第21天时，称量各组小鼠脾脏重量，计算脾脏指数(脾脏指数＝脾脏重量/体重)，结果如图3所示，RM组在经过鼠李糖乳酪杆菌GOLDGUT-M520干预后，小鼠脾脏指数下降，且与DSS组存在显著差异(P<0.05)，说明鼠李糖乳酪杆菌GOLDGUT-M520可以明显减轻IBD引起的炎症反应。
综上，本发明以小鼠为动物模型进行的改善炎症性肠病的研究发现，鼠李糖乳酪杆菌GOLDGUT-M520可以降低结肠炎小鼠疾病活动指数评分和脾脏指数，以及提高结肠长度/重量比值，从而达到减轻炎症性肠病的目的。
实验例2胃肠消化液的耐受性
pH 2.5的人工胃液的配制：在灭菌PBS(0.8％(w/v)NaCl，0.02％(w/v)KH2PO4，0.115％(w/v)Na2HPO4，pH7.2)(100ml)中加入3.0g/L胃蛋白酶(Pepsin，sigma)(0.3g)，用0.1mol/L的HCl调整pH值为2.5，配制成模拟人工胃液，0.22μm无菌滤膜过滤除菌备用；
pH 8.0的人工肠液的配制：在灭菌PBS(0.8％(w/v)NaCl，0.02％(w/v)KH2PO4，0.115％(w/v)Na2HPO4，pH7.2)(100ml)中加入1.0g/L的胰蛋白酶(Trypsin，sigma)(0.3g)和1.8％牛胆盐(Bile salt，sigma)(1.8g)，用0.1mol/L的NaOH调整pH值为8.0，配制成模拟人工肠液，0.22μm无菌滤膜过滤除菌备用；
实验方法：将鼠李糖乳酪杆菌菌株GOLDGUT-M520菌液(将原始菌株于MRS培养基中连续传代培养2次，将传代培养第2次且为生长稳定期的菌体离心(3000g/7min/4℃)收集，用PBS洗涤2次后，将菌体悬浮于10mL PBS中制得)按照1:9(体积比例)加入到pH 2.5的人工胃液中，然后37℃消化3小时，然后取1mL上述的转入到9mL pH 8.0的人工肠液中，然后37℃消化8小时，分别于0h(为加入到pH 2.5的人工胃液开始计时)和8h(为转入到pH 8.0的人工肠液中消化8小时)采用平板计数法计数测定存活率，测定结果为86.85％。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)菌株GOLDGUT-M520，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26205。
2.一种含权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌菌株GOLDGUT-M520的产品。
3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述的产品包括生物制品、食品或药品。
4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述生物制品包括鼠李糖乳酪杆菌菌株GOLDGUT-M520的微生物菌剂、传代培养后代、突变株或发酵剂。
5.根据权利要求3或4所述的产品，其特征在于，所述食品包括固体饮料、乳饮料、压片糖果、豆制品、乳制品或果蔬制品；
可选的，所述食品包括保健食品。
6.根据权利要求3-5任一项所述的产品，其特征在于，所述药品还包括药用辅料，所述药用辅料包括溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂和释放阻滞剂中的至少一种；
可选的，所述药用辅料包括微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素和卵磷脂中的至少一种；
可选的，所述药品的剂型包括颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
7.根据权利要求3-6任一项所述的产品，其特征在于，所述的产品中鼠李糖乳酪杆菌菌株GOLDGUT-M520的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
8.权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌菌株GOLDGUT-M520或权利要求2-7任一项所述的产品在制备改善或治疗炎症性肠病的产品中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的用途包括降低疾病活动指数评分、降低脾脏指数和/或提高结肠长度/重量比值来减轻或治疗炎症性肠病。
10.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在于，所述炎症性肠病为结肠炎；
可选的，所述的产品包括生物制品、食品或药品。
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