CN115943308A - 体外蛋白合成的监测 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于实时检测蛋白合成的方法和组合物。所述方法适用于在微流体装置上的监测。

Description

体外蛋白合成的监测
发明领域
本文提供用于以装置检测蛋白合成的方法和组合物。所述方法适用于在微流体装置上的监测。
发明背景
当在微流体装置，诸如数字微流体装置中以微流体规模进行无细胞蛋白合成时，实时检测由所述无细胞蛋白合成反应合成的蛋白是有用的。然而，在无细胞蛋白合成反应环境中进行蛋白的实时检测是困难的。反应含有高浓度的许多其他蛋白和生物分子，使得通过标准的蛋白染色方法(例如考马斯亮蓝G-250、SYPROTM Ruby、银染色)的非特异性蛋白检测困难。免疫染色或基于亲和力的纯化接着进行非特异性蛋白染色同样无济于事，因为必须在固体支持物上进行大量洗涤以防止背景干扰。由于已知在微流体和数字微流体装置中清洗是困难的，背景干扰可能变得令人困扰。
目前现有的发光互补方法不能在无细胞蛋白合成反应中实现延长的实时检测，无细胞蛋白合成反应往往超过16小时。这种限制是由于多种原因造成的，包括与无细胞蛋白合成O2需求相竞争的发光酶的O2消耗以及在重组蛋白表达检测的3-24小时内发光底物的暂时或永久耗尽。
所关注的蛋白也可以表达为与荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白(GFP)的融合体。然而，GFP是26.9kDa的蛋白，这是大多数荧光蛋白的典型尺寸。该尺寸的标签增加所关注的蛋白的总尺寸，特别是如果所关注的蛋白必须用其他大的融合蛋白，诸如42.5kDa的麦芽糖结合蛋白(MBP)标记。鉴于人蛋白的平均尺寸是约52kDa，并且大肠杆菌蛋白的平均尺寸是约35kDa(Kim,Y.E.等人，Annu.Rev.Biochem.2013.82:323-355)，添加尺寸相当的荧光蛋白标签可显著改变蛋白的生物功能和生物物理特性。
许多现有技术公开子组分标签用于监测细胞系统中的表达的用途。例如，US7,666,606公开使用微结构域的蛋白-蛋白相互作用的检测系统。
Schinn等人，Biotechnol.Bioeng 114 10 2017年10月，2412-2417(https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/bit.26305)公开快速体外筛选非天然氨基酸对蛋白表达和活性的位置依赖性影响—Schinn-2017-Biotechnology and Bioengineering-Wiley Online Library。
概述
在此，我们报告令人惊讶的发现：分开的肽系统可被工程化成对无细胞蛋白合成反应中所关注的蛋白的表达进行原位、基于荧光的监测。监测可以在表达过程期间在装置上进行，因此可以实时使用或作为终点测量。
本文公开一种用于实时监测体外蛋白合成的方法，其包括
a.体外转录和翻译与肽标签融合的所关注的蛋白；和
b.使用其它多肽监测肽标签的存在，所述其它多肽在所述肽标签存在下产生可检测信号。
本文公开一种用于监测数字微流体装置上液滴中的无细胞蛋白合成的方法，其包括
a.无细胞转录和翻译与肽标签融合的所关注的蛋白；和
b.使用其它多肽监测肽标签的存在，所述其它多肽在所述肽标签存在下产生可检测信号。
术语“体外”和“无细胞”的使用在本文可互换使用。
可检测信号可以是例如荧光或发光。可检测信号也可以由配体与融合到所关注的蛋白质的互补寡肽、肽或多肽标签的结合造成。
可检测信号也可由多肽与融合到His标签的所关注的蛋白的结合造成。
可以使用任何体外转录和翻译，例如来源于兔网状细胞裂解物、人裂解物、中国仓鼠卵巢裂解物、小麦胚芽、HEK293裂解物、大肠杆菌裂解物、酵母裂解物的基于提取物的系统。
供选择地，体外转录和翻译可由纯化的组分，例如纯化重组元件系统(PURE)组装。
体外转录和翻译可以是偶联的或不偶联的。
肽标签可以是荧光蛋白的一个组分，并且其它多肽是荧光蛋白的互补部分。荧光蛋白可包括sfGFP、GFP、eGFP、deGFP、frGFP、eYFP、eBFP、eCFP、Citrine、Venus、Cerulean、Dronpa、DsRED、mKate、mCherry、mRFP、FAST、SmURFP、miRFP670nano。例如，肽标签可以是GFP11，其它多肽可以是GFP1-10。肽标签可以是sfCherry的一个组分。肽标签可以是sfCherry11，其它多肽可以是sfCherry1-10。在存在羟基亚苄基罗丹宁类似物的情况下，肽标签可以是CFAST11或CFAST10，其它多肽可以是NFAST。
例如，GFP1-10多肽的氨基酸序列可以源自sfGFP：MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEK
供选择地，GFP1-10多肽的氨基酸序列可由上述序列进一步突变，以在互补时更快地变得更亮：
MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATIGKLTLKFICTTG
KLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFK
DDGKYKTRAVVKFEGDTLVNRIELKGTDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNV
YITADKQKNGIKANFTVRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNH
YLSTQTVLSKDPNEK
互补的GFP11肽的氨基酸序列可以是以下：
1.KRDHMVLLEFVTAAGITGT
2.KRDHMVLHEFVTAAGITGT
3.KRDHMVLHESVNAAGIT
4.RDHMVLHEYVNAAGIT
GFP11或GFP1-10可以通过氨基酸接头与所关注的蛋白融合。在一个实施方案中，寡肽、肽或多肽接头可以是0-50个氨基酸。
例如，sfCherry1-10多肽的氨基酸序列可以是：
MEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGHPYEGTQTAKLKV
TKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFTWERVMN
FEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLLGTNFPSDGPVMQKKTMGWEAS
TERMYPEDGALKGEINQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYN
VDIKLDITSHNED
互补的sfCherry11肽的氨基酸序列可以是：
YTIVEQYERAEGRHSTGG
sfCherry11或sfCherry1-10可以通过氨基酸接头与所关注的蛋白融合。在一个实施方案中，寡肽、肽或多肽接头可以是0-50个氨基酸。
例如，NFAST多肽的氨基酸序列可以是：
MEHVAFGSEDIENTLAKMDDGQLDGLAFGAIQLDGDGNILQYNAAEGDI
TGRDPKQVIGKNFFKDVAPGTDSPEFYGKFKEGVASGNLNTMFEWMIPTS
RGPTKVKVHMKKALS
互补的CFAST11肽的氨基酸序列可以是：
GDSYWVFVKRV
或者互补的CFAST10肽的氨基酸序列可以是：
GDSYWVFVKR
NFAST、CFAST11和/或CFAST10可以通过氨基酸接头与所关注的蛋白融合。在一个实施方案中，寡肽、肽或多肽接头可以是0-50个氨基酸。
肽标签也可以是形成可检测底物，诸如发光或发色底物的蛋白的一个组分。蛋白可包括β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶或荧光素酶。
蛋白可与多个标签融合。例如，蛋白可与多个GFP11肽标签融合，并在多个GFP1-10多肽的存在下发生合成。例如，蛋白可以与多个sfCherry11肽标签融合，并在多个sfCherry1-10多肽的存在下发生合成。所关注的蛋白可以与一个或多个sfCherry11肽标签和一个或多个GFP11肽标签融合，并在一个或多个GFP1-10多肽和一个或多个sfCherry1-10多肽的存在下发生合成。
任何所关注的蛋白都可以被合成。蛋白可以是酶，例如末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)或其截短形式，或其他物种中的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的同源氨基酸序列，或任何物种的Polμ、Polβ、Polλ和Polθ的同源氨基酸序列，或任何物种的X家族聚合酶的同源氨基酸序列。
合成可以在微流体装置，例如电介质上的电润湿(EWOD)装置中进行。供选择地，合成可以以微量滴定板形式进行。
附图简述
图1示意性地显示本发明的一个实施方案。无细胞蛋白合成反应包含核酸模板，所述核酸模板含有与可检测标签融合的所关注的基因的表达盒，所述基因然后通过偶联或不偶联的体外转录和体外翻译被表达成所关注的蛋白。因此，所关注的蛋白在N端或C端与可检测肽标签融合。可检测肽标签的性质是其可与互补多肽互补，产生发荧光的蛋白。
图2显示在蓝光照射下，实时检测无细胞蛋白合成反应中所关注的蛋白的表达。将GFP11_TdT克隆到p70a载体中，并将其(2μl，30nM)添加至MyTXTL Sigma70 CFPS MasterMix(10μl；Arbor Biosciences)，得到12μl的总反应体积。随后将GFP1-10溶液(0.9mg/ml；364mM尿素)分别以0、1、2、3、4、6和12μl加入CFPS反应中，得到0、28、51、72、90、120和180mM的最终CFPS尿素浓度。然后将反应在200μl的PCR管中在29℃下孵育。在470nm的蓝光照射器下使用580nm的滤光片拍摄照片。
图3以图的形式显示对图2的无细胞蛋白合成反应中所关注的蛋白的表达的实时检测。荧光测量是在指定的时间点使用485nm的激发波长和520nm的发射波长进行的。使用含有GFP1-10溶液但不含GFP11_TdTp70a质粒的阴性对照CFPS反应以减去背景荧光。
图4显示(A)含有无细胞蛋白合成裂解物的数字微流体装置上的液滴。用白色箭头标注的液滴已经与重组的GFP1-10检测多肽(t＝0)合并。最上面的两行另外含有DNA构建体，用于表达具有GFP11肽标签的蛋白(白色实心箭头)。(B)显示六小时过后与图(A)中相同的液滴的荧光图像。只有包含具有GFP11肽标签的表达的蛋白和重组GFP-10检测多肽两者的液滴(即实心箭头)显示显著的荧光增加。没有DNA构建体(空心箭头)或没有GFP1-10检测物(无箭头)的液滴是没有荧光的。(C)图(B)中的液滴的荧光定量。只有具有裂解物、DNA构建体和GFP1-10检测多肽的液滴显示显著的荧光增加，表明蛋白表达。阴性对照，即(B)中的最下排液滴不含DNA构建体，并因此荧光弱，即使在存在GFP1-10检测物的情况下也是如此。(B)中液滴的编号与(C)中的条相匹配。
图5：从一个时间过程实验中提取的图像，其中把无细胞蛋白合成(CFPS)裂解物的液滴，任选地与所关注的蛋白(POI—这里是用GFP11肽标记的麦芽糖结合蛋白(MBP))和/或GFP1-10多肽的DNA构建体，在数字微流体装置上孵育4小时并定期成像。只有含有裂解物、DNA构建体和GFP1-10多肽的液滴在实验过程中显示出显著的荧光增加，如右手列的图像中所见的。
图6显示在图5中呈现的液滴中看到的实时荧光增加的图。荧光的量化是在ImageJ中进行的，通过减去在CFPS裂解物和GFP1-10的液滴中看到的背景荧光(即没有DNA构建体，所以没有表达所关注的蛋白，POI)，呈现的数值已经被进行归一化。只有含有所有组分—裂解物、POI的DNA构建体和GFP1-10多肽—的液滴产生超过背景的荧光。
图7：在该实验中，将重组纯化的GFP1-10检测物与编码GFP11标记的蛋白的DNA构建体同时添加到无细胞裂解物中。以读板仪随时间监测荧光信号。显示根据CFPS反应的读板仪测量值，荧光信号随时间增加的图。GFP1-10检测物从开始时就存在于所有三个反应中，能够实时检测蛋白的表达。在两个具有与GFP11标签融合的所关注的蛋白的条件下，与没有GFP11标记蛋白的阴性对照条件相比，荧光增加。POI1是经工程化的末端转移酶，POI2是SARS-COV-NL63-Mpro。两者都在N端有3xGFP11标签。
图5-7展示蛋白表达的实时检测。GFP1-10检测多肽从实验开始时就存在。荧光信号随着GFP11标签被表达而增加。这些实验是在基础流体中进行的，所述基础流体包含0.2％的在十二甲基五硅氧烷中的Span85，而不是Tween20的水溶液和在十二烷中没有表面活性剂。
图8表明GFP11标签与重组GFP1-10检测物的互补在0.1％重量/体积Tween20表面活性剂的存在下被抑制。在TNG缓冲液(50mM Tris，pH 7.4，0.1M NaCl，10％体积/体积甘油)中进行互补试验。荧光是在29℃下孵育24小时后测量的。前四对是对照：sfGFP和deGFP是完整的荧光蛋白，而MBP-GFP11和GFP1-10是部分荧光蛋白(分别是标签和检测物)，因此没有显示荧光。这十个样品对具有相同量的MBP-GFP11，但具有增加的摩尔过量的重组GFP1-10检测多肽。数据还显示，相对于GFP11肽标签增加摩尔过量的GFP1-10检测多肽导致增强的荧光信号。
图9表明GFP11标签与重组GFP1-10检测物的互补在0.1％重量/体积Tween20表面活性剂的存在下被抑制。在无细胞裂解物(σ70Linear Master Mix，Arbor Bioscience)中进行互补试验。孵育24小时后用读板仪测量荧光。前四对是对照：sfGFP和deGFP是完整的荧光蛋白，而MBP-GFP11和GFP1-10是部分荧光蛋白(分别是标签和检测物)，因此没有显示荧光。三个样品对具有相同量的MBP-GFP11，但具有增加的摩尔过量的重组GFP1-10检测多肽。
图10：从时间过程实验中提取的图像，其中把无细胞蛋白合成(CFPS)裂解物的液滴，任选地与所关注的蛋白(POI—其在这里是TdT的变体或用GFP11肽标记的病毒Mpro蛋白酶)的DNA构建体和/或与GFP1-10多肽的DNA构建体一起，在数字微流体装置上孵育6小时并定期成像。只有含有裂解物、GFP11标记的POI的DNA构建体和GFP1-10多肽的液滴在实验过程中显示显著的荧光增加，如右手列图像中所见。只有GFP1-10的DNA或单独的POI的裂解物没有显示荧光增加。
图11：显示图10中呈现的液滴中所见的实时荧光增加的图(以及T＝1小时的时间点，其与T＝0小时相似，没有包括在图10中)。荧光的量化是在ImageJ中进行的，通过减去CFPS裂解物和GFP1-10的液滴中所见的背景荧光(即没有POI DNA构建，所以没有表达所关注的蛋白，POI)，所呈现的数值已经被进行归一化。只有含有所有组分—裂解物、POI和GFP1-10多肽两者的DNA构建体—的液滴产生超过背景的荧光。
图12：显示读板器测量的蛋白表达的实时荧光的图。三种不同的POI(1：具有GFP11肽标签的TdT变体，2：具有不同GFP11肽标签的TdT变体，3：具有GFP11肽标签的病毒Mpro蛋白酶)的DNA构建体在无细胞蛋白合成(CFPS)裂解物中与GFP1-10的DNA构建体共同表达。只有具有GFP11标记的POI和GFP1-10两者的DNA构建体的裂解物显示荧光随时间的增加，而具有仅GFP1-10或GFP11标记的POI的DNA的裂解物则不显示荧光随时间的增加。
发明详述
本文公开一种用于实时监测体外蛋白合成的方法，其包括
a.体外转录和翻译与肽标签融合的所关注的蛋白；和
b.使用其它多肽监测所述肽标签的存在，所述其它多肽在所述肽标签的存在下产生可检测信号。
本文公开一种用于监测数字微流体装置上液滴中的无细胞蛋白合成的方法，其包括
a.无细胞转录和翻译与肽标签融合的所关注的蛋白；和
b.使用其它多肽监测所述肽标签的存在，所述其它多肽在所述肽标签的存在下产生可检测信号。
公开一种用于在数字微流体装置中无细胞表达肽或蛋白的方法。具有无细胞蛋白合成(CFPS)，又称为体外蛋白合成所需组分的液滴可通过电运动操纵，以实现和改善蛋白表达。
电润湿是用所施加电场改变表面(其一般是疏水性的)的润湿性质。基于电润湿操纵液滴或磁珠的微流体装置已被广泛描述。在通道中的液滴的情况下，这可以通过使液滴，例如在不相溶的载体流体存在的情况下，行进通过由筒壁或微流体管限定的微流体通道来实现。嵌入筒壁或管壁的是被介电层覆盖的电极，每个电极都连接至能够隔一定时间快速开和关以改变所述层的电润湿场特性的A/C偏压电路。这样产生沿给定路径引导液滴的能力。作为微流体通道系统的替代方案，也可以使用数字微流体技术(DMF)在平面上产生和操纵液滴。与基于通道的微流体技术相比，DMF利用电极阵列上的交变电流以在阵列的表面上移动流体。因此，液体可以通过电润湿在开放式装置上移动。数字微流体技术实现对液滴的移动，包括液滴融合和分离的精确控制。
无细胞蛋白合成，也被称为体外蛋白合成或CFPS，是在无细胞系统中，即在不使用活细胞的情况下，使用生物机器产生肽或蛋白。体外蛋白合成环境不限于细胞壁内，也不受维持细胞活力所必需的条件的限制，并且能够由核酸模板，通常是质粒DNA或来自体外转录的RNA，快速产生任何期望的蛋白。已知CFPS几十年，有许多商业系统是可用的。无细胞蛋白合成包括基于粗制裂解物的系统(Cold Spring Harb Perspect Biol.2016Dec；8(12):a023853)和基于重组的、纯化的分子试剂的系统，诸如用于产生蛋白的PURE系统(MethodsMol Biol.2014；1118:275-284)。CFPS需要高浓度的生物大分子，包括DNA、RNA、蛋白、多糖、分子拥挤剂等(Febs Letters 2013,2,58,261-268)。
迄今为止，数字微流体技术、电介质上电润湿(EWoD)和电运动一般仅在基于无细胞的生物应用中找到了有限的用途，主要是由于生物污损，其中生物组分，诸如蛋白、核酸、粗细胞提取物和其他生物产品吸附和/或变性至疏水表面。在本领域中众所周知，生物污损限制EWoD装置操纵含有生物大分子的液滴的能力。Wheeler及同事报告，在生物污损抑制基于EWoD的液滴驱动之前，含有生物介质的EWoD装置上的液滴的最大驱动时间为30分钟(Langmuir 2011,27,13,8586-8594)。
数字微流体技术可以在填充空气的系统中进行，其中液滴在空气中的表面上被操纵。然而，在升高的温度下或在延长的时间段内，挥发性的水性液滴仅通过蒸发变干至表面上。该问题因纳升和微升尺寸的液滴的高表面积与体积比而复杂化。因此，填充空气的系统通常不适合蛋白表达，其中系统的温度需要保持在适合酶活性的温度，而且合成的持续时间需要被延长，以使合成的蛋白水平可被检测。
蛋白的表达一般需要充足的氧供应。为CFPS提供动力的最方便和高产的方式是经由氧化磷酸化，其中O2用作最终的电子受体；然而，还有其他的方式，其涉及用不参与氧化磷酸化的能量分子进行补充。在液滴的受限的微流体或数字微流体系统中，没有足够的氧可用来实现高效的蛋白合成。
本文描述实现在数字微流体装置中无细胞表达肽或蛋白的改善的方法。包括一种在微流体装置中无细胞表达肽或蛋白的方法，其中所述方法包括一个或多个含有核酸模板(即DNA或RNA)的液滴和无细胞系统，所述无细胞系统具有用于在填充油的环境中表达蛋白的组分，并且利用电运动移动所述液滴。用于无细胞蛋白合成液滴的组分可以在引入数字微流体装置之前预先混合，或在数字微流体装置上混合。
在表达蛋白的同时，液滴可以被重复移动至少30分钟的时间段。在表达蛋白的同时，液滴可以被重复移动至少两个小时的时间段。在表达蛋白的同时，液滴可以被重复移动至少12个小时的时间段。移动液滴的动作使得氧被供应给液滴并分散到整个液滴中。与保持静止的液滴相比，移动的动作改善蛋白表达水平。
可以使用任何电运动手段来移动液滴。可以使用电介质上的电润湿(E WoD)来移动液滴。EWoD或光学EWoD装置上的电信号可以通过分段电极、有源矩阵薄膜晶体管或数字微镜递送。
装置中的油可以是任何水不混溶的液体。油可以是矿物油、硅油、基于烷基的溶剂诸如癸烷或十二烷，或氟化油。在表达过程之前或期间，油可以被充氧。供选择地，装置可以是填充空气的装置，其中含有无细胞蛋白合成试剂的液滴被快速移动到位置，并在加湿气体下被固定到阵列中，以防止蒸发。加湿可以通过封闭或密封数字微流体装置和提供搭载的试剂储器(reservoir)来实现。另外，加湿可以通过将水性储器连接到封闭或密封的数字微流体装置来实现。水性储器可具有限定的温度或溶质浓度，以提供特定的相对湿度(例如，30℃的饱和硫酸钾溶液)。
可以向液滴供应补充氧的来源。例如，在蛋白表达过程中，含有气态或溶解氧的液滴或气泡可以与液滴合并。另外，补充氧的来源可以通过对用作填料介质的油充氧获得。本领域中众所周知，油，诸如十六烷、HFE-7500等可以被充氧，以支持细胞生长，特别是大肠杆菌细胞生长的氧需求(RSC Adv.,2017,7,40990-40995)。充氧可以通过用纯氧或大气空气给油充气来实现。
液滴可以在进入微流体装置之前形成，并流入装置。供选择地，液滴可以在装置上合并。包括一种方法，其包括将含有核酸模板，诸如质粒的第一液滴与含有具有用于蛋白表达的组分的无细胞提取物的第二液滴合并，以形成能够无细胞蛋白合成的组合液滴。
液滴可以在表达之前或之后在装置上被分割。这里包括一种方法，其进一步包括将水性液滴分割成多个液滴。如果期望的话，分割的液滴可以用其它添加剂进行筛选。包括一种方法，其中一个或多个分割的液滴与用于筛选的添加剂液滴合并。
肽或蛋白的无细胞表达可以使用具有实现蛋白表达的试剂的细胞裂解物。无细胞反应的常见组分包括能量源、氨基酸供应源、辅助因子诸如镁，以及相关的酶。细胞提取物是通过裂解所关注的细胞并通过离心除去细胞壁、DNA基因组和其他碎片获得的。剩下的是细胞机器，包括核糖体、氨酰基-tRNA合成酶、翻译起始因子和延伸因子、核酸酶等。一旦加入合适的核酸模板，就可以使用细胞来源的表达机器将核酸模板表达为肽或蛋白。
任何特定的核酸模板都可以用本文所述的系统来表达。用于CFPS的三种类型的核酸模板包括质粒、线性表达模板(LET)和mRNA。质粒是圆形模板，其可以在细胞中产生或通过合成产生。LET可以经由PCR制备。虽然LET的制备更容易和更快，但在CFPS中质粒的产量通常更高。mRNA可以通过体外转录系统产生。所述方法每个液滴使用单个核酸模板。所述方法每个液滴可以使用具有不同的核酸模板的多个液滴。
能量源是无细胞反应的一个重要部分。通常，含有所需能量源的单独混合物，连同氨基酸的供应源，被添加到用于反应的提取物中。常见的来源是磷酸烯醇丙酮酸、乙酰磷酸和磷酸肌酸。在表达过程中，可以通过在所述过程向液滴添加其他试剂来补充能量源。
具有用于蛋白表达的组分的无细胞提取物包含除核酸模板外的蛋白表达所需的一切。因此，该术语包括所有相关的核糖体、酶、启动因子、核苷酸单体、氨基酸单体、金属离子和能量源。一旦加入核酸模板，蛋白的表达就开始，不需要其它试剂。
因此，在加入模板之前，可以用另外的试剂来补充细胞裂解物。具有用于蛋白表达的组分的无细胞提取物将一般是作为批量试剂或‘反应混合物(master mix)’制造的，其在不同的模板被分别添加到不同的液滴之前，可以被配制成许多相同的液滴。目前使用的常见细胞提取物由大肠杆菌(ECE)、兔网状细胞(RRL)、小麦胚芽(WGE)、昆虫细胞(ICE)和克鲁维酵母属酵母(D2P系统)制成。所有这些提取物都是可商购的。
无细胞系统可以由所需的试剂组装而成，而不来自于细胞提取物。基于重构的、纯化的分子试剂的系统是可商购的，例如用于制造蛋白的PURE系统，可以按所提供的使用。PURE系统由参与转录和翻译的所有酶，以及高度纯化的70S核糖体组成。PURE系统的蛋白合成反应缺少蛋白酶和核糖核酸酶，所述酶在细胞提取物中经常作为不期望的分子存在。
术语数字微流体装置是指具有平面微电极的二维阵列的装置。该术语排除任何仅仅具有在通道中的油流中的液滴的装置。通过激活特定的电极，液滴通过电动力在表面上移动。电极激活后，介电层变得更不疏水，从而使液滴扩散到表面上。数字微流体(DMF)装置的设置在本领域中是已知的，并且取决于所使用的基底、电极、那些电极的配置、介电材料的使用、该介电材料的厚度、疏水层和施加的电压。
一旦CFPS试剂已经被封闭在液滴中，就可以通过将原始液滴与第二液滴合并来提供另外的试剂。第二液滴可以携带任何期望的另外的试剂，包括例如氧或‘动力’源，或期望暴露于所表达的蛋白的测试试剂。
液滴可以是水性液滴。液滴可以包含油不混溶的有机溶剂，诸如例如DMSO。液滴可以是水和溶剂的混合物，条件是液滴不溶解到批量油中。
液滴可以在批量油层中。在表达过程中，干燥的气体环境仅仅将气泡弄干至表面上，通过蒸发留下干材料的彗星式斑痕。因此，装置被用于表达过程的液体填充。供选择地，水性液滴可以在加湿的气体环境中。填充空气的装置可以被密封和加湿，以提供减少CFPS液滴蒸发的环境。
因此，在核酸模板被添加到液滴之前，含有具有用于蛋白表达的组分的无细胞提取物的液滴将一般处于填充油的环境中。模板可以通过合并微流体装置上的液滴来添加。供选择地，模板可以被添加到装置外的液滴，然后流入装置中用于表达过程。例如，可以通过提高温度在装置上启动表达过程。表达系统一般在高于标准室温的温度下，例如在29℃或以上运行最佳。
表达过程一般耗费许多个小时。因此，所述过程应保留至少30分钟或1小时，一般至少2小时。表达可以保留至少12小时。在表达过程中，液滴应在装置内移动。移动通过混合试剂和确保液滴内有足够的氧可用来改善该过程。移动可以是连续的，或者可以是重复的，具有不移动的中间时间段。
因此，在表达蛋白的同时，水性液滴可以被重复移动持续至少30分钟或1小时的时间段。在表达蛋白质的同时，水性液滴可以被重复移动至少两个小时的时间段。在表达蛋白的同时，水性液滴可以被重复移动至少12个小时的时间段。移动液滴的动作实现液滴内的混合，并实现将氧或其他试剂供应给液滴。与保持静止的液滴相比，移动的动作改善蛋白表达水平。
数字微流体技术(DMF)是指用于基于微液滴的操纵的芯片上实验室系统的二维平面平台。液滴可以在具有一组绝缘电极的平台上被分配、移动、储存、混合、反应或分析。数字微流体技术可与分析性分析过程，诸如质谱法、比色法、电化学法和电化学发光法一起使用。
液滴可以使用任何电运动的手段进行移动。水性液滴可以用电介质上的电润湿(EWoD)来移动。电介质上的电润湿(EWOD)是基于介电材料的电润湿现象的一个变型。在EWoD过程中，导电液体的液滴被放置在具有绝缘和疏水性质的介电层上。在激活电极后，介电层变得较不疏水，从而导致液滴扩散到表面上。
EWoD或光学激活的非晶硅(a-Si)EWoD装置上的电信号可以通过分段电极、有源矩阵薄膜晶体管或数字微镜递送。光学激活的s-Si EWoD装置在本领域中是众所周知的，用于驱动液滴(J.Adhes.Sci.Technol.,2012,26,1747-1771)。
装置中的油可以是任何水不混溶的或疏水性液体。油可以是矿物油、硅油、基于烷基的溶剂诸如癸烷或十二烷，或氟化油。装置中的空气可以是任何加湿的气体。
可以向液滴提供补充氧的来源。例如，在蛋白表达过程中，含有气态或溶解氧的液滴或气泡可以与水性液滴合并。供选择地，氧的来源可以是释放氧的分子来源。供选择地，液滴可以被移到空气/液体边界，以实现氧从气体环境的扩散增加。供选择地，油也可以被充氧。供选择地，液滴可以存在于加湿的填充空气的装置中。
液滴可以在进入微流体装置之前形成，并且流入所述装置。供选择地，液滴可以在装置上合并。包括一种方法，其包括将含有核酸模板，诸如质粒的第一液滴与含有具有用于蛋白表达的组分的无细胞系统的第二液滴合并，以形成液滴。
液滴可以在表达前、表达期间或表达后在装置上被分割。本文包括一种方法，其进一步包括将液滴分割成多个液滴。如果期望的话，分割的液滴可以用其它添加剂进行筛选。包括一种方法，其中一个或多个分割的液滴与用于筛选的添加剂液滴合并。
通过亲和标签，诸如FLAG-tag、HIS-tag、GST-tag、MBP-tag、STREP-tag或其他形式的亲和标签，CFPS表达的蛋白可以被固定在固体支撑亲和树脂上，新鲜批次的CFPS试剂可以在所述树脂上被递送。因此，更新的试剂可用于进行蛋白的合成，仔细地模仿连续流(CF)和连续交换(CE)CFPS的工业方法。通过模仿CF-和CE-CFPS，用户可以放大其CFPS制造方法。
液滴可以在数字微流体装置上的疏水表面上被驱动(ACSNano 2018,12,6,6050-6058)。疏水表面可以是诸如聚四氟乙烯(PTFE)、Teflon AF(DuPont Inc)、CYTOP(AGCChemicals Inc)或FluoroPel(Cytonix LLC)的疏水表面。疏水表面可以以这样的方式进行修饰，以减少生物污损，特别是由于暴露于CFPS试剂或核酸试剂导致的生物污损。疏水表面也可以是超疏水的，诸如NeverWet(NeverWet LLC)或Ultra-Ever Dry(FlotechPerformance Systems Ltd)。与一般的基于氟碳化合物的疏水表面相比，超疏水表面防止生物污损。因此，超疏水表面延长数字微流体装置移动CFPS液滴和含有生物聚合物的一般溶液的能力(RSC Adv.,2017,7,49633-49648)。疏水表面也可以是光滑的液体灌注的多孔表面(SLIPS)，其可以通过用Krtox-103油(DuPont)灌注多孔PTFE膜形成(Lab Chip,2019,19,2275)。
液滴还可以含有添加剂，以减少生物污损对数字微流体表面的影响。具体来说，含有CFPS组分的液滴还可以含有添加剂，诸如表面活性剂或洗涤剂，以减少生物污损对数字微流体装置的疏水或超疏水表面的影响(Langmuir 2011,27,13,8586-8594)。这样的液滴可以使用防污添加剂，诸如TWEEN 20、Triton X-100和/或Pluronic F127。具体来说，含有CFPS组分的液滴可以含有0.1％体积/体积的TWEEN20，0.1％体积/体积的Triton X-100，和/或0.08％重量/体积的Pluronic F127。
对于电介质上的电润湿(EWoD)，施加电势后试剂接触角的变化是表面张力的反函数。因此，对于低电压EWOD运行，表面张力的降低是通过将表面活性剂加至试剂中来实现的，其对于CFPS反应来说，意味着加至裂解物和加至DNA。这导致裂解物的稀释，在实验中已经看到，稀释或以其他方式掺杂裂解物导致所关注的蛋白的表达水平下降。因此，在其中将表面活性剂添加到正在被移动的溶液中的DMF上进行CFPS，必然将导致裂解物的稀释和掺杂，因此降低蛋白表达水平。除了其本身是一个问题外，这进一步使将DMF上的结果外推到管内的蛋白产量预测复杂化。必须向样品中添加表面活性剂的另一个不利之处是，这样增加样品制备所需的时间，也增加由于‘用户错误’而导致结果不一致的可能性，因为有更多的试剂处理。必须向样品中添加表面活性剂的另一个不利之处是某些下游操作受到妨碍。例如，如果所关注的蛋白在无细胞系统中用GFP 11(或类似的)肽标签表达，它与GFP1-10(或类似的)检测多肽的下游互补在表面活性剂的存在下受到妨碍。这在图8和图9中显示。因此，从水相中去除表面活性剂是有利的。
不向水性样品加入表面活性剂，反而可以向油中加入表面活性剂，诸如脱水山梨糖醇酯，诸如Span85(例如Sorbitan trioleate,Sigma Aldrich,SKU8401240025)。这样的优点是使CFPS反应在DMF上进行，而没有稀释或掺杂。另外，其简化用于建立反应的样品制备过程，提高使用的便利性和结果的一致性。在十二烷中使用1％重量/重量的Span85实现在DMF上的无稀释的CFPS反应以及对表达的非荧光蛋白的无稀释检测。可以使用除Span85之外的其他表面活性剂和除十二烷以外的油。可以使用一系列浓度的Span85。表面活性剂可以是非离子型、阴离子型、阳离子型、两性型或其混合物。油可以是矿物油或合成油，包括硅油、石油和全氟化油。表面活性剂可对(1)CFPS反应和(2)检测系统的效率(如果检测系统涉及标签和检测物的互补)具有不利的影响。例如，通过在具有油-表面活性剂混合物的DMF上进行CFPS反应，表达的蛋白的检测也可以在不稀释和不添加水性表面活性剂的情况下进行。已经表明，表面活性剂降低一些检测系统，包括但不限于Split GFP(例如GFP11/GFP1-10)系统的效率，因此从试剂混合物中去除表面活性剂，反而将其添加到油中会是有益的。
肽标签可以连接到蛋白的C端或N端。肽标签可以是绿色荧光蛋白(GFP)的一个组分。例如，肽标签可以是GFP11，其它多肽可以是GFP1-10。肽标签可以是sfCherry的一个组分。肽标签可以是sfCherry11，而其它多肽可以是sfCherry1-10。
蛋白可以与多个标签融合。例如，蛋白可与多个GFP11肽标签融合，并在多个GFP1-10多肽的存在下发生合成。例如，蛋白可以与多个sfCherry11肽标签融合，并在多个sfCherry1-10多肽的存在下发生合成。所关注的蛋白可以与一个或多个sfCherry11肽标签和一个或多个GFP11肽标签融合，并在一个或多个GFP1-10多肽和一个或多个sfCherry1-10多肽的存在下发生合成。
装置
通过施加电势对液滴的操纵可以在覆盖有绝缘体或电介质或一系列绝缘体或电介质的电极上实现。由施加的电势导致的液滴操纵被称为电润湿。电运动的发生是由于非均匀电场影响介电液体的流体静力学平衡(电润湿或DEP)或液体在固体表面上的接触角的改变(电介质上的电润湿或EWoD)。DEP也可以用于在可偏振的颗粒上产生力，以诱导它们的移动。电信号可以被传输到分立电极、晶体管、晶体管阵列或半导体膜片，其电性质可以通过光信号调制。
当液滴在两个平行的、覆盖有疏水绝缘体或电介质的电极之间被驱动时，发生EWoD现象。电极-电解质界面处的电场诱导表面张力的变化，由于液滴接触角的变化其导致液滴运动。电润湿效应可以用Young-Lippmann方程来定量处理：
cosθ-cosθ0＝(1/2γLG)c.V2
其中，θ0是跨越界面层的电场为零时的接触角，γLG是液体-气体张力，c是比电容(作为εr.ε0/t给出，其中εr是绝缘体/电介质的介电常数，ε0是真空的电容率，t是厚度)，V是施加的电压或电势。因此，接触角的变化(诱导液滴移动)是表面张力、电势、电介质厚度和介电常数的函数。
当液滴被EWoD驱动时，有两组相反的力作用在其上：由电场诱导的电润湿力和阻力，阻力包括由液滴与填料介质的相互作用导致的拖拽力和接触线摩擦(参考)。应用于平衡电润湿力与所有拖曳力之和的最小电压(阈值电压)由绝缘体/电介质的厚度与电介质接触比(t/εr)1/2可变地决定。因此，为了降低驱动电压，需要减小(t/εr)1/2(即增加介电常数或减小绝缘体/介电质厚度)。为了实现低电压驱动，必须使用薄的绝缘体/介电层。然而，高质量的薄绝缘体/介电层的沉积是一个技术挑战，在达到期望的电润湿接触角足够大以驱动液滴之前，这些薄层容易被损坏。因此，大多数学术研究报告，在容易制造的厚电介质膜(>3微米)上使用>100V的高得多的电压以实现电润湿。
然而，具有厚介电膜的高电压的基于EWoD的装置具有有限的工业适用性，主要是因为它们有限的液滴多路复用能力。包括薄膜晶体管(TFT)和光学激活的非晶硅层(a-Si)的低电压装置的使用已经为基于EWoD的装置的工业应用铺平了道路，因为它们在以高度多路复用方式寻址电信号方面的更大灵活性。TFT或光学激活的a-Si的驱动电压低(通常<15V)。制造和因此采用低电压装置的瓶颈已经是沉积高质量的薄膜绝缘体/电介质的技术挑战。因此，已经特别需要改善薄膜绝缘体/电介质装置的制造和组成。
一般，用于EWoD的电极(或阵列元件)被(i)亲水绝缘体/电介质和疏水涂层或(ii)疏水绝缘体/电介质覆盖。常用的疏水涂层包括含氟聚合物，诸如Teflon AF 1600或CYTOP。作为电介质上的疏水涂层的该材料的厚度一般<100nm，并可能有针孔或多孔结构形式的缺陷；因此，绝缘体/电介质没有针孔以避免电短路是特别重要的。特氟龙也已经被用作绝缘体/电介质，但由于其低介电常数和要使其没有针孔所需的厚度，其具有较高的电压需求。其他疏水绝缘体/电介质材料可以包括基于聚合物的电介质，诸如基于硅氧烷、环氧树脂(如SU-8)或聚对二甲苯(例如聚对二甲苯N、聚对二甲苯C、聚对二甲苯D或聚对二甲苯HT)的那些。由于接触角滞后最小和与水溶液的接触角较大，特氟龙仍被用作这些绝缘体/电介质聚合物的疏水外涂层。然而，在可靠地制造<1微米的聚对二甲苯或SU-8的无针孔涂层方面存在困难；因此，这些材料的厚度一般保持在2-5微米，代价是增加的电润湿电压要求。也已经报道，对于采用细胞培养基的重复液滴操纵，传统的具有聚对二甲苯C的EWoD装置容易破损和不稳定。用金属氧化物和聚对二甲苯C膜沉积的多层绝缘体装置已被用于制造更坚固的绝缘体/电介质，并能以较低的施加电压运行。无机材料，诸如金属氧化物和半导体氧化物，通常在CMOS工业中用作“栅极电介质”，已被用作用于EWoD装置的绝缘体/电介质。它们提供利用标准洁净室方法进行薄膜沉积(<100nm)的优势。这些材料本身是亲水的，需要另外的疏水涂层，并且由于薄膜层沉积过程，会容易形成针孔。连同EWoD的较低电压操作的需要，最近的开发工作已经集中在(1)使用具有改善的介电性质的材料(例如，使用高介电常数的绝缘体/介电质)，(2)优化制造方法以使绝缘体/介电质无针孔，以避免介电击穿。
EWoD装置的运行受到接触角饱和和滞后的影响，据信这是由以下这些现象中的一个或组合引起的：(1)电荷截留在疏水膜或绝缘体/介电质界面中，(2)离子的吸附，(3)热力学接触角的不稳定性，(4)介电层的介电击穿，(5)电极-电极-绝缘体界面电容(由双层效应引起)，以及(6)表面的污损(诸如由生物大分子对表面的污损)。这样的滞后的不利影响之一是降低基于EWoD的装置的运行寿命。
接触角滞后被认为是几次运行后在界面处或在疏水绝缘体内的电荷积累的结果。由于这种充电现象，所需的驱动电压增加，导致最终灾难性的介电击穿。最可能的解释是，绝缘体/电介质处的针孔可能使得液体与电极接触，导致电解。容易出现针孔或多孔的疏水绝缘体进一步促进电解。
大多数用于了解EWoD上接触角滞后的研究是基于短时间尺度和以低电导率溶液进行的。长持续时间的驱动(如>1小时)和高导电率溶液(如1M氯化钠)可能产生除电解以外的几种效应。溶液中的离子可渗透通过疏水涂层(在施加的电场下)，并与下面的绝缘体/电介质相互作用。离子渗透可导致(1)由于电荷截留而改变介电常数(这与界面充电不同)和(2)改变pH敏感的金属氧化物的表面电位。两者都可导致操纵水性液滴的电润湿力减小，导致接触角滞后。本发明人先前已经发现，来自高导电率溶液的损害通过抑制施加电场时接触角的调制而减少电极上的电润湿，或使得在电极上不能电润湿。
一种电运动装置包括具有电极矩阵的第一基板，其中每个矩阵电极都与薄膜晶体管耦合，并且其中矩阵电极外涂有功能涂层，所述功能涂层包括：与矩阵电极接触的介电层，与介电层接触的共形层，以及与共形层接触的疏水层；包括顶部电极的第二基板；设置在第一基板和第二基板之间并定义电运动工作空间的间隔物；以及可操作地耦合至矩阵电极的电压源。
介电层可包含二氧化硅、氧氮化硅、氮化硅、氧化铪、氧化钇、氧化镧、二氧化钛、氧化铝、氧化钽、硅酸铪、氧化锆、硅酸锆、钛酸钡、锆钛酸铅、钛酸锶或钛酸锶钡。介电层的厚度可为10nm至100μm。可以使用多于一种的材料的组合，并且介电层可以包括多于一个的子层，所述子层可由不同材料制成。
共形层可包含聚对二甲苯、硅氧烷或环氧树脂。它可以是在绝缘电介质和疏水涂层之间的薄的保护性聚对二甲苯涂层。一般，聚对二甲苯被用作简单装置上的介电层。在本发明中，沉积聚对二甲苯的理由不是为了改善绝缘/介电性质，诸如减少针孔，而是作为介电层和疏水层之间的共形层。本发明人发现，与其他相同厚度的类似绝缘涂层，诸如PDMS(聚二甲基硅氧烷)相反，聚对二甲苯防止由高电导率溶液或长时间偏离中性pH值的溶液引起的接触角滞后。共形层的厚度可为10nm至100μm。
疏水层可包含含氟聚合物涂层、氟化硅烷涂层、氧化锰聚苯乙烯纳米复合材料、氧化锌聚苯乙烯纳米复合材料、沉淀碳酸钙、碳纳米管结构、二氧化硅纳米涂层或光滑的液体灌注的多孔涂层。
所述元件可以包括多个阵列元件中的一个或多个，每个元件含有元件电路；分立电极；电性质可由入射光调制的薄膜半导体；以及其性质可由入射光调制的薄膜光电导体。
功能性涂层可包括包含氮化硅的介电层、包含聚对二甲苯的共形层以及包含无定形含氟聚合物的疏水层。已经发现这是特别有利的组合。
电运动装置可包括用以调节提供给单个矩阵电极的电压的控制器。电运动装置可包括多条扫描线和多条栅极线，其中每个薄膜晶体管都与一条扫描线和一条栅极线相耦合，多条栅极线与控制器可操作地连接。这使得所有的单个元件都能被单独地控制。
第二基板还可以包含设置在第二电极上的第二疏水层。第一基板和第二基板可以被设置成使得疏水层和第二疏水层相互面对，从而在疏水层之间限定电运动工作空间。
所述方法特别适合用于体积为1μl或更小的水性液滴。
下面显示和描述的基于EWoD的装置是有源矩阵薄膜晶体管装置，其含有具有特氟龙疏水表面涂层的薄膜介电涂层。这些装置是基于EInk公司的题为“包括具有薄膜晶体管和电容感应的双基板的数字微流体装置”的专利申请中描述的装置，该专利申请的美国专利申请号为2019/0111433，通过引用并入本文。
本文描述电运动装置，其包括：
具有电极矩阵的第一基板，其中每个矩阵电极都与薄膜晶体管耦合，并且其中矩阵电极外涂有包括以下的功能涂层：
与矩阵电极接触的介电层，
与介电层接触的共形层，以及
与共形层接触的疏水层；
包括顶部电极的第二基板；
设置在第一基板和第二基板之间并限定电运动工作空间的间隔物；以及
可操作地耦合至矩阵电极的电压源。
本文描述一种电运动装置，其包括：
具有电极矩阵的第一基板，其中每个矩阵电极都与薄膜晶体管耦合，并且其中矩阵电极外涂有包括以下的功能涂层：
一个或多个与矩阵电极接触的包含氮化硅、氧化铪或氧化铝的介电层，与介电层接触的包含聚对二甲苯的共形层，以及
与共形层接触的疏水层；
包括顶部电极的第二基板；
设置在第一基板和第二基板之间并限定电运动工作空间的间隔物；以及
可操作地耦合至矩阵电极的电压源。
所述电运动装置可与其他元件，诸如例如用于加热和冷却装置的装置或用于根据需要引入试剂的试剂盒一起使用。
实施例
实施例1.
创建了编码GFP11-末端脱氧核苷酸转移酶(GFP11_TdT)融合蛋白的cDNA序列。
GFP11-末端脱氧核苷酸转移酶(GFP11_TdT)融合蛋白(SEQ ID NO:1)：MKRDHMVLHEYVNAAGITGSGGSGGKFMHHHHHHMENLYFQGKISQYACQRKTTLNNYNHIFTDAFEILAENSEFKENEVSYVTFMRAASVLKSLPFTIISMKDTEGIPCLGDKVKCIIEEIIEDGESSEVKAVLNDERYQSFKLFTSVFGVGLKTSEKWFRMGFRSLSKIMSDKTLKFTKMQKAGFLYYEDLVSCVTRAEAEAVGVLVKEAVWAFLPDAFVTMTGGFRRGKKIGHDVDFLITSPGSAEDEEQLLPKVINLWEKKGLLLYYDLVESTFEKFKLPSRQVDTLDHFQKCFLILKLHHQRVDSSKSNQQEGKTWKAIRVDLVMCPYENRAFALLGWTGSRQFERDIRRYATHERKMMLDNHALYDKTKRVFLKAESEEEIFAHLGLDYIEPWERNA
GFP11-末端脱氧核苷酸转移酶(GFP11_TdT)融合蛋白包括376aa的工程化的TdT，其经由9aa接头与15aa的N-末端GFP11肽标签连接。
将GFP11_TdT cDNA序列克隆到p70a载体中，并将其(2μl，30nM)添加至MyTXTLSigma70 CFPS Master Mix(10μl；Arbor Biosciences)，得到12μl的总反应体积。
随后将GFP1-10溶液(0.9mg/ml；364mM尿素)分别以0、1、2、3、4、6和12μl的添加到CFPS反应中，得到分别为0、28、51、72、90、120和180mM的最终CFPS尿素浓度。
然后将反应在200μl PCR管中在29℃下孵育。在470nm的蓝光照射器下使用580nm的滤光片拍摄照片。
图2显示在蓝光照射下CFPS反应中GFP11_TdT的实时荧光检测。图2优化GFP1-10溶液的量，这是在增加GFP1-10蛋白的浓度和通过增加尿素浓度的CFPS失活之间的权衡。
图3对CFPS反应中GFP11_TdT的减去背景的、实时荧光检测进行量化。荧光测量是在所显示的时间点使用485nm的激发波长和520nm的发射波长进行的。含有GFP1-10溶液但不含GFP11_TdT p70a质粒的阴性对照CFPS反应被用来减去背景荧光。
图4显示对微流体装置上液滴中表达的测量。
图4A中可以看到在eDrop上的CFPS中表达了具有标记的蛋白(麦芽糖结合蛋白，MBP，与GFP11融合，即MBP-GFP11)的液滴。前两列包含具有表达的蛋白的CFPS裂解物，而第三列包含CPFS裂解物对照(无表达的蛋白)。图4A的图像是在暗视野照明下拍摄的。
图4B中显示其中向一些具有表达的蛋白的液滴添加了GFP1-10的液滴，T＝6小时。较大的液滴已具有添加到CFPS裂解物中的浓缩的重组GFP1-10。该图像是在荧光灯下拍摄的。只有添加了表达的标记蛋白和互补多肽两者的液滴才显示荧光。
图5-7展示蛋白表达的实时检测。GFP1-10检测多肽从实验开始时就存在。荧光信号随着GFP11标签被表达而增加。这些实验是在基础流体中进行的，所述基础流体包含0.2％的在十二甲基五硅氧烷中的Span 85，而不是Tween20的水溶液和十二烷中没有表面活性剂。
图8和9显示水性表面活性剂的不利影响。
图10-12显示通过检测物(GFP1-10)与所关注的GFP11标记的蛋白的共同表达在管和液滴中的实时蛋白表达检测。

Claims (25)

1.一种用于监测数字微流体装置上液滴中的无细胞蛋白合成的方法，其包括
a.无细胞转录和翻译与肽标签融合的所关注的蛋白；和
b.使用其它多肽监测所述肽标签的存在，所述其它多肽在所述肽标签存在下产生可检测信号。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述可检测信号是荧光或发光。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述转录和翻译发生在人裂解物系统中。
4.如权利要求1或权利要求2中任一项所述的方法，其中所述转录和翻译发生在兔网状细胞裂解物(RRL)系统中。
5.如权利要求1或权利要求2中任一项所述的方法，其中所述转录和翻译发生在中国仓鼠卵巢裂解物系统中。
6.如权利要求1或权利要求2中任一项所述的方法，其中所述转录和翻译发生在小麦胚芽无细胞系统中。
7.如权利要求1或权利要求2中任一项所述的方法，其中体外转录和翻译发生在大肠杆菌全细胞裂解物系统中。
8.如权利要求1或权利要求2中任一项所述的方法，其中体外转录和翻译发生在纯化重组元件(PURE)系统中。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中体外转录和翻译是偶联的。
10.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中体外转录和翻译是不偶联的。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述肽标签是绿色荧光蛋白(GFP)的一个组分。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述肽标签为GFP11，所述其它多肽为GFP1-10。
13.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述肽标签是sfCherry的一个组分。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述肽标签为sfCherry11，所述其它多肽为sfCherry1-10。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所关注的蛋白与多个肽标签融合。
16.如权利要求15所述的方法，其中所关注的蛋白与多个GFP11肽标签融合。
17.如权利要求15所述的方法，其中所关注的蛋白与多个sfCherry11肽标签融合。
18.如权利要求15所述的方法，其中所关注的蛋白与一个或多个sfCherry11肽标签和一个或多个GFP11肽标签融合。
19.如权利要求15至18中任一项所述的方法，其中所述多个肽标签以串联方式与所关注的肽融合。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所关注的蛋白是单一蛋白，诸如TdT、IFNβ1-α、VEGF，或者是蛋白-蛋白复合物或更大的组件，诸如细菌噬菌体的蛋白部分。
21.如权利要求20所述的方法，其中所关注的蛋白是末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)或其截短形式，或其他物种的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的同源氨基酸序列，或任何物种的Polμ、Polβ、Polλ和Polθ的同源氨基酸序列，或任何物种的X家族聚合酶的同源氨基酸序列。
22.权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述液滴在油层中，并且所述油层含有表面活性剂。
23.权利要求22所述的方法，其中所述油层中的表面活性剂是非离子表面活性剂。
24.根据权利要求24所述的方法，其中所述表面活性剂是脱水山梨糖醇酯。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述表面活性剂是Span85。
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