CN117794647A - 用于改进数字微流体器件上的生物分子试验的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于检测和分析微流体器件上的生物分子相互作用的方法和组合物。所述检测和分析发生在具有第二表面活性剂的油层内的具有第一表面活性剂的水性液滴中。

Description

用于改进数字微流体器件上的生物分子试验的方法和组合物
发明领域
本文提供了用于改进数字微流体器件上的生物分子试验的方法和组合物。本文提供了用于器件上蛋白合成及其检测的方法和组合物。所述方法适用于对微流体器件的监测。
发明背景
电润湿是用施加的电场对表面(其通常是疏水性的)的润湿特性的改性。用于基于电润湿来操纵液滴或磁珠的微流体器件已被广泛地描述。在液滴在通道中的情况下，这可以通过例如在不混溶的载体流体的存在下使液滴行进通过由盒或微流体管的壁限定的微流体通道来实现。嵌入盒或管的壁中的是覆盖有介电层的电极，这些电极中的每一个都连接到能够有间隔地被快速打开和关闭的A/C偏置电路，以改变所述层的电润湿场特征。这产生沿给定路径引导液滴的能力。
作为微流体通道系统的替代方案，还可以使用数字微流体(DMF)在平坦表面上产生和操纵液滴。与基于通道的微流体相比，DMF利用电极阵列上的交流电来移动阵列的表面上的流体。因此，可以通过电润湿在开放式器件上移动液体。数字微流体实现对液滴移动，包括液滴融合和分离的精确控制。
无细胞蛋白合成也称为体外蛋白合成或CFPS，其是在无细胞系统中，也就是说在不使用活细胞的情况下，使用生物机器生产肽或蛋白。体外蛋白合成环境不被约束在细胞壁内，也不受维持细胞活力所必需的条件的限制，并且能够由核酸模板，通常是来自体外转录的质粒DNA或RNA，快速生产任何期望的蛋白。CFPS已为人所知数十年，并且许多商业化系统是可用的。无细胞蛋白合成包括基于粗裂解物的系统(Cold Spring Harb PerspectBiol.2016Dec；8(12):a023853)和基于重构的、纯化的分子试剂的系统，如用于蛋白生产的PURE系统(Methods Mol Biol.2014；1118:275–284)。CFPS需要高浓度的生物大分子，包括DNA、RNA、蛋白、多糖、分子拥挤剂等(Febs Letters 2013,2,58,261-268)。
Lab Chip,2012,12,882(题为“一种用于蛋白工程和定向进化的完全体外超高通量的基于液滴的微流体筛选系统(A completely in vitro ultrahigh-throughputdroplet-based microfluidic screening system for protein engineering anddirected evolution)”)描述了一种基于流动毛细管通道中的液滴的系统，而不是基于三维阵列的EWoD系统。
美国专利申请20210016283描述了用于高通量蛋白表达的微孔阵列系统。
题为“一种用于快速无细胞生产蛋白生物制品的便携式流体平台(aPortableFluidic Platform For Rapid Cell-Free Production of Protein Biologics)”的US20160230203A1描述了一种集成流体平台，该平台包括偶联至快速蛋白纯化和表征模块、实现蛋白生物制品生产的无细胞蛋白合成系统。
US10464067描述了空气基质数字微流体(DMF)设备以及使用它们来防止或限制DMF设备的蒸发和表面结垢的方法。
WO2004002627公开了通道中液滴的形成。液滴悬浮在含有表面活性剂的硅油的连续相中。
US20070242105、WO2013006312和WO2017037078各自公开了用于流体系统中的液滴处理操作的填充流体。填充流体可含有表面活性剂。
迄今为止，仅发现了数字微流体、介质上电润湿(EWoD)和电运动一般在基于无细胞生物的应用中的有限用途，主要是由于生物淤积，其中生物组分如蛋白、核酸、粗细胞提取物和其它生物产品吸附至疏水性表面和/或变性成疏水性表面。本领域众所周知，生物淤积限制EWoD器件操纵含有生物大分子的液滴的能力。Wheeler和同事报告，在生物淤积抑制基于EWoD的液滴致动之前，含有生物介质的EWoD器件上的液滴的最大致动时间为30分钟(Langmuir 2011,27,13,8586-8594)。
数字微流体可以在充气的系统中进行，其中液滴在空气中在表面上被操纵。然而，在高温下或在长时间段内，挥发性水性液滴仅通过蒸发干到表面上。纳升和微升尺寸的液滴的高表面积与体积比使这个问题加重。因此，充气的系统一般不适合蛋白表达，其中系统的温度需要保持在适合酶活性的温度下，并且需要延长合成的持续时间以使合成的蛋白水平可检测。
概述
在这里，我们报告令人惊讶的发现，即与单独在水层或者油层中的表面活性剂相比，在用于基于生物分子的应用的数字微流体器件中，向油层和水层两者中添加表面活性剂得到显著改善的性能。
先前的报告已经表明，在油层中使用表面活性剂是有害的。例如，ACSAppl.Mater.Interfaces 2019,11,28487-28498(https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/acsami.9b07983)证明在十二烷中使用Span80改变EWoD的接触角。然而，当作者在数字微流体系统(市售的OpenDrop)中使用组合物时，十二烷中的Span80是有害的并被放弃。来自Tohgha等人的摘录(粗体表示强调)：
随后使用手动控制系统来研究跨平台移动纳米流体液滴所需的最小电压。当使用纯十二烷油作为环境流体时，QD-G-COOH液滴最小需要200V来实现有效的移动，而不分裂或固定不动。然而，当将QD-G-COOH的液滴置于表面活性剂掺杂的十二烷(1重量％的Span80)系统中时，无论施加的电压如何(120-250V)，速度和稳定性(不完全的液滴转移)两者都急剧下降。液滴在电极之间缓慢移动，通常在流体传输中有明显的滞后，并且速度从不大于约5毫米/秒(影片S2)。如上所述，由添加的表面活性剂产生的较低的界面表面张力降低固着的液滴所需的致动电压。尽管EWOD和DMF的运行相似，但DMF的驱动力不仅与接触角的总的变化相关，而与静电力的总和更密切相关。由于表面张力的降低降低液滴上总的力，因此可用于有效地沿电极移动液滴的功(work)较少。因此，OpenDrop器件上的所有剩余测试都是在不存在表面活性剂的情况下进行的。
上述参考文献中的试验没有使用生物分子，如蛋白或核酸。在许多情况下，水性液滴中某些表面活性剂的存在对生物分子相互作用是有害的。
发明人已经认识到，从水性液滴中完全除去表面活性剂影响可靠地处理器件上的液滴的能力。因此，发明人在本文中已经确定了用于水层的优选表面活性剂，连同用于油层的优选表面活性剂。公开了含有两种或更多种表面活性剂的组合物。
公开了一种数字微流体器件，其包括平面电极的二维阵列，其中所述器件包含在主体油相内的含有生物分子和第一表面活性剂的水性液滴群，其中主体油相含有第二表面活性剂。第一表面活性剂可以是非离子表面活性剂，例如Pluronic表面活性剂，如PluronicF127。
申请人已经认识到，不向水性生物分子样品添加高水平的表面活性剂，而向油添加另外的表面活性剂，如Span85是有益的。这样具有的优点是使包括CFPS在内的反应能够在DMF上进行，而试剂不经历稀释或掺杂。另外，其简化用于建立反应的样品制备过程，提高易用性和结果的一致性。
在油层，如十二烷中使用表面活性剂，如Span85实现DMF上的免稀释CFPS反应，以及表达的非荧光蛋白的免稀释检测。可以使用除Span85之外的其它表面活性剂和除十二烷之外的油。可以使用一系列浓度的Span85。
表面活性剂可以是非离子的、阴离子的、阳离子的、两性的。每种表面活性剂可以是不同表面活性剂的混合物。
油可以是矿物油或合成油，包括硅油、石油和全氟化油，或其混合物。
水层中高水平的表面活性剂可对(1)CFPS反应和(2)检测系统的效率(如果检测系统涉及标签和检测物(detector)的互补)有不利影响。因此，在本发明中减少水层中的表面活性剂，其具有解决用于生物应用的数字微流体(DMF)器件的使用中的许多问题的潜力。例如，通过用油-表面活性剂混合物在DMF上进行CFPS反应，可以在不稀释水性表面活性剂且不需要高水平的水性表面活性剂的情况下进行所表达的蛋白的检测。已经表明，高水平的某些表面活性剂降低一些依赖蛋白-蛋白相互作用的检测系统的效率，因此从试剂混合物减少表面活性剂而将它们添加到油中是有益的。
由于将表面活性剂移至油具有样品处理(如将样品加载到数字微流体器件上)的速度优势且容易，因此本发明可用于并且有益于将在DMF上进行的生物反应，例如酶促DNA合成、DNA组装、蛋白表达、蛋白纯化、蛋白结合和蛋白活性试验。
与在油相中没有表面活性剂的情况下操作的系统相比，水性液滴可含有显著减少的表面活性剂。在某些情况下，水性液滴中最低水平的表面活性剂可减少生物淤积，其与填充流体中最低水平的表面活性剂一起实现液滴处理和生化过程。
油可以是矿物油、硅油、基于烷基的溶剂或氟化油，或其共混物。烷基溶剂可以是癸烷或十二烷。
第二表面活性剂可以是非离子表面活性剂。第二表面活性剂可以是脱水山梨糖醇酯。表面活性剂可以是Span表面活性剂。表面活性剂可以是Span85。
表面活性剂可以是不同表面活性剂的混合物。混合物中的表面活性剂之一可以是非离子表面活性剂。表面活性剂之一可以是脱水山梨糖醇酯。表面活性剂之一可以是Span表面活性剂。表面活性剂之一可以是Span85。
生物分子可以是核酸，例如双链核酸。生物分子可以是肽。生物分子可以是蛋白质。
可以使用器件上的电极的子集来分配、移动、分裂或组合液滴。
公开了一种用于在数字微流体器件中无细胞表达肽或蛋白的方法，其中所述方法包括一个或多个液滴，所述一个或多个液滴含有核酸模板和在填充油的环境中的具有用于蛋白表达的组分的无细胞系统，其中所述油含有表面活性剂，并且使用介质上电润湿(EWoD)来移动所述液滴。
无细胞系统可以是用于蛋白表达的无细胞提取物。无细胞系统可以由单独的试剂制备。所述方法可以合并液滴。例如，将含有核酸质粒的第一液滴与含有具有用于蛋白表达的组分的无细胞系统的第二液滴合并，以在微流体器件上形成组合的液滴。所述方法可以针对具有不同核酸模板的多个液滴进行。例如，将含有核酸模板的多个第一液滴与含有具有用于蛋白表达的组分的无细胞系统的多个第二液滴合并，以形成能够进行无细胞蛋白合成的多个组合的液滴。
所述方法可以分裂液滴。分裂的液滴可以进一步合并，例如与用于筛选的添加剂液滴合并。可以例如使用光学手段，如荧光或发光来分析液滴。例如，可以通过光学手段检测所表达的肽或蛋白。
公开了一种用于在数字微流体器件中无细胞表达肽或蛋白的方法，所述数字微流体器件具有包含表面活性剂的填充油的环境，所述方法包括：
a.取多个具有不同核酸模板的液滴，
b.取各自含有具有用于蛋白表达的组分的无细胞系统的多个液滴，
c.利用介质上电润湿现象合并a的液滴和b的液滴，以产生能够表达不同序列的蛋白的多个液滴，
d.混合液滴以实现无细胞蛋白表达，和
e.检测单个液滴内蛋白的表达。
公开了一种方法，其中将能够表达不同序列的蛋白的液滴与用于筛选蛋白表达水平的添加剂液滴合并。
公开了一种用于制备多种肽或蛋白的试剂盒，其包含
a.数字微流体器件；
b.试剂源，所述试剂源产生多个含有具有用于蛋白表达的组分的无细胞系统的液滴；和
c.油，任选为矿物油、硅油、基于烷基的溶剂如癸烷或十二烷、或者氟化油，或其混合物，其中所述油含有表面活性剂。
公开了一种用于制备多种肽或蛋白的试剂盒，其包含
a.数字微流体器件；
b.试剂源，所述试剂源用于产生含有具有用于蛋白表达的组分的无细胞系统和第一表面活性剂的多个液滴；和
c.油，任选为矿物油、硅油、基于烷基的溶剂如癸烷或十二烷、或者氟化油，或其混合物，其中所述油含有第二表面活性剂。
试剂盒还可以包含核糖体、酶、起始因子、核苷酸单体、氨基酸单体、金属离子和能量源。在试剂盒中，表面活性剂可以是非离子型的，例如Span85。
公开了一种试剂盒，其具有含有Pluronic F127的试剂液滴，所述试剂液滴在含有Span85的油中。油可以是八甲基环四硅氧烷(CTS)、十甲基四硅氧烷(DMTS)或十二甲基五硅氧烷(DMPS)。
本文公开了一种用于监测数字微流体器件上的液滴中的无细胞蛋白合成的方法，其包括
a.与肽标签融合的感兴趣的蛋白的无细胞转录和翻译；和
b.使用另外的多肽监测肽标签的存在，所述另外的多肽在肽标签存在的情况下产生可检测信号。
术语“体外”和“无细胞”的使用在本文中可以互换使用。
可检测信号可以是例如荧光或发光。可检测信号还可以由配体与融合至感兴趣的蛋白的互补寡肽、肽或多肽标签的结合引起。可检测信号还可以由多肽检测物与融合至His标签的感兴趣的蛋白的结合引起。
可以使用任何体外转录和翻译，例如来源于兔网织红细胞裂解物、中国仓鼠卵巢裂解物、小麦胚芽、HEK293裂解物、大肠杆菌裂解物、酵母裂解物的基于提取物的系统。
供选择地，体外转录和翻译可以由纯化的组分，例如纯化的重组元件的系统(PURE)组装而成。
体外转录和翻译可以是偶联的或非偶联的。
肽标签可以是荧光蛋白的一个组分并且另外的多肽可以是荧光蛋白的互补部分。荧光蛋白可包括sfGFP、GFP、eGFP、ccGFP、deGFP、frGFP、eYFP、eBFP、eCFP、Citrine、Venus、Cerulean、Dronpa、DsRED、mKate、mCherry、mRFP、FAST、SmURFP、miRFP670nano。例如，肽标签可以是GFP11，并且另外的多肽可以是GFP1-10。肽标签可以是sfCherry的一种组分。肽标签可以是sfCherry11，并且另外的多肽可以是sfCherry1-10。在存在羟基亚苄基罗丹宁类似物的情况下，肽标签可以是CFAST11或CFAST10，并且另外的多肽可以是NFAST。
例如，GFP1-10多肽氨基酸序列可源自sfGFP：
MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEK
供选择地，GFP1-10多肽氨基酸序列可由上述序列进一步突变，以在互补时更快地变得更亮：
MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATIGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGKYKTRAVVKFEGDTLVNRIELKGTDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFTVRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQTVLSKDPNEK
供选择地，GFP1-10多肽氨基酸序列可以由上述序列进一步突变以具有改善的特性，如更高的溶解度或改善的表达。
互补的GFP11肽氨基酸序列可以是如下：
1.KRDHMVLLEFVTAAGITGT
2.KRDHMVLHEFVTAAGITGT
3.KRDHMVLHESVNAAGIT
4.RDHMVLHEYVNAAGIT
5.GDAVQIQEHAVAKYFTV
6.GDTVQLQEHAVAKYFTV
7.GETIQLQEHAVAKYFTE
GFP11或GFP1-10可以通过氨基酸接头与感兴趣的蛋白融合。在一个实施方案中，寡肽、肽或多肽接头可以是0-50个氨基酸。
例如，sfCherry1-10多肽氨基酸序列可以是：
MEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGHPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFTWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLLGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERMYPEDGALKGEINQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVDIKLDITSHNED
互补的sfCherry11肽氨基酸序列可以是：
YTIVEQYERAEGRHSTGG
sfCherry11或sfCherry1-10可以通过氨基酸接头与感兴趣的蛋白融合。在一个实施方案中，寡肽、肽或多肽接头可以是0-50个氨基酸。
例如，NFAST多肽氨基酸序列可以是：
MEHVAFGSEDIENTLAKMDDGQLDGLAFGAIQLDGDGNILQYNAAEGDITGRDPKQVIGKNFFKDVAPGTDSPEFYGKFKEGVASGNLNTMFEWMIPTSRGPTKVKVHMKKALS
互补的CFAST11肽氨基酸序列可以是：
GDSYWVFVKRV
或者互补的CFAST10肽氨基酸序列可以是：
GDSYWVFVKR
NFAST、CFAST11和/或CFAST10可以通过氨基酸接头与感兴趣的蛋白融合。在一个实施方案中，寡肽、肽或多肽接头可以是0-50个氨基酸。
肽标签还可以是形成可检测底物，如发光底物或生色底物的蛋白的一种组分。所述蛋白可包括β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶或荧光素酶。
所述蛋白可以与多个标签融合。例如，所述蛋白可以与多个GFP11肽标签融合，并且合成在多个GFP1-10多肽存在的情况下发生。例如，所述蛋白可以与多个sfCherry11肽标签融合，并且合成在多个sfCherry1-10多肽存在的情况下发生。感兴趣的蛋白可以与一个或多个sfCherry11肽标签和一个或多个GFP11肽标签融合，并且合成在一个或多个GFP1-10多肽和一个或多个sfCherry1-10多肽存在的情况下发生。
可以合成任何感兴趣的蛋白。所述蛋白可以是酶，例如末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)或其截短型、或其它物种中的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的同源氨基酸序列、或任何物种的Polμ、Polβ、Polλ和Polθ的同源氨基酸序列、或任何物种的X家族聚合酶的同源氨基酸序列。
合成可以在微流体器件，例如介质上电润湿(EWoD)器件上进行。
附图简述
图1显示当使用含Span85的十二烷作为油相时，每个液滴尺寸(以像素尺寸计)的成功分配情况。含1％重量/重量的Span85的十二烷是用于分配小CFPS液滴的表现最佳的浓度。
图2显示用于生成图1中的数据的代表性图像。将46μl的Span85(Sigma，#57135-250mL)添加到5ml的十二烷(Sigma，#297879-100mL)中以构成油相(含1％重量/重量的Span85的十二烷)。(A)来自软件的分配指令，用以从一系列储液器中生成范围从4x4至8x8的液滴。4x4和6x6液滴显示100％的成功分配，而8x8液滴获得11％的成功分配。中间的右手侧储液器变空。(B)分配在含1％重量/重量的Span85的十二烷上的CFPS液滴。(C)分配在DMF上的未稀释CFPS保留全部功能性，如通过表达GFP构建体的裂解物的强荧光所证明的。中间的左手侧加载有缺乏DNA构建体的阴性CFPS对照，因此分配的液滴不显示荧光。图像是在10个分配液滴周期和在室温下孵育3小时后拍摄的。
图3显示了各种水性试剂的分配。在含1％的Span85的十二烷中成功分配CFPS的配套试剂，所述试剂常规地用于对不同蛋白进行溶解度和表达能力测试：HNG缓冲液(50mMHEPES pH7.4、100mM NaCl、5％体积/体积甘油)、GFP1-10(1至10mg/ml，在不同的缓冲液中)，在HNG缓冲液中与GFP11标签融合的蛋白。
图4显示在Tween20和Span85系统之间sfGFP在DMF上的分配和表达能力的比较。在DMF上，在含1％重量/重量的Span85的十二烷中未稀释CFPS液滴比十二烷中表面活性剂稀释的CFPS反应液滴(即，其中水性液滴含有Tween20)显示出显著更可靠和更高的表达量。
图5示意性地显示本发明的一个实施方案。无细胞蛋白合成反应包含核酸模板，所述核酸模板含有与可检测标签融合的感兴趣的基因的表达盒，然后通过偶联或非偶联的体外转录和体外翻译将其表达为感兴趣的蛋白。因此，感兴趣的蛋白在N末端或C末端与可检测的肽标签融合。可检测的肽标签的性质是它可以与互补多肽互补，产生发荧光的蛋白。
图6显示(A)含有无细胞蛋白合成裂解物的数字微流体器件上的液滴。用白色箭头注释的液滴已与重组GFP1-10检测物多肽(t＝0)合并。顶部两排另外包含用于表达带有GFP11肽标签的蛋白的DNA构建体(实心白色箭头)。(B)显示六小时过后与图(A)中相同的液滴的荧光图像。仅含有带有GFP11肽标签的表达的蛋白和重组GFP1-10检测物多肽两者的液滴(即实心箭头)显示显著的荧光增加。没有DNA构建体(空心箭头)或没有GFP1-10检测物(无箭头)的液滴是不发荧光的。(C)图(B)中的液滴的荧光定量。仅含有裂解物、DNA构建体和GFP1-10检测物多肽的液滴显示显著的荧光增加，表明蛋白表达。阴性对照，即(B)中的底端行液滴不包含DNA构建体，因此即使在GFP1-10检测物存在的情况下，荧光也低。(B)中的液滴和(C)中的条的编号匹配。
图7从时间进程实验提取的图像，在所述时间进程实验中将无细胞蛋白合成(CFPS)裂解物的液滴在数字微流体器件上孵育4小时并定期成像，所述液滴任选地具有感兴趣的蛋白的DNA构建体(POI-这里其是用GFP11肽标记的麦芽糖结合蛋白(MBP))和/或GFP1-10多肽。在实验过程中，只有含有裂解物、DNA构建体和GFP1-10多肽的液滴显示出显著的荧光增加，如右手侧图像栏中所见的。
图8显示在图7中存在的液滴中看到的实时荧光增加。使用“图像J”进行荧光的定量，并且已经通过减去CFPS裂解物和GFP1-10的液滴(即没有DNA构建体，因此没有表达的感兴趣的蛋白POI)中看到的背景荧光对显示的值进行归一化。只有含有所有组分—裂解物、POI的DNA构建体和GFP1-10多肽—的液滴才相对于背景产生荧光。
图9在该实验中，将重组纯化的GFP1-10检测物与编码GFP11标记的蛋白的DNA构建体同时添加到无细胞裂解物中。在酶标仪中随时间监测荧光信号。图显示根据CFPS反应的酶标仪测量值，荧光信号随时间增加。GFP1-10检测物从开始就存在于所有三个反应中，使得能够实时检测蛋白表达。在具有与GFP11标签融合的感兴趣的蛋白的两种条件下，与其中没有GFP11标记的蛋白的阴性对照条件相比，荧光增加。POI1是一种工程化的末端转移酶，POI2是SARS-COV-NL63-Mpro。两者在N末端都有3xGFP11标签。
图7-9说明蛋白表达的实时检测。GFP1-10检测物多肽从实验开始就存在。荧光信号随着GFP11标签被表达而增加。这些实验是在基液中进行的，所述基液包含含0.2％的Span85的十二甲基五硅氧烷，而不是含Tween20的水性基液，以及十二烷中没有表面活性剂。
图10说明GFP11标签与重组GFP1-10检测物的互补在0.1％重量/体积的Tween20表面活性剂存在下受到抑制。互补试验在TNG缓冲液(50mM Tris，pH 7.4，0.1M NaCl，10％体积/体积的甘油)中进行。在29℃下孵育24小时后测量荧光。前四对是对照：sfGFP和deGFP是完整的荧光蛋白，而MBP-GFP11和GFP1-10是部分荧光蛋白(分别是标签和检测物)，因此不显示荧光。十个样品对具有相同量的MBP-GFP11，但重组GFP1-10检测物多肽的摩尔过量增加。数据还显示，增加GFP1-10检测物多肽相对于GFP11肽标签的摩尔过量导致荧光信号增强，并且由于蛋白组装水平较低，Tween的存在显著影响信号。
图11说明GFP11标签与重组GFP1-10检测物的互补在0.1％重量/体积的Tween20表面活性剂存在的情况下受到抑制。互补试验在无细胞的裂解物(σ70Linear Master Mix，Arbor Bioscience)中进行。孵育24小时后使用酶标仪测量荧光。前四对是对照：sfGFP和deGFP是完整的荧光蛋白，而MBP-GFP11和GFP1-10是部分荧光蛋白(分别是标签和检测物)，因此不显示荧光。三个样品对具有相同量的MBP-GFP11，但重组GFP1-10检测物多肽的摩尔过量增加。
图12显示一系列图像(1-3)，说明八个具有校准结构的水性储液器的形成，所述水性储液器由排气多通道移液器驱动。箭头显示在储液器上形成校准结构。加载的水相的体积为5μL，包括要形成的储液器和校准结构两者。主储液器的致动区域的尺寸为30x28像素，每个校准结构的致动区域尺寸为6x6像素。填充储液器所需的时间为120秒。加载的水性试剂为含0.05％重量/重量的Pluronic F127的水性缓冲液，其具有红色食用色素以帮助可视化(1:1稀释)。器件中的填充液为含0.1％的span85的十二甲基五硅氧烷(DMPS)。图像(4)显示在储液器填充期间发送到器件上的电极的电致动模式的快照，其中白色代表具有所施加的电位的电极。校准结构如图像上的箭头所示。图4图像(1)显示涂有填充液的DMF器件。图4图像(2)显示储液器加载的初始阶段。图4图像(3)显示两个填充至正确体积的储液器(两个校准结构均可见)，而其它储液器仍处于在器件上形成的过程中。
图13显示来自EWoD器件的代表性图像，所述图像比较在作为油相的具有0.1％的Span85的十二烷基液中0.05％体积/体积的水性表面活性剂：F127、Tween80、F68的性能。图像表明，当从储液器分配液滴时，F127比F68更好，并且与Tween80相当。第一个图像显示试剂位置。第二个显示不同尺寸的试剂液滴。第三个和第四个图像显示开始和结束像素驱动位置。
图14显示一系列随时间的分配。在长时间段内，F127是唯一实现适当的分配的清洁剂(中排)。将两种不同的水性试剂(LS70和GFP1-10)和三种清洁剂就0、4和20小时时的分配进行比较。作为油相的具有0.1％的Span85的十二烷基液，与3X的0.05％的水性表面活性剂进行比较。零时间时，Tween80和F127均等分配。4小时和20小时后，Tween80中的LS70无法分配，而F127继续运行。
图15显示图14的实验结束时的生物淤积。F68和Tween80显示来自具有GFP1-10的水性试剂的显著的蛋白生物淤积。F127(中心的圆)具有较低水平的生物淤积。
图16显示随F127浓度变化的sfGFP表达的管内筛选。较高水平的清洁剂抑制蛋白表达水平。基本结论是，清洁剂有益于液滴操纵和装置处理，但不利于生化过程。因此，应优化特定清洁剂的浓度。
图17显示电润湿器件上的液滴中sfGFP的表达。数据表明0.025％和0.05％ F127之间的产量没有显著差异。DMPS/0.1％ Span85用作基液。蛋白产量0.05％ F127：0.56mg/mL；0.025％ F127：0.56mg/mL。器件外产量：0.05％：0.72mg/mL；0.025％：0.67mg/mL。降低水性相中的Pluronic F127浓度不导致器件上蛋白产量的增加。因此，与Tween表面活性剂不同，Pluronic表面活性剂的存在不妨碍蛋白表达的检测。
图18显示来自三种不同水性试剂(裂解物、LEC(线性表达构建体，即DNA)和GFP1-10)的固定且相同尺寸的几个分配的液滴(在时间点＝20小时)，所述液滴含有两种不同浓度0.05％和0.01％体积/体积的F127。基液是含有0.1％的Span85的作为油的DMPS。中间和底部图像显示实验结束时仅LS70在0.01％的F127的情况下有生物淤积。
发明详述
本文公开了一种数字微流体器件，其包括平面电极的二维阵列，其中所述器件包括在主体油相内的水性液滴群，所述水性液滴群含有生物分子，其中所述主体油相含有表面活性剂。发明人已经认识到，两种或更多种表面活性剂的组合是有益的，一种在水层中，一种在油层中。
本文公开了一种用于监测在数字微流体器件上的液滴中的无细胞蛋白合成的方法，其包括
a.与肽标签融合的感兴趣的蛋白的无细胞转录和翻译；和
b.使用另外的多肽监测肽标签的存在，所述另外的多肽在肽标签存在的情况下产生可检测信号。
公开了一种用于在数字微流体器件中无细胞表达肽或蛋白的方法。具有无细胞蛋白合成(CFPS)，也称为体外蛋白合成所需的组分的液滴可以通过电运动来操纵，用以影响和改善蛋白表达。液滴通常缺乏表面活性剂，超过与油层平衡的表面活性剂。
本文描述了实现在数字微流体器件中无细胞表达肽或蛋白的改进的方法。包括一种用于在微流体器件中无细胞表达肽或蛋白的方法，其中所述方法包括一个或多个液滴，所述一个或多个液滴含有核酸模板(即DNA或RNA)和在填充油的环境中的具有用于蛋白表达的组分的无细胞系统，并使用电运动来移动所述液滴。无细胞蛋白合成液滴的组分可以在引入数字微流体器件之前预混合或在数字微流体器件上混合。油层含有器件上所需的表面活性剂。
在表达蛋白的同时，可以重复移动液滴至少30分钟的时间。在表达蛋白的同时，可以重复移动液滴至少两个小时的时间。在表达蛋白的同时，可以重复移动液滴至少十二个小时的时间。移动液滴的动作使得氧被供应到液滴并分散在整个液滴中。移动的动作相对于保持静止的液滴改善蛋白表达的水平。
可使用任何电运动手段来移动液滴。可使用介质上电润湿(EWoD)移动液滴。EWoD或光学EWoD器件上的电信号可以通过分段电极、有源矩阵薄膜晶体管或数字微镜传递。
器件中的油可以是任何水不混溶液体。油可以是矿物油、硅油如十二甲基五硅氧烷、基于烷基的溶剂如癸烷或十二烷、或氟化油。可以在表达过程之前或在表达过程期间对油进行充氧。
硅油可以是八甲基环四硅氧烷(CTS)、十甲基四硅氧烷(DMTS)或十二甲基五硅氧烷(DMPS)。
水层中的表面活性剂可以是Pluronic表面活性剂。Pluronic表面活性剂也称为泊洛沙姆，是一类合成嵌段共聚物，其由亲水性聚环氧乙烷(PEO)和疏水性聚(环氧丙烷)(PPO)组成，以ABA三嵌段结构排列，从而得到PEO-PPO-PEO。表面活性剂可以是PluronicF127。
Pluronic表面活性剂可以以小于0.1％的量存在。高水平的表面活性剂有害于蛋白表达的检测。Pluronic浓度可为0.025％至0.1％。浓度可以是0.05％。
公开了一种组合物及其在包括蛋白表达的电润湿应用中的用途，所述组合物包含含0.05％重量/重量的Pluronic F127的水性缓冲液，所述水性缓冲液在含0.1％的span85的十二甲基五硅氧烷(DMPS)的填充流体中。
可以向液滴供应补充氧源。例如，可将含有气态氧或溶解氧的液滴或气泡在蛋白表达期间与液滴合并。另外，通过给用作填充介质的油充氧可以找到补充氧源。本领域众所周知的是，油诸如十六烷、HFE-7500等可以被充氧以支持细胞生长、尤其是大肠杆菌细胞生长的氧需求(RSC Adv.，2017,7,40990-40995)。充氧可以通过用纯氧或大气空气向油充气来实现。
液滴可以在进入微流体器件之前形成并流入器件中。供选择地，液滴可以在器件上合并。包括一种方法，所述方法包括将含有核酸模板，如质粒的第一液滴与含有具有用于蛋白表达的组分的无细胞提取物的第二液滴合并，以形成能够进行无细胞蛋白合成的组合的液滴。
液滴可以在表达之前或之后在器件上分裂。本文包括一种方法，所述方法还包括将水性液滴分裂成多个液滴。如果需要，可以采用其它添加剂筛选分裂的液滴。包括一种方法，其中一个或多个分裂的液滴与用于筛选的添加剂液滴合并。
肽或蛋白的无细胞表达可以使用具有能够实现蛋白表达的试剂的细胞裂解物。无细胞反应的常见组分包括能量源、氨基酸供应、辅助因子如镁以及相关酶。通过裂解感兴趣的细胞并离心除去细胞壁、DNA基因组和其它碎片来获得细胞提取物。剩余的是细胞机器，包括核糖体、氨酰基-tRNA合成酶、翻译起始和延伸因子、核酸酶等。一旦添加合适的核酸模板，就可以使用细胞来源的表达机器将核酸模板表达为肽或蛋白。
可以使用本文描述的系统表达任何特定的核酸模板。CFPS中使用的三种类型的核酸模板包括质粒、线性表达模板(LET)和mRNA。质粒是圆形模板，其可以在细胞中或经合成产生。LET可以通过PCR制备。虽然LET的制作更容易、更快速，但在CFPS中质粒产量通常更高。mRNA可以通过体外转录系统产生。所述方法采用每个液滴单个核酸模板。所述方法可以使用每个液滴具有不同核酸模板的多个液滴。
能量源是无细胞反应的重要部分。通常，将含有所需的能量源的单独混合物以及氨基酸供应添加到提取物中进行反应。常见来源是磷酸烯醇丙酮酸、乙酰磷酸和磷酸肌酸。可以通过在表达过程中向液滴中添加其它试剂在该过程中补充能量源。
具有用于蛋白表达的组分的无细胞提取物包含除核酸模板之外的蛋白表达所需的一切。因此，该术语包括所有相关的核糖体、酶、起始因子、核苷酸单体、氨基酸单体、金属离子和能量源。一旦添加核酸模板，在不需要其它试剂的情况下就开始蛋白表达。
因此，在添加模板之前，可以向细胞裂解物补充另外的试剂。具有用于蛋白表达的组分的无细胞提取物通常将作为主体试剂或“主混合物”产生，其可以在将不同的模板分别添加到不同的液滴中之前被配制成许多相同的液滴。目前使用的常见细胞提取物是由大肠杆菌(ECE)、兔网织红细胞(RRL)、小麦胚芽(WGE)、昆虫细胞(ICE)和克鲁维酵母属酵母(D2P系统)制成的。所有这些提取物均可商购。
无细胞系统可以由所需的试剂组装，而不是源自细胞提取物。基于重构的、纯化的分子试剂的系统，例如用于蛋白生产的PURE系统可商购，并且可以按所供应的原样使用。PURE系统由参与转录和翻译的所有酶以及高度纯化的70S核糖体组成。PURE系统的蛋白合成反应缺乏蛋白酶和核糖核酸酶，所述酶通常作为细胞提取物中不需要的分子存在。
术语“数字微流体器件”是指具有平面微电极的二维阵列的器件。该术语不包括仅具有在通道中的油流中的液滴的任何器件。通过激活特定电极，液滴通过电运动力在表面上移动。一旦激活电极，介电层就变得更不疏水，从而导致液滴扩散到表面上。数字微流体(DMF)器件设置是本领域已知的，并且取决于所使用的基底、电极、那些电极的配置、介电材料的使用、该介电材料的厚度、疏水层和施加的电压。
一旦CFPS试剂已被封装在液滴中，就可以通过将原始液滴与第二液滴合并来供应另外的试剂。第二液滴可以携带任何期望的另外试剂，包括例如氧源或“动力”源，或希望暴露于所表达的蛋白的测试试剂。
液滴可以是水性液滴。液滴可含有油不混溶的有机溶剂，例如DMSO。液滴可以是水和溶剂的混合物，前提是液滴不溶解到主体油中。
因此，在将核酸模板添加至液滴之前，含有具有用于蛋白表达的组分的无细胞提取物的液滴将通常处于油填充的环境中。可以通过在微流体器件上合并液滴来添加模板。供选择地，可以将模板添加到器件外部的液滴中，然后使其流入器件中进行表达过程。例如，可以通过升高温度在器件上开启表达过程。表达系统通常在高于标准室温的温度下，例如在29℃或高于29℃下最佳地运行。
表达过程通常耗费许多个小时。因此，所述过程应该保持至少30分钟或1小时，通常至少2小时。表达可以保持至少12小时。在表达过程中，液滴应在器件内移动。通过混合试剂并确保液滴内有足够的氧可用，移动改善所述过程。移动可以是连续的，或者可以带有不移动的干预期重复移动。
因此，在表达蛋白的同时，水性液滴可以重复移动至少30分钟或一小时的时间。在表达蛋白的同时，水性液滴可以重复移动至少两个小时的时间。在表达蛋白的同时，水性液滴可以重复移动至少十二个小时的时间。移动液滴的动作实现在液滴内的混合，并且实现将氧或其它试剂供应到液滴。移动的动作相对于保持静止的液滴改善蛋白表达的水平。
数字微流体(DMF)是指用于芯片上实验室系统的二维平坦表面平台，所述芯片上实验室系统基于对微滴的操纵。可以在具有一组绝缘电极的平台上分配液滴、移动液滴、存储液滴、混合液滴、使液滴反应或分析液滴。数字微流体可以与分析性分析过程，如质谱、比色法、电化学和电化学发光一起使用。
可以使用任何电运动手段来移动液滴。可以使用介质上电润湿(EWoD)来移动水性液滴。介质上电润湿(EWoD)是基于介电材料的电润湿现象的变型。在EWoD过程中，导电液体的液滴被放置在具有绝缘和疏水特性的介电层上。一旦激活电极，介电层就变得较不疏水，从而导致液滴扩散到表面上。
EWoD或光激活非晶硅(a-Si)EWoD器件上的电信号可以通过分段电极、有源矩阵薄膜晶体管或数字微镜传递。光学激活的s-Si EWoD器件在本领域中是众所周知用于致动液滴的(J.Adhes.Sci.Technol.,2012,26,1747-1771)。
可以向液滴供应补充氧源。例如，可将含有气态氧或溶解氧的液滴或气泡在蛋白表达期间与水性液滴合并。供选择地，氧源可以是释放氧的分子源。供选择地，可以将液滴移动到空气/液体边界以使得来自气态环境的氧扩散增加。供选择地，可以给油充氧。
液滴可以在进入微流体器件之前形成并流入器件中。供选择地，液滴可以在器件上合并。包括一种方法，所述方法包括将含有核酸模板，如质粒的第一液滴与含有具有用于蛋白表达的组分的无细胞系统的第二液滴合并以形成液滴。
液滴可以在表达之前、期间或之后在器件上分裂。本文包括一种进一步包括将液滴分裂成多个液滴的方法。如果需要，可以用其它添加剂筛选分裂的液滴。包括一种方法，其中将一个或多个分裂的液滴与用于筛选的添加剂液滴合并。
通过亲和标签，如FLAG标签、HIS标签、GST标签、MBP标签、STREP标签或其它形式的亲和标签，CFPS表达的蛋白可以固定到固体载体亲和树脂上，并且新鲜批次的CFPS试剂可以在所述树脂上递送。因此，更新的试剂可用于进行蛋白合成，贴近地模仿连续流(CF)和连续交换(CE)CFPS的工业方法。通过模仿CF-CFPS和CE-CFPS，用户可以扩大其CFPS生产方法。
可以在数字微流体器件的疏水性表面上致动液滴(ACS Nano 2018,12,6,6050-6058)。疏水性表面可以是如聚四氟乙烯(PTFE)、Teflon AF(DuPont Inc)、CYTOP(AGCChemicals Inc)或FluoroPel(Cytonix LLC)的疏水性表面。疏水性表面可以以减少生物淤积、尤其是由于暴露于CFPS试剂或核酸试剂而导致的生物淤积的方式进行改性。疏水性表面也可以是超疏水的，如NeverWet(NeverWet LLC)或Ultra-Ever Dry(FlotechPerformance Systems Ltd)。与典型的基于碳氟化合物的疏水性表面相比，超疏水性表面防止生物淤积。因此，超疏水性表面延长数字微流体器件移动CFPS液滴和含有生物聚合物的通用溶液的能力(RSC Adv.,2017,7,49633-49648)。疏水性表面也可以是光滑的液体灌注的多孔表面(SLIPS)，其可以通过Krtox-103油(DuPont)灌注多孔PTFE膜而形成(LabChip,2019,19,2275)。对于介质上的电润湿(EWoD)，施加电势时试剂接触角的变化是表面张力的反函数。因此，对于低电压EWoD操作，通过向试剂中添加表面活性剂来实现表面张力的降低，这对于CFPS反应意味着向裂解物和向DNA添加表面活性剂。这导致裂解物的稀释，并且在实验中已经发现，稀释裂解物导致感兴趣的蛋白的表达水平降低。因此，在DMF上进行CFPS，其中将表面活性剂添加到正在被移动的溶液中，将必然导致裂解物的稀释和因此的蛋白表达水平的降低。除了其本身就是一个问题之外，这还使将DMF上的结果外推到蛋白产量的管内预测复杂化。不得不向样品中添加表面活性剂的另一个危害是，这增加样品制备所需的时间，以及增加由于“用户错误”而导致结果不一致的可能性，因为存在更多的试剂处理。不得不向样品中添加表面活性剂的另一个危害是某些下游操作受到阻碍。例如，如果感兴趣的蛋白在具有GFP11(或类似的)肽标签的无细胞系统中表达，则在存在表面活性剂的情况下，其与GFP1-10检测物多肽的下游互补受到阻碍。
不向水性样品中添加表面活性剂，反而可以向油中添加表面活性剂，如Span85(例如https://www.sigmaaldrich.com/GB/en/product/mm/840124)。这具有使CFPS反应能够在DMF上进行，而无稀释或掺杂的优点。另外，它简化用于建立反应的样品制备过程，提高易用性和结果的一致性。使用含1％重量/重量Span85的十二烷实现在DMF上的免稀释CFPS反应，以及表达的非荧光蛋白的免稀释检测。可以使用除Span85之外的其它表面活性剂和除十二烷之外的油。可以使用一系列浓度的Span85。表面活性剂可以是非离子的、阴离子的、阳离子的、两性的。油可以是矿物油或合成油，包括硅油、石油和全氟化油。表面活性剂可对(1)CFPS反应和(2)检测系统的效率(如果检测系统涉及标签和检测物的互补)有有害影响。例如，通过使用油-表面活性剂混合物在DMF上进行CFPS反应，表达的蛋白的检测也可以在不稀释和不添加水性表面活性剂的情况下进行。已经表明，表面活性剂降低一些检测系统，包括但不限于Split GFP系统的效率，因此从试剂混合物中除去表面活性剂而将它们添加到油中可能是有益的。
填充流体可以被选择为具有与液滴相或与液滴微致动器表面的特定表面张力或界面张力。可以将表面活性剂添加到填充流体中以稳定可能存在于液滴和固相之间的液膜。合适的表面活性剂的实例包括非离子低HLB(亲水-亲脂平衡的)表面活性剂。HLB优选小于约10或小于约5。合适的实例包括：Triton X-15(HLB＝4.9)(辛基酚乙氧基化物)；Span85(HLB 1.8)(脱水山梨糖醇三油酸酯)；Span 65(2.1)(脱水山梨糖醇三硬脂酸酯)；Span83(3.7)(脱水山梨糖醇倍半油酸酯)；Span 80(4.3)(脱水山梨糖醇单油酸酯)；Span 60(4.7)(脱水山梨糖醇单硬脂酸酯)；和氟化表面活性剂。
肽标签可以连接至蛋白的C末端或N末端。肽标签可以是绿色荧光蛋白(GFP)的一种组分。例如，肽标签可以是GFP11和另外的多肽可以是GFP1-10。肽标签可以是sfCherry的一种组分。肽标签可以是sfCherry11和另外的多肽可以是sfCherry1-10。
蛋白可以与多个标签融合。例如，蛋白可以与多个GFP11肽标签融合，并且合成在多个GFP1-10多肽存在的情况下发生。例如，蛋白可以与多个sfCherry11肽标签融合，并且合成在多个sfCherry1-10多肽存在的情况下发生。感兴趣的蛋白可以与一个或多个sfCherry11肽标签和一个或多个GFP11肽标签融合，并且合成在一个或多个GFP1-10多肽和一个或多个sfCherry1-10多肽存在的情况下发生。
通过从水层中除去表面活性剂而改进的试验可包括核酸合成、核酸构建或蛋白/蛋白相互作用。
器件
通过施加电势来操纵液滴可以在覆盖有绝缘体或电介质或一系列绝缘体或电介质的电极上实现。由于施加的电势导致的液滴操纵称为电润湿。发生电运动是由于不均匀电场，其影响介电液体的静力平衡(介电电泳或DEP)或液体在固体表面上的接触角的变化(介电上电润湿或EWoD)。DEP还可用于在可极化粒子上产生力以诱导其移动。电信号可以被传输到离散电极、晶体管、晶体管阵列或半导体膜片，其电特性可以通过光信号进行调制。
当液滴在覆盖有疏水性绝缘体或电介质的两个平行电极之间被致动时，发生EWoD现象。电极-电解质界面处的电场诱导表面张力的变化，其由于液滴接触角的变化导致液滴运动。电润湿效应可以使用Young-Lippmann方程定量处理：
cosθ-cosθ0＝(1/2γLG)c.V2
其中θ0是跨界面层的电场为零时的接触角，γLG是液-气张力，c是比电容(作为εr.ε0/t给出，其中εr是绝缘体/电介质的介电常数，ε0是真空的介电常数，t是厚度)，V是施加的电压或电势。因此，接触角的变化(诱导液滴运动)是表面张力、电势、电介质厚度和介电常数的函数。
当液滴被EwoD致动时，有两组相反的力作用在其上：电场诱导的电润湿力和阻力，其包括液滴与填充介质的相互作用和接触线摩擦产生的拖拽力(参考)。用于平衡电润湿力与所有拖曳力的总和的最小电压(阈值电压)由绝缘体/电介质的厚度与电介质接触比(t/εr)1/2可变地确定。因此，为了降低致动电压，需要降低(t/εr)1/2(即增加介电常数或减小绝缘体/电介质厚度)。为了实现低电压致动，必须使用薄绝缘体/介电层。然而，高质量薄绝缘体/介电层的沉积是一项技术挑战，并且在实现所期望的电润湿接触角足够大以驱动液滴之前，这些薄层很容易被损坏。因此，大多数学术研究报告在易于制造的厚介电薄膜(>3μm)上使用>100V的高得多的电压来实现电润湿。
具有厚介电膜的高压基于EWoD的器件在很大程度上由于其有限的液滴复用能力而具有有限的工业适用性。包括薄膜晶体管(TFT)和光激活的非晶硅层(a-Si)在内的低压器件的使用已经为基于EWoD的器件的工业应用铺平了道路，这是由于它们在以高度复用方式处理电信号方面具有更大的灵活性。TFT或光激活的a-Si的驱动电压低(通常<15V)。低压器件的制造和因此的应用的瓶颈已经是沉积高质量薄膜绝缘体/电介质的技术挑战。因此，已经特别需要改进薄膜绝缘体/电介质器件的制造和组成。
通常，用于EWoD的电极(或阵列元件)覆盖有(i)亲水性绝缘体/电介质和疏水性涂层或(ii)疏水性绝缘体/电介质。常用的疏水性涂层包含含氟聚合物，如Teflon AF 1600或CYTOP。作为电介质上的疏水性涂层的这种材料的厚度通常<100nm，并且可能具有针孔或多孔结构形式的缺陷；因此，绝缘体/电介质没有针孔以避免电路短路尤为重要。特氟龙也已经被用作绝缘体/电介质，但由于其低介电常数和使其无针孔所需的厚度，它具有更高的电压要求。其它疏水性绝缘体/介电材料可包括基于聚合物的电介质，如基于硅氧烷、环氧树脂(例如SU-8)或聚对二甲苯(例如聚对二甲苯N、聚对二甲苯C、聚对二甲苯D或聚对二甲苯HT)的电介质。由于最小的接触角滞后和与水溶液的较高接触角，特氟龙仍然被用作这些绝缘体/介电聚合物上的疏水性表面涂层。然而，可靠地生产聚对二甲苯或SU-8的<1微米的无针孔涂层存在困难；因此，这些材料的厚度通常保持在2-5微米，代价是电润湿的电压要求增加。还已经报道，对于使用细胞培养基的重复液滴操作，使用聚对二甲苯C的传统EWoD器件容易损坏且不稳定。沉积有金属氧化物和聚对二甲苯C膜的多层绝缘体器件已用于生产更坚固的绝缘体/电介质，并能够以较低的施加电压运行。无机材料，如金属氧化物和半导体氧化物，通常在CMOS行业中被用作“栅极电介质”，其已被用作EwoD器件的绝缘体/电介质。它们提供利用标准洁净室工艺进行薄膜沉积(<100nm)的优势。这些材料本来是亲水性的，需要另外的疏水性涂层，并且由于薄膜层沉积过程而易于形成针孔。连同EwoD的较低电压操作的需求，最近的开发工作已经聚焦在(1)使用具有改善的介电特性的材料(例如，使用高介电常数绝缘体/电介质)，(2)优化制造工艺以使得绝缘体/电介质无针孔，以避免介电击穿。
EwoD器件的运行遭遇接触角饱和和滞后，这被认为是由以下这些现象中的一种或组合引起的：(1)疏水膜或绝缘体/电介质界面中电荷的捕获，(2)离子的吸附，(3)热力学接触角不稳定性，(4)介电层的介电击穿，(5)电极-电极-绝缘体界面电容(由双层效应引起)，以及(6)表面的结垢(例如由生物大分子导致的)。这种滞后的不利影响之一是基于EWoD的器件的运行寿命减少。
接触角滞后被认为是几次操作后界面处或疏水性绝缘体内部电荷积累的结果。由于这种充电现象所需的致动电压增加，导致最终灾难性的介电击穿。最可能的解释是，绝缘体/电介质处的针孔可能使液体与电极接触，引起电解。容易出现针孔或多孔的疏水性绝缘体进一步促进电解。
已经针对短时间量程和采用低电导率溶液进行了大多数了解EwoD上的接触角滞后的研究。长时间致动(例如，>1小时)和高电导率溶液(例如，1M NaCl)可能产生电解以外的几种影响。溶液中的离子可以渗透通过疏水性涂层(在施加的电场下)并与下面的绝缘体/电介质相互作用。离子渗透可导致(1)由于电荷捕获(其与界面充电不同)而导致的介电常数变化，以及(2)pH敏感金属氧化物的表面电位的变化。两者都可导致操纵水性液滴的电润湿力降低，导致接触角滞后。发明人之前已经发现，通过施加电场时抑制接触角的调节，源自高电导率溶液的损害减少或使电极上不能电润湿。
电运动器件包括具有电极矩阵的第一基板，其中每个矩阵电极都耦合到薄膜晶体管，并且其中矩阵电极外涂覆有功能性涂层，所述功能性涂层包括：与矩阵电极接触的介电层，与介电层接触的保形层，以及与保形层接触的疏水层；第二基板，其包括顶部电极；设置在第一基板和第二基板之间并限定电运动工作空间的间隔件；以及可操作地耦合到矩阵电极的电压源。
介电层可包含二氧化硅、氮氧化硅、氮化硅、氧化铪、氧化钇、氧化镧、二氧化钛、氧化铝、氧化钽、硅酸铪、氧化锆、硅酸锆、钛酸钡、锆钛酸铅、钛酸锶或钛酸锶钡。介电层的厚度可为10nm至100μm。可以使用多于一种的材料的组合，并且介电层可以包括多于一个的可以具有不同材料的子层。
保形层可以包含聚对二甲苯、硅氧烷或环氧树脂。它可以是绝缘电介质和疏水性涂层之间的薄保护性聚对二甲苯涂层。通常，聚对二甲苯用作简单器件上的介电层。在本发明中，沉积聚对二甲苯的根本原因不是为了改善绝缘/介电特性，如减少针孔，而是用作为介电层和疏水层之间的共形层。发明人发现，与相同厚度的其它类似绝缘涂层，如PDMS(聚二甲基硅氧烷)相比，聚对二甲苯防止由高电导率溶液或长时间偏离中性pH的溶液引起的接触角滞后。共形层的厚度可以为10nm至100μm。
疏水层可包括含氟聚合物涂层、氟化硅烷涂层、氧化锰聚苯乙烯纳米复合材料、氧化锌聚苯乙烯纳米复合材料、沉淀的碳酸钙、碳纳米管结构、二氧化硅纳米涂层或光滑的液体灌注的多孔涂层。
元件可以包括多种阵列元件中的一个或多个，每个元件包含元件电路；离散电极；其中电特性可通过入射光调制的薄膜半导体；以及其特性可以通过入射光调制的薄膜光电导体。
功能性涂层可包括包含氮化硅的介电层、包含聚对二甲苯的保形层以及包含无定形含氟聚合物的疏水层。已发现这是特别有利的组合。
电运动器件可包括控制器以调节提供给单个矩阵电极的电压。电运动器件可包括多条扫描线和多条栅极线，其中每个薄膜晶体管耦合到扫描线和栅极线，并且多条栅极线可操作地连接到控制器。这实现单独控制所有单个的元件。
第二基板还可以包括设置在第二电极上的第二疏水层。第一基板和第二基板可以被设置为使得疏水层和第二疏水层彼此面对，从而限定疏水层之间的电运动工作空间。
所述方法特别适用于体积为1μL或更小的水性液滴。
以下显示和描述的基于EWoD的器件是有源矩阵薄膜晶体管器件，其包含具有特氟龙疏水性表面涂层的薄膜介电涂层。这些器件基于E Ink公司专利中描述的器件，所述专利以“包括具有薄膜晶体管和电容传感的双基板的数字微流体器件(Digital microfluidicdevices including dual substrate with thin-film transistors and capacitivesensing)”提交，美国专利申请号为2019/0111433，其通过引用并入本文。
本文描述了电运动器件，其包括：
具有电极矩阵的第一基板，其中每个矩阵电极耦合至薄膜晶体管，并且其中矩阵电极外涂覆有功能性涂层，所述功能性涂层包括：
与基质电极接触的介电层，
与介电层接触的共形层，和
与保形层接触的疏水层；
第二基板，其包括顶部电极；
间隔件，其设置在第一基板和第二基板之间并限定电运动工作空间；和
可操作地耦合到矩阵电极的电压源。
本文描述了一种电运动器件，其包括：
具有电极矩阵的第一基板，其中每个矩阵电极耦合至薄膜晶体管，并且其中矩阵电极外涂覆有功能性涂层，所述功能性涂层包括：
与矩阵电极接触的包含氮化硅、氧化铪或氧化铝的一个或多个介电层，
与介电层接触的包含聚对二甲苯的保形层，和
与保形层接触的疏水层；
第二基板，其包括顶部电极；
间隔件，其设置在第一基板和第二基板之间并限定电运动工作空间；和
可操作地耦合到矩阵电极的电压源。
所描述的电运动器件可与其它元件一起使用，例如与用于加热和冷却器件的装置或用于根据需要引入试剂的试剂盒一起使用。
发明的应用
本发明可用于很多种不同的应用。具体地，本发明可用于移动细胞、核酸、核酸模板、蛋白、用于核酸合成的起始寡核苷酸序列、珠、磁珠、固定在磁珠上的细胞或固定在磁珠上的生物聚合物。
在这些应用中，将具有离子强度的水性液滴设置在第一矩阵电极上和提供差别电势的步骤可以重复多次。它们可以重复超过1000次或超过10000次，有时超过24小时的时间。
核酸合成应用
本方法可用于核酸的合成，例如基于亚磷酰胺的核酸合成、模板化或非模板化酶促核酸合成，或更具体地，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的将3'-O-可逆地终止的核苷5'-三磷酸添加至5'-固定的核酸的3'-末端。在酶促核酸合成过程中，在仪器上进行以下步骤：
1.将含有TdT、任选的焦磷酸酶(PPiase)、3'-O-可逆终止的dNTP和所需的缓冲液(包含盐和必要的反应组分，如二价金属)的添加溶液带到含有固定化核酸的反应区，其中如通过磁珠经由与核酸的5'末端的共价键将核酸固定在表面上。初始固定化的核酸可称为起始寡核苷酸并且包含N个核苷酸，例如3-100个核苷酸，优选10-80个核苷酸，更优选20-65个核苷酸。起始寡核苷酸可含有切割位点，如限制性位点或非规范DNA碱基，如U或8-oxoG。添加溶液可以任选地包含磷酸盐传感器，如与MDCC荧光团缀合的大肠杆菌磷酸盐结合蛋白，以评估作为荧光输出的核酸合成的质量。dNTP可以按比例组合以生成DNA文库，如NNK合成。
2.将批量或离散液滴形式的洗涤溶液施加到反应区以洗掉添加溶液。洗涤溶液通常具有高的溶质浓度(>1M NaCl)。
3.将批量或离散液滴形式的脱保护溶液施加到反应区，以对步骤I中添加到固定化核酸区中的固定化核酸的3'-O-可逆终止子脱保护。脱保护溶液通常具有高溶质浓度。
4.将批量或离散液滴形式的洗涤溶液施加到反应区以洗去脱保护溶液。
5.重复步骤I-IV直至合成期望的序列，例如重复步骤I-IV 10次、50次、100次、200次或1000次。
本发明的方法可用于通过合成或组装来制备寡核苷酸序列。器件实现限定的序列的合成和移动。使用本方法，可以在电极上方的特定位置处修饰起始序列并制备延伸的寡核苷酸。不同位置的起始序列可以暴露于不同的核苷酸，从而在电运动器件的不同区域中合成不同的序列。
在电运动器件的不同区域中合成限定的不同序列的群后，可通过将两条或更多条合成的链连接在一起将序列进一步组装成更长的连续序列。
本文描述了一种用于制备长度至少2n个碱基的连续寡核苷酸序列的方法，所述方法包括采用本文所述的电运动器件，其具有多个固定化的起始寡核苷酸序列，其中一个或多个含有切割位点，使用起始寡核苷酸序列合成多个长度为至少n个碱基的固定化的寡核苷酸序列，使用延伸可逆阻断的核苷酸单体的循环，选择性地将长度为至少n个碱基的固定化的寡核苷酸序列中的至少两个切割到反应溶液中，同时保留一个或多个连接的固定化的寡核苷酸序列，使至少两个切割的寡核苷酸彼此杂交以形成夹板(splint)，并将夹板的一端与固定化的寡核苷酸序列之一杂交，并将至少一个切割的寡核苷酸连接到固定化的寡核苷酸序列，从而制备长度为至少2n个碱基的连续寡核苷酸序列。
合成和组装步骤可能涉及高溶质浓度，其中离子强度在没有保护性保形层的情况下会使器件劣化。
移动水性液滴的方法也可用于帮助促进肽或蛋白的无细胞表达。具体地，可以使用本发明的方法在所描述的电运动器件中移动含有核酸模板和在填充油的环境中的具有用于蛋白表达的组分的无细胞系统的液滴。
本发明可用于使盒中的液滴的移动自动化。例如，可以根据本发明移动打算用于分析的液滴。本发明可以结合到用于当地临床医生诊断的盒中。例如，在例如用于指标诸如癌症生物标志物的基因测试、例如检测血液样本中的细菌的病原体测试或者病毒检测，如冠状病毒，例如用于诊断COVID-19的SARS-CoV-2中，它可以与核酸扩增测试(NAAT)结合使用以确定核酸靶点。
器件可以进行热循环以实现核酸扩增，或者器件可以保持在期望的温度下进行等温扩增。在器件的不同区域中合成不同的序列实现在器件的不同区域中使用不同引物的多重扩增。
此外，本发明可以与下一代测序结合使用，其中通过添加核苷酸来合成DNA并对大量样品并行测序。本发明可用于准确定位下一代测序中使用的单个样品。
本发明可用于自动进行下一代测序的文库制备。例如，测序接头的连接步骤可以在器件上进行。然后，由样品扩增序列的选择性子集可以连接接头以实现对扩增的群的测序。
蛋白表达应用
移动水性液滴的方法也可用于帮助促进肽或蛋白的无细胞表达。具体地，可以使用本发明的方法在所描述的电运动器件中移动含有核酸模板和在填充油的环境中具有用于蛋白表达的组分的无细胞系统的液滴。
本文公开了一种实时监测体外蛋白合成的方法，其包括
1.与肽标签融合的感兴趣的蛋白的体外转录和翻译；和
2.使用另外的多肽监测肽标签的存在，所述另外的多肽在肽标签存在的情况下产生可检测信号。
本文公开了一种用于监测数字微流体器件上的液滴中的无细胞蛋白合成的方法，其包括
a.与肽标签融合的感兴趣的蛋白的无细胞转录和翻译；和
b.使用另外的多肽监测肽标签的存在，所述另外的多肽在肽标签存在的情况下产生可检测信号。
术语“体外”和“无细胞”的使用在本文中可以互换使用。
可检测信号可以是例如荧光或发光。可检测信号还可以由配体与融合至感兴趣的蛋白的互补的寡肽、肽或多肽标签的结合引起。
可检测信号还可以由多肽与融合至His标签的感兴趣的蛋白的结合引起。
可以使用任何体外转录和翻译，例如来源于兔网织红细胞裂解物、人裂解物、中国仓鼠卵巢裂解物、小麦胚芽、HEK293裂解物、大肠杆菌裂解物、酵母裂解物的基于提取物的系统。
供选择地，体外转录和翻译可以由纯化的组分，例如纯化的重组元件系统(PURE)组装而成。
体外转录和翻译可以是偶联的或非偶联的。
肽标签可以是荧光蛋白的一个组分并且另外的多肽可以是荧光蛋白的互补部分。荧光蛋白可包括sfGFP、GFP、ccGFP、eGFP、deGFP、frGFP、eYFP、eBFP、eCFP、Citrine、Venus、Cerulean、Dronpa、DsRED、mKate、mCherry、mRFP、FAST、SmURFP、miRFP670nano。例如，肽标签可以是GFP11，并且另外的多肽可以是GFP1-10。肽标签可以是sfCherry的一种组分。肽标签可以是sfCherry11，并且另外的多肽可以是sfCherry1-10。在存在羟基亚苄基罗丹宁类似物的情况下，肽标签可以是CFAST11或CFAST10，并且另外的多肽可以是NFAST。
肽标签还可以是形成可检测底物，如发光底物或生色底物的蛋白的一种组分。所述蛋白可包括β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶或荧光素酶。
所述蛋白可以与多个标签融合。例如，所述蛋白可以与多个GFP11肽标签融合，并且合成在多个GFP1-10多肽存在的情况下发生。例如，所述蛋白可以与多个sfCherry11肽标签融合，并且合成在多个sfCherry1-10多肽存在的情况下发生。感兴趣的蛋白可以与一个或多个sfCherry11肽标签和一个或多个GFP11肽标签融合，并且合成在一个或多个GFP1-10多肽和一个或多个sfCherry1-10多肽存在的情况下发生。
可以合成任何感兴趣的蛋白。蛋白可以是酶，例如末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)或其截短型、或其它物种中的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的同源氨基酸序列、或任何物种的Polμ、Polβ、Polλ和Polθ的同源氨基酸序列、或任何物种的X家族聚合酶的同源氨基酸序列。
蛋白表达通常需要充足的氧供应。为CFPS提供动力的最方便且高产的方式是通过氧化磷酸化，其中O2用作最终电子受体；然而，还有其它涉及用不参与氧化磷酸化的能量分子补充的方式。在受限的微流体或数字微流体液滴系统中，没有足够的氧用来实现有效的蛋白合成。
本文描述的是实现在数字微流体器件中的无细胞表达肽或蛋白的改进方法。包括一种用于在微流体器件中无细胞表达肽或蛋白的方法，其中所述方法包括一个或多个含有核酸模板(即DNA或RNA)和在填充油的环境中的具有用于蛋白表达的组分的无细胞系统的液滴，并使用电润湿来移动所述液滴。无细胞蛋白合成液滴的组分可以在引入数字微流体器件之前预混合或在数字微流体器件上混合。
在表达蛋白的同时，可以重复移动液滴至少30分钟的时间。在表达蛋白的同时，可以重复移动液滴至少两个小时的时间。在表达蛋白的同时，可以重复移动液滴至少十二个小时的时间。移动液滴的动作使得氧被供应到液滴并分散在整个液滴中。移动的动作相对于保持静止的液滴改善蛋白表达水平。
可使用任何电润湿手段来移动液滴。可使用介质上电润湿(EWoD)移动液滴。EWoD或光学EWoD器件上的电信号可以通过分段电极、有源矩阵薄膜晶体管或数字微镜传递。
器件中的填充流体可以是任何水不混溶液体。填充流体可以是矿物油、硅油如八甲基环四硅氧烷(CTS)、十甲基四硅氧烷(DMTS)或十二甲基五硅氧烷(DMPS)、基于烷基的溶剂如癸烷或十二烷、或氟化油。可以在表达过程之前或在表达过程期间对填充流体充氧。
可以向液滴供应补充氧源。例如，可将含有气态氧或溶解氧的液滴或气泡在蛋白表达期间与液滴合并。另外，通过给用作填充介质的油充氧可以找到补充氧源。本领域众所周知的是，油诸如十六烷、HFE-7500等可以被充氧以支持细胞生长、尤其是大肠杆菌细胞生长的氧需求(RSC Adv.，2017,7,40990-40995)。充氧可以通过用纯氧或大气空气向油充气来实现。
液滴可以在进入微流体器件之前形成并流入器件中。供选择地，液滴可以在器件上合并。包括一种方法，所述方法包括将含有核酸模板如质粒的第一液滴与含有具有用于蛋白表达的组分的无细胞提取物的第二液滴合并，以形成能够进行无细胞蛋白合成的组合的液滴。
液滴可以在表达之前或之后在器件上分裂。本文包括一种方法，所述方法还包括将水性液滴分裂成多个液滴。如果需要，可以用其它添加剂筛选分裂的液滴。包括一种方法，其中一个或多个分裂的液滴与用于筛选的添加剂液滴合并。
肽或蛋白的无细胞表达可以使用具有能够实现蛋白表达的试剂的细胞裂解物。无细胞反应的常见组分包括能量源、氨基酸供应、辅助因子如镁，以及相关酶。通过裂解感兴趣的细胞并通过离心除去细胞壁、DNA基因组和其它碎片来获得细胞提取物。剩余的是细胞机器，包括核糖体、氨酰基-tRNA合成酶、翻译起始和延伸因子、核酸酶等。一旦添加合适的核酸模板，就可以使用细胞来源的表达机器将核酸模板表达为肽或蛋白。
可以使用本文描述的系统表达任何特定的核酸模板。CFPS中使用的三种类型的核酸模板包括质粒、线性表达模板(LET)和mRNA。质粒是圆形模板，其可以在细胞中产生或经合成产生。LET可以通过PCR制备。虽然LET的制作更容易、更快速，但CFPS中的质粒产量通常更高。mRNA可以通过体外转录系统产生。所述方法使用每个液滴单个核酸模板。所述方法可以使用每个液滴具有不同核酸模板的多个液滴。
能量源是无细胞反应的重要部分。通常，将含有所需能量源的单独混合物以及氨基酸供应一起添加到提取物中进行反应。常见来源是磷酸烯醇丙酮酸、乙酰磷酸和磷酸肌酸。可以通过在表达过程中向液滴中添加其它试剂来在该过程中补充能量源。
具有用于蛋白表达的组分的无细胞提取物包含除核酸模板之外的蛋白表达所需的一切。因此，该术语包括所有相关的核糖体、酶、起始因子、核苷酸单体、氨基酸单体、金属离子和能量源。一旦添加核酸模板，在不需要其它试剂的情况下就开始蛋白表达。
因此，在添加模板之前，可以向细胞裂解物补充另外的试剂。具有用于蛋白表达的组分的无细胞提取物通常将作为批量试剂或“主混合物”生产，其可以在将不同的模板被分别添加到不同的液滴中之前被配制成许多相同的液滴。目前使用的常见细胞提取物是由大肠杆菌(ECE)、兔网织红细胞(RRL)、小麦胚芽(WGE)、昆虫细胞(ICE)和克鲁维酵母属酵母(D2P系统)制成的。所有这些提取物均可商购。
无细胞系统可以由所需的试剂组装，而不是源自细胞提取物。基于重构的、纯化的分子试剂的系统可商购，例如用于蛋白生产的PURE系统，并且可以按所供应的原样使用。PURE系统由参与转录和翻译的所有酶以及高度纯化的70S核糖体组成。PURE系统的蛋白合成反应缺乏蛋白酶和核糖核酸酶，这些酶通常作为细胞提取物中不希望的分子存在。
一旦CFPS试剂已被封装在液滴中，就可以通过将原始液滴与第二液滴合并来供应另外的试剂。第二液滴可以携带任何期望的另外的试剂，包括例如氧源或“动力”源，或期望暴露于所表达的蛋白的测试试剂。
液滴可以是水性液滴。液滴可含有油不混溶的有机溶剂，例如DMSO。液滴可以是水和溶剂的混合物，前提是液滴不溶解到主体填充液中。
因此，在将核酸模板添加至液滴之前，含有具有用于蛋白表达的组分的无细胞提取物的液滴将通常处于填充油的环境中。可以通过在微流体器件上合并液滴来添加模板。供选择地，可以将模板添加到器件外部的液滴中，然后使其流入器件中用于表达过程。例如，可以通过升高温度在器件上开启表达过程。表达系统通常在高于标准室温的温度下，例如在29℃或高于29℃下最佳地运行。
表达过程通常耗费许多个小时。因此，所述过程应该保持至少30分钟或1小时，通常至少2小时。表达可以保持至少12小时。在表达过程中，液滴应在器件内移动。移动通过混合试剂并确保液滴内有足够的氧可用来改善所述过程。移动可以是连续的，或者可以带有不移动的介入期重复移动。
因此，在表达蛋白的同时，水性液滴可以重复移动至少30分钟或一小时的时间。在表达蛋白的同时，水性液滴可以重复移动至少两个小时的时间。在表达蛋白的同时，水性液滴可以重复移动至少十二个小时的时间。移动液滴的动作实现在液滴内混合，并且使得将氧或其它试剂被供应到液滴。移动的动作相对于保持静止的液滴改善蛋白表达水平。
器件中的填充流体可以是任何水不混溶的、非离子型或疏水性液体。油可以是矿物油、硅油如八甲基环四硅氧烷(CTS)、十甲基四硅氧烷(DMTS)或十二甲基五硅氧烷(DMPS)、基于烷基的溶剂如癸烷或十二烷、或氟化油，或其混合物。
可以向液滴供应补充氧源。例如，可将含有气态氧或溶解氧的液滴或气泡在蛋白表达期间与水性液滴合并。供选择地，氧源可以是释放氧的分子源。供选择地，可以将液滴移动到空气/液体边界以使得来自气态环境的氧扩散增加。供选择地，可以给油充氧。
液滴可以在进入微流体器件之前形成并流入器件中。供选择地，液滴可以在器件上合并。包括一种方法，所述方法包括将含有核酸模板如质粒的第一液滴与含有具有用于蛋白表达的组分的无细胞系统的第二液滴合并以形成液滴。
液滴可以在表达之前、期间或之后在器件上分裂。本文包括一种进一步包括将液滴分裂成多个液滴的方法。如果需要，可以用其它添加剂筛选分裂的液滴。包括一种方法，其中将一个或多个分裂的液滴与用于筛选的添加剂液滴合并。
通过亲和标签，如FLAG标签、HIS标签、GST标签、MBP标签、STREP标签或其它形式的亲和标签，CFPS表达的蛋白可以固定到固体载体亲和树脂上，并且新鲜批次的CFPS试剂可以在所述树脂上递送。因此，更新的试剂可用于进行蛋白合成，贴近地模仿连续流(CF)和连续交换(CE)CFPS的工业方法。通过模仿CF-CFPS和CE-CFPS，用户可以扩大其CFPS生产方法。
液滴还可以含有添加剂，以减少生物淤积对数字微流体表面的影响。具体地，含有CFPS组分的液滴还可以含有添加剂，如表面活性剂或清洁剂，以减少生物淤积对数字微流体器件的疏水性或超疏水性表面的影响(Langmuir 2011,27,13,8586-8594)。
不向水性样品中添加表面活性剂，反而可以向填充液中添加表面活性剂，如Span85(例如脱水山梨糖醇三油酸酯，Sigma Aldrich，SKU 8401240025)。其具有使CFPS反应能够在DMF上进行，而无稀释或掺杂的优点。另外，它简化用于设立反应的样品制备过程，提高易用性和结果的一致性。使用含1％重量/重量的Span85的十二烷实现DMF上的免稀释CFPS反应，以及表达的非荧光蛋白的免稀释检测。可以使用除Span85之外的其它表面活性剂和除十二烷之外的油。可以使用一系列浓度的Span85。表面活性剂可以是非离子的、阴离子的、阳离子的、两性的或其混合物。油可以是矿物油或合成油，包括硅油、石油和全氟化油。表面活性剂可对(1)CFPS反应和(2)检测系统的效率(如果检测系统涉及标签和检测物的互补)有有害影响。例如，通过使用油-表面活性剂混合物在DMF上进行CFPS反应，表达的蛋白的检测也可以在不稀释的情况下进行。已经表明，表面活性剂降低一些检测系统，包括但不限于Split GFP(例如GFP11/GFP1-10)系统的效率，因此从水性试剂混合物中减少表面活性剂而将它们添加到油中可能是有益的。
肽标签可以连接至蛋白的C末端或N末端。肽标签可以是绿色荧光蛋白(GFP)的一种组分。例如，肽标签可以是GFP11和另外的多肽可以是GFP1-10。肽标签可以是sfCherry的一种组分。肽标签可以是sfCherry11和另外的多肽可以是sfCherry1-10。
蛋白可以与多个标签融合。例如，蛋白可以与多个GFP11肽标签融合，并且合成在多个GFP1-10多肽存在的情况下发生。例如，蛋白可以与多个sfCherry11肽标签融合，并且合成在多个sfCherry1-10多肽存在的情况下发生。感兴趣的蛋白可以与一个或多个sfCherry11肽标签和一个或多个GFP11肽标签融合，并且合成在一个或多个GFP1-10多肽和一个或多个sfCherry1-10多肽存在的情况下发生。
当本文使用“和/或”时，应将其视为两个指定特征或组分中的每一个与或不与另一个一起具体公开。例如，“A和/或B”应被视为(i)A、(ii)B和(iii)A和B中每一种的具体公开，如同每一种在本文中单独列出一样。
除非上下文另有规定，否则上述阐述的特征的描述和定义不局限于本发明的任何具体方面或实施方案，并且同样适用于所描述的所有方面和实施方案。
本领域技术人员还应当理解，尽管已经参考若干实施方案通过示例的方式描述了本发明，但是其不限于所公开的实施方案，并且在不脱离所附权利要求中所限定的本发明的范围的情况下，可以构建供选择的实施方案。
实验细节
附着促进
将0.5％体积/体积的硅烷A-174添加到1:1比例的异丙醇/水中，搅拌30秒形成的溶液1。将溶液1静置至少2小时以充分反应，并在24小时内使用。将基板浸入溶液1中30分钟，同时确保TFT阵列的弹性条保持干燥。取出基板并风干15分钟，然后在异丙醇中清洁15-30秒，同时使用镊子搅拌。用气枪干燥基板，并在30小时内储存在特氟龙盒中，用于聚对二甲苯C涂覆。
聚对二甲苯涂层
将制备的基板(硅烷化的和非硅烷化的)面朝上布置在旋转台上，与干净的载玻片一起在彻底清洁的SCS Labcoater 2的沉积室内，并将该室密封。称取50mg的聚对二甲苯C二聚体置于一次性铝舟中并装载到升华室内。将系统密封并抽气至50毫托，然后将液氮加到冷阱中。在整个沉积过程中系统持续抽空。将升华室加热至175℃，并循环加热器以保持0.1Torr的目标压力。升华室通过热解区连接至沉积室，热解区在0.5托的目标压力下被加热至690℃。沉积区保持在环境温度，约25℃，和约50毫托下。将系统在该温度和压力下保持两小时。在关闭平台和真空泵并对系统排气之前，使系统在30-40分钟内逐渐恢复到环境温度。将样品从沉积室中取出，并通过轮廓测定法验证涂层厚度为约100nm。
图中显示的数据表明，在不存在水性表面活性剂的情况下，即使在油层中有表面活性剂，水性液滴也难以处理。水性表面活性剂的不存在或水平太低导致生物淤积和难以移动的液滴。较高水平的表面活性剂影响应用如蛋白表达所需的生物分子相互作用。因此，为了实现在数字微流体器件上的蛋白表达，需要两种表面活性剂的正确平衡。Pluronic表面活性剂F127在较长时间段内提供良好的分配。低水平的Pluronic表面活性剂与蛋白表达和检测相容。因此，水相中的Pluronic F127可用于电润湿器件上的液滴中的蛋白表达应用。

Claims (26)

1.一种数字微流体器件，其包括平面电极的二维阵列，其中所述器件包含在主体油相内的水性液滴群，所述水性液滴群含有生物分子和第一表面活性剂，其中所述主体油相含有第二表面活性剂。
2.根据权利要求1所述的器件，其中所述水性液滴含有非离子表面活性剂。
3.根据权利要求1所述的器件，其中所述水性液滴含有Pluronic表面活性剂。
4.根据权利要求3所述的器件，其中所述水性液滴含有Pluronic F127。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的器件，其中所述油为矿物油、硅油、基于烷基的溶剂或氟化油。
6.根据权利要求5所述的器件，其中所述油是十二甲基五硅氧烷、癸烷或十二烷。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的器件，其中所述第二表面活性剂是非离子表面活性剂。
8.根据权利要求7所述的器件，其中所述表面活性剂是脱水山梨糖醇酯。
9.根据权利要求7所述的器件，其中所述表面活性剂是Span85。
10.根据权利要求1所述的器件，其中所述第一表面活性剂是Pluronic F127并且所述第二表面活性剂是Span85。
11.根据权利要求10所述的器件，其中所述油是八甲基环四硅氧烷(CTS)、十甲基四硅氧烷(DMTS)或十二甲基五硅氧烷。
12.根据权利要求11所述的器件，其具有含0.05％重量/重量的Pluronic F127的水性缓冲液，所述含0.05％重量/重量的Pluronic F127的水性缓冲液在含0.1％的span85的十二甲基五硅氧烷(DMPS)的填充液中。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的器件，其中所述生物分子是双链核酸或蛋白。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的器件，其中使用所述器件上的电极的子集来移动、分裂或组合所述液滴。
15.一种用于在根据权利要求1至14中任一项所述的数字微流体器件中无细胞表达肽或蛋白的方法，其中所述方法包括一个或多个液滴，所述一个或多个液滴含有核酸模板和在填充油的环境中的含有第一表面活性剂的具有用于蛋白表达的组分的无细胞系统，其中所述油含有第二表面活性剂，并且使用介质上电润湿(EWoD)来移动所述液滴。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述无细胞系统是用于蛋白表达的无细胞提取物。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述无细胞系统由单独的试剂制备。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其包括将含有核酸质粒的第一液滴与含有具有用于蛋白表达的组分的无细胞系统的第二液滴合并，以在微流体器件上形成组合的液滴。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，其包括将含有核酸模板的多个第一液滴与含有具有用于蛋白表达的组分的无细胞系统的多个第二液滴合并，以形成能够进行无细胞蛋白合成的多个组合的液滴。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其中通过光学手段检测所表达的肽或蛋白。
21.用于在根据权利要求1所述的数字微流体器件中无细胞表达肽或蛋白的方法，所述数字微流体器件具有包含第二表面活性剂的填充油的环境，所述方法包括：
a.取多个具有不同核酸模板的液滴，
b.取各自含有具有用于蛋白表达的组分的无细胞系统的多个液滴，
c.使用介质上电润湿现象合并a的液滴和b的液滴，以产生能够表达不同序列的蛋白的多个液滴，所述液滴含有第一表面活性剂，
d.混合液滴以实现无细胞蛋白表达，和
e.检测单个液滴内蛋白的表达。
22.根据权利要求15至21所述的方法，其中所述第一表面活性剂是Pluronic F127并且所述第二表面活性剂是Span85。
23.一种用于制备多种肽或蛋白的试剂盒，其包括
a.数字微流体器件；
b.试剂源，所述试剂源用于产生含有具有用于蛋白表达的组分的无细胞系统和第一表面活性剂的多个液滴；和
c.油，任选为矿物油、硅油、基于烷基的溶剂如癸烷或十二烷、或者氟化油、或其混合物，其中所述油含有第二表面活性剂。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其中所述无细胞系统包含核糖体、酶、起始因子、核苷酸单体、氨基酸单体、金属离子和能量源。
25.根据权利要求23或24所述的试剂盒，其中所述第一表面活性剂是Pluronic F127并且所述第二表面活性剂是Span85。
26.根据权利要求25所述的试剂盒，其具有在水性缓冲液中的Pluronic F127和在八甲基环四硅氧烷(CTS)、十甲基四硅氧烷(DMTS)或十二甲基五硅氧烷(DMPS)中的span85。
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