CN115942948A - 肽化合物及其治疗疾病的方法 - Google Patents

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Abstract

公开多种分离肽，其能够在一小鼠中减少地塞米松诱导的脾脏及/或胸腺重量减轻的量。还公开了其用于治疗炎症性或退行性疾病的用途。

Description

肽化合物及其治疗疾病的方法
相关申请案
本申请主张于2020年1月15日提交的以色列专利申请案第272074号的优先权，其内容均以引用的方式并入本文。
序列表声明
标题为84727 SequenceListing.txt的ASCII文件，于2021年1月13日创建，包括12,288字节，与本申请的提交同时提交，通过引用并入本文。
技术领域及背景技术
本发明在其若干实施例中涉及用于治疗炎症性及自体免疫性疾病的组合物及其使用方法。
对新型组合物的需求尚未得到满足，这些组合物可以以一种特异性、安全且有效的方式减弱正常组织中的细胞及免疫应激反应，从而减轻与应激相关的退行性疾病及应激性炎症的严重程度。
肽LPPLPYP(SEQ ID NO：42，也被称为Stressin-1及IPL344)是一种短的7个胺基酸肽，它可以保护各种类型的细胞免受促细胞凋亡压力的影响，并激活Akt信号系统。IPL344的结构类似于接头蛋白(adaptor proteins)的结合位点。有人提出，它的作用机制包括模拟这些蛋白，并通过Akt及其他途径激活细胞保护过程。
国际专利申请公告号：WO 2006/021954及WO2012/160563揭露了LPPLPYP(SEQ IDNO：42)肽用于治疗ALS等疾病。
发明内容
根据本发明的一方面，提供了一种由5或7个胺基酸组成的分离肽，所述分离肽是由分子式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7，即为SEQ ID NO：45所表示的一胺基酸序列所组成，其中
(i)X1系选自于由亮胺酸、d-亮胺酸、d-缬胺酸、d-精胺酸以及缺少所组成的群组；
(ii)X2系选自于由二甲基脯胺酸(dMP)、脯胺酸、α-胺基异丁酸(Aib)以及d-脯胺酸所组成的群组；
(iii)X3系选自于由二甲基脯胺酸、脯胺酸、α-胺基异丁酸以及d-脯胺酸所组成的群组；
(iv)X4系选自于由组胺酸、丝胺酸、缬胺酸、亮胺酸、d-亮胺酸及苏胺酸所组成的群组；
(v)X5为脯胺酸或丙胺酸；
(vi)X6系选自于由酪胺酸、d-缬胺酸、d-天冬胺酸、色胺酸及苯丙胺酸所组成的群组；以及
(vii)X7系选自于由脯胺酸、dMP、d-脯胺酸以及缺少所组成的群组；
所述肽能够减少在一小鼠中地塞米松诱(dexamethasone)导的脾脏及/或胸腺重量减轻的量，但条件是所述肽并非由SEQ ID NO 42、43或44中所述的序列所组成。
根据本发明的一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本文所揭露的肽作为一活性剂及一生理可接受载体。
根据本发明的一方面，提供了一种不超过10个胺基酸的分离肽，所述分离肽包括选自于由SEQ ID NO：1-33以及34所组成的群组的一胺基酸序列，其中所述肽能够减少在一小鼠中地塞米松诱导的脾脏及/或胸腺的重量减轻的量。
根据本发明的一些实施例，所述肽是由选自于由SEQ ID NO：6-33以及34所组成的群组的胺基酸序列所组成的。
根据本发明的一些实施例，所述肽是由选自于由SEQ ID NO：6-12以及13所组成的群组的胺基酸序列所组成的。
根据本发明的一些实施例，所述肽包括选自于由SEQ ID NO：1-4以及5所组成的群组的一胺基酸序列。
根据本发明的一些实施例，所述肽是由选自于由SEQ ID NO：1-33以及34所组成的群组的所述胺基酸序列所组成的。
根据本发明的一些实施例，所述肽为一钉合肽(stapled peptide)。
根据本发明的一些实施例，所述肽为环肽(cyclic peptide)。
根据本发明的一些实施例，所述序列的顺序颠倒并且所有的所述胺基酸都是D型的。
根据本发明的一些实施例，所述肽连接到一细胞穿透部分。
根据本发明的一些实施例，所述细胞穿透部分连接到所述肽的一N端。
根据本发明的一些实施例，所述肽在治疗与细胞凋亡相关的疾病的用途。
根据本发明的一些实施例，与细胞凋亡相关的疾病为一炎症性或一退行性疾病。
根据本发明的一些实施例，所述炎症性疾病为一自体免疫性疾病。
根据本发明的一些实施例，所述退行性疾病为一神经退行性疾病。
根据本发明的一些实施例，所述与细胞凋亡相关的疾病系选自于由老年性黄斑部退行(age-related macular degeneration，AMD)、视网膜色素退行(retinitispigmentosa)、中风以及心肌梗死(myocardial infarction)所组成的群组。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术及/或科学术语具有与本发明所属领域的通常技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的方法及材料相似或等效的方法及材料可以用于本发明的实施例的执行或测试，但示例性方法及/或材料在下文描述。如有冲突，以专利说明书，包括定义，为准。此外，这些材料、方法及示例仅是说明性的，并不意味着必然是限制性的。
具体实施方式
本发明在其若干实施例中涉及用于治疗炎症性及自体免疫性疾病的组合物及其使用方法。
在详细说明本发明的至少一实施例之前，应当了解本发明的适用范围并不一定限于以下描述所述的细节或由本示例所示的细节。本发明能够以各种方式执行或实施其他实施例。
多脯胺酸肽LPPLPYP(SEQ ID NO：42)，也被称为IPL344及Stressin-1)是一种短的7个胺基酸肽，可以保护各种类型的细胞免受促细胞凋亡压力的影响，并激活Akt信号系统。它是治疗退行性、炎症性及自体免疫性疾病的候选药物。
在研究肽的单个胺基酸的贡献时，本发明的发明人惊奇地发现，核心序列的特定胺基酸替代在减少小鼠中地塞米松诱导的脾脏及/或胸腺重量减轻的量有显著改善，而其他替代及/或缺失则严重消除了这种减少。此外，这些肽还能最大限度地降低地塞米松诱导的脾脏及胸腺细胞数量的减少。
发明人发现这些肽的大多数符合SEQ ID NO：45中规定的分子式，并建议将这些肽用于治疗退行性疾病、炎症性及自体免疫性疾病。
在进一步简化本发明以实施本发明的同时，本发明人注意到在特定位置用合成胺基酸Aib替代脯胺酸也导致肽在小鼠中减少地塞米松诱导的脾脏及/或胸腺重量减轻的量方面具有增强的改善，并最大限度地减少地塞米松诱导的脾脏及胸腺细胞数量的减少。
此处使用的术语“肽”是指天然或合成胺基酸的聚合物，包括天然肽(降解产物、合成多肽或重组多肽)及拟肽(通常是合成肽)，以及类肽及半类肽，这些多肽类似物，例如，可能具有修饰使多肽在体内更稳定或更能渗透到细胞中。
本发明还包括衍生物(在胺基酸侧链上修改及/或添加化学功能，而在肽链上不发生化学变化)及类似物(在肽链上修改及/或添加化学功能，例如，N端或C端修改或肽键修改)。
这些修饰包括但不限于N端修饰、C端修饰、肽键修饰，包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O、O＝C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S＝C-NH、CH＝CH或CF＝CH、主链修饰、残基修饰。制备类肽化合物的方法在本技术中是众所周知的，例如，在《定量药物设计》，C.A.RamsdenGd，F.Choplin Pergamon Press(1992)第17.2章，其通过引用并入本文，如同在此完整叙述。进一步细节于下文提供。
多肽化学键(-CO-NH)内的多肽可能被代替，例如，通过N甲基化键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮亚甲基键(-CO-CH2-)、α氮杂键(-NH-N(R)-CO-)，其中R是烷基，如甲基、胺基键(-CH2-NH-)、羟基乙烯键(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯双键(-CH＝CH-)、逆酰胺键(-NH-CO-)、多肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中R为“正常”的侧链，自然地呈现在碳原子上。
这些修饰可以发生在肽链上的任何一个化学键上，甚至可以同时发生在复数个(2-3)化学键上。
非天然胺基酸总结于以下表2中。
在本说明书及权利要求中使用的术语“胺基酸”或“胺基酸(复数)”被理解为包括20种自然产生的胺基酸；这些胺基酸经常在体内进行转译后修饰，例如，羟脯胺酸(hydroxyproline)、磷丝胺酸(phosphoserine)及磷苏胺酸(phosphothreonine)；其他不常见的胺基酸包括但不限于2-胺基己二酸(2-aminoadipic acid)、羟离胺酸(hydroxylysine)、异胺嘧啶(isodesmosine)、正缬胺酸(nor-valine)、正亮胺酸(nor-leucine)及鸟胺酸(ornithine)。此外，“胺基酸”一词包括D-及L-胺基酸(立体异构体)。
以下表1及表2列出了可以与本发明一起使用的天然胺基酸(表1)及非常规或修改的胺基酸(表2)。
表1
胺基酸(Amino Acid) Three-Letter缩写 One-letter符号
丙胺酸(Alanine) Ala A
精胺酸(Arginine) Arg R
天冬酰胺(Asparagine) Asn N
天冬胺酸(Aspartic acid) Asp D
半胱胺酸(Cysteine) Cys C
谷胺酰胺(Glutamine) Gln Q
谷胺酸(Glutamic Acid) Glu E
甘胺酸(Glycine) Gly G
组胺酸(Histidine) His H
异亮胺酸(Isoleucine) Ile I
亮胺酸(Leucine) Leu L
离胺酸(Lysine) Lys K
甲硫胺酸(Methionine) Met M
苯丙胺酸(Phenylalanine) Phe F
脯胺酸(Proline) Pro P
丝胺酸(Serine) Ser S
苏胺酸(Threonine) Thr T
色胺酸(Tryptophan) Trp W
酪胺酸(Tyrosine) Tyr Y
缬胺酸(Valine) Val V
任何如上所述的胺基酸 Xaa X
表2
Figure BPA0000326488540000061
Figure BPA0000326488540000071
Figure BPA0000326488540000081
Figure BPA0000326488540000091
Figure BPA0000326488540000101
续表2
如前所述，本发明肽的N端及C端可以被官能基团保护。合适的官能基团在Green及Wuts中描述，“有机合成中的保护基团”，John Wiley及Sons，第5章及第7章，1991年，其中教示的内容均以引用的方式纳入本文。优选的保护基团是那些促进与之相连的化合物运输到细胞的基团，例如，通过减少化合物的亲水性及增加化合物的亲油性。
这些部分可以在体内通过水解或酶在细胞内进行切割。羟基保护基团包括酯类、碳酸类及胺基甲酸酯保护基团。胺基保护基团包括烷氧基及芳氧基羰基，如上所述的N端保护基团。羧酸保护基团包括脂肪族酯、苄基酯及芳基酯，如上所述的C端保护基团。在一实施例中，本发明的肽中的一或多个谷胺酸或天冬胺酸残基侧链中的羧酸基团优选使用甲基、乙基、苄基或取代的苄基酯进行保护。
N端保护基团的示例包括酰基(CO R1)及烷氧羰基或芳氧羰基(CO O R1)，其中R1是脂肪族、取代脂肪族、苄基、取代苄基、芳香族或一个取代芳香族基团。酰基的具体例子包括乙酰基、(乙基)CO、正丙基CO、异丙基CO、正丁基CO、仲丁基CO、t butyl CO、己基、月桂酰、棕榈酰、肉豆蔻基、硬脂基、油酰苯基CO、取代苯基CO、苄基CO及(取代苄基)CO。烷氧羰基及芳氧羰基的例子包括CH3 O CO，(乙基)O CO，正丙基O CO，异丙基O CO，正丁基O CO，仲丁基O CO，t butyl O CO，苯基O CO，取代苯基O CO及苄基O CO，(取代苄基)O CO。金刚烷、萘烷、肉豆蔻酰基、甲苯、联苯、肉桂基、硝基苯甲酰、甲苯基、呋喃基、苯甲酰、环己烷、降冰片烷、Z-己基。为了促进N酰化，在分子的N端可以存在1至4个甘胺酸残基。
化合物C端羧基可以被保护，例如，酰胺(即C端羟基被NH2、NHR2及NR2R3取代)或酯(即C端羟基被OR2取代)。R2及R3分别是脂肪族、取代脂肪族、苄基、取代苄基、芳基或取代芳基。此外，R2及R3与氮原子结合可以形成一个C4到C8的杂环，另外还有大约0-2个杂原子，如氮、氧或硫。
合适的杂环的例子包括哌啶基、吡咯烷基、吗啉(morpholino)、硫吗啉(thiomorpholino)或哌嗪基(piperazinyl)。C端保护基团的例子包括-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-NH(乙基)、-N(乙基)2、-N(甲基)(乙基)、-NH(苄基)、-N(C1-C4烷基)(苄基)、-NH(苯基)、N(C1-C4烷基)(苯基)、-OCH3、-O(乙基)、-O(N丙基)、-O(正丁基)、-O(异丙基)、-O(仲丁基)、-O(叔丁基)、-O苄基及-O苯基。
本发明的肽还可以包括非胺基酸部分，例如，附着在肽上的疏水性部分(各种线性的、支链的、环的、多环的或六环的碳氢化合物及碳氢化合物衍生物)；非肽渗透剂；各种保护基团，特别是在化合物是线性的地方，它们附着在化合物的末端以减少降解。化合物中存在的化学(非胺基酸)基团可以包括在内，以便改善各种生理特性，如；退行或清除减少；减少各种细胞泵的排斥，提高免疫原活性，改善各种给药模式(如各种序列的附着，允许穿透各种障碍、通过肠道等)；特异性增加、亲及力增加、毒性降低等。
将本发明的肽的胺基酸序列组件连接到其他非胺基酸试剂上，可以通过共价连接、通过非共价连接，例如，通过共价连接到疏水聚合物上，疏水聚合物可以被降解或切割，产生可缓释的化合物；通过将肽的胺基酸部分包裹在脂质体或胶束中以产生本发明的最终肽。结合可以通过在其他组分(脂质体、胶束)中捕获所述胺基酸序列或在聚合物中浸渍所述胺基酸序列以产生本发明的最终肽。
根据特定的实施例，肽连接到细胞穿透部分。
这里所使用的术语“细胞穿透部分”指的是一种能增强所附肽跨细胞膜易位的部分(如脂质、如棕榈酸)。在特定实施例中，细胞穿透部分不是肽部分。这部分可以连接到N端或C端。
本发明的肽可以是线性的，也可以是循环的(环化可以提高稳定性)。环化可以通过任何已知的方法发生。当化合物主要由胺基酸组成时，环化可能是通过N端到C端、N端到侧链及N端到主链、C端到侧链、C端到主链、侧链到主链、侧链到侧链以及主链到主链的环化。肽的环化也可以通过肽中所含的非胺基酸有机部分进行。
本发明的发明人还设想了钉合肽(stapled peptides)。
这里使用的术语“钉合肽”是指具有选定数量的标准或非标准胺基酸，并进一步具有至少两个能够进行反应以促进碳-碳键形成的部分的肽，所述部分已与一种试剂接触，在至少两个部分之间产生至少一个交联剂，例如，调节肽的稳定性。
这里使用的术语“钉合”将至少两个能够进行反应以促进碳-碳键形成的肽引入，所述碳-碳键可以与一种试剂接触以在至少两个基团之间产生至少一个交联剂。钉合为二级结构(如α螺旋结构)提供了约束。可以优化交联剂的长度及几何形状，以提高所需二级结构含量的产率。例如，所提供的约束可以防止二级结构展开及/或可以加强二级结构的形状。例如，被阻止展开的二级结构就更加稳定。
本发明的肽可以通过使用标准固相技术进行生物化学合成。这些方法包括专属固相合成法、部分固相合成法、片段缩合法、经典溶液合成法。固相多肽合成流程在本领域是众所周知的，并由John Morrow Stewart及Janis Dillaha Young进一步描述，固相多肽合成(第二版，Pierce Chemical Company，1984)。
本发明人还考虑了特别适用于小型肽的液相技术。
安德森生物聚合物2000；55(3)：227-50描述了大规模肽合成。
合成的肽可以用制备型高效液相色谱来纯化[Creighton T.(1983)蛋白质、结构及分子原理，WH Freeman及Co.N.Y.]。其组成可以通过胺基酸测序来确认。
重组技术也可用于产生本发明的肽。为了使用重组技术生产本发明的肽，将编码本发明肽的多核苷酸连接到核酸表达载体中，所述载体包括在顺式调控序列(例如，启动子序列)的转录控制下的多核苷酸序列，所述顺式调控序列适合于在宿主细胞中指导本发明肽的组成性、组织特异性或可诱导的转录。
除了可以在宿主细胞中合成外，本发明的肽还可以使用体外表达系统进行合成。这些方法在本领域及系统的组成部分是众所周知的。
本文中所述的肽能够减少小鼠中地塞米松诱导的脾脏及/或胸腺体重减轻的量-例如，在注射(IP)100μg地塞米松后。此外，它们还能最大限度地减少地塞米松诱导的脾脏及胸腺细胞数量的减少。
在另一实施例中，本文所述的肽能够干扰及阻断巨噬细胞应答先天激活物(如脂多糖(LPS)及CpG寡核苷酸)时TNF-α及IL-6的分泌。
此外或交替地，本文所述的肽能够或减少、防止或抑制真核细胞的凋亡。不考虑该发明的肽介导应激反应的机制，并且不希望受到任何理论或作用机制的约束，假定肽可能能够激活Akt-CREB轴。所述肽可以通过分析其激活Akt激酶及/或cAMP反应元件结合蛋白(CREB)转录因子的能力来测试，详见Herkel等人，《免疫学》，2017年，151、474-480页，其内容通过引用并入本文。
细胞凋亡的测量方法：细胞凋亡是一种活跃的、基因导向的自我毁灭过程，与特有的形态及生化变化相关。细胞凋亡的典型特征是细胞核及细胞质的凝聚及死亡细胞碎裂成膜结合的凋亡小体。细胞凋亡的细胞死亡的另一个特征是，特定的核酸酶被激活后，染色体的DNA降解为寡核体片段。
“抑制细胞凋亡”或“抑制细胞凋亡活性”指的是相对于未处理对照(即未接触本发明肽的细胞)发生凋亡的细胞数量的任何减少。优选地，至少减少25％，更优选地减少至少50％，更优选地减少至少65％，最优选地减少至少80％。
流式细胞仪为检测细胞凋亡提供了多种可能性。建立及实施了不同的染色方法，有些染色细胞表面，有些染色细胞内。
除了观察到凋亡细胞收缩及细胞内颗粒度更高外，第一种方法是用DNA特异性荧光染色(如碘化丙啶[PI]、溴化乙啶[EtBr])。一旦致命的撞击被诱导，DNA就开始改变它的特征。细胞凋亡DNA不仅包括DNA片段(在琼脂糖凝胶中显示为较短的条带，称为DNA阶梯)，而且部分被消化成单核苷酸，因此荧光色素，如PI或EtBr，可以染色的DNA更少(Nicolettiet al.，1991年)。这通常是通过FACScanTM(来自美国Becton Dickinson)中特定荧光色素检测通道上的左移(称为亚G1峰)观察到的。
另一种方法是末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyltransferase，TdT)介导的DNA链断裂末端标记(TUNEL)。TUNEL法检测细胞凋亡时细胞的DNA链断裂。TdT是一种催化双链或单链DNA的3’-OH端加入三磷酸脱氧核糖核苷酸的酶。与正常细胞不同，在TdT作用下，凋亡细胞的细胞核包括外源性核苷酸(dUTP)-DIG。具有共轭荧光色素的抗DIG抗体片段可以显示凋亡细胞。凋亡细胞的增加会导致更多的DNA片段，从而产生更亮的荧光。这种方法的优点是特异性非常高(Gavrieli等人，1992年)。这种方法的缺点是价格昂贵，而且由于时间紧张，只能用于一小部分样本。因此不适用于大型筛选项目。
在细胞凋亡的早期，细胞膜极性的丧失及细胞膜外磷脂酰丝胺酸(phosphatidylserine，PS)的增加为细胞凋亡提供了新的途径。膜联蛋白V(Annexin V)是一种钙依赖的磷脂结合蛋白，对PS具有很高的亲及力，在凋亡的早期及中期细胞膜保持完整性。早期及中期凋亡细胞Annexin-FITC结合增强，PI染色主要为阴性。晚期凋亡阶段及坏死细胞呈双阳性，这是由于细胞膜解体导致胞内核酸呈PS及PI染色。这种方法成本高，且人工密集。
美国专利号6,726,895及6,723,567公开了体内及体外测定细胞凋亡的其他方法。
提供了一种由5或7个胺基酸组成的分离肽，所述分离肽是由分子式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7，即为SEQ ID NO：45所表示的一胺基酸序列所组成，其中
(i)X1系选自于由亮胺酸、d-亮胺酸、d-缬胺酸、d-精胺酸以及缺少所组成的群组；
(ii)X2系选自于由二甲基脯胺酸(dMP)、脯胺酸、α-胺基异丁酸(Aib)以及d-脯胺酸所组成的群组；
(iii)X3系选自于由二甲基脯胺酸、脯胺酸、α-胺基异丁酸以及d-脯胺酸所组成的群组；
(iv)X4系选自于由组胺酸、丝胺酸、缬胺酸、亮胺酸、d-亮胺酸及苏胺酸所组成的群组；
(v)X5为脯胺酸或丙胺酸；
(vi)X6系选自于由酪胺酸、d-缬胺酸、d-天冬胺酸、色胺酸及苯丙胺酸所组成的群组；以及
(vii)X7系选自于由脯胺酸、dMP、d-脯胺酸以及缺少所组成的群组；
所述肽能够减少在一小鼠中地塞米松诱导的脾脏及/或胸腺重量减轻的量，但条件是所述肽并非由SEQ ID NO 42、43或44中所述的序列所组成
根据本发明的这方面的肽可以是5或7个胺基酸长度。因此，当X1不存在时，X7也不存在。
本发明的这方面所设想的肽的例子在SEQ ID NO：6-34中列出。
在一实施例中，所述肽由SEQ ID NO：6-34中所述的任何一个序列组成。
在另一实施例中，所述肽由SEQ ID NO：6-13中所述的序列之一组成。
值得注意的是，在本发明的这方面，胺基酸根据SEQ ID NO：45中的分子式列出，除指定的突变外，不考虑保守性/非保守性突变。此外，当一特定的立体异构体出现在分子式中时，很明显它不能被另一立体异构体所取代。
根据本发明的另一方面，提供了一种不超过10个胺基酸的分离肽，所述分离肽包括选自于由SEQ ID NO：1-33以及34所组成的群组的一胺基酸序列，其中所述肽能够减少在一小鼠中地塞米松诱导的脾脏及/或胸腺的重量减轻的量。
在一实施例中，本发明的这方面的肽是10个胺基酸的长度。
在一实施例中，本发明的这方面的肽长度为9个胺基酸的长度。
在一实施例中，本发明的这方面的肽长度为8个胺基酸的长度。
在一实施例中，本发明的这方面的肽长度为7个胺基酸的长度。
在一实施例中，本发明的这方面的肽长度为6个胺基酸的长度。
在一实施例中，本发明的这方面的肽长度为5个胺基酸的长度。
这类肽的例子包括SEQ ID NO：1-34中列出的肽，更具体地说，包括SEQ ID NO：1-5中列出的肽。
对于本文所述的任何肽，本发明还考虑逆反肽(retro-inverso peptide)。这种肽对蛋白酶具有抗性，由相反顺序的D-胺基酸组成，导致肽主干改变，但侧链方向不变。
本文所描述的肽可用于治疗无数的疾病，包括那些与压力相关的反应相关的疾病。这些包括病理状况，如神经退行性疾病(如中风、帕金森氏症及阿尔茨海默症)、心肌梗死、暴露于辐射或化疗制剂、炎症、损伤(如烧伤及中枢神经系统损伤)、细胞老化、高温、癫痫、缺氧(如缺血及中风)，以及移植前的移植组织及器官。
这些病症还包括自体免疫性疾病，其特征在于个体对至少一种身体正常成分的免疫状态。这些现象尤其在病理学中观察到，包括但不限于与系统性红斑狼疮病(systemiclupus erythematosus disease，SLE)、修格连氏症候群(Gougerot-Sjogren syndrome)(或干燥病)和类风湿性多关节炎相关的感染，以及诸如结节病和骨质减少、脊椎关节炎等病理学。硬皮病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、甲状腺机能亢进、艾迪生病、自身免疫性溶血性贫血、克罗恩病、古巴斯捷氏症候群(Goodpastures syndrome)、格雷夫斯病(Graves’disease)、桥本甲状腺炎(Hashimoto’sthyroiditis)、特发性紫癜出血(idiopathic purpura hemorrhage)、胰岛素依赖型糖尿病、肌无力、寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris)、恶性贫血(pernicious anemia)、链球菌感染后肾小球肾炎(poststreptococcal glomerulonephritis)、牛皮癣和自发不育，以及在移植排斥和移植物抗宿主病期间观察到的即时或延迟现象。在另一实施例中，本发明的肽可用于治疗局部缺血或心肌梗塞。
根据特定实施例，所述疾病为ALS。
本发明考虑的其他疾病包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森氏病、创伤后继发性退行、中风、CNS中毒、青光眼、黄斑部退行、1型糖尿病、系统性红斑狼疮、自体免疫性葡萄膜炎、移植物抗宿主病、移植排斥、关节炎、全身炎症反应综合征(systemic inflammatoryresponse syndrome，SIRS)、炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)、成人呼吸窘迫综合征(adult respiratory distress syndrome，ARDS)、银屑病(psoriasis)、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、心肌梗塞、放射病、高热、缺氧、暴发性肝毒性、肾衰竭、不孕症和诸多其它病症。
移植物排斥现象是指个体对故意植入患者体内的外来成分(体液，如血液、脑脊液等，细胞、组织、器官、抗体等)的免疫状态。
在这里使用的术语“退行性症状”、“退行性疾病”及“退行性条件”是指以不适当的细胞增殖或不适当的细胞死亡或在两者的某些情况下，或异常或失调的细胞凋亡为特征的任何紊乱、疾病或条件。这些条件还包括，尽管在单细胞水平上适当及调节，过度细胞凋亡与器官功能障碍或衰竭相关的条件。
在一实施例中，所述肽用于防止患有肿瘤性疾病并为治疗癌症而接受化疗及/或放疗的受试者的非恶性组织或细胞中的细胞死亡。
此处使用的术语“炎症性疾病”及“炎症条件”是指过度或不受调控的炎症反应导致过度炎症症状、宿主组织损伤或组织功能丧失的任何疾病或条件。
在一实施例中，炎症性疾病或条件是自体免疫性疾病。
在另一实施例中，炎症性疾病或条件具有与从IL-6及TNF-α中选择的至少一种促炎症细胞因子的产生相关的病因。
在另一实施例中，所述疾病或条件系选自于由阿尔茨海默病、帕金森氏病、创伤后继发性退行、中风、中枢神经系统中毒、青光眼、黄斑部退行、心肌梗死、放射性疾病、高温、缺氧、暴发性中毒性肝、肾衰竭及不育症所组成的群组。
在另一实施例中，所述疾病包括色素性视网膜炎及黄斑部退行。
在另一实施例中，所述疾病包括中风或心肌梗死。
所述肽可以单独提供，也可以作为药物组合物的一部分，与合适的载体或辅料混合。
此处所使用的“药物组合物”是指将本文所述的一种或多种活性成分与其他化学成分(如生理上适宜的载体及辅料)制备而成。药物组合物的目的是便于将化合物施用于生物体。
这里的“活性成分”指的是对生物效应负责的肽。
以下，术语“生理上可接受的载体”及“药学上可接受的载体”可以互换使用，指的是一种载体或稀释剂，所述载体或稀释剂不会对生物体造成显着刺激，也不会削弱所给化合物的生物活性及性质。辅助词包括在这些术语下。
本技术中众所周知的含有肽或多肽作为有效成分的药物组合物的制备。通常，这些组合物制备为可指示的溶液或悬浮液，然而，也可以制备在注射前可悬浮或增溶的固体形式。所述制剂也可以被乳化。活性治疗成分与无机及/或有机载体混合，这些载体在药物上是可接受的，并与活性成分相容。载体是药物上可接受的辅料(赋形剂)，当添加到药物组合物中以使组合物具有适当的稠度或形式时，含有或多或少的惰性物质。合适的载体是，例如，水、生理盐水、葡萄糖、甘油、乙醇或其类似物及其组合。此外，如果需要，所述组合物可以包括少量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂及pH缓冲剂，可增强活性成分的有效性。
本文中描述的肽的毒性及治疗效果可以通过细胞培养或实验动物中的标准制药程序来确定，例如，通过确定目标化合物的IC50(提供50％抑制的浓度)及LD50(导致50％实验动物死亡的致死剂量)。从这些细胞培养分析及动物研究中获得的数据可用于制定人体使用的一系列剂量。剂量可根据使用的剂型及给药途径而变化。具体的配方、给药途径及剂量可由个别医生根据病人的情况选择。(参见Fingl等人，1975年)。
在本发明的给药组合物中使用的活性剂的量是有效地实现特定活性剂用于目标指示的目的的量。组合物中活性剂的量通常是药理学、生物学、治疗或化学上有效的量。但是，当所述组合物以剂量单位形式使用时，使用量可以较小，因为所述剂量单位形式可以在单一组合物中包括多个化合物或活性剂，也可以包括药物上、生物上、治疗上或化学上有效的分割量。然后，总有效剂量可以以累积单位给药，其中总有效剂量为活性剂。
本发明的肽的治疗有效量是当给药给病人时能够发挥抗细胞凋亡活性及/或抗炎活性的量。用于检测本发明的肽抗细胞凋亡活性的测定方法包括但不限于，用特定的荧光色素(如碘化丙啶及溴化乙啶)对DNA进行染色、Annexin V测定、TUNEL测定等；这种分析的某些非限制性例子在下面的例子中提出。检测抗炎肽活性的分析方法在本领域中也很是众所周知的。
虽然本发明的肽的适当剂量因给药途径、年龄、体重、性别或患者的状况而异，最终应由医生决定，但适合成人的剂量(例如静脉给药)一般可在约2-6毫克体重之间，较佳在约2-4毫克/公斤之间。
本发明的药物组合物包括本发明的一种或多种化合物，以及一种或多种辅料或稀释剂。在一实施例中，所述化合物或所述化合物的溶剂或盐的一种或多种。
本文使用的术语“药物上可接受的盐”，指的是基本上对生物无毒的盐。典型的药物可接受的盐包括通过本发明的化合物与药物可接受的矿物酸或有机酸反应制备的那些盐。这种盐也被称为酸添加盐。
包括所述化合物及活性剂的组合物在将活性剂输送到选定的生物系统方面具有效用，并且与不使用所述活性剂相比，在增加或改善活性剂的生物利用度方面具有效用。输送可以通过在一段时间内输送更有活性的药剂，或在特定的时间段内输送活性剂(例如加快或延迟输送)或在一段时间内(例如持续输送)来改进。
因此，根据本发明使用的药物组合物可以使用一个或多个生理上可接受的载体，包括辅料及助剂，以常规方式配制，这些载体促进将活性化合物加工成可用于制药的制剂。正确的配方取决于所选择的给药途径。
所述药物组合物可通过任何常规及适当的途径局部或系统给药，包括但不限于口服、腹腔内、肠外、静脉、肌肉内、皮下、经皮、鞘内、局部、直肠、颊部、吸入或鼻内。
对于注射，本发明的化合物可以在水溶液中配制，优选在生理相容缓冲液中，如汉克溶液、林格溶液或生理盐水缓冲液中配制。对于经粘膜给药，渗透剂适用于要渗透的屏障在配方中。这种渗透剂，例如DMSO或聚乙二醇，在本领域中通常是已知的。
可口服的药物组合物，包括由明胶制成的推合胶囊，以及由明胶及增塑剂制成的柔软、密封胶囊，如甘油或山梨醇。推合胶囊可以在与填充物(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)、润滑剂(如滑石粉或硬脂酸镁)以及选择性稳定剂的混合物中含有活性成分。
在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮在适当的液体中，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，还可以添加稳定剂。所有口服制剂的剂量应与所选择的给药途径相适应。
或者，本发明的化合物可以合并到口服液制剂中，例如，水或油悬浮液、溶液、乳剂、糖浆或酏剂。此外，含有这些化合物的配方可以在使用前作为干燥产品与水或其他合适的载体组成。这种液体制剂可能含有常规添加剂，如悬浮剂，如山梨醇糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/糖糖浆、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶及氢化食用脂肪；乳化剂，如卵磷脂、单油酸山梨醇或金合欢；非水性载体(可包括食用油)，如杏仁油、分馏椰子油、油酯、丙二醇及乙醇；防腐剂，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯及山梨酸。
对于吸入给药，根据本发明所使用的肽通过使用适当的推进剂，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳，以来自加压包或雾化器的气溶胶喷雾呈现的形式方便地提供。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供一个阀门来输送计量量来确定。用于吸入器或吸入器的，例如明胶制成的胶囊及粉盒，配制时可包括所述肽的粉状混合物及适当的粉状基质，如乳糖或淀粉。
本发明的药物组合物也可用于局部及局域应用。在这里使用的术语“局部的”是指“与特定的表面区域有关的”，例如皮肤及粘膜，局部的制剂应用于表面的某一区域只会影响其应用的区域。所述肽/肽类似物的配方可作为凝胶、软膏、乳膏、乳液及包括透皮贴片在内的缓释配方局部给药，并可包括脂质体及任何其他药学上可接受的适合局部给药的载体。本文所述的药物组合物也可包括合适的凝胶相固体载体或辅料。这种载体或辅料的例子包括但不限于，碳酸钙、磷酸钙、各种醣、淀粉、纤维素衍生物，明胶及聚合物，如聚乙二醇。
如果需要，本发明的组合物可以在包装或分配器装置中呈现，例如FDA批准的试剂套组，所述试剂套组可以包括一个或多个含有活性成分的单位剂型。例如，所述包装可包括金属或塑料箔，如吸塑包装。包装或分配器装置可能附有管理说明。包装或分配器还可以附有与容器有关的注意事项，其形式由管制药品制造、使用或销售的政府机构规定，注意事项反映所述机构对成分或人体或兽医管理机构的形式的批准。例如，此类注意事项可能是美国食品及药物管理局批准的处方药标签或批准的产品说明书。如上所述，包括在兼容的药物载体中配制的本发明制剂的组合物，也可以制备，放置在适当的容器中，并标记用于治疗指定的状况。
在这里，“大约”指的是±10％。
术语“包括(comprise)”、“包括有(comprising)”、“包括(includes)”、“包括有(including)”、“具有(having)”及其共轭词的意思是“包括但不限于”。
术语“由...组成(consisting of)”是指“包括并限于”。
术语“实质上由...组成consisting essentially of”是指所述成分、方法或结构可以包括额外的成分、步骤及/或部分，但前提是这些额外的成分、步骤及/或部分不会实质性地改变所要求的成分、方法或结构的基本及新的特征。
此处使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数形式，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一化合物”或“至少一化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。
在整个申请中，本发明的各种实施例可以以范围格式提出。应该理解的是，范围格式的描述仅仅是为了方便及简短，不应该被解释为对发明范围的一个不灵活的限制。因此，对一个范围的描述应该认为已经明确地揭示了所述范围内所有可能的子范围以及各个数值。例如，描述一范围，如1到6，应该认为有专门公开的子范围，如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等，以及所述范围内的个别数字，如1、2、3、4、5及6。这与范围的广度无关。
无论何时在本文提出一个数值范围，它意味着包括任何引用的数字(分数或整数)在所提出的范围内。术语“介于”第一个提出数字及第二个提出数字之间的“一范围/多个范围之间(ranging/ranges between)”，以及“自”第一个提出数字“到”第二个提出数字之间的“一范围/多个范围(ranging/ranges from)”在这里可以互换使用，包括第一个提出数字及第二个提出数字之间的所有分数及整数。
在这里，“方法”是指完成某一任务的方式、手段、技术及程序，包括但不限于化学、药理、生物、生化及医学从业人员已知的或由已知的方式、手段、技术及程序发展而来的方式、手段、技术及程序。
在这里使用的术语“治疗”包括废除、实质上抑制、减缓或逆转一种疾病的进展，实质上改善一种疾病的临床或美学症状，或者实质上防止一种疾病的临床或美学症状的出现。
值得注意的是，本发明的某些特征，为了清晰起见，可以在单独实施例的上下文中描述，也可以组合在单个实施例中提供。相反地，本发明的各种特征(为简单起见，在单个实施例的上下文中描述)也可以单独提供或以任何适当的子组合提供，或作为本发明的任何其他所描述的实施例的适当的提供。在各种实施例的上下文中描述的某些特征不能被认为是这些实施例的基本特征，除非没有这些要素，所述实施例是无效的。
如上所述以及在以下的权利要求部分中所述的本发明的各种实施例及各方面在以下示例中找到了实验支持。
示例
现在参考下列示例，这些示例与上述描述一起以非限制性的方式说明本发明的一些实施例。
通常，这里使用的命名法及本发明中使用的实验室程序包括分子、生化、微生物及重组DNA技术。这种技术在文献中有详尽的解释。例如，参见Sambrook等人(1989年)的“分子克隆：实验室手册”；“分子生物学的当前协议”卷I-III Ausubel，R.M.，主编(1994年)；Ausubel等人，“分子生物学的当前协议”，John Wiley及Sons，巴尔的摩，马里兰州(1989年)；Perbal，“分子克隆的实用指南”，John Wiley及Sons，纽约(1988年)；Watson等人，“重组DNA”，科学美国图书，纽约；Birren等人编“基因组分析：实验室手册系列”，第1-4卷，冷泉港实验室出版社，纽约(1998年)；美国专利号：4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659及5,272,057年；“细胞生物学：实验室手册”，第I-III卷Cellis，J.E.，编辑，(1994年)；“动物细胞培养-基本技术手册”，Freshney，Wiley-Liss，N.Y.(1994年)，第三版；“当前免疫学协议”第I-III卷，Coligan J.E.编辑，(1994年)；Stites等人编辑，“基础及临床免疫学”(第8版)，Appleton及Lange，Norwalk，CT(1994年)；Mishell及Shiigi编辑，“细胞免疫学中的选定方法”，W.H.弗里曼公司，纽约(1980年)；可用的免疫测定在专利和科学文献中被广泛描述，参见，例如，美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771及5,281,521；“寡核苷酸合成”Gait，M.J.，编辑(1984年)；“核酸杂交”Hames，B.D.及Higgins S.J.编辑(1985年)；“转录及转译”Hames，B.D.及HigginsS.J.编辑(1984年)；“动物细胞培养”Freshney，R.I.编辑(1986年)；“固定化细胞和酶”IRLPress，(1986年)；“分子克隆实用指南”Perbal，B.，(1984年)和“酶学方法”第1-317卷，学术出版社；“PCR方案：方法指南及应用”，Academic Press，圣地牙哥，加州(1990年)；Marshak等人，“蛋白质纯化及表征策略-实验室课程手册”CSHL Press(1996年)；以上所有均通过引用的方式并入本文。在整份文件中提供了其他一般性参考。其中的程序被认为是本领域公知的并且是为了方便读者而提供的。其中包括的所有信息通过引用并入本文。
示例1
方法：
地塞米松是一种皮质类固醇药物，其诱导免疫细胞及淋巴样组织细胞凋亡。BALB/c小鼠用于检查候选肽拯救淋巴细胞免于凋亡的能力。小鼠腹腔被注射100μg地塞米松。地塞米松处理的小鼠立即接受地塞米松处理后24小时注射候选肽(200μg肽/小鼠)。第一次处理后48小时牺牲小鼠。称重脾脏及胸腺，计数两器官的全细胞数。
筛选中使用的肽为SEQ ID NO：1-13。以SEQ ID NO：42的肽为阳性对照。SEQ IDNO：35-41的肽作为阴性对照。
结果：
结果汇总在表3及表4中
表3
Figure BPA0000326488540000261
表4
Figure BPA0000326488540000262
地塞米松诱导脾脏及胸腺重量减轻，脾脏细胞数量减少约50％。与正常小鼠相比，胸腺细胞数量减少了近60％。
表3中所有的肽均较SEQ ID NO：42有显着改善。与SEQ ID NO：42相比，表4中所有的肽的作用降低。
虽然已经结合其具体实施例描述了本发明，但很明显，许多替代方案、修改及变化对于本技术中的技术人员来说是显而易见的。因此，它旨在包括符合所附权利要求的精神及广泛范围的所有这些替代办法、修改及变更。
本规范中提到的所有公开内容、专利及专利申请在此通过引用完整地并入到本说明书中，如同每个单独的公开内容、专利或专利申请通过引用具体地及单独地表示要纳入本说明书中一样。此外，在本申请中引用或识别任何参考不得被解释为承认所述参考是本发明的现有技术。就使用章节标题而言，它们不应被解释为必然限制。
此外，本申请的优先权文件通过引用整体并入本文。
Figure IPA0000326488470000011
Figure IPA0000326488470000021
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Claims (17)

1.一种由5或7个胺基酸组成的分离肽，其特征在于：所述分离肽是由分子式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7，即为SEQ ID NO：45所表示的一胺基酸序列所组成，其中
(i)X1系选自于由亮胺酸、d-亮胺酸、d-缬胺酸、d-精胺酸以及缺少所组成的群组；
(ii)X2系选自于由二甲基脯胺酸、脯胺酸、α-胺基异丁酸以及d-脯胺酸所组成的群组；
(iii)X3系选自于由二甲基脯胺酸、脯胺酸、α-胺基异丁酸以及d-脯胺酸所组成的群组；
(iv)X4系选自于由组胺酸、丝胺酸、缬胺酸、亮胺酸、d-亮胺酸及苏胺酸所组成的群组；
(v)X5为脯胺酸或丙胺酸；
(vi)X6系选自于由酪胺酸、d-缬胺酸、d-天冬胺酸、色胺酸及苯丙胺酸所组成的群组；以及
(vii)X7系选自于由脯胺酸、dMP、d-脯胺酸以及缺少所组成的群组；
所述肽能够减少在一小鼠中地塞米松诱导的脾脏及/或胸腺重量减轻的量，但条件是所述肽并非由SEQ ID NO 42、43或44中所述的序列所组成。
2.如权利要求1所述的分离肽，其特征在于：所述分离肽是由选自于由SEQ ID NOs：6-33以及34所组成的群组的胺基酸序列所组成的。
3.如权利要求1所述的分离肽，其特征在于：所述分离肽是由选自于由SEQ ID NOs：6-12以及13所组成的群组的胺基酸序列所组成的。
4.一种不超过10个胺基酸的分离肽，其特征在于：所述分离肽包括选自于由SEQ IDNO：1-33以及34所组成的群组的一胺基酸序列，其中所述肽能够减少在一小鼠中地塞米松诱导的脾脏及/或胸腺的重量减轻的量。
5.如权利要求4所述的分离肽，其特征在于：所述分离肽包括选自于由SEQ ID NO：1-4以及5所组成的群组的一胺基酸序列。
6.如权利要求4所述的分离肽，其特征在于：所述分离肽是由选自于由SEQ ID NO：1-33以及34所组成的群组的所述胺基酸序列所组成的。
7.如权利要求1-6中任一项所述的分离肽，其特征在于：所述肽为钉合肽。
8.如权利要求1-6中任一项所述的分离肽，其特征在于：所述肽为环肽。
9.如权利要求4所述的分离肽，其特征在于：所述序列的顺序颠倒并且所有的所述胺基酸都是D型的。
10.如权利要求1-9中任一项所述的分离肽，其特征在于：所述肽连接到一细胞穿透部分。
11.如权利要求10所述的分离肽，其特征在于：所述细胞穿透部分连接到所述肽的一N端。
12.如权利要求1-11中任一项所述的分离肽在治疗与细胞凋亡相关的疾病的用途。
13.如权利要求12所述的分离肽，其特征在于：所述与细胞凋亡相关的疾病为一炎症性或一退行性疾病。
14.如权利要求13所述的分离肽，其特征在于：所述炎症性疾病为一自体免疫性疾病。
15.如权利要求13所述的分离肽，其特征在于：所述退行性疾病为一神经退行性疾病。
16.如权利要求12所述的分离肽，其特征在于：所述与细胞凋亡相关的疾病系选自于由老年性黄斑部退行、视网膜色素退行、中风以及心肌梗死所组成的群组。
17.一种药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包括如权利要求1-11中的任一项所述的肽作为一活性剂及一生理可接受载体。
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