CN115919797A - 一种类外泌体负载阿霉素在治疗神经母细胞瘤的应用 - Google Patents

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CN115919797A CN202211275753.4A CN202211275753A CN115919797A CN 115919797 A CN115919797 A CN 115919797A CN 202211275753 A CN202211275753 A CN 202211275753A CN 115919797 A CN115919797 A CN 115919797A
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何大维
李慕婕
王进奎
郭鹏
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Abstract

本发明公开了一种类外泌体负载阿霉素在治疗神经母细胞瘤的应用，具体是一种骨髓间充质干细胞类外泌体负载阿霉素在治疗神经母细胞瘤的应用及新型生物纳米药物载体的制备方法。本发明通过连续挤压法制备类外泌体，并通过硫酸铵梯度法成功负载阿霉素，证明其是一种产率更高、肿瘤特异性更高、心脏毒性更低、抗肿瘤效果更好的新型生物纳米药物载体。值得注意的是，这种新型纳米载体的有效载荷将不局限于阿霉素，还可以扩展到其他传统化疗药物、小分子抑制剂，甚至核酸或蛋白质药物，为开发针对神经母细胞瘤或其他儿童肿瘤的新型精准药物带来希望。

Description

一种类外泌体负载阿霉素在治疗神经母细胞瘤的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及类外泌体负载阿霉素在治疗神经母细胞瘤的应用，尤其是一种骨髓间充质干细胞类外泌体负载阿霉素在治疗神经母细胞瘤的应用及新型生物纳米药物载体的制备方法。。
背景技术
神经母细胞瘤(NB)是儿童最常见的颅外实体瘤。在世界范围内，NB的发病率占所有儿童癌症的6％～10％。由于晚期NB患者易复发、远处转移和耐药，尽管积极治疗，NB患儿预后仍较差，5年总生存率小于50％。化疗是目前NB患儿综合治疗的重要组成部分。传统化疗药物虽然对肿瘤具有很高的致死率，但由于其对肿瘤的特异性较差，体内不良反应严重，成为NB治疗过程中的巨大障碍。开发靶向NB活性高、毒性低的新型药物纳米载体将是NB治疗的重大突破。
外泌体是一种几乎所有类型的细胞都积极分泌的细胞外囊泡(EV)，其大小相对均匀，直径在30nm～150nm之间，因此可以很容易地通过血液肿瘤屏障。此外，外泌体具有脂质双层膜结构，其较低的免疫原性使其能够有效地逃避免疫清除，因而可以延长血液循环时间，保护其内容物免受酶降解。此外，来自不同亲本细胞的外泌体在体内外均表现出比传统化疗药物更好的肿瘤靶向活性。基于上述优势，外泌体作为一种新型的生物纳米odds近年来被广泛研究。
然而，外泌体作为药物载体，由于产量低、耗时长、规模化制备的局限性，很难进入临床或临床前转化阶段。与外泌体相比，骨髓间充质干细胞类外泌体(exosome-mimetics，EM)似乎是向临床转化的一个有前途的替代解决方案。将亲本细胞通过不同孔径的聚碳酸酯径迹蚀刻膜连续挤压制备成EMs，具有与亲本细胞高度相似的生物功能和特性。同时，EMs的产率远高于外泌体，具有类似的药物传递功能。EMs的脂质双分子膜结构可以保持药物稳定性、良好的组织通透性和低免疫原性。尽管EMs已被用于几种成人肿瘤治疗，但尚未有研究关注其对NB的治疗效果，NB是一种高度侵袭性的儿童肿瘤，急需靶向治疗。既往研究表明，骨髓间充质干细胞(BMSCs)在NB中可以蓄积14天。因此，我们假设骨髓间充质干细胞来源的EMs可以获得其亲本细胞向NB归巢的活性。本发明通过连续挤压骨髓间充质干细胞通过不同孔径的聚碳酸酯径迹蚀刻膜制备EMs，并主动负载一线化疗药物阿霉素靶向治疗NB，在体内外进一步评估其作为一种新型纳米药物载体的潜力。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种骨髓间充质干细胞类外泌体负载阿霉素在治疗神经母细胞瘤的应用及新型生物纳米药物载体的制备方法。
一种类外泌体负载阿霉素在治疗神经母细胞瘤的应用，其特征是所述类外泌体为骨髓间充质干细胞类外泌体。
一种新型生物纳米药物载体的制备方法，包括如下步骤：
1)细胞培养
人成神经细胞瘤细胞株SH-SY5Y和SK-N-DZ分别购自国家生物医学实验细胞资源库和美国型培养库；两种细胞系均在37℃和5％ CO2条件下使用添加10％胎牛血清的GibcoDMEM高糖培养基培养；
2)外泌体的分离
利用超速离心法分离骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)来源的外泌体，收集培养72h以上的BMSCs上清，在4℃下依次经300×g,10min；2000×g,10min；10000×g,30min进行粗离，去除细胞碎片或死细胞。然后收集上清液，在4℃下进行超速离心，离心条件为100000×g,70min，浓缩外泌体，所得外泌体沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤后，再次超速离心纯化，超速离心纯化条件为100000×g，70min，4℃，所得纯化的外泌体沉淀用PBS重悬；最后，纯化后的外泌体经0.22μm无菌过滤器过滤后置于-80℃保存；
3)EM和负载阿霉素的EM(EM-Dox)的制备
EM的制备：用PBS洗涤细胞1-2次后，刮取收集BMSCs，然后用微型挤出机，微型挤出机厂家为Avanti Polar Lipids,Inc.；挤压BMSC悬液依次通过不同孔径的聚碳酸酯膜过滤膜，过滤膜厂家为Whatman，过滤流程为10μm、5μm、1μm，每个孔径3次，然后用超速离心法，超速离心条件为100000×g,70min,4℃；浓缩纯化EM，最后经0.22μm的无菌过滤器过滤，-80℃保存；
EM-Dox的制备：收集骨髓间充质干细胞，分别经孔径为10μm和5μm的聚碳酸酯径迹蚀刻膜各挤压3次，超速离心纯化EM，超速离心纯化条件为100000×g，70min，4℃，用240mM硫酸铵溶液重悬，再经1μm聚碳酸酯径迹蚀刻膜挤压3次；然后经0.22μm的无菌过滤器过滤后参照Guo et al提出的硫酸铵浓度梯度法对阿霉素进行主动负载；再将样品转移到Slide-A-Lyzer，规格为MWCO 20kDa的透析盒中，室温下在pH 7.4PBS中透析过夜，去除EM外的硫酸铵；然后，在EM中加入终浓度为0.2-1.0mg/mL的阿霉素，在室温下共孵育6小时，以促进主动载药；最后，样品再次转移到Slide-A-Lyzer透析盒中，室温下在PH7.4 PBS缓冲液中透析过夜，去除游离的阿霉素，得到纯化后的EM-Dox，-80℃保存。
有益效果：
本发明通过系列挤压骨髓间充质干细胞制备EMs，并主动负载一线化疗药物阿霉素靶向治疗NB，并在体内外进一步评估其作为一种新型纳米药物载体的潜力。
本发明通过连续挤压法制备EMs，并通过硫酸铵梯度法成功负载阿霉素，证明其是一种产率更高、肿瘤特异性更高、心脏毒性更低、抗肿瘤效果更好的新型生物纳米药物载体。值得注意的是，这种新型纳米载体的有效载荷将不局限于阿霉素，还可以扩展到其他传统化疗药物、小分子抑制剂，甚至核酸或蛋白质药物，为开发针对NB或其他儿童肿瘤的新型精准药物带来希望。
附图说明
图1为本发明的EM-Dox的简单制备过程示意图。
图2为本发明的外泌体、EM和EM-dox的表征示意图，图中：(A)外泌体、EM和EM-dox的透射电镜图像显示典型的外泌体、EM和EM-dox的形态(比例尺为200nm)；(B)粒径分析表征的外泌体、EM和EM-dox的大小分布；(C)外泌体、EM和EM-dox峰值直径的比较；(D)Westernblot分析外泌体、EM和EM-dox中蛋白标志物的表达；(E)外泌体和EM的产量以107个骨髓间充质干细胞的总蛋白和粒子数来衡量；(F)EM-Dox在不同阿霉素浓度下的包封效率；(G)EM-Dox在pH7.4和pH5.5 PBS中的药物释放率。
图3为本发明的具有代表性的激光共聚焦显微镜图像显示EM-Dox在神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y(A)和SK-N-DZ(B)中3h、6h和9h后的分布示意图；比例尺为25μm。
图4为本发明的EM-Dox体外抗肿瘤作用示意图：EM-Dox对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y和SK-N-DZ的细胞毒活性(A)，(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)；细胞周期实验显示EM-Dox诱导SH-SY5Y(B)和SK-N-DZ(C)的G2/M期细胞阻滞。
图5为本发明的EM-Dox在体内的生物分布及抗肿瘤作用示意图；(A)注射EM-Dox-DIR和Free-DIR后6h、24h、48h小鼠近红外荧光图(每组3例)；肿瘤(B)和主要器官(C)的荧光定量。(D)从PBS(对照组)、EM(载体)、Free-Dox和EM-dox处理的小鼠身上切除SK-N-DZ肿瘤的大体图像(每组n＝6)；(E)使用卡尺测量肿瘤体积，密切监测肿瘤进展。(F)终点(第9天)肿瘤质量定量(*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001)。
缩写:EM，源自骨髓间充质干细胞的类囊泡；Free-Dox,游离阿霉素；EM-Dox，负载阿霉素的骨髓间充质干细胞的类囊泡；CK，肌酸激酶；WBC，白细胞计数；PLT，血小板计数；HGB，血红蛋白。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步说明。
如图1至图5。
材料和方法
1.1细胞培养
人成神经细胞瘤细胞株SH-SY5Y和SK-N-DZ分别购自国家生物医学实验细胞资源库和美国型培养库；两种细胞系均在37℃和5％ CO2条件下使用添加10％胎牛血清的GibcoDMEM高糖培养基培养；
1.2外泌体的分离
利用超速离心法分离骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)来源的外泌体，收集培养72h以上的BMSCs上清，在4℃下依次经300×g,10min；2000×g,10min；10000×g,30min进行粗离，去除细胞碎片或死细胞。然后收集上清液，在4℃下进行超速离心(100000×g,70min)浓缩外泌体，所得外泌体沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤后，再次超速离心纯化(100000×g，70min，4℃)，所得纯化的外泌体沉淀用PBS重悬；最后，纯化后的外泌体经0.22μm无菌过滤器过滤后置于-80℃保存；
1.3EM和负载阿霉素的EM(EM-Dox)的制备
EM的制备：用PBS洗涤细胞1-2次后，刮取收集BMSCs，然后用微型挤出机(AvantiPolar Lipids,Inc.)挤压BMSC悬液依次通过不同孔径的聚碳酸酯膜过滤器(Whatman)(10μm、5μm、1μm，每个孔径3次)，然后用超速离心法(100000×g,70min,4℃)浓缩纯化EM，最后经0.22μm的无菌过滤器过滤，-80℃保存。
EM-Dox的制备：收集骨髓间充质干细胞，分别经孔径为10μm和5μm的聚碳酸酯径迹蚀刻膜各挤压3次，超速离心纯化EM(100000×g，70min，4℃)，用240mM硫酸铵溶液重悬，再经1μm聚碳酸酯径迹蚀刻膜挤压3次；然后经0.22μm的无菌过滤器过滤后参照Guo et al提出的硫酸铵浓度梯度法对阿霉素进行主动负载；再将样品转移到Slide-A-Lyzer(MWCO20kDa)透析盒中，室温下在pH 7.4PBS中透析过夜，去除EM外的硫酸铵；然后，在EM中加入终浓度为0.2-1.0mg/mL的阿霉素，在室温下共孵育6小时，以促进主动载药；最后，样品再次转移到Slide-A-Lyzer透析盒中，室温下在PH7.4 PBS缓冲液中透析过夜，去除游离的阿霉素，得到纯化后的EM-Dox，-80℃保存。
1.4外泌体、EM和EM-dox的表征
采用透射电子显微镜(TEM)(日立，S-3000N，日本)观察外泌体、EM和EM-dox的结构和形态。使用Zeta View PMX 110(Particle Metrix,Meerbusch,Germany)和相应的ZetaView 8.05.14软件，在Viva Cell Biosciences公司使用纳米颗粒跟踪分析(NTA)测量粒径和浓度。Western Blot检测外泌体、EM和EM-dox中标志蛋白(ALIX、CD63、TSG101)的表达。此外，使用BCA蛋白测定试剂盒(Beyotime,P0012,China)测定外泌体和EM蛋白的总含量。
1.5测定阿霉素包封率
为了定量测定阿霉素，我们使用多功能酶标仪(Biotek Synergy H1,USA)测量每个样品中阿霉素的荧光强度(λEX＝480nm，λEM＝594nm)。用逐渐稀释的游离阿霉素(free-dox)设定标准曲线，包封率(％)＝样品中最终阿霉素含量/初始添加的阿霉素含量×100。
1.6体外药物释放率
取含2mL EM-Dox(阿霉素浓度336μg/mL)的Slide-A-lyzer透析盒(MWCO 20kDa)分别置于150mL PBS(PH＝5.5和PH＝7.4)中，37℃透析。3h、6h、9h、12h、24h、48h后，分别用1mL新鲜缓冲液代替1mL孵育液。采用多功能酶标仪测定孵育液中阿霉素的含量(如上所述)，并计算累积释药率。
1.7细胞摄取实验
PKH26红色荧光细胞标记试剂盒(λEX＝551nm；λEM＝567nm,Sigma-Aldrich，美国)被用于标记EM-dox。将2万个SH-SY5Y细胞和SK-N-DZ细胞接种于24孔载玻片上，培养24小时。加入IC50的EM-Dox，孵育1、3和6小时。PBS轻轻冲洗细胞，4％多聚甲醛固定30min。DAPI染色5min，再次冲洗载玻片，抗荧光猝灭剂封片，晾干过夜。最后，使用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM,Nikon,AX confocal,Japan)观察阿霉素是否位于EM中，EM-Dox是否被两种NB细胞系摄取。
1.8细胞增殖及IC50测定
Cell Counting Kit-8(MCE,HY-K0301,USA)检测EM-Dox对NB细胞的抗增殖活性。将2500个SH-SY5Y细胞和SK-N-DZ细胞分别接种于96孔板中。培养24h后，依次加入0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、7.5μg/ml和10μg/ml阿霉素浓度的EM-Dox。共孵育24h后，吸除原培养基，每孔加入含10％CCK8试剂的培养基100μL,37℃暗孵育2h。用酶标仪(Bio-Rad，美国)测量吸光度为450nm的光密度(OD)。未处理的细胞作为对照。细胞存活率(％)＝(OD处理-OD培养基)/(OD对照-OD培养基)×100。根据剂量-反应曲线测定EM-Dox对两株NB细胞最大半数50％抑制浓度(IC50)。
1.9细胞周期测定
SH-SY5Y和SK-N-DZ分别与PBS/EM/free阿霉素(free-dox)/EM-dox共孵育24h(均为EM-dox组的IC50)。根据说明书，使用碘化丙啶(PI)/RNase染色缓冲液(EM-DoxPharmingen TM,550825,USA)和流式细胞仪(EM-Dox Biosciences,USA)检测细胞周期。
1.10EM-Dox在体内的生物分布及抗肿瘤作用
EM-Dox荧光标记:用DiR染料荧光标记EM-Dox进行生物分布研究(中国大连美伦生物科技有限公司)。简单地说，将1010粒/mL EM-Dox用40μg/mL的DiR在37℃孵育30min。为了去除EM-Dox上未标记的游离DiR，样品用Slide-A-Lyzer透析盒((MWCO 10kDa))在PBS(pH＝7.4)中室温透析过夜，纯化后的EM-Dox-DiR保存在-80℃。
动物模型:按照重庆医科大学附属儿童医院伦理委员会批准的方案进行动物实验。4周龄雄性裸BALB/c小鼠购自中国江苏华创中国医药科技有限公司，左腋下皮下植入2×106SK-N-DZ 200μL DMEM悬浮液。
EM-Dox生物分布:在肿瘤体积约为100mm3时，将SK-N-DZ荷瘤小鼠随机分为2个治疗组，每只小鼠经尾静脉注射EM-Dox-DIR或Free-DIR 150μL。使用PerkinElmer IVISLumina III系统分别在注射后6h、24h和48h评估荧光强度。然后处死小鼠，解剖其心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织，再次评价荧光强度。采用Living Image(Version 4.5.2,PerkinElmer)对数据进行分析，比较器官与肿瘤之间荧光强度的差异。
EM-Dox的抗肿瘤作用及生物安全性:当肿瘤体积达到100mm3左右时，将荷瘤小鼠随机分为4组(n＝6)，每隔1天经尾静脉给予150μL PBS/EM/EM-dox/Free-Dox(阿霉素浓度为3mg/Kg)，共4次。给药后每隔一天测量小鼠体重，用游标卡尺测量肿瘤体积。给药后第9天处死小鼠去瘤测量肿瘤质量，取血送重庆医科大学附属儿童医院临床实验室检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血尿素氮(BUN)、血清肌酐(CRE)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、白细胞计数(WBC)、血红蛋白(HGB)和血小板计数(PLT)，以评估EM-Dox是否造成肝肾功能损害、心肌损伤或骨髓抑制。
1.11统计分析
使用GraphPad Prism(版本8.0.2,La Jolla,CA)对数据进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)或非参数检验，两组间比较采用独立样本T检验。P＜0.05为有统计学意义。
2.结果和讨论
2.1外泌体、EM和EM-Dox的制备和表征
EM-Dox的制备过程如图1所示。TEM显示，EM、EM-Dox和外泌体都是类圆形的，具有典型的脂质双层结构(图2A)。NTA显示，EXO和EM的峰值直径分别为120.9±2.5nm和120.7±2.2nm，非常接近。然而，EM-Dox的峰值直径稍大，为135.0±2.0nm(图2B，C)，这在以前的研究中也有报道，这可能是因为负载了阿霉素。此外，WB分析显示，在EM中也发现了外泌体标志物(CD63、TSG101和ALIX)(图2D)。这些结果表明，通过连续挤压制备的EM或EM-Dox具有类似于外泌体的形态和大小。也有报道说，EM和外泌体具有相似的蛋白质组表达谱，这表明EM可能具有与外泌体相似的药物输送能力。
然后，我们继续比较从相同数量的细胞中提取的EM和外泌体的产量。以前的各种研究报告表明，EM的产量比外泌体高几十倍甚至几百倍，这可能是由于细胞类型的不同或制备EM时涉及的一些细节。在本研究中(图2E)，由107个BMSCs获得的EM的蛋白质产量是外泌体的16.8倍。(160.0±40.9μg vs.9.5±2.0μg)，而粒子数产量是外泌体的26.3倍(8.96×1010vs.3.41×109)。EM的蛋白质产量较高的原因可能是在挤压细胞的过程中产生了一些杂蛋白。尽管如此，EM的粒子数产量仍然远远高于外泌体，这为EM在临床和临床前转化中取代外泌体作为药物纳米载体提供了更多的可能性。
2.2药物装载和药物体外释放
由于阿霉素可以自发地发出荧光，我们用荧光分光光度计作为一种简单的方法来测量阿霉素的封装效率。将不同量的游离阿霉素(最终浓度为0.2mg/mL、0.5mg/mL、0.5mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL)加入到1010粒/mL的EM中，相应的封装效率为25.8±0.3％、63.6±0.5％、77.9±0.5％，73.2±0.9％，这与以往其他研究一致，即药物封装效率在一定浓度区间内才以浓度依赖的方式逐渐增加。在本发明中，当阿霉素的孵化浓度达到1.0mg/mL时，药物的封装效率并没有高于0.8mg/mL组，而是有所下降(图2F)。
正常生理环境的pH值为7.4左右，而肿瘤微环境一般为酸性。为了研究EM-Dox在不同的pH环境下药物释放率是否有差异，我们比较了EM-Dox在pH7.4和pH5.5的PBS中不同时间段的阿霉素释放量(图2G)。在pH7.4的PBS中，阿霉素的累积释放率在3小时为12.7±3.0％，48小时为51.6±2.4；而在pH5.5的PBS中，3小时为16.9±2.1％，48小时为86.1±2.3。这表明EM-Dox在体内的肿瘤微环境中释放药物的速度可能比在正常生理环境中更快。这可能意味这EMs作为药物载体可能可以增加药物的血液循环时间和肿瘤积累，从而提高了治疗效果，同时避免了对正常组织的进一步损害。
2.3神经母细胞瘤(NB)细胞对EM-Dox的吸收
PKH26红色荧光标记EM的脂质膜，而绿色荧光信号代表阿霉素。与EM-Dox共同培养1、3和6小时后，SH-SY5Y和SK-N-DZ都内化了EM-Dox。此外，EM和阿霉素在细胞内和细胞外都呈现了明显的共定位(图3A，B)。一方面，这意味着我们成功地将阿霉素包封入EM；另一方面，这也表明EM和阿霉素可同时被内吞到细胞质中。
2.4体外抗肿瘤作用
为了比较EM-Dox和Free-Dox在体外抑制NB细胞增殖的差异，将SH-SY5Y和SK-N-DZ分别与EM-Dox和Free-Dox共同培养24小时，进行CCK8检测(图4A)。在低剂量范围内(0.25-2.5μg/mL)，EM-Dox对NB细胞增殖的抑制作用比Free-Dox强，而且EM-Dox的IC50比Free-Dox低(SH-SY5Y：0.52μg/mL vs.0.87μg/mL；SK-N-DZ：0.76μg/mL vs.1.01μg/mL)。这表明与Free-Dox相比，NB细胞可能对EM-Dox更敏感，而且用EM-Dox在较低的剂量下也能达到相同的抗肿瘤效果。
阿霉素的抗肿瘤的主要机制之一是细胞周期停滞，所以我们进一步比较了EM-Dox和Free-Dox对细胞周期影响的差异，并以PBS和EM作为对照。如图4所示，当用PBS/EM/Free-Dox/EM-Dox(均为EM-Dox的IC50)处理SH-SY5Y(图4B)和SK-N-DZ(图4C)时，流式细胞仪结果显示，EM-Dox和Free-Dox都能诱发明显的G2/M期停滞。这表明EM-Dox能有效地干扰细胞周期，导致细胞代谢紊乱。此外，虽然以前的研究表明EM也有抗肿瘤作用，但在我们的研究中EM对NB细胞的细胞周期没有明显影响，说明EM可能不会杀死NB细胞。
2.5EM-Dox在体内的生物分布情况
为了观察EM-Dox在体内的分布，评估其靶向肿瘤的能力，我们将EM-Dox-DIR和free-DIR通过尾静脉注射到荷瘤裸鼠体内，并在给药后6、24和48小时使用IVIS获得荧光图像。从图5A可以看出，EM-Dox-DIR和free-DIR在6小时时都已到达肿瘤部位，而EM-Dox-DIR在24小时时肿瘤部位的荧光信号最强，48小时时稍有减弱。相反，在游离DIR组中，24小时和48小时时在肿瘤部位没有观察到明显的荧光信号。这表明EM-Dox可以在体内靶向肿瘤并增加在肿瘤的停留时间。从小鼠身上取出肿瘤和主要器官，再次检测荧光信号。结果显示，EM-Dox-DIR和游离DIR都主要聚集在肝脏和脾脏(图5B)，但只有EM-Dox组的肿瘤组织出现明显的荧光信号(图5C)，这与体内的成像结果基本一致。
2.6EM-Dox在体内的抗肿瘤效果和生物安全性评价
高危NB患儿的预后很差，五年生存率不到50％。由于MYCN扩增是NB的高危因素之一，我们选择MYCN扩增的SK-N-DZ细胞建立了一个荷瘤小鼠模型，以评估EM-Dox对高危NB的治疗效果。用PBS、EM、Free-Dox和EM-Dox(3mg/Kg)治疗肿瘤小鼠后，每隔一天用游标卡尺测量肿瘤体积。结果发现，EM-Dox和Free-Dox都能抑制肿瘤的生长，EM-Dox组和Free-Dox组的肿瘤体积差异有统计学意义(图5D，E)。然而，作为对照组，PBS组和EM组的肿瘤体积没有统计学差异，而且肿瘤生长迅速。EM在体内仍未显示出对NB的抗肿瘤作用。用药后第9天收获的肿瘤质量的比较与上述结果一致(图5F)。与PBS对照组相比，EM-Dox明显减少NB生长67％，约为Free-Dox的2.2倍。EM-Dox在体内显示出比Free-Dox更强的抗NB增殖作用。
同时，在给药后监测了小鼠的体重，发现EM-Dox并没有引起明显的体重下降，这在一定程度上证明了EM-Dox的生物安全性。此外，由于阿霉素可能引起心肌损伤、骨髓抑制、肝肾功能损伤，我们还采集了小鼠的血液样本，测量其相关的指标水平(表1)。结果显示，ALT、AST、BUN、CRE、LDH水平在PBS、EM、Free-Dox和EM-Dox组之间没有明显差异。值得注意的是，组间CK的差异是显著的。进一步的统计分析显示，Free-Dox组的CK水平明显高于对照组，而EM-Dox组的CK水平与对照组无明显差异。这表明EM-Dox可能比Free-Dox更不容易引起心肌损伤，EM-Dox是一种安全有效的抗NB的纳米药物，而且副作用小。最后，4组之间的WBC、PLT、HGB没有明显差异，这可能是由于治疗时间太短，累积剂量不足以造成骨髓抑制。因此，EM-Dox是否能减少由Free-Dox引起的骨髓抑制的风险可能需要进一步研究。
3.结论
本发明通过连续挤压法制备EMs，并通过硫酸铵梯度法成功负载阿霉素，证明其是一种产率更高、肿瘤特异性更高、心脏毒性更低、抗肿瘤效果更好的新型生物纳米药物载体。值得注意的是，这种新型纳米载体的有效载荷将不局限于阿霉素，还可以扩展到其他传统化疗药物、小分子抑制剂，甚至核酸或蛋白质药物，为开发针对NB或其他儿童肿瘤的新型精准药物带来希望。

Claims (2)

1.一种类外泌体负载阿霉素在治疗神经母细胞瘤的应用，其特征是所述类外泌体为骨髓间充质干细胞类外泌体。
2.一种新型生物纳米药物载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)细胞培养
人成神经细胞瘤细胞株SH-SY5Y和SK-N-DZ分别购自国家生物医学实验细胞资源库和美国型培养库；两种细胞系均在37℃和5％CO2条件下使用添加10％胎牛血清的Gibco DMEM高糖培养基培养；
2)外泌体的分离
利用超速离心法分离骨髓间充质干细胞来源的外泌体，收集培养72h以上的BMSCs上清，在4℃下依次经300×g,10min；2000×g,10min；10000×g,30min进行粗离，去除细胞碎片或死细胞；然后收集上清液，在4℃下进行超速离心浓缩外泌体，所得外泌体沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤后，再次超速离心纯化，所得纯化的外泌体沉淀用PBS重悬；最后，纯化后的外泌体经0.22μm无菌过滤器过滤后置于-80℃保存；
3)EM和负载阿霉素的EM的制备
EM的制备：用PBS洗涤细胞1-2次后，刮取收集BMSCs，然后用微型挤出机挤压BMSC悬液依次通过不同孔径的聚碳酸酯膜过滤器，然后用超速离心法浓缩纯化EM，最后经0.22μm的无菌过滤器过滤，-80℃保存；
EM-Dox的制备：收集骨髓间充质干细胞，分别经孔径为10μm和5μm的聚碳酸酯径迹蚀刻膜各挤压3次，超速离心纯化EM，用240mM硫酸铵溶液重悬，再经1μm聚碳酸酯径迹蚀刻膜挤压3次；然后经0.22μm的无菌过滤器过滤后参照Guo et al提出的硫酸铵浓度梯度法对阿霉素进行主动负载；再将样品转移到Slide-A-Lyzer透析盒中，室温下在pH 7.4PBS中透析过夜，去除EM外的硫酸铵；然后，在EM中加入终浓度为0.2-1.0mg/mL的阿霉素，在室温下共孵育6小时，以促进主动载药；最后，样品再次转移到Slide-A-Lyzer透析盒中，室温下在PH7.4PBS缓冲液中透析过夜，去除游离的阿霉素，得到纯化后的EM-Dox，-80℃保存。
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Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MUJIE LI等: "Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells ablate neuroblastoma tumor in vitro and in vivo", BIOMATERIALS ADVANCES, pages 1 - 11 *

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