CN115918525A - 一种高压电场低温等离子体激活农作物种子的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高压电场低温等离子体激活农作物种子的方法及其应用，属于农作物种植技术领域。本发明提供了一种高压电场低温等离子体激活农作物种子的方法，包括如下步骤：(1)将农作物种子与水混合，浸泡4～24h，得到浸泡过的种子；(2)将所述浸泡过的种子在80～130kv电压下进行放电激活，得到激活的种子。利用该方法可以提高作物的产量、提高作物的耐热、抗病的性能，为后续得到优良的种子提供科学依据。
Description
技术领域
本发明涉及农作物种植技术领域，尤其涉及一种高压电场低温等离子体激活农作物种子的方法及其应用。
背景技术
不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)是起源于中国的十字花科芸薹属白菜类作物，别名小白菜、青菜、油菜等，营养价值高，在中国各地普遍栽培，在长江中下游广泛种植，广受消费者喜爱。近年由于片面追求高产和集约化品种的选育推广，育种材料的遗传背景日渐狭窄，种植品种遗传基础趋向单一化，主要体现在优异基因的匮乏及对抗逆境环境因素的遗传脆弱性。导致不结球白菜新品种选育遇到很大的技术瓶颈，甚至停滞。如何应对当前这一严峻的形势，己成为育种工作者面临的重大问题。构建一种对抗逆境环境优良的作物，是需要构建一定规模的突变体库，获得大量具有遗传多样性的变异材料，才能得到优良的作物。
随着人们生活水平的提高，市场需求发生了很大的变化。为提高不结球白菜育种效率或者赋予其优良、高产和特色功能性的品质，需要通过理化方法进行诱变或通过分子生物学技术对其进行诱导突变，产生新种质。目前，不结球白菜新品种培育以杂交育种和雄性不育系为主，育种周期长效率低，阻碍了不结球白菜育种进程。又因其品种遗传背景相近，很难选育出新的优良品种。如何快速创制新种质一直是不结球白菜育种的科学难题。
基于此，提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高压电场低温等离子体激活农作物种子的方法及其应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种高压电场低温等离子体激活农作物种子的方法，包括如下步骤：
(1)将农作物种子与水混合，浸泡4～24h，得到浸泡过的种子；
(2)将所述浸泡过的种子在80～130kv电压下进行放电激活。
作为优选，所述农作物种子包括水稻、小麦、玉米、油菜、大豆、番茄、辣椒、茄子、黄瓜、甜瓜、南瓜、菜豆、萝卜、甘蓝、芥菜、白菜或豆瓣菜。
作为优选，所述农作物种子与水混合的质量体积比为：1:4～6。
作为优选，所述浸泡为黑暗条件下浸泡；
所述浸泡时水的温度为18～22℃。
作为优选，所述放电激活的时间为0.5～10h；
所述放电激活的温度为18～25℃。
本发明还提供了所述的方法在提高作物产量、耐热性能方面的应用。
本发明还提供了所述的方法在诱变育种方面的应用。
本发明还提供了一种高压电场低温等离子体对农作物种子进行诱变的方法，包括如下步骤：
(1)将农作物种子与水混合，浸泡4～24h，得到浸泡过的种子；
(2)将所述浸泡过的种子在80～130kv电压下进行放电激活。
作为优选，所述农作物种子与水混合的质量体积比为1:4～6；
所述浸泡为黑暗条件下浸泡；
所述浸泡时水的温度为18～22℃；
作为优选，所述放电激活的时间为0.5～10h；
所述放电激活的温度为18～25℃。
本发明提供了一种高压电场低温等离子体激活农作物种子的方法及其应用。
本发明的方法可以提高作物的产量、耐热性能，还可以延长花期。本发明的高压电场低温等离子体，是指气体在强电磁场作用下产生的高度电离的气体云，由部分电子被剥夺后的原子及原子被电离后产生的正负电子组成的离子化气体状物质，呈现出高度激发的不稳定态，为物质的第四态。该方法为一种物理方法，具有使用方便、安全、有效突变率高等优点。
本发明通过高压电场低温等离子体诱导吸水膨胀的种子，可以获得较多的正向突变体(16.5％)。等离子体诱变相比EMS化学诱变，在M0代可以获得正向突变株的效率高。该方法为农作物及蔬菜构建突变体及种质创制，提供新途径。获得高诱导成功率的原理在于利用种子周围介质产生光电子、离子和活性自由基对种子细胞产生高强度遗传物质损失，进而利用细胞启动的SOS高容错率修复机制，产生种类多样的错配位点，最终形成了遗传稳定、种类丰富的突变株。
该方法具有比现有其他技术诱变周期短、成本低、易获得较多正向突变体等优点，整个操作具有简单、安全、无污染等特点。
附图说明
图1为不同电压对不结球白菜种子发芽率和发芽势的影响。
图2为不同处理时间对不结球白菜种子发芽率和发芽势的影响。
图3为不同处理时间对不结球白菜种子成活率的影响。
图4为正突变植株的获得。
图5为开花时间候选基因连锁的SSR标记在突变株上的分子检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种高压电场低温等离子体激活农作物种子的方法，包括如下步骤：
(1)将农作物种子与水混合，浸泡4～24h，得到浸泡过的种子；
(2)将所述浸泡过的种子在80～130kv电压下进行放电激活。
在本发明中，所述农作物种子包括水稻、小麦、玉米、油菜、大豆、番茄、辣椒、茄子、黄瓜、甜瓜、南瓜、菜豆、萝卜、甘蓝、芥菜、白菜或豆瓣菜；优选为不结球白菜。在本发明中，所述农作物种子与水混合的质量体积比为：1:4～6，优选为1:5。在本发明中，所述浸泡为黑暗条件下浸泡；所述浸泡时水的温度为18～22℃，优选为20℃。所述浸泡的时间优选为8～20h，进一步优选为14h。
在本发明中，所述电压优选为105kv；在本发明中，所述放电激活的时间为0.5～10h，优选为3.5～7h，进一步优选为5.25h；所述放电激活的温度为18～25℃，优选为21.5℃。
本发明还提供了所述的方法在提高作物产量、耐热性能方面的应用。
本发明还提供了所述的方法在诱变育种方面的应用。
本发明还提供了一种高压电场低温等离子体对农作物种子进行诱变的方法，包括如下步骤：
(1)将农作物种子与水混合，浸泡4～24h，得到浸泡过的种子；
(2)将所述浸泡过的种子在80～130kv电压下进行放电激活，得到诱变的种子。
在本发明中，所述农作物种子包括水稻、小麦、玉米、油菜、大豆、番茄、辣椒、茄子、黄瓜、甜瓜、南瓜、菜豆、萝卜、甘蓝、芥菜、白菜或豆瓣菜；优选为不结球白菜。在本发明中，所述农作物种子与水混合的质量体积比为1:4～6，优选为1:5；所述浸泡为黑暗条件下浸泡；所述浸泡时水的温度为18～22℃，优选为20℃；所述浸泡的时间优选为8～20h，进一步优选为14h。
在本发明中，所述电压优选为105kv；在本发明中，所述放电激活的时间为0.5～10h，优选为3.5～7h，进一步优选为5.25h；所述放电激活的温度为18～25℃，优选为21.5℃。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本实施例选用不结球白菜‘苏州青’为材料进行实验。
在本发明实施例中所述的发芽率＝(发芽种子粒数/供试种子粒数)×100％，催芽第7d统计；
所述的发芽势＝(发芽种子粒数/供试种子粒数)×100％，催芽第3d统计；
所述成活率＝(成活的株数/总株数)×100％，定植30d统计。
实施例1
选用不结球白菜材料‘苏州青’，按照种子与水的质量体积比为1:5加入到培养皿中，在20℃水温下黑暗吸水8h，得到浸泡过的种子。
将浸泡过的种子随机分成3组，第一组利用80kv的电压对种子进行放电激活，第二组利用100kv的电压对种子进行放电激活，第三组利用130kv的电压对种子进行放电激活，三组种子在激活时温度均为20℃，激活的时间均为4h，得到激活的种子。
每组选取50粒激活的种子，在20℃，16h光照/8h黑暗条件下进行培养3d，统计各组激活的种子的发芽势，7d统计各组激活种子的发芽率。结果图图1所示。
图1显示，在不同电压处理下发现，吸水膨胀8h的种子，在80kv和100kv条件下对发芽率和发芽势没有明显的影响，随着处理电压的增加，当电压达到130kv时，发芽率和发芽势受到显著抑制，发芽势降至40％，发芽率降至65％。本结果揭示出，高压低温等离子体诱变不结球白菜抑制发芽率和发芽势，在处理电压为130kv时效果最明显。
实施例2
选用不结球白菜材料‘苏州青’，按照种子与水的质量体积比为1:5加入到培养皿中，在20℃水温下黑暗吸水8h，得到浸泡过的种子。
剔除掉出芽的种子，将浸泡过的种子分成10组，第一组在恒定的峰值电压130kv条件下，放电激活0.5h；第二组在恒定的峰值电压130kv条件下，放电激活1h；第三组在恒定的峰值电压130kv条件下，放电激活1.5h；第三组在恒定的峰值电压130kv条件下，放电激活2h；第四组在恒定的峰值电压130kv条件下，放电激活2.5h；第五组在恒定的峰值电压130kv条件下，放电激活3h；第六组在恒定的峰值电压130kv条件下，放电激活4h；第七组在恒定的峰值电压130kv条件下，放电激活5h；第八组在恒定的峰值电压130kv条件下，放电激活6h；第九组在恒定的峰值电压130kv条件下，放电激活8h；第十组在恒定的峰值电压130kv条件下，放电激活10h；十组种子在激活时温度均为20℃。以不进行激活的种子为对照。
每组选取50粒种子，在20℃，16h光照/8h黑暗条件下进行培养3d，统计各组种子的发芽率，7d统计各组种子的发芽势。结果如图2所示。
图2显示，与对照相比，随着处理时间的延长，发芽率和发芽势均受到抑制，在处理2～4h之间其迅速受到抑制，发芽率从82％(2h)降低到60％(4h)，发芽势64％(2h)降低到32％(4h)，之后趋于平稳。本结果揭示出，高压低温等离子体诱变不结球白菜抑制发芽率和发芽势，在处理2～4h效果明显。
实施例3
选用不结球白菜材料‘苏州青’，按照种子与水的质量体积比为1:4加入到培养皿中，在20℃水温下黑暗吸水8h，得到浸泡过的种子。
剔除掉出芽的种子，将浸泡过的种子分成10组，第一组在恒定的峰值电压130kv条件下，放电激活0.5h；第二组在恒定的峰值电压130kv条件下，放电激活1h；第三组在恒定的峰值电压130kv条件下，放电激活1.5h；第三组在恒定的峰值电压130kv条件下，放电激活2h；第四组在恒定的峰值电压130kv条件下，放电激活2.5h；第五组在恒定的峰值电压130kv条件下，放电激活3h；第六组在恒定的峰值电压130kv条件下，放电激活4h；第七组在恒定的峰值电压130kv条件下，放电激活5h；第八组在恒定的峰值电压130kv条件下，放电激活6h；第九组在恒定的峰值电压130kv条件下，放电激活8h；第十组在恒定的峰值电压130kv条件下，放电激活10h；十组种子在激活时温度均为20℃。以不进行激活的种子为对照组。
每组选取200粒种子播种于穴盘中，在光照16h/20℃、8h黑暗/16℃条件下生长，培养26d后，将幼苗定植于田间，按常规的方法进行田间管理，统计幼苗在田间定植30d、60d和90d的成活率，结果如图3所示。
图3显示，与对照相比，随着处理时间的延长，成活率呈下降趋势，在处理2～4h之间下降更为明显，定植30d成活率从60％(2h)降低到30％(4h)，定植60d成活率由50％(2h)降低到34％(4h)，定植90d成活率由38％(2h)降低到30(4h)，之后成活率更低。本结果揭示出，高压低温等离子体处理抑制不结球白菜的成活率，在处理2～4h合适，既能保证成活率达到50％(定植30d)，又能创制突变体，且产生正向突变体较多，占16.5％。
实施例4
实施例3的各组植株定植30d后，调查每组植物的生长发育情况。
结果：在高压等离子体处理2h和4h的地块中观察到了多种正、反向性状的突变株。有33株表现出株型、抗病性、叶色(深)、耐热性均优于对照。另外，2h处理组的反向突变株较多，正向突变株也因抗病性弱没有收到种子。得到的正向突变株的结果如图4所示。
实施例5
利用与温度途径调控开花时间候选基因紧密连锁的SSR候选基因标记9个(BcVIN3_A02、BcAGL24_A01、BcFRI_A03、BcFLC5_A03、BcFLC1_A10、BcFLC2_A02、BcAGL24_A03、BcFT_A02和BcFLM_A08)。以对照CK、突变株M0(0代)、突变株M1(1代)DNA为模板，聚丙烯酰胺检测其多态性。扩增BcVIN3_A02的正向引物为：CCACCAGAACTGGCTCTCAT，反向引物为：GAGGGAGGACCTGGAGTTGT；扩增BcAGL24_A01的正向引物为：TCTTTGTGATGCCGATGTTG，反向引物为：GATATCTCCAAGCCCGAGAA；扩增BcFRI_A03的正向引物为：CTGATACTGCTGCTCCATCG，反向引物为：AGGGAGGGAGTCCTCCATAA；扩增BcFLC5_A03的正向引物为：ACGCCGAGATAATGCAGAAG，反向引物为：GTATATTCCGACGCCCTCAA；扩增BcFLC1_A10的正向引物为：CTTCCTGCGAATCTTGTGTG，反向引物为：TATGCATCACAGCGTGTCAA；扩增BcFLC2_A02的正向引物为：AGGGAAACTAATACAATACGCAA，反向引物为：GTCGACTCCCTCGTTCAGC；扩增BcAGL24_A03的正向引物为：TGGCAAAAATTTGGTAACGA，反向引物为ATATTGTGCTGCTGCATTGG；扩增BcFT_A02的正向引物为：GACGACAGCTTCGAAAGAGA，反向引物为：TGAGCATTGTTTTGGTGATG；扩增BcFLM_A08的正向引物为：CCAAAAAGCCGAAAAACAGA，反向引物为TTTGGAACCACCAAGTTGAA。具体序列如SEQID NO.1～18所示。遗传多样性结果如图5所示。引物是按CK的基因组序列进行设置的，CK的基因组序列发表在(http://tbir.njau.edu.cn/NhCCDbHubs/)网站中。如果利用该引物扩增得到的M0和M1代与CK有差异，就说明M0和M1代发生了突变。
图5显示，BcAGL24_A01和BcFLC5_A03在PCR产物的大小的地方，M0和M1上有明显的标记，而CK没有该标记。本结果揭示出，等离子体诱变不结球白菜可以获得优良突变株，且可以稳定遗传。
由以上实施例可知，本发明提供一种高压电场低温等离子体激活农作物种子的方法及其应用。利用本发明的方法可以提高种子的产量、耐热性能以及种子的抗病能力，为后续得到优良的种子提供科学依据。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种高压电场低温等离子体激活农作物种子的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将农作物种子与水混合，浸泡4～24h，得到浸泡过的种子；
(2)将所述浸泡过的种子在80～130kv电压下进行放电激活。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述农作物种子包括水稻、小麦、玉米、油菜、大豆、番茄、辣椒、茄子、黄瓜、甜瓜、南瓜、菜豆、萝卜、甘蓝、芥菜、白菜或豆瓣菜。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述农作物种子与水混合的质量体积比为：1:4～6。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述浸泡为黑暗条件下浸泡；
所述浸泡时水的温度为18～22℃。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述放电激活的时间为0.5～10h；
所述放电激活的温度为18～25℃。
6.权利要求1～5任意一项所述的方法在提高作物产量、耐热性能方面的应用。
7.权利要求1～5任意一项所述的方法在诱变育种方面的应用。
8.一种高压电场低温等离子体对农作物种子进行诱变的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将农作物种子与水混合，浸泡4～24h，得到浸泡过的种子；
(2)将所述浸泡过的种子在80～130kv电压下进行放电激活。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述农作物种子与水混合的质量体积比为1:4～6；
所述浸泡为黑暗条件下浸泡；
所述浸泡时水的温度为18～22℃。
10.根据权利要8或9所述的方法，其特征在于，所述放电激活的时间为0.5～10h；
所述放电激活的温度为18～25℃。
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