CN115896108A - 靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA及其应用。靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA，选自ALKBH3sgRNA 102A或ALKBH3sgRNA 102B中的任意一种，所述的ALKBH3sgRNA 102A102A的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述的ALKBH3sgRNA 102B的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。本发明提供针对不同ALKBH3外显子的sgRNA能有效靶向ALKBH3基因，将其构建进入CRISPR/Cas9系统，该系统能敲除ALKBH3基因，得到敲除ALKBH3基因的细胞株，从而有利于研究细胞株中ALKBH3基因的作用机制。

Description

靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学与基因工程领域，涉及靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA及其应用。

背景技术

AlkB同系物3(AlkB Homolog 3,ALKBH3)属于AlkB家族，是一种依赖于Fe²⁺和α-酮戊二酸(α-KG)的去甲基化酶，可以去除单链DNA或RNA上的m¹A(N6-甲基腺嘌呤)，m³C(3-甲基胞嘧啶)修饰。ALKBH3最早被称为PCA-1，因为其在前列腺癌中高度表达，是前列腺癌的诊断标志之一。此外ALKBH3还在胰腺癌，非小细胞肺癌中高表达，促进胰腺癌和非小细胞肺癌等癌细胞的增殖、侵袭和迁移。ALKBH3在细胞核与细胞基质中均有分布，不同亚细胞定位的ALKBH3功能存在差异。作为核酸损伤修复酶定位于细胞核的ALKBH3可与激活信号协整复合体(ASCCs)协同，富集在转录相关位点，修复高表达基因的转录相关DNA烷基化损伤，保持DNA稳定性，维持基因组的完整性，保证细胞正常生命活动。定位于细胞质的ALKBH3以tRNA为底物，发挥其去甲基化酶的活性，去除tRNA上的m⁶A修饰以促进癌细胞的蛋白质翻译。ALKBH3还可以通过去除tRNA上的m¹A修饰从而降低tRNA的稳定性来增加tDRs(tRNA-derived small RNAs)的产生，以抵抗细胞凋亡最终促进癌症的进程。所以进一步揭示ALKBH3的分子调控机制对了解细胞DNA损伤修复和癌细胞发生发展具有重要意义。

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)是存在于众多细菌和许多古菌基因组中的串联重复序列,是细菌和古菌长期进化而来的阻止外来病毒的入侵的适应性免疫系统的组成部分。II型的CRISPR/Cas9系统是应用最广泛的一种，其作为一种高效、精确、强大的基因编辑工具使基础科学研究发生了革命性变化。

现在针对ALKBH3的研究大部分都只是利用RNA干扰的手段，从mRNA层面阻断ALKBH3的表达，无法改变ALKBH3的基因型，敲除效率较低，不适用于长期研究。在针对ALKBH3分子机制的研究中存在缺陷。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA。

本发明的另一目的在于提供所述一种靶向敲除ALKBH3基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统的应用。

本发明的再一目的在于提供靶向敲除ALKBH3基因的人肾上皮HEK 293细胞的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA，选自DNA序列如下的ALKBH3 sgRNA 102A或ALKBH3sgRNA 102B：

ALKBH3 sgRNA 102A102 A的序列如下：

ALKBH3 sgRNA 102A oligo1：5’-caccg CTGCTAAGAGCCATCTCCAC-3’(SEQ IDNO.1)；

ALKBH3 sgRNA 102A oligo2：5’-aaac GTGGAGATGGCTCTTAGCAGc-3’(SEQ IDNO.2)；

ALKBH3 sgRNA 102B的序列如下：

ALKBH3 sgRNA 102B oligo1：5’-caccg AACCGCATTGAAGAGAACAC-3’(SEQ IDNO.3)；

ALKBH3 sgRNA 102B oligo2：5’-aaac GTGTTCTCTTCAATGCGGTTc-3’(SEQ IDNO.4)。

一种靶向敲除ALKBH3基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统，含有上述靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA的DNA序列。

所述的靶向敲除ALKBH3基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统的构建，包括如下步骤：

(1)使用BsmBI酶切CRISPR/Cas9慢病毒载体LentiCRISPRV2，得到酶切后的CRISPR/Cas9慢病毒载体；

(2)将上述靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA的DNA序列磷酸化后与酶切后的CRISPR/Cas9慢病毒载体连接，得到靶向敲除ALKBH3基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统。

步骤(2)中所述靶向敲除ALKBH3基因外显子3的sgRNA的DNA序列命名为LentiCRISPR-ALKBH3-102 A。靶向敲除ALKBH3基因外显子8的sgRNA的DNA序列优选为LentiCRISPR-ALKBH3-102 B。

步骤(2)中所述的DNA序列是将寡核苷酸链1(oligo1)和寡核苷酸链2(oligo2)退火得到双链序列。

所述的靶向敲除ALKBH3基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统在制备敲除ALKBH3基因的细胞株中的应用。

一种敲除ALKBH3基因的细胞株，是将所述的靶向敲除ALKBH3基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统转染目的细胞株得到的。

所述的敲除ALKBH3基因的细胞株，具体是通过如下步骤构建得到：

1)将所述的靶向敲除ALKBH3基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统通过包装细胞进行包装，得到慢病毒颗粒；

2)将慢病毒颗粒感染目的细胞株，筛选得到敲除ALKBH3基因的细胞株。

所述的目的细胞株优选为人肾上皮细胞系。

所述的人肾上皮细胞系优选为HEK 293细胞株。

所述的敲除ALKBH3基因的细胞株，是HEK 293细胞中的ALKBH3基因缺失核苷酸得到的细胞株，为如下的细胞株1、2中的任一株：

细胞株1是在野生型ALKBH3基因的靶向敲除位点上缺失4个碱基；细胞株2是在野生型ALKBH3基因的靶向敲除位点上有13个碱基缺失；ALKBH3基因的具体靶向敲除位点如图4所示。

本发明对于现有技术具有如下优点及效果：

本发明提供针对不同ALKBH3外显子的sgRNA能有效靶向ALKBH3基因，将其构建进入CRISPR/Cas9系统，该系统能敲除ALKBH3基因，得到敲除ALKBH3基因的细胞株，从而有利于研究细胞株中ALKBH3基因的作用机制。

附图说明

图1是检测构建成功LentiCRISPR-ALKBH3质粒的琼脂糖电泳图。其中泳道M为DNAMarker，泳道V为原始LentiCRISPRV2空载质粒，泳道102A为LentiCRISPR-ALKBH3-102 A质粒，泳道102B为LentiCRISPR-ALKBH3-102 B质粒。

图2是敲除ALKBH3基因的单克隆HEK 293细胞株102A中的ALKBH3基因的测序图。

图3是敲除ALKBH3基因的单克隆HEK 293细胞株102B中的ALKBH3基因的测序图。

图4是野生型HEK 293细胞株和敲除ALKBH3基因的单克隆HEK 293细胞株102A和102B中ALKBH3基因的比对结果图；其中，WT代表野生型HEK 293细胞株，102A和102B代表敲除ALKBH3的单克隆HEK 293细胞株，虚线代表缺失片段。

图5是野生型HEK 293细胞株和敲除ALKBH3基因的单克隆HEK 293细胞株102A和102B的白光照片；其中，WT代表野生型HEK 293细胞株，102A和102B代表敲除ALKBH3的单克隆HEK 293细胞株。

图6是稳定细胞株中ALKBH3蛋白的表达检测图；其中，WT代表野生型HEK 293细胞株，102A和102B分别代表靶向ALKBH3的外显子3和ALKBH3的外显子8敲除ALKBH3的单克隆HEK 293细胞株。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

1.使用CRISPR/Cas9技术构建敲除ALKBH3质粒

(1)sgRNA寡核苷酸链合成

使用CRISPR在线设计工具(http://chopchop.cbu.uib.no/)根据评分系统，在ALKBH3的外显子3上设计1个20bp的sgRNA(102A)，在ALKBH3的外显子8上设计1个20bp的sgRNA(102B)并通过BLAST验证无非特异性基因。根据这两条标准找到外显子上的核心序列：ALKBH3 sgRNA 102A和ALKBH3 sgRNA 102B。编码链模板5′端添加CACC，非编码链模板3′端添加AAAC，与BsmBI酶切后形成的粘性末端互补，设计2对CRISPR寡核苷酸链，见表1。

表1 ALKBH3靶向位点及sgRNA寡核苷酸序列

(2)载体构建

1)使用BsmBI酶切1μg LentivirusCRISPRV2质粒，30min，37℃:

2)使用诺唯赞胶回收试剂盒(DC301-01)纯化酶切质粒产物，按说明书进行操作。

3)磷酸化并退火sgRNA oligos：

PCR仪器退火程序：

37℃30min

95℃维持5min，每分钟降低5℃至25℃

4)将退火形成的oligo双链稀释200倍后和酶切后的LentiCRISPRV2载体直接连接，室温下，10min。

5)将连接后的质粒转化至感受态细胞DH5α中，均匀涂至含氨苄抗性的LB固体培养基平板中，置于37℃培养箱中培养12-16小时，单个菌落即可出现。

(3)挑取单个菌落扩大培养并质粒小提。

(4)测序鉴定质粒构建成功，得到LentiCRISPRV2-ALKBH3-102 A与LentiCRISPRV2-ALKBH3-102 B质粒。检测构建成功LentiCRISPR-ALKBH3质粒的琼脂糖电泳图如图1所示。

2.慢病毒包装与感染

(1)慢病毒质粒包装

1)转染前1天：

接种HEK 293TD至6孔盘中，使其在第二天长满盘的80％-90％，在37℃，5％CO₂的条件下培养24小时。

2)转染当天：

在开始前在37℃水浴中预热不含FBS的DMEM的培养基

a)准备一个1.5mL的离心管，加入200μl DMEM培养基，加入14μl Lipofectamine2000，用手指轻弹管壁温柔混匀，室温孵育5分钟

b)与此同时准备另一只1.5mL的离心管，加入0.25μg VsVg，加入1μg PsPax，加入2μg DNA表达载体，用DMEM将总体积补到200μl，用手指轻弹管壁温柔混匀

c)将1)和2)步液体混合，用手指轻弹管壁温柔混匀，总体积为400μl

d)在室温孵育混合液20分钟

将HEK 293TD从培养箱中拿出，弃去旧培养液，向每个培养孔加入700μl无FBS的DMEM培养基

e)将400μl DNA混合液小心滴入细胞培养孔中

f)轻轻涡旋细胞板使其匀一，将细胞板置于培养箱中

g)在37℃，5％CO₂的条件下培养过夜，转染4小时后可加入1ml完全培养基(含FBS、Glu等)。

3)转染一天后

在实验开始前37℃的水浴中对含有10％FBS和Glutamine的DMEM培养基预热

用1.5mL含10％FBS的新鲜DMEM培养基替换原有培养基

4)转染两天后

转染48小时后收集病毒产物并用0.45μm pvdf滤膜过滤(2)感染靶细胞

1)感染前准备

a)准备所需的DMEM培养基；

b)用无菌水配制2mg/ml的嘌呤霉素溶液，滤入1.5ml ep管，-20℃保存；

c)用无菌水配制10mg/ml的凝聚胺溶液，滤入1.5ml ep管，-20℃保存。

2)转染当天

a)从-80℃冰箱中取出冷冻慢病毒，在病毒室室温下解冻；

b)弃去靶细胞原培养液，加入新鲜培养液；

c)转移合适的病毒至靶细胞中转染；

d)加入10mg/ml的凝聚胺溶液调整终浓度为10μg/ml；

e)轻轻搅动平板，使其混合并覆盖细胞。将平板放置在病毒培养箱中在37℃，5％CO₂的条件下培养过夜。

3)转染第二天

弃去病毒培养基并更换所需的新鲜DMEM培养基，将平板置于病毒培养箱中在37℃，5％CO₂的条件下培养过夜。

4)转染第三天

从病毒培养基中取出细胞培养板并弃去培养液，加入含有2μg/ml嘌呤霉素溶液的新鲜DMEM培养液在37℃，5％CO₂的条件下培养。

5)转染一周后

在接下来的1周内仔细观察细胞，传代细胞并根据需要更换培养基。确保每次更换的培养基均包含2μg/mL嘌呤霉素。

6)挑取少量的细胞做western blot检测，观察有无消减效果。

3.筛选稳定的单克隆细胞株

(1)消化细胞，用新鲜DMEM培养基将细胞稀释至合适浓度；

(2)取96孔板，每孔加入10μl稀释后的细胞培养液，尽量使每孔只有一个细胞，置于细胞培养箱中，在37℃，5％CO₂的条件下培养过夜；

(3)在显微镜下观察96孔板中细胞情况，挑选只有一个细胞的细胞培养孔为单克隆，继续培养至长满；

(4)消化长满96孔板单孔的单克隆细胞接种至35mm盘中继续培养。

4.稳定细胞株鉴定

提取各组敲除ALKBH3的单克隆细胞株进行Western blot方法检测ALKBH3蛋白在各株单克隆细胞中的表达情况。选取敲除效率最高的两个单克隆细胞进行基因组DNA测序，鉴定出2株具有ALKBH3基因缺失突变的稳定细胞株。基因测序结果(图2-4))显示，敲除ALKBH3的人肾上皮细胞HEK 293sgALKBH3-102 A在ALKBH3外显子3处有4个碱基的缺失，HEK293sgALKBH3-102 B的ALKBH3外显子8处有13个碱基的缺失；稳定细胞株HEK 293sgALKBH3-102 A和HEK 293sgALKBH3-102 B比HEK 293-WT野生型ALKBH3蛋白表达水平显著降低(图6)。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA，其特征在于选自ALKBH3 sgRNA 102A或ALKBH3 sgRNA102B中的任意一种，

所述的ALKBH3 sgRNA 102A102 A的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

所述的ALKBH3 sgRNA 102B的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

2.一种靶向敲除ALKBH3基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统，其特征在于含有权利要求1所述的靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA的DNA序列。

3.权利要求2所述的所述的靶向敲除ALKBH3基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)使用BsmBI酶切CRISPR/Cas9慢病毒载体LentiCRISPRV2，得到酶切后的CRISPR/Cas9慢病毒载体；

(2)将所述靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA的DNA序列磷酸化后与酶切后的CRISPR/Cas9慢病毒载体连接，得到靶向敲除ALKBH3基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于步骤(2)中所述的DNA序列是将所述sgRNA的两条寡核苷酸链退火得到双链序列。

5.权利要求1所述的靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA在制备敲除ALKBH3基因的细胞株中的应用。

6.权利要求2所述的靶向敲除ALKBH3基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统在制备敲除ALKBH3基因的细胞株中的应用。

7.一种敲除ALKBH3基因的细胞株，其特征在于是将权利要求2所述的靶向敲除ALKBH3基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统转染目的细胞株得到的。

8.根据权利要求7所述的敲除ALKBH3基因的细胞株，其特征在于具体是通过如下步骤构建得到：

1)将所述的靶向敲除ALKBH3基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统通过包装细胞进行包装，得到慢病毒颗粒；

2)将慢病毒颗粒感染目的细胞株，筛选得到敲除ALKBH3基因的细胞株。

9.根据权利要求7所述的敲除ALKBH3基因的细胞株，其特征在于所述的目的细胞株为人肾上皮细胞系。

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