CN115887353A - 一种水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种水凝胶及其制备方法与应用,通过醛基封端的聚(乙二醇)106‑聚(丙二醇)70‑聚(乙二醇)106三嵌段聚合物(F127‑CHO)与羧甲基壳聚糖(CMCS)形成动态共价交联的聚合物网络,并原位负载黑磷‑亚甲基蓝纳米复合物制备水凝胶,所述水凝胶具有温度响应性、自愈合和可注射功能,注射到鼻腔后形成原位凝胶,避免被鼻粘膜快速清除,缓控释放药物,鼻腔给药可绕过血脑屏障直接将药物递送入脑,显著提高脑组织生物利用度,黑磷纳米片不仅可负载药物亚甲基蓝,还可捕捉氧自由基,发挥抗氧化应激的神经保护作用。本发明为脑部疾病的治疗提供了一种有效的经鼻给药制剂,具有良好的临床应用前景和开发价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药纳米材料技术领域,涉及一种水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
神经退行性病变多发于中老年人,表现为神经元丢失和髓鞘退化,最终导致神经系统功能异常。常见的神经退行性疾病有阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)、肌萎缩性侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、亨廷顿病(Huntington disease,HD)等。其中,阿尔茨海默病是最常见的神经退行性疾病,其病理特征是细胞外淀粉样蛋白沉积、细胞内高度磷酸化Tau蛋白形成的神经纤维缠结、神经元细胞死亡和小胶质细胞增生等。然而AD的发病机制复杂,至今仍未有有效的治愈方法。目前靶向Aβ的多项临床试验无法延缓或阻止疾病进展,越来越多的研究人员将研究重点转向了与AD相关的其他治疗靶点,如靶向Tau蛋白、抗炎、减轻氧化应激、改善金属离子代谢紊乱等。
血脑屏障(Blood Brain Barrier,BBB)的存在一直是脑部递药的难题,它严格控制大脑与血液间的物质交换,同时也阻碍了药物进入脑部发挥有效的治疗作用。鼻内给药是一种无创、安全的方法,可绕过血脑屏障直接通过嗅觉和三叉神经通路进入大脑,实现脑靶向递药。然而一些药物透膜能力差,以溶液形式给药后易受到鼻腔中的酶降解和鼻纤毛的清除,降低给药效率。亚甲基蓝能够抑制Tau蛋白的聚集和分解Tau原纤维,对阿尔茨海默病具有治疗作用,然而其在进入脑内后快速弥散,无法有效停留于脑部发挥治疗作用,生物利用度低。因此,有必要研发出一种能够延长药物与鼻粘膜接触时间、减少药物清除,提高药物经鼻吸收和脑靶向递送效率的鼻腔给药制剂。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种具有温度响应性、自愈合和可注射功能,注射到鼻腔后可形成原位凝胶,避免被鼻粘膜快速清除,缓控释放药物,鼻腔给药可绕过血脑屏障直接将药物递送入脑,显著提高脑组织生物利用度的水凝胶及其制备方法与应用。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:
第一方面,本发明提供了一种水凝胶的制备方法,包括以下步骤:
(1)将醛基封端的聚(乙二醇)106-聚(丙二醇)70-聚(乙二醇)106三嵌段聚合物F127-CHO加入至负载亚甲基蓝的黑磷纳米复合物的分散液A中,溶解,得到混合物A;
(2)将羧甲基壳聚糖加入至负载亚甲基蓝的黑磷纳米复合物的分散液B中,溶解,得到混合物B;
(3)将混合物A和混合物B混匀,充分反应后得到所述水凝胶;
所述负载亚甲基蓝的黑磷纳米复合物的分散液A与负载亚甲基蓝的黑磷纳米复合物的分散液B中负载亚甲基蓝的黑磷纳米复合物的浓度相同;
所述F127-CHO与羧甲基壳聚糖的质量比为(1~4):4。
所述步骤(3)中,混匀的条件包括但不限于在冰水浴中缓慢搅拌,反应条件为37℃反应12h。
水凝胶是一种由水溶性聚合物交联而成的具有三维亲水性网络的不溶性聚合物,具有良好的三维架构和与细胞外基质相似的结构,生物相容性良好,广泛应用于创伤敷料、药物缓释基质和人体软组织填充等技术领域。具有适宜相转变温度的鼻腔给药凝胶制剂在与鼻粘膜接触后能够迅速形成凝胶,可作为药物的储库,提高药物在鼻腔的停留时间,并最大限度地减少粘液纤毛清除,缓控释放药物,进一步提高药物经鼻吸收效率和脑组织生物利用度。
黑磷(black phosphorus,BP)是二维材料家族的新星,独特的褶皱结构使其具有更大的比表面积,有利于负载药物;此外,BP对活性氧具有巨大的反应活性,在体内外均可清除各种类型的氧自由基,且最终降解为无毒亚磷酸根离子和磷酸盐,具有优越的生物相容性,在神经退行性疾病的治疗具有良好的应用前景。
亚甲基蓝(MB)能够抑制Tau蛋白的聚集和分解Tau原纤维,对阿尔茨海默病具有治疗作用,然而其在进入脑内后快速弥散,无法有效停留于脑部发挥治疗作用,生物利用度低。亚甲基蓝通过静电吸附和疏水相互作用与黑磷结合,形成黑磷-亚甲基蓝纳米复合物,避免药物快速释放;同时黑磷纳米片(BP NSs)具有清除活性氧的生物效应,可与亚甲基蓝协同发挥神经保护作用。
本发明提供的制备方法生产工艺较为简单,合成复合水凝胶时所涉及的溶剂为水,没有毒性,对环境友好,可实现低成本、大规模生产。
作为本发明所述水凝胶的制备方法的优选实施方式,所述F127-CHO与羧甲基壳聚糖的质量比为3:4。
当所述F127-CHO与羧甲基壳聚糖的质量比为3:4时制备的水凝胶具有良好的温度响应性,具有剪切稀化特性,可用于注射给药,并且具有良好的自愈合能力。
作为本发明所述水凝胶的制备方法的优选实施方式,所述负载亚甲基蓝的黑磷纳米复合物分散液A与负载亚甲基蓝的黑磷纳米复合物分散液B中,负载亚甲基蓝的黑磷纳米复合物的浓度均为0.1~3mg/mL。
所述负载亚甲基蓝的黑磷纳米复合物分散液A与负载亚甲基蓝的黑磷纳米复合物分散液B的体积为0.5mL。
作为本发明所述水凝胶的制备方法的优选实施方式,所述负载亚甲基蓝的黑磷纳米复合物的制备方法,包括以下步骤:
S1、向黑磷纳米片水分散液中加入亚甲基蓝水溶液,避光搅拌状态下反应,得到反应产物;
S2、将所得反应产物离心,用水溶液洗涤,然后重悬于水中,即得负载亚甲基蓝的黑磷纳米复合物分散液;
所述步骤S1中,黑磷纳米片水分散液中黑磷纳米片的浓度为0.5~2mg/mL,亚甲基蓝水溶液中亚甲基蓝的浓度为1~3mg/mL;黑磷纳米片水分散液与亚甲基蓝水溶液的体积比为1:(1~3)。
所述步骤S1中,黑磷纳米片水分散液中黑磷纳米片的优选浓度为1mg/mL,亚甲基蓝水溶液的优选浓度为2mg/mL,黑磷纳米片水分散液与亚甲基蓝水溶液的优选体积比为1:1.5,溶剂水均为除氧水,搅拌条件为室温下搅拌10~12h。
作为本发明所述水凝胶的制备方法的优选实施方式,所述黑磷纳米片的粒径为100~200nm,厚度为5~8nm。
所述黑磷纳米片的制备方法包括以下步骤:
将黑磷粉末分散于过饱和NaOH的N-甲基吡咯烷酮溶液(NMP)中超声,离心收集上清液得到黑磷纳米片;
所述黑磷纳米片的制备方法中,黑磷粉末:NMP的用量比为0.75~1mg:1mL,超声条件为4~10℃冰浴条件下探头超声600w,剥离10~12h,离心后,取上清液以相同条件超声10~12h,再次离心,所得沉淀即为黑磷纳米片(BP NSs),以上所有操作均避光进行。
作为本发明所述水凝胶的制备方法的优选实施方式,所述F127-CHO的制备方法,包括以下步骤:
S1、称取普兰尼克溶解于有机溶剂中,加入戴斯-马丁氧化剂,搅拌、加热进行氧化反应;
S2、取步骤S1氧化反应所得滤液,浓缩至粘稠状,然后加入到冰乙醚中搅拌,产生沉淀,冷却,离心收集沉淀,即得F127-CHO。
所述步骤S1中,有机溶剂包括但不限于二氯甲烷,溶解条件包括但不限于:过夜溶解,F127与戴斯-马丁的反应条件为40℃加热24h。所述步骤S2中,冰乙醚的体积为100~150mL,冷却的方式包括但不限于:在冰水浴冷却1h,离心收集沉淀后采用干燥获得最终产品,干燥的方式包括但不限于:40℃真空干燥12h。
普兰尼克(F127)是一种两亲性三嵌段共聚物,在水中自组装成微型胶束,可作为动态交联剂。醛基封端的F127能够与羧甲基壳聚糖发生醛氨缩合反应,形成动态可逆的席夫碱键,赋予凝胶良好的机械性能、优异的自愈合性和可注射性,适合作为鼻腔给药凝胶制剂。F127-CHO是通过戴斯-马丁试剂将普兰尼克末端的羟基氧化醛基获得。
第二方面,本发明提供了由所述水凝胶的制备方法制备得到的水凝胶。
在本发明所述制备条件下得到的水凝胶具有温敏、可注射和自愈合的特性,给药后形成凝胶,黏附于鼻腔内黏膜,作为药物储库,延长药物在鼻粘膜滞留时间,使药物被持续吸收入脑,可作为鼻腔给药的优良凝胶制剂。
第三方面,本发明提供了所述水凝胶在制备治疗神经退行性病变的药物中的应用。
作为本发明所述水凝胶在制备治疗神经退行性病变的药物中的应用的优选实施方式,所述神经退行性病变为阿尔茨海默病。
本发明制备的负载黑磷-亚甲基蓝纳米复合物水凝胶有望在多方向多维度的纳米生物医药领域如阿尔茨海默症、帕金森病、脑卒中等以脑部病变为主的疾病方向作为药物递送策略使用。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
1、本发明制备的负载黑磷-亚甲基蓝纳米复合物的水凝胶,将黑磷-亚甲基蓝纳米片装载于凝胶三维网络结构中,所制备的复合水凝胶存在动态化学键,具有温敏、可注射和自愈合的特性,给药后形成凝胶,黏附于鼻腔内黏膜,作为药物储库,延长药物在鼻粘膜滞留时间,使药物被持续吸收入脑,可作为鼻腔给药的优良凝胶制剂。
2、本发明利用醛基封端的F127和羧甲基壳聚糖之间发生醛氨缩合形成的席夫碱键易水解的特性,使水凝胶具有良好的可降解性,且黑磷纳米复合物易降解为无毒的磷酸盐,因此,本发明所述的负载黑磷-亚甲基蓝纳米复合物的水凝胶生物相容性优越,适合于疾病治疗。
3、本发明提供的负载黑磷-亚甲基蓝纳米复合物的水凝胶的制备方法生产工艺较为简单,合成复合水凝胶时所涉及的溶剂为水,没有毒性,对环境友好,可实现低成本、大规模生产。
4、本发明还提供了一种黑磷-亚甲基蓝纳米复合物的制备方法,亚甲基蓝通过静电吸附和疏水相互作用与黑磷结合,构成黑磷-亚甲基蓝纳米复合物,改善药物生物分布;同时黑磷纳米片具有清除活性氧的生物效应,可与亚甲基蓝协同发挥神经保护作用。
5、本发明提供的负载黑磷-亚甲基蓝纳米复合物水凝胶有望在多方向多维度的纳米生物医药领域如阿尔茨海默症、帕金森病、脑卒中等以脑部病变为主的疾病方向作为药物递送策略使用。
附图说明
图1为本发明制备的F127-CHO的核磁共振氢谱图。
图2为本发明制备的F127-CHO和F127-CHO/CMCS水凝胶的傅里叶红外光谱图。
图3为本发明制备的新鲜BP NSs和BP-MB的透射电镜图(标尺:100μm);其中,A为BPNSs的透射电镜图,B为BP-MB的透射电镜图。
图4为本发明制备的新鲜BP NSs和BP-MB的原子力显微镜图;其中,A为BP NSs的原子力显微镜图,B为BP-MB的原子力显微镜图。
图5为本发明制备的BP、BP-MB、负载黑磷-亚甲基蓝纳米复合物的水凝胶(BP-MB@Gel)的傅里叶红外光谱图。
图6为本发明制备的F127-CHO/CMCS水凝胶和BP-MB@F127-CHO/CMCS在不同温度下的相转变行为图片。
图7为本发明制备的F127-CHO/CMCS水凝胶和BP-MB@F127-CHO/CMCS的扫描电镜图(标尺:10μm、4μm)。
图8为本发明制备的F127-CHO/CMCS水凝胶和BP-MB@F127-CHO/CMCS的流变学特性结果图。
图9为本发明制备的BP NSs和BP-MB捕捉氧自由基实验结果图。
图10为本发明制备的BP NSs和BP-MB的细胞毒性实验结果图。
图11为本发明制备的BP NSs和BP-MB的体外神经保护作用实验结果图。
图12为本发明制备的BP NSs和BP-MB的体外耗氧率实验结果图。
图13为本发明制备的BP NSs标记Cy5后在SH-SY5Y细胞上的摄取机制结果图。
图14为本发明制备的BP NSs标记Cy5在HNEpC细胞上的摄取机制结果图。
图15为本发明制备的BP-MB在HNEpC细胞的渗透率结果图。
图16为本发明制备的BP-MB在HNEpC细胞上的跨膜转运机制结果图。
图17为本发明制备的BP NSs标记Cy5后在脑部的荧光成像图。
图18为本发明制备的BP-MB@Gel给药治疗后,对动物旷场行为学影响的实验结果图。
图19为本发明制备的BP-MB@Gel给药治疗后的动物水迷宫和筑巢行为学实验结果图;其中,A~F为水迷宫实验结果图,G~H为筑巢实验结果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
在此,对实施例中的缩写进行解释:F127-CHO:醛基封端的三嵌段共聚物F127;CMCS:羧甲基壳聚糖;F127-CHO/CMCS:醛基封端的三嵌段共聚物F127-CHO动态共价交联CMCS的聚合物;BP NSs:黑磷纳米片;MB:亚甲基蓝;BP-MB:黑磷-亚甲基蓝纳米复合物;F127-CHO/CMCS(Gel):F127-CHO动态共价交联CMCS的空白水凝胶;BP-MB@F127-CHO/CMCS(BP-MB@Gel):负载黑磷-亚甲基蓝纳米复合物的水凝胶;BP-Cy5:负载Cy5荧光的黑磷纳米片;BP-Cy5@Gel:负载BP-Cy5的水凝胶。
实施例1
本发明所述水凝胶的一种实施例,本实施例所述水凝胶的制备方法包括以下步骤:
1、在200mL无水二氯甲烷中加入8.0g普兰尼克搅拌至完全溶解,冰水浴搅拌下向溶液中少量多次加入1.072g戴斯-马丁试剂粉末,30min后加热到40℃,反应进行24h。抽滤,除去不溶物,将滤液旋转蒸发为粘稠状液体,然后加入到100mL冰乙醚中剧烈搅拌得到大量沉淀,于冰水浴中冷却1h。9000rpm离心5min,收集沉淀,40℃真空干燥12h,获得产物F127-CHO。
2、称取1g NaOH粉末溶于40mL N-甲基吡咯烷酮(NMP)中,充分涡旋10-20min,去除未溶解的NaOH,将30mg黑磷粉末分散于上述过饱和NaOH的NMP溶液中,取上述分散液进行探头超声,4~10℃冰浴条件下,600W功率超声12h,随后以2000rpm、20min离心,收集上清液,所述上清液继续以上述条件进行探头超声,再次离心,条件为4000rpm、20min,得到尺寸为100~200nm的BP NSs的上清液。
3、将MB水溶液(1.5mL,2mg/mL)加入BP水分散液(1mL,1mg/mL)中,随后加入7.5mL的除氧水,避光于室温搅拌12h,随后将反应产物于12000rpm离心15min,并用水洗涤三次并于水中重悬,即得BP-MB水分散液。
4、称取30mg的F127-CHO加入至0.5mL的BP-MB分散液(浓度为1.5mg/mL)中,于4℃过夜溶解。称取40mg的CMCS加入0.5mL同样浓度的BP-MB分散液中,搅拌至完全溶解。冰水浴缓慢搅拌下将两种溶液混合均匀后,置于37℃充分反应12h,获得负载BP-MB的水凝胶BP-MB@F127-CHO/CMCS(BP-MB@Gel)。
实施例2
本发明所述空白水凝胶F127-CHO/CMCS(Gel)的一种实施例,本实施例所述空白水凝胶F127-CHO/CMCS(Gel)的制备方法包括以下步骤:
1、在200mL无水二氯甲烷中加入8.0g普兰尼克搅拌至完全溶解,冰水浴搅拌下向溶液中少量多次加入1.072g戴斯-马丁试剂粉末,30min后加热到40℃,反应进行24h。抽滤,除去不溶物,将滤液旋转蒸发为粘稠状液体,然后加入到100mL冰乙醚中剧烈搅拌得到大量沉淀,于冰水浴中冷却1h。9000rpm离心5min,收集沉淀,40℃真空干燥12h,获得产物F127-CHO。
2、称取30mg的F127-CHO加入0.5mL去离子水中,于4℃过夜溶解。另外,称取40mg的CMCS加入0.5mL去离子水中,搅拌至完全溶解。冰水浴缓慢搅拌下,将F127-CHO溶液和CMCS溶液混合均匀,得到澄清透明的液体之后,将其置于37℃充分反应12h,获得空白水凝胶F127-CHO/CMCS(Gel)。
实施例3
实施例3与实施例1的区别为:步骤5中称取10mg的F127-CHO加入至0.5mL的BP-MB分散液(浓度为1.5mg/mL)中,其余步骤均相同。
实施例4
实施例4与实施例1的区别为:步骤5中称取40mg的F127-CHO加入至0.5mL的BP-MB分散液(浓度为1.5mg/mL)中,其余步骤均相同。
实施例5
对本发明实施例1~4制备产物的表征及性能测试:
1、对实施例1~4所述F127-CHO进行H1 NMR表征,结果如图1所示,H1NMR图9.58ppm位移处的峰值代表醛基中的氢,证明成功制备了F127-CHO。
2、对实施例1~4所述F127-CHO和实施例2所述F127-CHO/CMCS水凝胶进行FT-IR表征,结果如图2所示,与F127相比,F127-CHO的谱图于1727cm-1处出现了醛基中的羰基对称振动的吸收带,表明醛基封端的F127制备成功。而F127-CHO/CMCS水凝胶(F/C Hydrogel)的谱图中1727cm-1处的羰基特征吸收带消失,同时在1590cm-1处有羧酸根阴离子伸缩振动,证实F127-CHO与羧甲基壳聚糖形成化学键交联。
3、对实施例1、3、4所述BP NSs和实施例1所述BP-MB进行透射电镜测试和原子力显微镜扫描,如图3所示,图3A(标尺:100μm)显示BP NSs为二维片状结构,横向尺寸约为100~200nm,表明二维黑磷纳米片的成功剥离,图3B(标尺:100μm)显示所述BP-MB有相同的片状结构,且尺寸增大。图4A和B为对应的厚度数据,BP NSs的厚度在5~8nm范围内,与MB反应后纳米片变薄,厚度为3~4nm,实施例3和实施例4所述BP-MB与实施例1的结果类似。
4、对实施例1、3、4所述BP NSs、实施例1所述BP-MB和所述BP-MB@Gel(载药凝胶)进行傅里叶红外光谱(FT-IR)表征,如图5所示,BP的FT-IR中1641cm-1和1001cm-1处的吸收分别对应磷酸基团;负载MB后所得的BP-MB在1400cm-1出现碳氢键,且在3419cm-1出现的特征吸收表明BP-MB存在分子间氢键作用;BP-MB@Gel的谱图有BP-MB的特征吸收,表明水凝胶内BP-MB的成功装载,实施例3和实施例4所述BP-MB和所述BP-MB@Gel与实施例1的结果类似。
5、对实施例2所述F127-CHO/CMCS水凝胶和实施例1所述BP-MB@Gel的相变行为进行测试,结果如图6所示,空白水凝胶和负载BP-MB的水凝胶在室温下为流体状态,当温度达到37℃时,均发生溶胶-凝胶相转变,证实其温度响应性。对实施例2所述F127-CHO/CMCS水凝胶和实施例1所述BP-MB@Gel进行扫描电镜测试,图7显示两者均呈现均匀的多孔网络状结构,且BP-MB的装载没有破坏凝胶结构。实施例3和实施例4所述BP-MB@Gel与实施例1的结果类似。
6、对实施例2所述F127-CHO/CMCS水凝胶和实施例1所述BP-MB@Gel进行流变性能测试,如图8A所示,随温度升高,凝胶的存储模量G’高于损耗模量G”,当G’=G”时的温度即为溶胶-凝胶相变温度。空白凝胶和载药凝胶的相变温度分别为29.8℃和31.8℃,证实其能在体温条件下形成凝胶。对实施例2所述F127-CHO/CMCS水凝胶和实施例1所述BP-MB@Gel进行振荡剪切和应变力测试,考察凝胶的力学性能,频率扫描测试结果如图8B所示,G’和G”均随着角频率的增加而增大,且G’始终大于G”,表明固态凝胶形成。应变力测试如图8C所示,当施加的应变力大于160%时,空白凝胶和载药凝胶可由固态凝胶可转变为流体。由图8D可知,随着剪切速率增加,载药凝胶的黏度减小,证明其具有剪切稀化特性,因此可用于注射给药。基于共价键构建的自愈合水凝胶在受到往复变化的剪切应变作用时,模量或黏度发生动态变化并能恢复至原来的状态。图8E、8F分别为空白凝胶和载药凝胶的高低应变扫描图,在1%和500%的交替应变力作用下,载药凝胶的模量可恢复至较小应变时的数值,证明其具有良好的自愈合能力。实施例3和实施例4所述BP-MB@Gel与实施例1的结果类似。
7、对实施例1、3、4所述BP NSs和实施例1所述BP-MB进行抗氧化性能测试,如图9所示,实施例1、3、4所述BP NSs和实施例1所述BP-MB及药物MB对羟基自由基(·OH)、超氧阴离子(O2 ·-,)和过氧化氢(H2O2)不同的自由基均具有一定清除能力,其抗氧化能力呈现剂量依赖性,且由于负载有抗氧化剂MB,BP-MB具有更强的清除自由基能力。实施例3和实施例4所述BP-MB与实施例1的结果类似。
实施例6
对本发明实施例1所述BP-MB的体外安全性评价实验的一种实施例,本实施例所述BP-MB的体外安全性评价实验包括BP-MB在人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞和人鼻粘膜上皮细胞(HNEpC)水平上的安全性评价。
将SH-SY5Y细胞和HNEpC细胞分别按3×104个/孔和1×104/孔的密度接种于96孔板中,培养24h后分别加入梯度浓度的MB,BP和BP-MB共同孵育,继续培养24h。随后加入CCK-8溶液孵育4h,使用微孔板读取器来测定450nm处的吸光度。细胞活力表示为A450nm下的给药组相对于空白对照组的百分比。结果如图10A所示,与SH-SY5Y孵育24h后,MB在1~8μg/mL、BP及BP-MB在1.25~10μg/mL浓度范围内,细胞活力无明显变化。由图10B可看出,当MB在1~10μg/mL、BP及BP-MB在2.5~40μg/mL浓度范围内,HNEpC细胞活力与对照组无明显差异,具有良好生物相容性。
实施例7
对本发明实施例1所述BP-MB在SH-SY5Y细胞水平上的神经保护作用验证和在SH-SY5Y细胞水平上线粒体耗氧量测定:
1、BP-MB在SH-SY5Y细胞水平上的神经保护作用验证:将SH-SY5Y细胞按3×104个/孔接种于96孔板中,24h后用40nM的冈田酸预处理细胞12h,替换培养基,分别加入浓度梯度的MB,BP和BP-MB,继续培养24h后,加入CCK-8溶液,4h后使用微孔板读取器测量读取450nm处的吸光度值。细胞活力表示为A450nm下的给药组相对于空白对照组的百分比。结果如图11所示,在1.25~10μg/mL的浓度范围内,与游离MB组和BP组相比,BP-MB显示出更优异的体外神经保护作用(P<0.05)且细胞活力呈剂量依赖性增加。
2、BP-MB在SH-SY5Y细胞水平上线粒体耗氧量测定:将SH-SY5Y细胞(3×104个/孔)在96孔板上培养24h,然后加入40nM冈田酸继续孵育12h。随后替换培养基,分别加入2μg/mL的MB,10μg/mL的BP及10μg/mL的BP-MB共孵育24h。在进行线粒体应激试验之前,用FX培养基(175μL)替换细胞培养基。细胞在37℃下平衡60min后进行线粒体应激试验,加入线粒体抑制剂:羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯肼(FCCP,1μM)、寡霉素A(1μM)、抗霉素A(1μM)和鱼藤酮(1μM)的混合物。结果如图12所示。BP-MB治疗后显著改善了冈田酸所致的线粒体功能障碍,提高了基础呼吸、ATP生成、H+质子泄漏和最大呼吸等能量指标的水平。与MB和BP组相比,具有更出色的逆转线粒体功能障碍作用(P<0.05)。
以上结果表明,BP-MB在具备良好生物相容性的情况下,比游离MB和BP具有更明显的神经保护作用,且能改善体外AD模型的线粒体障碍。
实施例8
本实施例中BP-Cy5的制备方法包括以下步骤:
将Cy5-PEG-NH2水溶液(2.5mL,2mg/mL)加入BP水分散液(1mL,1mg/mL)中,并加入1.5mL的除氧水,避光在冰水浴(10℃)超声30min后,于常温下搅拌8h,随后将反应产物在12000rmp下离心15min,用水洗涤底物三次并用水重悬,即得负载Cy5的BP-Cy5分散液。
利用所述BP-Cy5分散液进行SH-SY5Y细胞和HNEpC细胞对BP-Cy5的摄取机制考察实验:
SH-SY5Y细胞和HNEpC细胞生长至适宜密度后,替换为含MβCD(甲基-β-环糊精),CPZ(氯丙嗪),HS(高渗蔗糖)或EIPA(5-(N-乙基-N-异丙基)-阿米洛利)的培养基,在37℃下培养30min,随后加入BP-Cy5(保留抑制剂),将孔板置于37℃下避光孵育2h后,弃去培养基,PBS清洗3次后用4%多聚甲醛固定15-20min,加入DAPI染色液继续避光培养10min,弃去染液,PBS清洗3遍后,封片,在激光共聚焦下观察细胞的摄取情况。结果如图13和14所示,SH-SY5Y细胞和HNEpC细胞均主要通过网格蛋白和巨胞饮介导的途径摄取BP-Cy5,其中,SH-SY5Y最主要通过网格蛋白介导内吞,HNEpC细胞最主要通过巨胞饮介导内吞。
实施例9
对本发明实施例1所述BP-MB在HNEpC细胞水平上的跨鼻黏膜屏障实验:
将HNEpC细胞以5×105/cm2的密度种于Transwell上室形成单层致密细胞,跨膜电阻值>200Ω·cm2时表明完整的鼻粘膜屏障建立成功,可用于验证药物在体外鼻粘膜的渗透性。为了确保体外鼻粘膜屏障完整性,在实验前后测量TEER值。为了测量顶端至基底外侧跨上皮运输,分别将含有MB(8μg/mL)和BP-MB(等剂量MB)的300μL DMEM溶液加入顶端侧(上部隔室),将细胞在37℃下孵育2小时。随后收集上室溶液,通过紫外分光光度计检测MB的浓度。用以下公式计算渗透率:渗透率(%)=(C0-Cs)/C0×100%,其中C0和Cs分别为孵育前后药物在上室的浓度。结果如图15A所示,MB和BP-MB均显现出高达约65%的渗透率,由图14B可知,且处理前后鼻黏膜细胞层的膜电位无显著改变,表明MB和BP-MB转运未影响鼻黏膜屏障的完整性。
实施例10
对本发明实施例1所述BP-MB的转运机制考察实验:
将HNEpC细胞以5×105/cm2的密度种于Transwell上室,当跨膜电阻值>200Ω·cm2时,上室分别加入0.3mL含32.5μg/mL的Monensin(抑制高尔基体到质膜的运输),25μg/mL的Brefeldin A(特异性阻断囊泡从内质网到高尔基体的运输)和2.5μg/mL的Bafilomycin(抑制胞吞酸化)的培养基共孵育1h,对照组加入等体积DMEM,下室为1mLDMEM。随后加入BP-MB(保留抑制剂,Monensin和Bafilomycin除外)孵育2h后,收集下室溶液,通过紫外分光光度计测定下室中BP-MB的浓度,与对照组相比较,计算各组的相对转运率。由图16A可知,相应浓度的不同蛋白转运抑制剂与HNEpC孵育24h后未对细胞产生毒性。结果如图16B所示,Monensin和Brefeldin A显著抑制了BP-MB的转运,表明BP-MB跨鼻黏膜上皮细胞的转运途径主要涉及高尔基体到质膜以及内质网到高尔基体的运输。
实施例11
按照实施例8所述步骤制备负载Cy5荧光的BP-Cy5。本实施例中负载BP-Cy5的水凝胶的制备方法包括以下步骤:
将30mg的F127-CHO加入至0.5mL的BP-Cy5分散液(浓度为1.5mg/mL)中,于4℃过夜溶解。将40mg的CMCS加入0.5mL同样浓度的BP-Cy5分散液中,搅拌至完全溶解。冰水浴缓慢搅拌下将两种溶液混合均匀后,置于37℃充分反应12h,获得负载BP-Cy5的水凝胶(BP-Cy5@Gel)。
利用所述BP-Cy5和所述BP-Cy5@Gel研究鼻腔给药凝胶制剂脑靶向特性。
将C57BL/6雌性小鼠随机分为3组:①Cy5组,②BP-Cy5组,③BP-Cy5@Gel组(n=3)。各组小鼠通过鼻腔给予等剂量Cy5,于1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h取全脑在活体成像仪下进行荧光成像。结果如图17所示,给药4h后,游离Cy5在脑部逐渐被代谢,而BP-Cy5@Gel在脑中的蓄积增加,在8h达到最大累积量,24h后仍然在脑部有少量蓄积。此外,在各时间点的成像中,BP-Cy5@Gel组均显示出强烈的荧光分布,这些结果表明,BP-Cy5@Gel经鼻腔给药能够显著提高药物在脑部的累积量,且粘附于鼻腔的凝胶能够缓慢释放药物,提高药物在脑的生物利用度,从而达到良好的治疗效果。
实施例12
利用本发明实施例1所述BP-MB@Gel研究鼻腔给药凝胶制剂在体内抗阿尔茨海默病的药效学研究:
使用六月龄的雌性野生型C57BL/6小鼠,各组小鼠术前24h禁食不禁水,腹腔麻醉小鼠后将其固定在小动物立体定位仪上,剪开小鼠的脑皮,暴露出脑颅骨后用75%酒精消毒,根据小鼠脑立体定位图谱,在外侧杏仁核(前囟后:-1.94mm,旁开:-3.15mm)钻孔。OA用DMSO溶解,生理盐水稀释,精密吸取130nL稀释好的100μM的OA溶液注射于外侧杏仁核内,注射深度为-4.5mm,注射速度保持在60nL/min,注射持续5min,并在注射后保持注射针头原位5min以保证输注药物完全,然后缓慢将注射针拔离开小鼠脑内。之后,将青霉素粉末盖至小鼠脑钻孔处以防止感染死亡,并用手术线缝合脑皮。正常给予小鼠水和食物,三天后开始给药治疗。假手术组注射等体积的0.9%生理盐水。
将模型小鼠随机分为四组进行给药治疗:①MB;②BP;③BP-MB;④BP-MB@Gel(等BP剂量:3mg/kg,等MB剂量:0.6mg/kg),给药体积30μL,每天给药一次,连续给药七天。同时OA模型组给予等体积生理盐水。给药结束后进行行为学评价实验,所述行为学评价实验包括旷场实验、水迷宫实验和筑巢实验。
旷场实验:将小鼠置于活动空箱(60厘米×60厘米×40厘米)中,在测试之前,将小鼠放置在空箱的中心,在10分钟内进行自由探索提前适应。然后在20分钟的测试中记录移动的总距离和平均移动速度。结果如图18所示。
水迷宫实验:MWM设置由圆形池(直径150厘米,高50厘米)组成,圆形池水中添加白粉使黑色的C57BL/6小鼠更容易被追踪。学习训练前将小鼠放入水迷宫中适应性自由游泳2min。训练时将小鼠任意从西北、西南、东北方向开始头朝池壁放入水中,设置游泳时间最长为90s来寻找隐匿站台,若成功找到平台,记录找到隐匿平台的时间,即逃逸潜伏期,并让小鼠在平台上停留15s;若90s内未找到平台,则引导小鼠到平台上停留15s。将游泳完的小鼠小心用衣物擦干并烘干。规定一个方向为一轮,每只小鼠每天训练3轮,每次训练间隔1h,连续训练4天,每天按照不同的方向训练。第5天进行空间位置探寻实验,撤去隐匿性逃逸平台,将小鼠从隐匿性平台对侧象限(西北)面朝池壁放入水中,记录60s内小鼠穿越隐匿平台原位置的次数和停留时间。结果如图19A-F所示。
筑巢实验:在筑巢测试之前,将小鼠单独饲养玉米芯供应一周。在第一天,往笼子中放6张纸(5×5cm2)以提供小鼠筑巢的条件。巢的质量具体评分标准(从低到高):1至4如下:1.纸张没有明显的咬/撕,没有可识别的巢址;2.没有明显的咬/撕裂纸张,有一个可识别的巢址;3.局部咬/撕纸张,有一个可识别的巢址;4.最尖锐/撕裂的纸张,具有可识别的巢穴。观察第三天各组小鼠的筑巢情况。结果如图19G-H所示。
行为学结果显示:在旷场实验中,BP-MB@Gel给药治疗的小鼠自主活动能力和空间探索能力显著增强;经过五天的水迷宫空间学习,BP-MB@Gel治疗组小鼠学习记忆能力显著改善;在筑巢实验中,AD小鼠由于学习记忆能力缺陷,不能建立完整的巢穴,而BP-MB@Gel组治疗小鼠筑巢行为明显改善。这些结果表明所制备的鼻腔给药凝胶制剂具有改善AD小鼠行为认知功能障碍的作用。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,但并不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.一种水凝胶的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将醛基封端的聚(乙二醇)106-聚(丙二醇)70-聚(乙二醇)106三嵌段聚合物F127-CHO加入至负载亚甲基蓝的黑磷纳米复合物的分散液A中,溶解,得到混合物A;
(2)将羧甲基壳聚糖加入至负载亚甲基蓝的黑磷纳米复合物的分散液B中,溶解,得到混合物B;
(3)将混合物A和混合物B混匀,充分反应后得到所述水凝胶;
所述负载亚甲基蓝的黑磷纳米复合物的分散液A与负载亚甲基蓝的黑磷纳米复合物的分散液B中负载亚甲基蓝的黑磷纳米复合物的浓度相同;
所述F127-CHO与羧甲基壳聚糖的质量比为(1~4):4。
2.如权利要求1所述水凝胶的制备方法,其特征在于,所述F127-CHO与羧甲基壳聚糖的质量比为3:4。
3.如权利要求1所述水凝胶的制备方法,其特征在于,所述负载亚甲基蓝的黑磷纳米复合物分散液A与负载亚甲基蓝的黑磷纳米复合物分散液B中,负载亚甲基蓝的黑磷纳米复合物的浓度均为0.1~3mg/mL。
4.如权利要求1所述水凝胶的制备方法,其特征在于,所述负载亚甲基蓝的黑磷纳米复合物的制备方法,包括以下步骤:
S1、向黑磷纳米片水分散液中加入亚甲基蓝水溶液,避光搅拌状态下反应,得到反应产物;
S2、将所得反应产物离心,用水溶液洗涤,然后重悬于水中,即得负载亚甲基蓝的黑磷纳米复合物分散液;
所述步骤S1中,黑磷纳米片水分散液中黑磷纳米片的浓度为0.5~2mg/mL,亚甲基蓝水溶液中亚甲基蓝的浓度为1~3mg/mL;黑磷纳米片水分散液与亚甲基蓝水溶液的体积比为1:(1~3)。
5.如权利要求4所述水凝胶的制备方法,其特征在于,所述黑磷纳米片的粒径为100~200nm,厚度为5~8nm。
6.如权利要求1所述水凝胶的制备方法,其特征在于,所述F127-CHO的制备方法,包括以下步骤:
S1、称取普兰尼克溶解于有机溶剂中,加入戴斯-马丁氧化剂,搅拌、加热进行氧化反应;
S2、取步骤S1氧化反应所得滤液,浓缩至粘稠状,然后加入到冰乙醚中搅拌,产生沉淀,冷却,离心收集沉淀,即得F127-CHO。
7.如权利要求1-6任一所述水凝胶的制备方法制备得到的水凝胶。
8.如权利要求7所述水凝胶在制备治疗神经退行性病变的药物中的应用。
9.如权利要求8所述水凝胶在制备治疗神经退行性病变的药物中的应用,其特征在于,所述神经退行性病变为阿尔茨海默病。
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