CN115885041A - 转化蓝细菌的方法 - Google Patents

Abstract

本技术涉及一种用于产生经转化且完全分离的蓝细菌的方法，所述方法包括在适合用包含选择标记的核酸转化蓝细菌的条件下孵育蓝细菌和所述核酸；在适合蓝细菌恢复的条件下在生长培养基中进一步孵育蓝细菌；使用选择剂选择经转化且完全分离的蓝细菌。

Description

转化蓝细菌的方法

技术领域

本技术涉及转化蓝细菌(Cyanobacteria)以产生经转化且完全分离的蓝细菌的方法。

相关申请的交叉应用

本申请要求于2020年4月3日提交的澳大利亚临时申请号2020901047的权益，其全部内容通过引用并入本文。

发明背景

蓝细菌产生大量的次级代谢物并且具有用于生产药物、高价值化学品和用作生态修复工具的潜力。在公共数据库中可获得的超过400种蓝细菌基因组中，明显可见蓝细菌的生化途径是多种多样的(Alvarenga et al,Front.Microbiol.,第8卷,2017,第809页)。因此，正在探索通过使用经基因操作的蓝细菌来改善和/或改变代谢物生产的可能性。

目前，以下三种方法可用于将异源核酸引入蓝细菌：自然转化、电穿孔和接合。使用每种方法进行转化的成功率均相对较低，并且因为不同物种之间抵抗外来核酸插入的物理和生化屏障不同而可能是物种依赖性的。此外，转化成功率还可能取决于所用核酸的长度、形式和浓度。

整合载体和复制载体可用于转化蓝细菌。整合质粒通过同源重组将异源核酸整合到基因组DNA中。或者，复制质粒允许引入异源核酸并且能够在细胞中自我复制。这两种类型的质粒均已被开发用于蓝细菌。

蓝细菌菌株的基因操作是具有挑战性的，原因是当前的转化方案效率低且费力，通常需要3到6个月的时间以产生经基因操作且完全分离的蓝细菌的纯菌株。

蓝细菌具有可变的倍性，其中一些菌株每个细胞具有3至4个基因组拷贝，而另一些菌株在指数期具有218个基因组拷贝，在线性生长期和静止生长期具有58个基因组拷贝。也就是说，倍性水平受生长阶段高度调控。此外，细胞分裂和分离在时间上没有分开，而是逐渐随复制发生分离。这导致，当用核酸转化蓝细菌时，携带所转化的核酸的基因组拷贝通常不会完全分离到后代中。

因此，需要开发新的转化方案以便于对蓝细菌进行基因工程化。

本发明人已开发出在转化后仅7至9天就能产生出经基因操作的蓝细菌的完全分离的菌株(fully-segregated strain)的方法。所述方法显著减少了生产经基因操作的蓝细菌所需的资源和时间。

发明内容

在第一个方面，提供了一种用于转化革兰氏阴性微生物的方法，所述方法包括：

a)在适合用包含选择标记的核酸转化微生物的条件下孵育微生物和核酸；

b)在适合微生物恢复的条件下在生长培养基中进一步孵育微生物；和

c)使用选择剂选择经转化的微生物。

革兰氏阴性微生物可以是蓝细菌，例如聚球藻属(Synechococcus)或集胞藻(Synechocystis)属的蓝细菌。聚球藻可以是聚球藻PCC 7002，或细长聚球藻(Synechococcus elongatus)PCC 7942。集胞藻可以是集胞藻PCC 6803。

在一个实施方案中，经转化的微生物是完全分离的。

步骤a)中的蓝细菌可以处于指数生长期。在步骤a)之前的步骤的一些实施方案中，蓝细菌可以已经在光/暗循环中培养。步骤a)中使用的蓝细菌可以在光循环结束时或接近光循环结束时收获。

适合转化的条件可以包括在低光照条件下孵育蓝细菌1至10小时，例如约5小时。

适合恢复的条件可包括添加生长培养基并在低光照条件下孵育蓝细菌约1至约24小时，例如约4至约18小时。

选择步骤可包括添加选择剂并在低光照条件下孵育蓝细菌约12至至少约144小时，例如约48小时至约144小时。

所述孵育、进一步孵育或两者可以在水性培养基中进行。

在一些实施方案中，可以在孵育时间之后将选择步骤中的蓝细菌的一部分涂覆到固体或半固体培养基以获得单独的菌落。

在第二个方面，提供了通过第一个方面的方法产生的经转化的蓝细菌。

在第三个方面，提供了一种转化蓝细菌的方法，所述方法包括：

a)在低光照条件下孵育蓝细菌和包含选择标记的核酸1至10小时；

b)在低光照条件下在生长培养基中进一步孵育蓝细菌约1至约24小时；和

c)使用选择剂选择经转化的蓝细菌，其中所述选择包括添加选择剂并在低光照条件下孵育蓝细菌约12至至少约144小时。

在第四个方面，提供了一种转化蓝细菌的方法，所述方法包括：

a)在低光照条件下孵育蓝细菌和包含选择标记的核酸约5小时；

b)在低光照条件下在生长培养基中进一步孵育蓝细菌约4至约18小时；和

c)使用选择剂选择经转化的蓝细菌，其中所述选择包括添加选择剂并在低光照条件下孵育蓝细菌约48至约144小时。

蓝细菌可以处于指数生长期。

在一个实施方案中，所述孵育、进一步孵育或两者在水性培养基中进行。

优选地，经转化的蓝细菌是完全分离的。

定义

在整个本说明书中，除非上下文另有明确要求，否则词语“包含(comprise)”或诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的变体将理解为表示包含所述元素、整数或步骤，或元素、整数或步骤的组，但不排除任何其他元素、整数或步骤，或元素、整数或步骤的组。

在整个本说明书中，术语“由……组成”意指仅由……组成。

对已经包括在本说明书中的文件、行为、材料、装置、物品等的任何讨论仅仅是出于提供本技术的上下文的目的。它们不应被视为承认任何或所有这些事物构成在本申请每个权利要求的优先权日期之前存在的本技术相关领域中现有技术基础的一部分或者是公知常识。

除非上下文另有要求或相反明确说明，否则以单个整数、步骤或元素出现的本文所述技术的整数、步骤或元素清楚地涵盖所列举的整数、步骤或元素的单数和复数形式。

在本说明书的上下文中，术语“a”和“an”用于指代文章的语法对象的一个或多于一个(即，至少一个)。举例来说，提及“an element”意指一个元素，或多于一个元素。

在本说明书的上下文中，术语“约”意指提到的数字或值不视为绝对数字或值，而是包括高于或低于该数字或值的变化幅度，这与技术人员对技术的理解一致，并且包括在通常的误差范围内或仪器限制内。换言之，所使用的术语“约”应理解为是指本领域人员或技术人员认为在实现相同功能或结果方面与所列举的值等同的范围或近似值。

通常，分离过程是指染色体分离过程，在该过程中，由于DNA复制而形成的姐妹染色单体，或寡倍体或多倍体蓝细菌中存在的同源染色体，彼此分离并迁移至蓝细菌的不同部分，从而在细胞分裂时，每个子细胞接收至少一个拷贝的姐妹染色单体或同源染色体。如本文所用，“分离”另外也指向用核酸转化的蓝细菌施加选择压力的过程。选择压力产生了存活偏差，使得只有含有至少一个拷贝的所述核酸的蓝细菌才能存活。

“完全分离的”在本文中用于用核酸转化的蓝细菌，其中所转化的核酸存在于多个代次的蓝细菌中，使得基本上培养物中的每个单独蓝细菌都包含所转化的核酸。“完全分离的”蓝细菌是用靶向中性位点的核酸转化的蓝细菌，其中所述核酸基本上存在于每个单独蓝细菌内的每个染色体或质粒中的靶向中性位点(neutral site)中，并且不存在原始的未经修饰的染色体的拷贝。

本领域技术人员将理解，本文所述的技术易于除具体描述的那些之外的多种变化和修改。应当理解，所述技术包括所有这些变化和修改。为避免疑义，本技术还包括本说明书中单独或共同提及或说明的所有步骤、特征和化合物，以及任何两个或更多个所述步骤、特征和化合物的任何和所有组合。

为了可以更清楚地理解本技术，将根据以下附图和实施例来描述优选的实施方案。

附图简述

图1是CORA-312的质粒图谱。

图2是CORA-200的质粒图谱。

图3是CORA-410的质粒图谱。

图4是显示完全分离的CORA-312和CORA-200转化体的凝胶。

图5是CORA-402的质粒图谱。

图6是显示完全分离的CORA-402转化体的凝胶。

图7是CORA-300的质粒图谱。

图8是显示完全分离的CORA-300转化体的凝胶。

序列表

提供了对应于说明书中提及的序列标识符的核苷酸序列列表。质粒pBB-CORA-200的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。质粒pBB-CORA-300的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。质粒pBB-CORA-312的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。质粒pBB-CORA-402的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。质粒pBB-CORA-410的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

实施方案的描述

方法

提供了一种转化和获得经转化蓝细菌的完全分离的克隆的方法。所述方法包括以下步骤：提供处于特定生长阶段的细胞，使细胞与核酸接触，将细胞与核酸一起孵育一段时间，用另外的生长培养基允许细胞恢复一段时间，然后添加选择压力以选择经转化蓝细菌的完全分离的克隆。

细胞生长和制备

在转化方法中使用活跃生长的蓝细菌。蓝细菌可处于指数期的早期、中期或晚期。这可以使用OD测量值(例如在750nm处)来确定。可以使用来自OD为0.1至3.0的培养物的蓝细菌。例如，合适的OD为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8或3.0。

可以使用在本领域已知的任何生长条件下培养的蓝细菌。在一些实施方案中，蓝细菌在低光照条件下、恒定光照下或使用光照和黑暗周期(如模拟正常昼夜循环的光照和黑暗周期)下生长。

在使用光/暗循环来制备用于转化的蓝细菌的实施方案中，可以在光/暗循环中的任何点收获蓝细菌。然而，众所周知，在某些(但不一定是所有)菌株中，菌毛的生物发生(pilus biogenesis)出现在每天早晨，但黑暗一开始，自然感受态(natural competence)就达到顶峰，即蓝细菌的自然感受态是有条件的，并且与细胞的生理节律有关。因此，在一些实施方案中，在从亮到暗的转变时或在从亮到暗的转变附近，或在光循环结束时，收获细胞。

用于转化而培养的蓝细菌可以在低光照条件下培养(即小于100μmol光子·m^-2·s^-1)，例如50μmol光子·m^-2·s^-1，在正常光照条件下培养(100-750μmol光子·m^-2·s^-1)，例如100-150μmol光子·m^-2·s^-1，或在饱和光照条件下培养(大于750μmol光子·m^-2·s^-1)。在使用光/暗循环的实施方案中，每个光循环中的光水平可以独立地选自低光照、正常光照或饱和光照。

通常使用广谱光，但是也可以使用包括各种波长和辐照度水平的光，即可以调节在波长(或波长范围)处可用的光能总量以优化或调节细胞生长和/或细胞功能。

在一些实施方案中，细胞通过离心收获。或者，可以通过过滤、沉降或本领域已知的任何其他方法来收获细胞。虽然不是必需的，但通常用不含生长培养基的溶液(例如10mMNaCl)洗涤收获的细胞。

在一个实施方案中，将收获的细胞重悬于新鲜的生长培养基中至每毫升约10⁹个细胞的浓度。重悬细胞的浓度可以是每毫升10⁵个细胞至每毫升至少10¹²个细胞。

将重悬细胞的等分试样分配到合适的容器(例如PCR管或多孔板的孔)中用于转化。本发明人已经证明以20μL等分试样提供细胞，尽管可以使用任何体积等分试样，例如10μL。

在一些实施方案中，细胞在不控制CO₂水平的情况下生长。在其他实施方案中，细胞在包含约0.05％至约10％CO₂的气氛中培养，例如CO₂水平为约0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或约10％。

使细胞与核酸接触

然后将蓝细菌与待转化的核酸接触。例如，通过将核酸添加到分配的细胞中，或者在分配等分试样时核酸可以已经存在于容器中。在一些实施方案中，使用100ng核酸。在其他实施方案中，每20μL等分试样可使用1至至少500ng核酸。例如，每20μL等分试样可使用约1ng、5ng、10ng、50ng、100ng、150ng、200ng、250ng、300ng、350ng、400ng、450ng或至少500ng核酸。

核酸

可以使用任何类型的核酸，例如线性或环状DNA。

核酸可用于本文公开的方法中以对蓝细菌进行基因修饰。此类修饰可以顺式(例如通过染色体修饰)或反式(例如通过添加质粒，例如用于修饰蓝细菌中天然存在的质粒的质粒)进行。

顺式基因修饰通常用于修饰蓝细菌染色体，因为它利用许多蓝细菌菌株进行自然转化和同源重组的能力以在蓝细菌染色体中产生插入、缺失或替换突变。在一些实施方案中，使用选择标记(例如抗生素抗性基因)和感兴趣的序列转化菌株，其中选择标记和感兴趣的序列侧翼有与染色体上的任何非必需序列同源的序列。这可以采取自杀载体的形式，所述自杀载体经设计而通过载体中的侧翼区域在非必需位点整合到基因组中。所述载体还将包含插入物，该插入物包含感兴趣的序列和可选的选择标记。

合适的抗生素抗性基因赋予对氯霉素、红霉素、卡那霉素、壮观霉素、新霉素、链霉素、博来霉素(zeocin)或庆大霉素的抗性。

感兴趣的序列可以例如是一个或多个蓝细菌基因的修饰形式，或者可以是要在蓝细菌中表达的一个或多个异源基因。

或者，可能没有感兴趣的序列，并且两侧具有侧翼序列的选择标记可用于删除蓝细菌基因组的一部分，例如以敲除基因或其部分。

在一些实施方案中，感兴趣的序列可以不包含要表达的一个或多个基因，而是可以仅包含选择标记。在这些实施方案中，侧翼区域被设计为与待通过自杀载体删除的和待通过选择标记替换的区域每侧的部分蓝细菌基因组同源。

或者，可以通过选择-反选择或通过使用重组酶系统如FLP/FRT来制备无标记突变体。

反选择方法开始使用如上所述的自杀载体，但插入物还包含反选择标记，例如sacB。在这些方法中，反选择标记如sacB(条件性毒性基因)与选择标记如抗生素抗性盒连接，然后使用本文所述的方法将该质粒转化到蓝细菌中，并选择抗生素抗性突变体。进行第二次转化，在该转化中抗性盒和毒素基因被删除，并选择已丧失毒性基因的无标记突变体。

合适的反选择标记是枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶合酶(levansucrase synthase)基因sacB，该基因赋予蔗糖敏感性。或者，也可以使用在镍诱导型启动子下表达的大肠杆菌mazF(蛋白合成抑制子)。这允许重复使用单个选择标记来对染色体进行多次连续改变。其他合适的反选择标记包括rpsL、tetAR(赋予对镰孢菌酸和喹啉酸的敏感性)、pheS(赋予对氯苯丙氨酸的敏感性)、thyA(赋予对甲氧苄啶和相关化合物的敏感性)、lacY(赋予对t-o-硝基苯基-β-d-半乳糖苷的敏感性)、gata-1(抑制核酸复制)和ccdB(有毒蛋白)。

侧翼区域可以设计为与蓝细菌基因组的任何区域同源，并且技术人员可以使用本领域已知的方法设计侧翼区域。

在一些实施方案中，侧翼区域的长度为至少500bp。例如，每个侧翼区区域的长度可以独立地选自约500bp、550bp、600bp、650bp、700bp、750bp、800bp、850bp、900bp、950bp或至少约1000bp。

侧翼区域可以与蓝细菌基因组的任何区域同源。在一些实施方案中，侧翼区域与非必需区域同源。非必需区域是本领域已知的。

例如，PCC 6803的合适的非必需区域由Ng,A.H.,Berla,B.M.和Pakrasi,H.B.,2015.Fine-tuning of photoautotrophic protein production by combiningpromoters and neutral sites in the cyanobacterium Synechocystis sp.strain PCC6803.Appl.Environ.Microbiol.,81(19),pp.6857-6863描述为NSC1位点。

在另一个实施方案中，PCC 6803的非必需位置可以是slr0168，如Xiao,Y.,Wang,S.,Rommelfanger,S.,Balassy,A.,Barba-Ostria,C.,Gu,P.,Galazka,J.M.和Zhang,F.,2018.Developing a Cas9-based tool to engineer native plasmids inSynechocystis sp.PCC 6803.Biotechnology and bioengineering,115(9),pp.2305-2314所述。

对于PCC 7002，可以使用A0159和A2842等非必需位置，这些位置描述在Vogel,A.I.M.,Lale,R.和Hohmann-Marriott,M.F.,2017.Streamlining recombination-mediated genetic engineering by validating three neutral integration sites inSynechococcus sp.PCC 7002.Journal of biological engineering,11(1),p.19中。

适用于PCC 7942的非必需位置描述在Kulkarni,R.D.和Golden,S.S.,1997.mRNAstability is regulated by a coding-region element and the unique 5′untranslated leader sequences of the three Synechococcus psbAtranscripts.Molecular microbiology,24(6),pp.1131-1142；和Andersson,C.R.,2000.Application of bioluminescence to the study of circadian rhythms incyanobacteria.Methods Enzymol.,305,pp.527-542中。

在一些实施方案中，本文所述的方法可用于反式表达基因。有许多在蓝细菌中复制的已知质粒，这些质粒可以与本文所述的方法一起使用。合适的质粒可以含有选自pDU1SZ、pDU1LZ、PDC1Z、pFDAZ、pANS、pCC5.2和pAQ1的蓝细菌复制子。

在其他实施方案中，质粒可以是天然存在的蓝细菌质粒，其被工程化以包括所需的核酸序列。或者，质粒可以没有能力复制，因此只有在整合到细胞基因组中时才会在细胞中持续存在。

质粒还可以含有常用细菌如大肠杆菌的复制起点，以促进质粒序列的修饰，以及在使用本文公开的方法转化蓝细菌之前在不同的物种中制备质粒。

在一些实施方案中，启动子与感兴趣的序列可操作的连接(无论是在自杀载体还是复制载体中)。

启动子可以是组成型活性启动子或诱导型启动子。诱导型启动子是响应特定信号的启动子。在一些实施方案中，诱导型启动子在没有诱导剂的情况下将不会被激活，它会对给定浓度的诱导剂或阻遏剂产生可预测的反应。这种反应可能是二元的(即开/关)，或随着诱导剂/阻遏剂的不同浓度而逐渐变化。理想地，饱和浓度的诱导剂对蓝细菌宿主生物体无害。

诱导型启动子可以是金属诱导型启动子、代谢物诱导型启动子或大量营养素(macronutrient)诱导型启动子。

金属诱导型启动子可以选自包含以下的组：ArsB(由AsO^2-诱导)、ziaA(由Cd²⁺或Zn^{2 +}诱导)、coat(由Co²⁺或Zn²⁺诱导)、nrsB(由Co²⁺或Ni²⁺诱导)、petE(由Cu+²诱导)、isiAB(被Fe^{3 +}阻遏)、idiA(被Fe²⁺阻遏)和Smt(被Zn²⁺阻遏)。

代谢物诱导型启动子可以选自包含以下的组：四环素诱导型和IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷)诱导型tetR、trp-lac、Trc、AllacO-1、trc10、trc20、LlacO1、clac143和Trc。在一个实施方案中，诱导型启动子是clac143。

大量营养素诱导型启动子可以选自psbA2(由光照诱导)、psbA1(由光照诱导)、nirA(由NO₃ ^-诱导，被NH₄ ⁺阻遏)和Nir(由NO₃ ^-诱导，被NH₄ ⁺阻遏)。

启动子可以是I型、II型或III型启动子。I型启动子包含+1处(根据定义)的转录起始位点、-10元件(共有序列5'-TATAAT-3')和-35元件(共有序列5'-TTGACA-3')。当基因的表达由应激或适应反应诱导并因此通常由第2组sigma因子转录时，通常使用II型启动子。II型启动子具有-10元件，但通常缺少-35元件。III型启动子没有常规的-10和-35元件。因此，启动子的选择可以根据所需的生长条件进行调整。

在一些实施方案中，可以使用组成型启动子。合适的组成型启动子的实例包括cpc560、psbA、质体蓝素启动子、BBaJ23101和J23。

初始孵育

在蓝细菌与核酸接触后，将它们孵育至少一小时的时间。孵育时间可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小时。在一些实施方案中，孵育时间为4、5或6小时，例如5小时。在该孵育时间中，选择温度以适合正在被转化的蓝细菌菌株，温度可以在约15℃至约35℃的范围内，例如温度可以是约15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或约35℃。

任何光照条件均可用于该初始孵育，例如低光照、低光照条件(即小于100μmol光子·m^-2·s^-1)、正常光照条件(100-750μmol光子·m^-2·s^-1)或饱和光照条件(大于750μmol光子·m^-2·s^-1)。在一个实施方案中，使用了低光照条件。

在初始孵育期间，振荡液体培养物，例如在振动器或旋转器上。通常，使用回旋振动器作为振动器。回旋振动器可以利用多种旋转速度，例如从约10rpm至约500rpm。在一些实施方案中，使用约100rpm的旋转速度。

恢复

在该初始孵育时间之后，将额外的生长培养基添加到蓝细菌中，并允许它们在培养条件下恢复一段时间。

使用超过等分试样体积的添加培养基的体积，例如可以添加1、2、3、4、5、6、7、8、9或至少10倍过量的培养基，仅受容器体积的限制。例如，在使用20μl等分试样的实施方案中，可以添加额外的180μL培养基(9倍过量)。

在添加过量生长培养基后，将细胞孵育1至24小时的时间，然后添加选择压力。培养时间可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时。如本文所例示，在一些实施方案中，恢复时间可为4至18小时。

恢复期间的培养条件选自上述用于初始孵育的条件。

选择

在恢复后，将选择剂添加到培养物中。所选择的选择剂对应于核酸的选择标记，例如如果选择标记是氯霉素抗性基因，则选择剂是氯霉素。

待添加的选择剂的量可以由技术人员使用公开可获得的信息来确定。在选择剂是抗生素的实施方案中，终浓度通常在约5μg/mL至约500μg/mL的范围内。

选择期间的培养条件选自上述用于初始孵育的条件。

在选择期间的不同时间点，可以取出培养物样品并将其铺板在琼脂平板上，以评估是否已经产生了对选择剂具有抗性(并因此成功转化)的克隆。方便的初始时间点是48小时。在其他实施方案中，可以在约12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时、120小时、132小时、144小时或更晚时取样。

在一些实施方案中，在取样后，剩余的培养物用含有选择剂的新鲜培养基补足。

使用本领域已知的培养基和方法将样品铺在固体或半固体培养基上以允许形成单独的菌落。

一旦形成单独的菌落，就可以对它们进行测试以评估转化是否成功以及转化体是否完全分离。这可以使用针对侧翼区域的引物进行PCR来实现，例如，如果核酸的侧翼区域之间的距离是例如1.5kb并且基因组中的侧翼区域之间的距离是500bp，那么简单的PCR反应将确定单独的菌落是否包含成功转化的蓝细菌以及改变的染色体是否已完全分离。单个PCR产物将确认没有剩余拷贝的“野生型”染色体。或者，可以使用RT-PCR来评估转化体是否已完全分离。

在可选的实施方案中，可以测试样品的转化成功和完全分离，而无需首先形成单独的菌落。

菌株

大多数蓝细菌具有编码用于IV型菌毛器官的蛋白的基因，已知这些蛋白与自然感受态有关。因此，本文公开的方法可用于具有IV型菌毛的任何蓝细菌属。

可以使用本文公开的方法转化的蓝细菌属包括选自包含以下的组的那些：聚环藻(Collenia)、葛万藻(Girvanella)、Gunflintia、Morania、Sphaerocodium、Acaryochloris、鱼腥藻(Anabaena)、拟鱼腥藻(Anabaenopsis)、束丝藻(Aphanizomenon)、节旋藻(Arthrospira)、管链藻(Aulosira)、博氏藻(Borzia)、眉藻(Calothrix)、拟绿胶藻(Chlorogloeopsis)、拟色球藻属(Chroococcidiopsis)、蓝细菌(Cyanobacterium)、Cyanonephron、蓝杆藻(Cyanothece)、拟柱孢藻(Cylindrospermopsis)、筒孢藻(Cylindrospermum)、Gloeobacter、粘球藻(Gloeocapsa)、胶刺藻(Gloeotrichia)、须藻(Homoeothrix)、Jakutophyton、拟丝藻(Johannesbaptistia)、Loefgrenia、Lyngbya、平裂藻(Merismopedia)、微囊藻(Microcystis)、节球藻(Nodularia)、念珠藻(Nostoc)、颤藻(Oscillatoria)、Ozarkcollenia、Palaeolyngbya、翅线藻(Petalonema)、浮丝藻(Planktothrix)、原绿球藻(Prochlorococcus)、原绿藻(Prochloron)、Radaisia、胶须藻(Rivularia)、Rothpletzella、伪枝藻(Scytonema)、螺旋藻(Spirulina)、聚球藻(Synechococcus)、集胞藻(Synechocystis)、束毛藻(Trichodesmium)和Wollea。

在一些实施方案中，合适的菌株包括可使用传统方法进行基因修饰的菌株，例如集胞藻PCC 6803、细长聚球藻PCC 7942、聚球藻PCC 7002、聚球藻UTEX 2973、聚球藻UTEX3153、聚球藻UTEX 3154、多变鱼腥藻PCC 7120和细鞘丝藻(Leptolyngbya)BL0902。

对高通量方法的适应性

本文公开的方法利用相对小体积的细胞，因此可以使用多孔板等平行地进行大量转化。再加上分离经转化且完全分离的克隆的时间相对较短，使得该方法可以使用市售平板、流体和孵育系统实现自动化。因此，本文公开的方法可以是自动化的。

本领域技术人员将理解，在不背离广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对具体实施方案中所示的本发明进行多种变化和/或修改。因此，本文的实施方案在所有方面都被认为是说明性的而不是限制性的。

实施例

实施例1：转换和分离的一般方法

蓝细菌(集胞藻PCC 6803，细长聚球藻PCC 7942)在BG-11A培养基中生长至对数中期，BG-11A培养基是常用BG-11培养基的改良版本，含52mg/L K₂HPO₄ x 3H₂O(相比于BG-11中的30mg/L)和100mM NaHCO₃(碳酸氢钠)。在一些实例中，使用AA+培养基，该培养基在例如Vogel et al.Journal of Biological Engineering(2017)11:19中描述。聚球藻PCC 7002在AA+中生长。

然后将细胞沉淀并用10mM NaCl洗涤，然后重悬于新鲜的BG-11A培养基中至每毫升约10⁹个细胞的密度。将重悬细胞的20μL等分试样置于PCR管中，向每个等分试样添加100ng DNA并轻柔混合。DNA含有感兴趣的序列，例如选择标记以及与蓝细菌基因组的一部分同源的上游和下游侧翼区域(详见下文实施例)。然后将混合物在30℃下以100rpm在低光照条件(约35μmol光子·m^-2·s^-1和广谱白光)下孵育5小时。然后将每个细胞和DNA混合物转移到96孔板中，并添加180μL BG-11A培养基，然后将平板在30℃下以100rpm在低光照条件下进一步孵育18小时。孵育18小时后，添加选择剂(氯霉素)至终浓度为25μg/ml集胞藻PCC 6803、聚球藻PCC 7002和5μg/ml细长聚球藻PCC 7942。然后将96孔板在30℃下以100rpm在低光照条件下孵育144小时，然后将培养物的一部分置于包含上述浓度的选择剂的培养皿、6孔或12孔平板中的琼脂上。

转化和获得经转化蓝细菌的完全分离克隆的步骤如下：

1.将对数中期细胞沉淀，可选地使用10mM NaCl。

2.在生长培养基中重悬细胞至每毫升约10⁹个细胞。

3.将重悬细胞的20μL等分试样分配到单独的试管或孔中。

4.将核酸(例如100ng DNA)添加到等分试样中。

5.在低光照条件下，在30℃下以100rpm孵育5小时。

6.恢复：向等分试样中添加180μL培养基，在30℃下以100rpm在低光照条件下孵育18小时。

7.添加选择剂(例如，对于集胞藻6803、聚球藻属PCC 7002，添加25μg/ml氯霉素，对于细长聚球藻PCC 7942，使用5μg/ml氯霉素)。

8.在30℃下以100rpm在低光照条件下孵育144小时。

9.将培养物的一部分铺到具有选择剂的培养基上以获得单独的菌落。

包含成功转化且完全分离的蓝细菌的菌落可以通过使用针对侧翼区域的引物对在步骤4中添加的核酸(或其一部分)进行PCR扩增来鉴定。

在以下实施例中遵循该方法，除了每个实施例中指示的变化之外。

实施例2：4小时和18小时恢复

在该实施例中，遵循实施例1的方法，但是使用4小时和可选的18小时恢复步骤来评估是否可以使用更短的恢复时间来减少获得转化体所需的时间。在4小时和18小时恢复之间没有观察到该方法的成功率(产生完全分离的转化克隆)有显著差异。

表1列出了本实施例的相关参数。

还观察到在非选择培养基上生长的转化细胞保留了选择标记(氯霉素抗性)并保持转化和完全分离(如通过PCR验证)。

在该实施例中观察到的分离水平与何时施加选择无关。

表1：实施例2中使用的参数

CORA-312(SEQ ID NO:3)、CORA-200(SEQ ID NO:1)和CORA-410(SEQ ID NO:5)的质粒图谱分别显示在图1至3中。

参考图4，对于每个克隆数，左泳道显示4小时恢复的结果，而右侧泳道显示18小时恢复时间的结果。对于CORA-312，没有Cm0的实施例显示部分分离，其中同时存在野生型染色体和经转化的染色体。Cm10和Cm25显示完全分离的菌落。

对于CORA-200，在任何用抗生素处理的菌落中只有转化体条带而没有野生型条带，代表了完全分离的克隆。

实施例3：OD和铺板时间对6803转化效率的影响

在该实施例中，改变初始培养物的OD以评估这是否对转化效率有影响。如表2所示，选择了两个OD，以使用指数期开始时和指数期后期时的细胞。还使用了两个铺板时间点。

表2：6803的参数和结果

实施例4：OD和铺板时间对7002转化效率的影响

在本实施例中，改变起始培养物的OD以评估这是否对转化效率有影响。如表3所示，选择了两个OD，以使用指数期开始和指数期后期时的细胞。还使用了两个铺板时间点。

表3：7002的参数和结果

实施例5：OD和铺板时间对7002和7942转化效率的影响

在该实施例中，努力提高7002的转化效率和获得7942的结果。如表4a和4b中所列，对于每种菌株使用三个OD，对于7942使用两个时间点。

表4a：7002的参数和结果

/>

表4b：7942的参数和结果

CORA-402(SEQ ID NO:4)的质粒图谱如图5所示。

图6显示了在铺板144小时后7942的第一个完全分离的克隆。泳道1，在OD为1时收获的细胞。泳道2，在OD为1.19时收获的细胞。泳道3，在OD为1.16时收获的细胞。

实施例6：DNA构象的影响

在该实施例中，使用环状形式的CORA-312和CORA-200质粒，以通过PCR扩增产生从同源重组区域开始和结束的线性化DNA，用于转化6803和7002中的每一种。

表5：实施例6中使用的参数

使用线性DNA(分别为CORA-312和CORA-200)成功地转化了7002和6803。

实施例7：DNA构象的比较

在本实施例中，使用环状和线性形式的DNA转化6803。如表6所示，测试了一种质粒。

表6：实施例7中使用的参数

CORA-300(SEQ ID NO:2)的质粒图谱如图7所示。

图8显示了使用线性和质粒DNA(分别为CORA-300)成功地转化了完全分离的6803菌落。在一些泳道可见的较小条带是脱靶的错误引导的DNA扩增，既不代表野生型也不代表转化体。

序列表

<110> 邦迪比奥私人有限公司（BondiBio Pty Ltd）

<120> 转化蓝细菌的方法

<130> 120992769

<150> 2020901047

<151> 2020-04-03

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4833

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pBB-CORA-200

<400> 1

gctcactcaa aggcggtaat ctcgagtccc gtcaagtcag cgcgcaataa aaaagccccc 60

ggaaggtgat cttccggggg ctttctcatg cgttccaagt tatgtatgga ccggccgaca 120

gatcgtcaag attactataa gattccgcat tgcggacgat ttaggcgcac tatcgagcca 180

tgctcccatt tggcggagtt tctttagatc ccaaaaggct tgtcactaca tcgccgatca 240

gggttctcac ttgtattacc agccgaaaaa ataagctcca aaagcgtgac tagatagcgc 300

tgtaaaccct aattttcctc ggagaattgg ggtttttctt tggttggtga tgatgatttt 360

tagagagatc gcctatgatc gagaccgttg aatttatggc agcaacatga aacgggttcg 420

ggtcaagtac agttcaccag tcttttggct gggtcttggt ttaaccggca ttttgggcat 480

tggggcgatc gccaaccgca atgctttact tcccttgttt ccaggcagtg gtcaggtgga 540

atctccagca gcggtagatt ctgaagtgtt agccctggtg gatctcgccc cggcagagcg 600

gcgcgatcgc ctcgaagtga tcgccaacag cagcaacaat gacctcgacc gaaaccgcgc 660

ccgttacctg ttggggatgg actacttggt tgcggaagat ggggcagcgg ccctagccgc 720

cttcgagaac ctagaacagg actatccggt gttaacgcct catattttga ttaaacgggg 780

ccgcgcctac gaattggtca ataatcccga acaggcccag gtgatttggt ttgatgtggt 840

gcaaaattat ccagaggatg ctgccgctgc cgaagcgctg tttcgcctca gtgcctacga 900

cccgaaatat gccgaccagg cgatcgccga atatcccgcc catccgcgca cccaaagctt 960

gatccaacaa cgccttgcag aaagcccaac tcaatcacaa ctcggcgtta tgaatcttcg 1020

gactcagaat tggttaattg gttgtaacac tgacccctat ttgtttattt ttctaaatac 1080

attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa 1140

aaaggaagaa tatgagccat attcaacggg aaacgtcgag gccgcgatta aattccaaca 1200

tggatgctga tttatatggg tataaatggg ctcgcgataa tgtcgggcaa tcaggtgcga 1260

caatctatcg cttgtatggg aagcccgatg cgccagagtt gtttctgaaa catggcaaag 1320

gtagcgttgc caatgatgtt acagatgaga tggtcagact aaactggctg acggaattta 1380

tgccacttcc gaccatcaag cattttatcc gtactcctga tgatgcatgg ttactcacca 1440

ctgcgatccc cggaaaaaca gcgttccagg tattagaaga atatcctgat tcaggtgaaa 1500

atattgttga tgcgctggca gtgttcctgc gccggttgca ctcgattcct gtttgtaatt 1560

gtccttttaa cagcgatcgc gtatttcgcc tcgctcaggc gcaatcacga atgaataacg 1620

gtttggttga tgcgagtgat tttgatgacg agcgtaatgg ctggcctgtt gaacaagtct 1680

ggaaagaaat gcataaactt ttgccattct caccggattc agtcgtcact catggtgatt 1740

tctcacttga taaccttatt tttgacgagg ggaaattaat aggttgtatt gatgttggac 1800

gagtcggaat cgcagaccga taccaggatc ttgccatcct atggaactgc ctcggtgagt 1860

tttctccttc attacagaaa cggctttttc aaaaatatgg tattgataat cctgatatga 1920

ataaattgca gtttcatttg atgctcgatg agtttttcta agttatgagt caggaaaaaa 1980

ggcgacagag taatctgtcg ccttttttct ttgcttgctt tttgacacgg tttagcagaa 2040

ggacgtcgaa cagtcatgaa attatggtgg tgtcggatca gcgaacctca gttagcgtac 2100

attgtccaat ctaactcacc ggcgtgtcat tgagggctta tttaataaga tgatcttctt 2160

gagatcgttt tggtctgcgc gtaatctctt gctctgaaaa cgaaaaaacc gccttgcagg 2220

gcggtttttc gaaggttctc tgagctacca actctttgaa ccgaggtaac tggcttggag 2280

gagcgcagtc accaaaactt gtcctttcag tttagcctta accggcgcat gacttcaaga 2340

ctaactcctc taaatcaatt accagtggct gctgccagtg gtgcttttgc atgtctttcc 2400

gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcggactg aacggggggt 2460

tcgtgcatac agtccagctt ggagcgaact gcctacccgg aactgagtgt caggcgtgga 2520

atgagacaaa cgcggccata acagcggaat gacaccggta aaccgaaagg caggaacagg 2580

agagcgcacg agggagccgc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt 2640

tcgccaccac tgatttgagc gtcagatttc gtgatgcttg tcaggggggc ggagcctatg 2700

gaaaaacggc tttgccgcgg ccctctcact tccctgttaa gtatcttcct ggcatcttcc 2760

aggaaatctc cgccccgttc gtaagccatt tccgctcgcc gcagtcgaac gaccgagcgt 2820

agcgagtcag tgagcgagga agcggaatat atcctgtatc acatattctg ctgacgcacc 2880

ggtgcagcct tttttctcct gccacatgaa gcacttcact gacaccctca tcagtgccaa 2940

catagtaagc cagtatacac tccgctagag aattacctac cggcctccag tactgtcatg 3000

tcgtcacgga acttccgatt agaccctaaa tttccagaat tttgcctatt tcgtctgatt 3060

aataaggtaa ttgggaatag gcagcctggg aaatagtcgg caactccgca tatttgccga 3120

ggatcgattg caccattgca tagagacaag ccactaaagt accgagaaag gcaacatttg 3180

aaagggtttc aacgagaaga ctgccgcccc caaagccaaa aaagcgaatt aaaatcccga 3240

acaacaccag ggcaatgtca atcaaaatcg cctggagggt attgaagcga atgaagtggc 3300

taattttgct gttgcgtacc accgcagcat agagaatgaa gaaaataatc agccctgcaa 3360

agggaaatga ataaaggcgg attaggggtt gtaaaggcac atagattacc gccaggatcg 3420

gaaagcgcat taaaaacggc agaccgaagg gcaaagcgta gacgaggggt aataggtaag 3480

gtaaggcccc aaataaacga tctgtgggtt cagtggtagt ggacataaaa ctttttctgc 3540

aatggactag ctcctattct acagagaagt cttgaagaag ttctgtggcg atcgccaggg 3600

ccaaacaatg ggaaaaatta aacgaaattc aggaattttg cggcgatttc ccctgcatcc 3660

tgacaaaagg cagtagaatt gtaaacattt gttaatctct ttttgaaact gaatgcaaag 3720

tacagtccgc tccccaggga gtcgcgagtc tctacggcaa gatctgccct tcaccctcaa 3780

ggatgtgaaa gcagccatcc cagactactg ttacagccgt agactacaac gggccacgcg 3840

tagtgagaca tacgagttga tcgggcacgt aagaggttcc aactttcacc ataatgaaat 3900

aagatcacta ccgggcgtat tttttgagtt atcgagattt tcaggagcta aggaagctaa 3960

aatggagaaa aaaatcactg gatataccac cgttgatata tcccaatggc atcgtaaaga 4020

acattttgag gcatttcagt cagttgctca atgtacctat aaccagaccg ttcagctgga 4080

tattacggcc tttttaaaga ccgtaaagaa aaataagcac aagttttatc cggcctttat 4140

tcacattctt gcccgcctga tgaatgctca tccggaattt cgtatggcaa tgaaagacgg 4200

tgagctggtg atatgggata gtgttcaccc ttgttacacc gttttccatg agcaaactga 4260

aacgttttca tcgctctgga gtgaatacca cgacgatttc cggcagtttc tacacatata 4320

ttcgcaagat gtggcgtgtt acggtgaaaa cctggcctat ttccctaaag ggtttattga 4380

gaatatgttt ttcgtctcag ccaatccctg ggtgagtttc accagttttg atttaaacgt 4440

ggccaatatg gacaacttct tcgcccccgt tttcaccatg ggcaaatatt atacgcaagg 4500

cgacaaggtg ctgatgccgc tggcgattca ggttcatcat gccgtttgtg atggcttcca 4560

tgtcggcaga atgcttaatg aattacaaca gtactgcgat gagtggcagg gcggggcgta 4620

atccggcaaa aaaacgggca aggtgtcacc accctgccct ttttctttaa aaccgaaaag 4680

attacttcgc gttaaataag cacgtagtgg cgcgcacttc agccaaggaa gttgtcagtt 4740

tcacctgttt tacgtaaaaa cccgcttcgg cgggttttta cttttggggt gccacctgac 4800

gtctaagaaa ccattattat catgacatta acc 4833

<210> 2

<211> 4531

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pBB-CORA-300

<400> 2

gctcactcaa aggcggtaat ctcgagtccc gtcaagtcag cgcgcaataa aaaagccccc 60

ggaaggtgat cttccggggg ctttctcatg cgttccaagt tatgtatgga ccggccgaca 120

gatcgtcaag attactataa gattccgcat tgcggacgat ttaggcgcac tatcgctctt 180

tttcctgggt tgtggtgtcg gcttactact gtcggtggtt tgggtcaatg ttgctcgcca 240

tagtcctccg ctagaatcct ccccagtcaa ggtctcgcct cccttccagg tcgactagtc 300

acaacaattt aaaaatcaga aaaattgtcc cattgatcaa cttacagggg gccattgagc 360

aaaatccggg gtcaccatct agtccccaaa aagctggcga tcgccaaata atagtaaaac 420

ttatcattca aatttaaaat tacttagcag atccaggggg acaactgcaa aattggtcgg 480

atttacatat agactttagc ttatagattt caagacatag gcattcaaac ctgcatagac 540

aagagtctat acagagcgaa gccaatgggg ttcattgccc ctggaaagat caagcaaact 600

gccgaagatt cagggccaag ctttactacc ccaatcccca taaatttcaa ccaaggagac 660

aatttacatt atggattttt tgtccaattt cttgacggac ttcgtgggac aattgcagtc 720

cccaacccta gcctttctga ttggggggat ggttattgcc ggcccaactc aatcacaact 780

cggcgttatg aatcttcgga ctcagaattg gttaattggt tgtaacactg acccctattt 840

gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa 900

tgcttcaata atattgaaaa aggaagaata tgagccatat tcaacgggaa acgtcgaggc 960

cgcgattaaa ttccaacatg gatgctgatt tatatgggta taaatgggct cgcgataatg 1020

tcgggcaatc aggtgcgaca atctatcgct tgtatgggaa gcccgatgcg ccagagttgt 1080

ttctgaaaca tggcaaaggt agcgttgcca atgatgttac agatgagatg gtcagactaa 1140

actggctgac ggaatttatg ccacttccga ccatcaagca ttttatccgt actcctgatg 1200

atgcatggtt actcaccact gcgatccccg gaaaaacagc gttccaggta ttagaagaat 1260

atcctgattc aggtgaaaat attgttgatg cgctggcagt gttcctgcgc cggttgcact 1320

cgattcctgt ttgtaattgt ccttttaaca gcgatcgcgt atttcgcctc gctcaggcgc 1380

aatcacgaat gaataacggt ttggttgatg cgagtgattt tgatgacgag cgtaatggct 1440

ggcctgttga acaagtctgg aaagaaatgc ataaactttt gccattctca ccggattcag 1500

tcgtcactca tggtgatttc tcacttgata accttatttt tgacgagggg aaattaatag 1560

gttgtattga tgttggacga gtcggaatcg cagaccgata ccaggatctt gccatcctat 1620

ggaactgcct cggtgagttt tctccttcat tacagaaacg gctttttcaa aaatatggta 1680

ttgataatcc tgatatgaat aaattgcagt ttcatttgat gctcgatgag tttttctaag 1740

ttatgagtca ggaaaaaagg cgacagagta atctgtcgcc ttttttcttt gcttgctttt 1800

tgacacggtt tagcagaagg acgtcgaaca gtcatgaaat tatggtggtg tcggatcagc 1860

gaacctcagt tagcgtacat tgtccaatct aactcaccgg cgtgtcattg agggcttatt 1920

taataagatg atcttcttga gatcgttttg gtctgcgcgt aatctcttgc tctgaaaacg 1980

aaaaaaccgc cttgcagggc ggtttttcga aggttctctg agctaccaac tctttgaacc 2040

gaggtaactg gcttggagga gcgcagtcac caaaacttgt cctttcagtt tagccttaac 2100

cggcgcatga cttcaagact aactcctcta aatcaattac cagtggctgc tgccagtggt 2160

gcttttgcat gtctttccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg 2220

tcggactgaa cggggggttc gtgcatacag tccagcttgg agcgaactgc ctacccggaa 2280

ctgagtgtca ggcgtggaat gagacaaacg cggccataac agcggaatga caccggtaaa 2340

ccgaaaggca ggaacaggag agcgcacgag ggagccgcca gggggaaacg cctggtatct 2400

ttatagtcct gtcgggtttc gccaccactg atttgagcgt cagatttcgt gatgcttgtc 2460

aggggggcgg agcctatgga aaaacggctt tgccgcggcc ctctcacttc cctgttaagt 2520

atcttcctgg catcttccag gaaatctccg ccccgttcgt aagccatttc cgctcgccgc 2580

agtcgaacga ccgagcgtag cgagtcagtg agcgaggaag cggaatatat cctgtatcac 2640

atattctgct gacgcaccgg tgcagccttt tttctcctgc cacatgaagc acttcactga 2700

caccctcatc agtgccaaca tagtaagcca gtatacactc cgctagagaa ttacctaccg 2760

gcctccagta ctgtcatgtc gtcacggaac ttggcaatgc ccactcctcc acaggcggtg 2820

agggtaaagc tcagcagtaa agttaccagg actacagcag tggataggga ctttttcaac 2880

atgggagaaa gggaagaact gggcaagaag gcaaaattac ctttccttac ccattaaacc 2940

tccaatggtt gaccagaaac tagaggtaga atgattcccg ccagaaaaag aagtttaaca 3000

atttgccatg ggcactgttc tgaagcgggg aggaaggcta tggcctcctc aaccaattta 3060

tttcctgcct aacccagggg acgttgttga ggctataagt tgaggctata aatttaactt 3120

attaaaaggt tcgacaaatt tgagatagtt ttgtggcaaa gatactgctt aggaaccaaa 3180

tattgcataa acttagagat atagtttttt ctaaaaaaat agtcttattt ctatctattg 3240

aatcggggca atttaaactc agaatagatt agttgttccc agctgaaacc atcgtgtgct 3300

ttttccagag gcgtttttgg caatttttcc tctggtaaat ttcaccgact ttggggcaat 3360

gctcataatc accatagagt gaaatccatg aacaagtttg aatcaagaca atcggacagc 3420

cgtagactac aacgggccac gcgtagtgag acatacgagt tgatcgggca cgtaagaggt 3480

tccaactttc accataatga aataagatca ctaccgggcg tattttttga gttatcgaga 3540

ttttcaggag ctaaggaagc taaaatggag aaaaaaatca ctggatatac caccgttgat 3600

atatcccaat ggcatcgtaa agaacatttt gaggcatttc agtcagttgc tcaatgtacc 3660

tataaccaga ccgttcagct ggatattacg gcctttttaa agaccgtaaa gaaaaataag 3720

cacaagtttt atccggcctt tattcacatt cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccggaa 3780

tttcgtatgg caatgaaaga cggtgagctg gtgatatggg atagtgttca cccttgttac 3840

accgttttcc atgagcaaac tgaaacgttt tcatcgctct ggagtgaata ccacgacgat 3900

ttccggcagt ttctacacat atattcgcaa gatgtggcgt gttacggtga aaacctggcc 3960

tatttcccta aagggtttat tgagaatatg tttttcgtct cagccaatcc ctgggtgagt 4020

ttcaccagtt ttgatttaaa cgtggccaat atggacaact tcttcgcccc cgttttcacc 4080

atgggcaaat attatacgca aggcgacaag gtgctgatgc cgctggcgat tcaggttcat 4140

catgccgttt gtgatggctt ccatgtcggc agaatgctta atgaattaca acagtactgc 4200

gatgagtggc agggcggggc gtaatccggc aaaaaaacgg gcaaggtgtc accaccctgc 4260

cctttttctt taaaaccgaa aagattactt cgcgttaaat aagcacgtag tggcgcgcac 4320

ttcagccaag gaagttgtca gtttcacctg ttttacgtaa aaacccgctt cggcgggttt 4380

ttacttttgg ggtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctact 4440

agtagcggcc gctgcaggag tcactaaggg ttagttagtt agccaattat tgaagacgct 4500

taacagcgtc tttttttgtt tctggtctcc c 4531

<210> 3

<211> 5326

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pBB-CORA-312

<400> 3

ctggaattcg cggccgcatc tagagttgac aattaatcat ccggctcgta taatgtgtgg 60

aattgtgagc ggataacaat ttcacacata ctagagtagt ggaggttact agatggtgag 120

caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt 180

aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct 240

gaccctgaag ctgatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac 300

caccctgggc tacggcgtgc agtgcttcgc ccgctacccc gaccacatga agcagcacga 360

cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga 420

cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg 480

catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga 540

gtacaactac aacagccaca acgtctatat caccgccgac aagcagaaga acggcatcaa 600

ggccaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcggc gtgcagctcg ccgaccacta 660

ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag 720

ctaccagtcc aagctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga 780

gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aactcggtac 840

caaattccag aaaagacacc cgaaagggtg ttttttcgtt ttggtcctac tagtagcggc 900

cgctgcagga gtcactaagg gttagttagt tagccaatta ttgaagacgc ttaacagcgt 960

ctttttttgt ttctggtctc ccgctcactc aaaggcggta atctcgagtc ccgtcaagtc 1020

agcgcgcaat aaaaaagccc ccggaaggtg atcttccggg ggctttctca tgcgttccaa 1080

gttatgtatg gaccggccga cagatcgtca agattactat aagattccgc attgcggacg 1140

atttaggcgc actatcaccc agatgggaag gtattttatg cttcctttgc tgccgctgat 1200

gaccaagcca cggatttaac cacggcgatc gccaatccca cggccatcga tttaattaac 1260

gccaggggat ttacggcggg tagttccgtc accgtatcgg gttcctacag tcgggaagcc 1320

ttttttgatg gatccatggg tttttatcga cttctggacg ataacggtgc agtgctagat 1380

cccttaacag gtggtgtaat caacccagga caggtaggtt atcaagaagc agctttggca 1440

gatagcaatc gtttgcaagc cactggctcc accctaacgg cagaagacct agaaaccaga 1500

gcattttcct tcaatatttt gggtggcgag ttgtatgcgc catttttaac ggttaatgac 1560

agtctttccg gtattaatca gacttatttt gcctttgggt cggccaaccc agatggcatc 1620

agccacagca caaacttggg acccaacgtg attggttttg aagattttct cggcggaggc 1680

ccaactcaat cacaactcgg cgttatgaat cttcggactc agaattggtt aattggttgt 1740

aacactgacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag 1800

acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagaatatga gccatattca 1860

acgggaaacg tcgaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat atgggtataa 1920

atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgcttgt atgggaagcc 1980

cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg atgttacaga 2040

tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcca cttccgacca tcaagcattt 2100

tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggaa aaacagcgtt 2160

ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc tggcagtgtt 2220

cctgcgccgg ttgcactcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg atcgcgtatt 2280

tcgcctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga gtgattttga 2340

tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata aacttttgcc 2400

attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc ttatttttga 2460

cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag accgatacca 2520

ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac agaaacggct 2580

ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc atttgatgct 2640

cgatgagttt ttctaagtta tgagtcagga aaaaaggcga cagagtaatc tgtcgccttt 2700

tttctttgct tgctttttga cacggtttag cagaaggacg tcgaacagtc atgaaattat 2760

ggtggtgtcg gatcagcgaa cctcagttag cgtacattgt ccaatctaac tcaccggcgt 2820

gtcattgagg gcttatttaa taagatgatc ttcttgagat cgttttggtc tgcgcgtaat 2880

ctcttgctct gaaaacgaaa aaaccgcctt gcagggcggt ttttcgaagg ttctctgagc 2940

taccaactct ttgaaccgag gtaactggct tggaggagcg cagtcaccaa aacttgtcct 3000

ttcagtttag ccttaaccgg cgcatgactt caagactaac tcctctaaat caattaccag 3060

tggctgctgc cagtggtgct tttgcatgtc tttccgggtt ggactcaaga cgatagttac 3120

cggataaggc gcagcggtcg gactgaacgg ggggttcgtg catacagtcc agcttggagc 3180

gaactgccta cccggaactg agtgtcaggc gtggaatgag acaaacgcgg ccataacagc 3240

ggaatgacac cggtaaaccg aaaggcagga acaggagagc gcacgaggga gccgccaggg 3300

ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc accactgatt tgagcgtcag 3360

atttcgtgat gcttgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acggctttgc cgcggccctc 3420

tcacttccct gttaagtatc ttcctggcat cttccaggaa atctccgccc cgttcgtaag 3480

ccatttccgc tcgccgcagt cgaacgaccg agcgtagcga gtcagtgagc gaggaagcgg 3540

aatatatcct gtatcacata ttctgctgac gcaccggtgc agcctttttt ctcctgccac 3600

atgaagcact tcactgacac cctcatcagt gccaacatag taagccagta tacactccgc 3660

tagagaatta cctaccggcc tccagtactg tcatgtcgtc acggaactta tgactattca 3720

atacaccccc ctagccgatc gcctgttggc ctacctcgcc gccgatcgcc taaatctcag 3780

cgccaagagt agttccctca acaccagtat tctgctcagc agtgacctat tcaatcagga 3840

agggggaatt gtaacagcca actatggctt tgatggttat atgggaattc ccggtatgga 3900

tggcaccgat gcggaatccc aacagattgc ctttgacaac aatgtggcct ggaataacct 3960

gggggatttg tccaccacca cccaacgggc ctacacttcg gctattagca cagacacagt 4020

gcagagtgtt tatggcgtta atctggaaaa aaacgataac attcccattg tttttgcgtg 4080

gcccattttt cccaccaccc ttaatcccac agattttcag gtaatgctta acacggggga 4140

aattgtcacc ccggtgatcg cctctttgat tcccaacagt gaatacaacg aacggcaaac 4200

ggtagtaatt acagccgtag actacaacgg gccacgcgta gtgagacata cgagttgatc 4260

gggcacgtaa gaggttccaa ctttcaccat aatgaaataa gatcactacc gggcgtattt 4320

tttgagttat cgagattttc aggagctaag gaagctaaaa tggagaaaaa aatcactgga 4380

tataccaccg ttgatatatc ccaatggcat cgtaaagaac attttgaggc atttcagtca 4440

gttgctcaat gtacctataa ccagaccgtt cagctggata ttacggcctt tttaaagacc 4500

gtaaagaaaa ataagcacaa gttttatccg gcctttattc acattcttgc ccgcctgatg 4560

aatgctcatc cggaatttcg tatggcaatg aaagacggtg agctggtgat atgggatagt 4620

gttcaccctt gttacaccgt tttccatgag caaactgaaa cgttttcatc gctctggagt 4680

gaataccacg acgatttccg gcagtttcta cacatatatt cgcaagatgt ggcgtgttac 4740

ggtgaaaacc tggcctattt ccctaaaggg tttattgaga atatgttttt cgtctcagcc 4800

aatccctggg tgagtttcac cagttttgat ttaaacgtgg ccaatatgga caacttcttc 4860

gcccccgttt tcaccatggg caaatattat acgcaaggcg acaaggtgct gatgccgctg 4920

gcgattcagg ttcatcatgc cgtttgtgat ggcttccatg tcggcagaat gcttaatgaa 4980

ttacaacagt actgcgatga gtggcagggc ggggcgtaat ccggcaaaaa aacgggcaag 5040

gtgtcaccac cctgcccttt ttctttaaaa ccgaaaagat tacttcgcgt taaataagca 5100

cgtagtggcg cgcacttcag ccaaggaagt tgtcagtttc acctgtttta cgtaaaaacc 5160

cgcttcggcg ggtttttact tttggggtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca 5220

tgacattaac cttttgttat caataaaaaa ggccgcgatt tgcggcctta ttgttcgtct 5280

tagttagtta gcccttagtg actcgaattc gcggccgctt ctagag 5326

<210> 4

<211> 6082

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pBB-CORA-402

<400> 4

ctggaattcg cggccgcatc tagagttgac aattaatcat ccggctcgta taatgtgtgg 60

aattgtgagc ggataacaat ttcacacata ctagagtagt ggaggttact agatggtgag 120

caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt 180

aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct 240

gaccctgaag ctgatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac 300

caccctgggc tacggcgtgc agtgcttcgc ccgctacccc gaccacatga agcagcacga 360

cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga 420

cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg 480

catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga 540

gtacaactac aacagccaca acgtctatat caccgccgac aagcagaaga acggcatcaa 600

ggccaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcggc gtgcagctcg ccgaccacta 660

ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag 720

ctaccagtcc aagctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga 780

gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aactcggtac 840

caaattccag aaaagacacc cgaaagggtg ttttttcgtt ttggtcctac tagtagcggc 900

cgctgcagga gtcactaagg gttagttagt tagccaatta ttgaagacgc ttaacagcgt 960

ctttttttgt ttctggtctc ccgctcactc aaaggcggta atctcgagtc ccgtcaagtc 1020

agcgcgcaat aaaaaagccc ccggaaggtg atcttccggg ggctttctca tgcgttccaa 1080

gttatgtatg gaccggccga cagatcgtca agattactat aagattccgc attgcggacg 1140

atttaggcgc actatcttcc gcgatcgccc gtttacaagc tgcctcagct ggggcgatca 1200

catcggcttg aagttgctgc tgcacctgtt tgatccgctc ctgctgcaca gggagttctg 1260

cttggctacg agcgacttcg gtagcaatgt ccgcttcagc ttcggccacc accgcttcgc 1320

gccgcgtcaa cgcatcctga atccggcgct cggcctcggc ttgggcgatc gctacatcgc 1380

gatcgatccg acgcagggcc gtgatcttgt cattttcggc cgtttggatc gcagaggcag 1440

cctgggcatc ggcttcagca attcgggcat ctcgctgcag atcagcccgc tgcttgcgtc 1500

cactagccga gagataaccg acctcatcgg aaatgttctg gacttgcagc gtatcgagga 1560

ctagacccag ctgctcaagg tcatcctccg cctcttccag cagacttttg gcaaaggcaa 1620

ttttgtcctc gttgatctgc tccggcgtga ggctggctaa aacaccacgc aagttgcctt 1680

cgagggtctc cttggcaatt tgctcgattt ccttacggtt tttgccaagc agccgctcga 1740

tcgcgttgtg gatggtcggt tcttccccag caatcttgat attggcaacg ccttcaacag 1800

tcaggggaat gccgcccttg gagaaggcat tggaaacgcg caactcaatg atcatgttgg 1860

tcagatccat gcggagcgct ttttccagca gaggtacccg caggctgctg ccgcccttga 1920

ccaagcgata gccaactcgg cggccatcac tactgcggcg actactgcca gcaaagatca 1980

aaatttcact gggttggcag atgtagtaga gattgcgcag gactaagctg ccagccccgg 2040

cggcccaact caatcacaac tcggcgttat gaatcttcgg actcagaatt ggttaattgg 2100

ttgtaacact gacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca 2160

tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagaat atgagccata 2220

ttcaacggga aacgtcgagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat ttatatgggt 2280

ataaatgggc tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcgc ttgtatggga 2340

agcccgatgc gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc aatgatgtta 2400

cagatgagat ggtcagacta aactggctga cggaatttat gccacttccg accatcaagc 2460

attttatccg tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc ggaaaaacag 2520

cgttccaggt attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag 2580

tgttcctgcg ccggttgcac tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg 2640

tatttcgcct cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat gcgagtgatt 2700

ttgatgacga gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg cataaacttt 2760

tgccattctc accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat aaccttattt 2820

ttgacgaggg gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc gcagaccgat 2880

accaggatct tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca ttacagaaac 2940

ggctttttca aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag tttcatttga 3000

tgctcgatga gtttttctaa gttatgagtc aggaaaaaag gcgacagagt aatctgtcgc 3060

cttttttctt tgcttgcttt ttgacacggt ttagcagaag gacgtcgaac agtcatgaaa 3120

ttatggtggt gtcggatcag cgaacctcag ttagcgtaca ttgtccaatc taactcaccg 3180

gcgtgtcatt gagggcttat ttaataagat gatcttcttg agatcgtttt ggtctgcgcg 3240

taatctcttg ctctgaaaac gaaaaaaccg ccttgcaggg cggtttttcg aaggttctct 3300

gagctaccaa ctctttgaac cgaggtaact ggcttggagg agcgcagtca ccaaaacttg 3360

tcctttcagt ttagccttaa ccggcgcatg acttcaagac taactcctct aaatcaatta 3420

ccagtggctg ctgccagtgg tgcttttgca tgtctttccg ggttggactc aagacgatag 3480

ttaccggata aggcgcagcg gtcggactga acggggggtt cgtgcataca gtccagcttg 3540

gagcgaactg cctacccgga actgagtgtc aggcgtggaa tgagacaaac gcggccataa 3600

cagcggaatg acaccggtaa accgaaaggc aggaacagga gagcgcacga gggagccgcc 3660

agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccaccact gatttgagcg 3720

tcagatttcg tgatgcttgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacggct ttgccgcggc 3780

cctctcactt ccctgttaag tatcttcctg gcatcttcca ggaaatctcc gccccgttcg 3840

taagccattt ccgctcgccg cagtcgaacg accgagcgta gcgagtcagt gagcgaggaa 3900

gcggaatata tcctgtatca catattctgc tgacgcaccg gtgcagcctt ttttctcctg 3960

ccacatgaag cacttcactg acaccctcat cagtgccaac atagtaagcc agtatacact 4020

ccgctagaga attacctacc ggcctccagt actgtcatgt cgtcacggaa cttgatccgg 4080

cagccggcgg agcgctgctt tcttggcaag cggtcgccag ccccaacgcc agggctgcca 4140

gcccgaaaca gcggggcaag gcagcttgga agggcgatcg cagcacgggc atggcaatgt 4200

ctctctgaag gaatgcagac cttattcgta cagccagggt tgaatcgtgg gggtccaatc 4260

acttagctct gctgggctaa accagagagc aatttcctgt tgtgctgttt cgattgcatc 4320

cgagccatgg atgatgttgc ggccaatatt gacaccaaaa tcaccacgga tggtgcccgg 4380

ttctgccgtc agcggattgg tagcgccgat caacttgcga gcagccgcca caacgccttc 4440

gccttccaag acgatcgcca cgatcggccc agaggtgatg aactcgacga ggccattgaa 4500

gaaggggcgc tcgcggtgga cagcatagtg ctgttcggcc agctcgcgac tgggcttcag 4560

ctgctttagg cccaccagtt tgaagccttt ttgctcaaag cggccgatga tcgtaccgac 4620

caaaccccgc tgaacgccat cgggcttgat ggcaataaat gtgcgttcca cagacatcta 4680

gatagtcctc aagacgaggc aagcattgag cttgccttcc tatggttcgg gatcactggg 4740

attcttgaca agcgatcgcg gtcacatcgc tatctcttag gacttcgcag cgggcgagtc 4800

ggattgaccc ggtagggatt tcgccagatc aatgcccgtg gtttgtttca gcttctccag 4860

caagctagcg atttgggtag cgctgccttc cccttcgcca atcacagtga tcgactccac 4920

gtcgatatct ggcacggtgc ctgaaagcgt gacgagcagg gactcgacag ccgtagacta 4980

caacgggcca cgcgtagtga gacatacgag ttgatcgggc acgtaagagg ttccaacttt 5040

caccataatg aaataagatc actaccgggc gtattttttg agttatcgag attttcagga 5100

gctaaggaag ctaaaatgga gaaaaaaatc actggatata ccaccgttga tatatcccaa 5160

tggcatcgta aagaacattt tgaggcattt cagtcagttg ctcaatgtac ctataaccag 5220

accgttcagc tggatattac ggccttttta aagaccgtaa agaaaaataa gcacaagttt 5280

tatccggcct ttattcacat tcttgcccgc ctgatgaatg ctcatccgga atttcgtatg 5340

gcaatgaaag acggtgagct ggtgatatgg gatagtgttc acccttgtta caccgttttc 5400

catgagcaaa ctgaaacgtt ttcatcgctc tggagtgaat accacgacga tttccggcag 5460

tttctacaca tatattcgca agatgtggcg tgttacggtg aaaacctggc ctatttccct 5520

aaagggttta ttgagaatat gtttttcgtc tcagccaatc cctgggtgag tttcaccagt 5580

tttgatttaa acgtggccaa tatggacaac ttcttcgccc ccgttttcac catgggcaaa 5640

tattatacgc aaggcgacaa ggtgctgatg ccgctggcga ttcaggttca tcatgccgtt 5700

tgtgatggct tccatgtcgg cagaatgctt aatgaattac aacagtactg cgatgagtgg 5760

cagggcgggg cgtaatccgg caaaaaaacg ggcaaggtgt caccaccctg ccctttttct 5820

ttaaaaccga aaagattact tcgcgttaaa taagcacgta gtggcgcgca cttcagccaa 5880

ggaagttgtc agtttcacct gttttacgta aaaacccgct tcggcgggtt tttacttttg 5940

gggtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac attaaccttt tgttatcaat 6000

aaaaaaggcc gcgatttgcg gccttattgt tcgtcttagt tagttagccc ttagtgactc 6060

gaattcgcgg ccgcttctag ag 6082

<210> 5

<211> 4757

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pBB-CORA-410

<400> 5

gctcactcaa aggcggtaat ctcgagtccc gtcaagtcag cgcgcaataa aaaagccccc 60

ggaaggtgat cttccggggg ctttctcatg cgttccaagt tatgtatgga ccggccgaca 120

gatcgtcaag attactataa gattccgcat tgcggacgat ttaggcgcac tatcggtaac 180

cccagcgcgg ttgctaccaa gtagtgaccc gcttcgtgat gcaaaatccg ctgacgatat 240

tcgggcgatc gctgctgaat gccatcgagc agtaacgtgg caccccgccc ctgccaagtc 300

accgcatcca gactgaacag caccaagagg ctaaaaccca atcccgccgg tagcagcgga 360

gaactaccca gcattggtcc caccaaagct aatgccgtcg tggtaaaaat cgcgatcgcc 420

gtcagactca agcccagttc gctcatgctt cctcatctag gtcacagtct tcggcgatcg 480

catcgatctg atgctgcagc aagcgttttc cataccggcg atcgcgccgt cgccctttcg 540

ctgccgtggc ccgcttacga gctcgtttat cgaccacgat cgcatccaaa tccgcgatcg 600

cttcccagtc cggcaattca gtctggggcg tccgtttcat taatcctgat caggcacgaa 660

attgctgtgc gtagtatcgc gcatagcggc cagcctctgc caacagcgca tcgtgattgc 720

ctgcctcaac aatctggccg cgctccatca ccaagatgcg gctggcatta cgaaccgtag 780

ccagacggtg agcaatgata aagaccgtcc gtccctgcat cacccgttct agggcctctt 840

gcaccaaggt ttcggactcg gaatcaagcg ccgaagtcgc ctcatccaga attaaaatgc 900

gtggatcgcc caactcaatc acaactcggc gttatgaatc ttcggactca gaattggtta 960

attggttgta acactgaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc 1020

gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agaatatgag 1080

ccatattcaa cgggaaacgt cgaggccgcg attaaattcc aacatggatg ctgatttata 1140

tgggtataaa tgggctcgcg ataatgtcgg gcaatcaggt gcgacaatct atcgcttgta 1200

tgggaagccc gatgcgccag agttgtttct gaaacatggc aaaggtagcg ttgccaatga 1260

tgttacagat gagatggtca gactaaactg gctgacggaa tttatgccac ttccgaccat 1320

caagcatttt atccgtactc ctgatgatgc atggttactc accactgcga tccccggaaa 1380

aacagcgttc caggtattag aagaatatcc tgattcaggt gaaaatattg ttgatgcgct 1440

ggcagtgttc ctgcgccggt tgcactcgat tcctgtttgt aattgtcctt ttaacagcga 1500

tcgcgtattt cgcctcgctc aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg ttgatgcgag 1560

tgattttgat gacgagcgta atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag aaatgcataa 1620

acttttgcca ttctcaccgg attcagtcgt cactcatggt gatttctcac ttgataacct 1680

tatttttgac gaggggaaat taataggttg tattgatgtt ggacgagtcg gaatcgcaga 1740

ccgataccag gatcttgcca tcctatggaa ctgcctcggt gagttttctc cttcattaca 1800

gaaacggctt tttcaaaaat atggtattga taatcctgat atgaataaat tgcagtttca 1860

tttgatgctc gatgagtttt tctaagttat gagtcaggaa aaaaggcgac agagtaatct 1920

gtcgcctttt ttctttgctt gctttttgac acggtttagc agaaggacgt cgaacagtca 1980

tgaaattatg gtggtgtcgg atcagcgaac ctcagttagc gtacattgtc caatctaact 2040

caccggcgtg tcattgaggg cttatttaat aagatgatct tcttgagatc gttttggtct 2100

gcgcgtaatc tcttgctctg aaaacgaaaa aaccgccttg cagggcggtt tttcgaaggt 2160

tctctgagct accaactctt tgaaccgagg taactggctt ggaggagcgc agtcaccaaa 2220

acttgtcctt tcagtttagc cttaaccggc gcatgacttc aagactaact cctctaaatc 2280

aattaccagt ggctgctgcc agtggtgctt ttgcatgtct ttccgggttg gactcaagac 2340

gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg actgaacggg gggttcgtgc atacagtcca 2400

gcttggagcg aactgcctac ccggaactga gtgtcaggcg tggaatgaga caaacgcggc 2460

cataacagcg gaatgacacc ggtaaaccga aaggcaggaa caggagagcg cacgagggag 2520

ccgccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca ccactgattt 2580

gagcgtcaga tttcgtgatg cttgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cggctttgcc 2640

gcggccctct cacttccctg ttaagtatct tcctggcatc ttccaggaaa tctccgcccc 2700

gttcgtaagc catttccgct cgccgcagtc gaacgaccga gcgtagcgag tcagtgagcg 2760

aggaagcgga atatatcctg tatcacatat tctgctgacg caccggtgca gccttttttc 2820

tcctgccaca tgaagcactt cactgacacc ctcatcagtg ccaacatagt aagccagtat 2880

acactccgct agagaattac ctaccggcct ccagtactgt catgtcgtca cggaacttcg 2940

tctgcaagaa gccggtgccc atctcatttt tgacgatatg cgactgctgc ccagtctgct 3000

ccaatcgtcg ccaaaagata actccacagc attgcccaat ccctaacccc tgctcgcgcc 3060

gcaactacac actaaaccgt tcctgcgcga tcgctcttac tgttgatggc tcgtgcttaa 3120

aaacaatgca accctaaccg tttcagctgg tgattttcgg acgatttggc ttacagggat 3180

aactgagagt caacagcctc tgtccgtcat tgcacaccca tccatgcact ggggacttga 3240

ctcatgctga atcacatttc ccttgtccat tgggcgagag gggaggggaa tcttctggac 3300

tcttcactaa gcggcgatcg caggttcttc tacccaagca gtggcgatcg cttgattgca 3360

gtcttcaatg ctggcctctg cagccatcgc cgccaccaaa gcatcgtagg cgggacgttg 3420

ttgctccagt aaagtcttcg cccgtaacaa tccccagcga ctgcgtaaat ccgcttcggc 3480

aggattgcga tcgagttgcc gccacagttg tttccactgg gcgcgatcgt cagctccccc 3540

ttccacgttg ccgtagacca gttgctctgc cgctgcaccg gccatcaaca cctgacacca 3600

ctgttccagc gatcgctgac tgagttgccc ctgtgcggct tcggcttcta gcgcagctgc 3660

ttggaactgc acacccccgc gaccaggttg tccttggcgc agcgcttccc acgctgagag 3720

ggtgtagccc gtcacgacag ccgtagacta caacgggcca cgcgtagtga gacatacgag 3780

ttgatcgggc acgtaagagg ttccaacttt caccataatg aaataagatc actaccgggc 3840

gtattttttg agttatcgag attttcagga gctaaggaag ctaaaatgga gaaaaaaatc 3900

actggatata ccaccgttga tatatcccaa tggcatcgta aagaacattt tgaggcattt 3960

cagtcagttg ctcaatgtac ctataaccag accgttcagc tggatattac ggccttttta 4020

aagaccgtaa agaaaaataa gcacaagttt tatccggcct ttattcacat tcttgcccgc 4080

ctgatgaatg ctcatccgga atttcgtatg gcaatgaaag acggtgagct ggtgatatgg 4140

gatagtgttc acccttgtta caccgttttc catgagcaaa ctgaaacgtt ttcatcgctc 4200

tggagtgaat accacgacga tttccggcag tttctacaca tatattcgca agatgtggcg 4260

tgttacggtg aaaacctggc ctatttccct aaagggttta ttgagaatat gtttttcgtc 4320

tcagccaatc cctgggtgag tttcaccagt tttgatttaa acgtggccaa tatggacaac 4380

ttcttcgccc ccgttttcac catgggcaaa tattatacgc aaggcgacaa ggtgctgatg 4440

ccgctggcga ttcaggttca tcatgccgtt tgtgatggct tccatgtcgg cagaatgctt 4500

aatgaattac aacagtactg cgatgagtgg cagggcgggg cgtaatccgg caaaaaaacg 4560

ggcaaggtgt caccaccctg ccctttttct ttaaaaccga aaagattact tcgcgttaaa 4620

taagcacgta gtggcgcgca cttcagccaa ggaagttgtc agtttcacct gttttacgta 4680

aaaacccgct tcggcgggtt tttacttttg gggtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta 4740

ttatcatgac attaacc 4757

Claims (23)

1.一种转化革兰氏阴性微生物的方法，所述方法包括；

a)在适合用包含选择标记的核酸转化所述微生物的条件下孵育所述微生物和所述核酸；

b)在适合所述微生物恢复的条件下在生长培养基中进一步孵育所述微生物；和

c)使用选择剂选择经转化的微生物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述革兰氏阴性微生物是蓝细菌。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述蓝细菌属于聚球藻属(Synechococcus)或集胞藻属(Synechocystis)。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述聚球藻是聚球藻PCC 7002，或细长聚球藻(Synechococcus elongatus)PCC 7942。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述集胞藻是集胞藻6803。

6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中经转化的蓝细菌是完全分离的。

7.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中所述蓝细菌处于指数生长期。

8.根据权利要求7所述的方法，其中在步骤a)之前，所述蓝细菌已经在光/暗循环中培养。

9.根据权利要求8所述的方法，其中步骤a)是使用在光循环结束时或接近光循环结束时收获的蓝细菌进行的。

10.根据权利要求2至9中任一项所述的方法，其中适合转化的条件包括在低光照条件下孵育所述蓝细菌1至10小时的时间。

11.根据权利要求10所述的方法，其中孵育时间为约5小时。

12.根据权利要求2至11中任一项所述的方法，其中适合恢复的条件包括添加生长培养基并在低光照条件下孵育所述蓝细菌约1至约24小时。

13.根据权利要求12所述的方法，其中孵育时间为约4至约18小时。

14.根据权利要求2至13中任一项所述的方法，其中所述选择包括添加选择剂并在低光照条件下孵育所述蓝细菌约12至至少约144小时。

15.根据权利要求14所述的方法，其中孵育时间为约48小时至约144小时。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述孵育、进一步孵育或两者在水性培养基中进行。

17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其进一步包括在孵育时间之后将所述蓝细菌的一部分涂覆到固体或半固体培养基以获得单独的菌落。

18.通过权利要求2至16中任一项所述的方法产生的经转化且完全分离的蓝细菌。

19.一种转化蓝细菌的方法，所述方法包括：

a)在低光照条件下将所述蓝细菌和包含选择标记的核酸孵育1至10小时的时间；

b)在低光照条件下在生长培养基中进一步孵育所述蓝细菌约1至约24小时；和

c)使用选择剂选择经转化的蓝细菌，其中所述选择包括添加选择剂并在低光照条件下孵育所述蓝细菌约12至至少约144小时。

20.一种转化蓝细菌的方法，所述方法包括：

a)在低光照条件下将所述蓝细菌和包含选择标记的核酸孵育约5小时的时间；

b)在低光照条件下在生长培养基中进一步孵育所述蓝细菌约4至约18小时；和

c)使用选择剂选择经转化的蓝细菌，其中所述选择包括添加选择剂并在低光照条件下孵育所述蓝细菌约48至约144小时。

21.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述蓝细菌处于指数生长期。

22.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述孵育、进一步孵育或两者在水性培养基中进行。

23.根据权利要求18至21中任一项所述的方法，其中所述经转化的蓝细菌是完全分离的。

Images