CN115876740B - 生鲜肉新鲜度的荧光高光谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生鲜肉新鲜度的荧光高光谱检测方法，包括以下步骤：S1、获取新鲜度差异肉类样品的潜在荧光标志物含量和新鲜度指标数据；S2、基于每个新鲜度指标、潜在荧光标志物含量利用线性回归方法确定重点荧光标志物，全部新鲜度指标对应的重点荧光标志物求并确定为新鲜度荧光标志物；S3、基于每个新鲜度指标，构建肉样品的新鲜度预测模型，S4、利用新鲜度预测模型判定待测肉样品的新鲜度。本发明具有以肉的新鲜度荧光标志物为切入点，实现新鲜度的快速、精确预测的有益效果。
Description
技术领域
本发明涉及肉品新鲜度检测技术领域。更具体地说，本发明涉及一种生鲜肉新鲜度的荧光高光谱检测方法。
背景技术
肉品高蛋白质、高水分含量的特性，导致其在流通贮藏过程中极易受到微生物侵染而腐败变质，产生食品安全和食品资源浪费等问题。新鲜度是评价肉品质关键指标，直接影响产品的货架期，因此，快速、准确评价肉品新鲜度，关系着人们的切身利益，也对肉品的运输、储藏及加工过程有着重要的科学意义和应用价值。
目前常用于评价肉品新鲜度的方法有凯氏定氮法、GC-MS、高效液相色谱法、平板计数法等用于测定挥发性盐基氮、菌落总数等以判断肉品新鲜度，存在操作过程复杂、费时费力，无法满足产业快速检测的需求。为解决传统操作存在的问题，基于荧光检测的方式被提出，借助激光、LED等作为光源，当激发光与具有荧光特征的物质相互作用之后，会产生荧光信号，最后荧光信号被探测器检测到，并转换成能够识别的电信号，通过对光谱信号的研究判断肉品新鲜度。传统的高光谱图像无损检测方法，在获取高光谱图像的过程中，盲目设置激发光源波长，存在容易遗漏有效信息或无效信息过多的问题，且获得高光谱图像后，通常无目的提取高光谱图像的特征信息，存在相关性差的问题，例如，申请号为2014191360714，名称为基于多特征融合的肉类新鲜度高光谱图像可视化融合技术，通过提取在不同波段下的高光谱反射图像的多个特征增强肉品新鲜度预测精度，如何有效确定荧光标志物，以肉新鲜度荧光标志物为切入点，利用荧光高光谱灵敏度和高光谱成像技术图谱合一的优势，获取肉品荧光光谱分析，建立基于荧光标志物的快速、无损预测模型，进而研发肉品新鲜度快速检测技术，为肉类产业转型升级提供技术支撑是目前急需解决的问题。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种生鲜肉新鲜度的荧光高光谱检测方法，以肉的新鲜度荧光标志物为切入点，实现新鲜度的快速、精确预测。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种生鲜肉新鲜度的荧光高光谱检测方法，包括以下步骤：包括以下步骤：
S1、获取新鲜度差异肉类样品的潜在荧光标志物含量和新鲜度指标数据；
S2、基于每个新鲜度指标、潜在荧光标志物含量利用线性回归方法确定重点荧光标志物，全部新鲜度指标对应的重点荧光标志物求并确定为新鲜度荧光标志物；
S3、基于每个新鲜度指标，构建肉样品的新鲜度预测模型，具体包括：
S3.1、获取新鲜度差异肉类样品感兴趣区域的新鲜度指标数据；
S3.2、依据新鲜度荧光标志物的激发波长获取新鲜度差异肉类样品感兴趣区域的荧光高光谱数据，并计算为平均荧光光谱；
S3.3、基于平均荧光光谱、新鲜度指标数据，利用偏最小二乘回归法构建新鲜度预测模型；
S4、利用新鲜度预测模型判定待测肉样品的新鲜度
优选的是，潜在荧光标志物包括酪氨酸、色氨酸、维生素B2、三磷酸腺苷、还原型辅酶Ⅰ、卟啉、胶原蛋白。
优选的是，新鲜度指标包括菌落总数、挥发性盐基氮。
优选的是，步骤S2中确定重点荧光标志物具体为：
以潜在荧光标志物含量为自变量、新鲜度指标含量为因变量，建立一元线性回归模型，确定相关系数高于第一阈值的一元线性回归模型对应的潜在荧光标志物为重点荧光标志物；
以重点荧光标志物含量为自变量、新鲜度指标含量为因变量，建立多元线性回归模型，判断多元线性回归模型的相关系数是否小于第二阈值；
若否，重点荧光标志物确定为肉类的重点荧光标志物；
若是，将剩余潜在荧光标志物分别逐渐增多补充至重点荧光标志物，形成新的重点荧光标志物，建立新的多元线性回归模型，至新的多元线性回归模型的相关系数不小于第二阈值，确定该新的重点荧光标志物为重点荧光标志物。
优选的是，至新的多元线性回归模型的相关系数不小于第二阈值，确定多元线性回归模型为新鲜度指标模型；
步骤S2中确定重点荧光标志物还包括进一步确证重点荧光标志物，包括：
重新制备新鲜度差异肉类样品作为样本，分别测定样本的各重点荧光标志物含量及菌落总数、挥发性盐基氮的实测值；
将样本的重点荧光标志物含量代入新鲜度指标模型，计算新鲜度指标预测值；
确定新鲜度指标的预测值与实测值的相关系数是否均大于第一阈值；
若是，确认重点荧光标志物为有效荧光特征标志物，新鲜度指标模型为有效模型；
若否，确认重点荧光标志物为无效荧光特征标志物，新鲜度指标模型为无效模型。
优选的是，构建新鲜度预测模型前还包括构建PARAFAC模型，具体为：
利用新鲜度荧光标志物的标准品配置多个混合溶液、各新鲜度荧光标志物的单一溶液，采集各单一溶液、多个混合溶液的荧光光谱；
以多个混合溶液的荧光光谱、新鲜度荧光标志物的激发波长和发射波长作为输入，每个新鲜度荧光标志物的荧光光谱为输出，各新鲜度荧光标志物的单一溶液的荧光光谱为参照，构建PARAFAC模型；
步骤S3.1还包括：基于PARAFAC模型将平均荧光光谱解析为各新鲜度荧光标志物对应的单一荧光光谱；针对每个样品，将全部单一荧光光谱沿波长方向合并，得到合并荧光光谱；
S3.3为基于合并荧光光谱、新鲜度指标数据，利用偏最小二乘回归法构建新鲜度预测模型。
优选的是，各新鲜度荧光标志物的单一溶液的荧光光谱为参照具体为：
输出的每个新鲜度荧光标志物的荧光光谱分别与对应单一溶液的荧光光谱进行对比，谱峰中心位置偏移在2nm以内，且峰相对强度小于5%。
优选的是，针对任意一新鲜度荧光标志物还包括明确各新鲜度荧光标志物的荧光信号响应规律，包括：
明确新鲜度荧光标志物的浓度和荧光强度的关系方程，具体为：
a1、以新鲜度荧光标志物的标准品为原料，配置不同浓度的单一荧光标志物溶液；
a2、测定多个不同浓度的单一荧光标志物溶液的荧光光谱，获得荧光强度；
a3、基于单一荧光标志物溶液的浓度、荧光强度数据构建浓度、荧光强度关系方程Xc=KcC+Bc，其中，C为荧光标志物溶液的浓度，Xc为荧光标志物溶液的荧光强度，Kc为斜率，Bc为常数；
明确新鲜度荧光标志物的荧光强度在不同温度下的变化规律，具体为：
b1、以新鲜度荧光标志物的标准品为原料，配置荧光标志物溶液，在不同温度条件下测定荧光标志物溶液的荧光光谱，获得荧光强度；
b2、基于不同温度、不同温度下荧光标志物溶液的荧光强度构建温度、荧光强度关系曲线为XT=KTT+BT，其中，XT为温度为T时的荧光强度，T为样品温度，KT为斜率，BT为常数；
b3、以4℃为基准温度，计算荧光强度随温度变化的校正系数ΔX/℃=KT/X4；
明确各荧光标志物的荧光信号响应规律，还包括明确新鲜度荧光标志物的荧光强度在不同pH下的变化规律，具体为：
c1、以新鲜度荧光标志物的标准品为原料，配置同一浓度、不同pH的荧光标志物溶液，测定荧光标志物溶液的荧光发射光谱，获得荧光强度；
c2、基于不同pH下荧光标志物溶液的荧光强度构建pH、荧光强度关系曲线为XP=KPP+BP，其中，XP为荧光强度，P为样品pH，KP为斜率，BP为常数；
c3、以pH=7为基准pH，计算荧光强度随pH变化的校正系数ΔX/1pH=KP/X7；
步骤S3基于每个新鲜度指标，构建肉样品的新鲜度预测模型，还包括：
d1、获得新鲜度差异肉类样品的新鲜度指标数据；
d2、针对每一新鲜度差异肉类样品，取一定重量的样品，向样品中加入占样品质量3倍量的磷酸盐缓冲液，匀浆后离心，取上清，得待测液体样品；
d3、采集所有待测液体样品的荧光高光谱图像数据，并计算为平均荧光光谱；
d4、基于PARAFAC模型将每个待测液体样品的平均荧光光谱解析为各新鲜度荧光标志物对应的荧光光谱；
d5、基于ΔX/℃、ΔX/1pH将各荧光标志物对应的荧光发射光谱校正至基准温度和基准pH条件下，得校正荧光光谱；
d6、基于新鲜度荧光标志物的浓度和荧光强度的关系方程、校正液体光谱，确定待测液体样品中各荧光标志物含量；
d7、基于确定的新鲜度指标模型、待测液体样品中各荧光标志物含量、新鲜度指标数据，计算新鲜度指标模型的相关系数，若相关系数大于0.85，则确定新鲜度指标模型为液体样品的新鲜度预测模型，否则增加样本数后重新采用S2记载方式确定新鲜度荧光标志物，及对应的多元线性回归模型。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、通过线性回归模型确定肉类的新鲜度荧光标志物，明确有效特征，基于荧光高光谱采集肉品高相关性荧光信号，进一步，构建PARAFAC模型，丰富高相关性荧光信号，基于此构建可直接快速无损服务于固体肉样品的新鲜度预测模型，实现肉品新鲜度的高精度判别，且检测过程快速无损、操作简便，适用于多种场合，能够满足现代产业快速检测的需求。
第二、在确定肉类的新鲜度荧光标志物、构建PARAFAC模型的基础上，针对任意一新鲜度荧光标志物明确各新鲜度荧光标志物的荧光信号关于浓度、温度、pH的响应规律，基于此，针对远程不易运输样品，处理为待测液体样品，构建服务于液体样品的新鲜度预测模型，满足测量精度的同时避免运输导致的新鲜度变化。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的其中一种技术方案所述新鲜度差异肉类样品的还原型辅酶Ⅰ、三磷酸腺苷的含量图；
图2为本发明的其中一种技术方案所述新鲜度差异肉类样品的菌落总数的含量图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
不同品种的生鲜肉包括羊肉、猪肉、牛肉等，不同品种生鲜肉的潜在荧光特征标志物至少包括酪氨酸、色氨酸、维生素B2、三磷酸腺苷（ATP）、还原型辅酶Ⅰ（NADH）、卟啉、胶原蛋白7种，其余可以根据文献公开补充；不同品种生鲜肉的新鲜度荧光标志物可能不同，针对不同品种生鲜肉需按照如下各方案分别确定；
<方案1>
生鲜肉新鲜度的荧光高光谱检测方法，包括以下步骤：
步骤一、确定肉类的新鲜度荧光标志物
A1，确定肉类新鲜度的潜在荧光标志物，其中，潜在荧光标志物包括酪氨酸、色氨酸、维生素B2、三磷酸腺苷（ATP）、还原型辅酶Ⅰ（NADH）、卟啉、胶原蛋白，潜在荧光标志物依据文献公开的筛选确认；
A2，制备新鲜度差异肉类样品，具体的：将新鲜的一批生鲜肉样品分割为若干块，均置于预定温度（根据实际情况确定，具体可为0-4℃）下进行贮藏，每块肉分别贮藏不同时间，具体的储藏时间可设定为0、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21天，即对于其中一块肉，在储藏0、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21天的条件下作为样品分别进行相应的测试；
A3，获取新鲜度差异肉类样品的潜在荧光标志物含量，其中，在其中一中具体方案中：
酪氨酸、色氨酸、胶原蛋白含量的测定均利用酸水解+高效液相色谱荧光法测定；
维生素B2含量的测定参考GB 5009.85—2016《食品安全国家标准 食品中维生素B2的测定》中的高效液相色谱法，称取2.0 g肉样测定；
ATP含量的测定利用试剂盒法进行测定；
NADH含量的测定利用吸光度法进行测定；
卟啉含量的测定利用荧光分光光度计测定；
A4，测定新鲜度差异肉类样品中各样品的新鲜度指标数据，其中，新鲜度指标包括菌落总数、挥发性盐基氮，具体的：
菌落总数的测定参照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》中的方法，称取10.0 g肉样进行测定；
挥发性盐基氮的测定参照GB 5009.228-2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》中的自动凯氏定氮法，称取10 g肉样进行测定；
A5、针对任意一新鲜度指标确定重点荧光标志物
A5.1、针对菌落总数的重点荧光标志物
A5.1.1、以潜在荧光标志物含量为自变量、新鲜度指标含量为因变量，建立一元线性回归模型，即针对任一潜在荧光标志物，以新鲜度差异肉类样品中各样品的潜在荧光标志物含量为自变量，菌落总数含量为因变量，建立一元线性回归模型，若潜在荧光特征标志物包括酪氨酸、色氨酸、维生素B2、三磷酸腺苷（ATP）、还原型辅酶Ⅰ（NADH）、卟啉、胶原蛋白7种，则共建立7个一元线性回归模型；
A5.1.2、基于每个一元线性回归模型获得对应潜在荧光标志物与菌落总数的相关系数；
A5.1.3、确定相关系数高于第一阈值（0.8）的一元线性回归模型对应的潜在荧光标志物为重点荧光标志物，其中，重点荧光标志物的个数为n，n≤7；
A5.1.4、基于新鲜度差异肉类样品中各样品的重点荧光标志物含量为自变量、菌落总数含量为因变量，建立菌落总数的多元线性回归模型（n级），YTVC=K1X1+K2X2+……+KnXn-Vn，其中，YTVC为菌落总数，X1、X2、……、Xn为各重点荧光标志物含量；
A5.1.5、明确多元线性回归模型（n级）的相关系数，判断相关系数是否小于第二阈值（0.95）；
若否，重点荧光标志物确定为针对菌落总数的重点荧光标志物；
若是，且n＜7，将剩余潜在荧光标志物分别逐渐增多补充至重点荧光标志物，形成新的重点荧光标志物，建立新的多元线性回归模型，至新的多元线性回归模型的相关系数不小于第二阈值，确定该新的重点荧光标志物为针对菌落总数的重点荧光标志物，即：
ⅰ、将剩余潜在荧光标志物分别单个补充至重点荧光标志物，形成新的重点荧光标志物；
ⅱ、基于各样品的新的重点荧光标志物含量为自变量、菌落总数含量为因变量，建立菌落总数的多元线性回归模型（n+1级），明确多元线性回归模型（n+1级）的相关系数，至其中一n+1级多元线性回归模型的相关系数≥第二阈值（0.95），即每形成一组新的重点荧光标志物，构建对应的多元线性回归模型（n+1级），并判断该多元线性回归模型的相关系数是否满足≥第二阈值（0.95），若是，终止构建新的重点荧光标志物，若否，继续构建新的重点荧光标志物；
ⅲ、若均不满足，且n+i-1＜7，将剩余潜在荧光标志物任意i个分别补充至重点荧光标志物，形成新的重点荧光标志物；
ⅳ、基于各样品的新的重点荧光标志物含量为自变量、菌落总数含量为因变量，建立菌落总数的多元线性回归模型（n+i级），明确该多元线性回归模型的相关系数，至其中一多元线性回归模型的相关系数≥第二阈值（0.95），其中，i=2；
ⅴ、若均不满足，i增加1，重复步骤ⅲ-ⅳ，至n+i-1=7结束，即在n+i-1=7结束之前确定重点荧光标志物；
A5.1.6、确定相关系数≥第二阈值（0.95）的多元线性回归模型对应的重点荧光标志物为针对菌落总数的重点荧光标志物；
A5.2、针对挥发性盐基氮的重点荧光标志物
A5.2.1、以潜在荧光标志物含量为自变量、新鲜度指标含量为因变量，建立一元线性回归模型，即针对任一潜在荧光标志物，以新鲜度差异肉类样品中各样品的潜在荧光标志物含量为自变量，挥发性盐基氮含量为因变量，建立一元线性回归模型，若潜在荧光特征标志物包括酪氨酸、色氨酸、维生素B2、三磷酸腺苷（ATP）、还原型辅酶Ⅰ（NADH）、卟啉、胶原蛋白7种，则共建立7个一元线性回归模型；
A5.2.2、基于每个一元线性回归模型获得对应潜在荧光标志物与挥发性盐基氮的相关系数；
A5.2.3、确定相关系数高于第一阈值（0.8）的一元线性回归模型对应的潜在荧光标志物为重点荧光标志物，其中，重点荧光标志物的个数为w，w≤7；
A5.2.4、基于新鲜度差异肉类样品中各样品的重点荧光标志物含量为自变量、挥发性盐基氮含量为因变量，建立挥发性盐基氮的多元线性回归模型（w级），YTVBN=K1X1+K2X2+……+KwXw-Vw，其中，YTVBN为挥发性盐基氮，X1、X2、……、Xw为各重点荧光标志物含量；
A5.2.5、明确多元线性回归模型（w级）的相关系数，判断相关系数是否小于第二阈值（0.95）；
若否，重点荧光标志物确定为针对挥发性盐基氮的重点荧光标志物；
若是，且w＜7，将剩余潜在荧光标志物分别逐渐增多补充至重点荧光标志物，形成新的重点荧光标志物，建立新的多元线性回归模型，至新的多元线性回归模型的相关系数不小于第二阈值，确定该新的重点荧光标志物为重点荧光标志物，即：
Ⅰ、将剩余潜在荧光标志物分别单个补充至重点荧光标志物，形成新的重点荧光标志物；
Ⅱ、基于各样品的新的重点荧光标志物含量为自变量、挥发性盐基氮含量为因变量，建立挥发性盐基氮的多元线性回归模型（w+1级），明确多元线性回归模型（w+1级）的相关系数，至其中一w+1级多元线性回归模型的相关系数≥第二阈值（0.95），即每形成一组新的重点荧光标志物，构建对应的多元线性回归模型（w+1级），并判断该多元线性回归模型的相关系数是否满足≥第二阈值（0.95），若是，终止构建新的重点荧光标志物，若否，继续构建新的重点荧光标志物；
Ⅲ、若均不满足，且w+i-1＜7，将剩余潜在荧光标志物任意i个分别补充至重点荧光标志物，形成新的重点荧光标志物；
Ⅳ、基于各样品的新的重点荧光标志物含量为自变量、挥发性盐基氮含量为因变量，建立挥发性盐基氮的多元线性回归模型（w+i级），明确该多元线性回归模型的相关系数，至其中一多元线性回归模型的相关系数≥第二阈值（0.95），其中，i=2；
Ⅴ、若均不满足，i增加1，重复步骤Ⅲ-Ⅳ，至w+i-1=7结束，即在w+i-1=7结束之前确定重点荧光标志物；
A5.2.6、确定相关系数≥第二阈值（0.95）的多元线性回归模型对应的重点荧光标志物为针对挥发性盐基氮的重点荧光标志物；
A5.3、肉类针对菌落总数的重点荧光标志物、针对挥发性盐基氮的重点荧光标志物求并确定为新鲜度荧光标志物；
步骤二、基于每个新鲜度指标，构建肉样品的新鲜度预测模型，具体包括：
B1，获得至少120个新鲜度差异肉类样品，作为样品集；
B2、依据新鲜度荧光标志物的激发波长获取样品集中每个样品的荧光高光谱数据；
B3、针对每个样品选定感兴趣区域，测定每个样品感兴趣区域的新鲜度指标数据，其中，样品集中全部样品的菌落总数数据构成菌落总数数据集，样品集中全部样品的挥发性盐基氮数据构成挥发性盐基氮数据集；
提取感兴趣区域的荧光高光谱数据，基于提取的荧光高光谱数据，计算感兴趣区域的平均荧光光谱，其中，感兴趣区域为没有脂肪的圆形或者方形区域；
B4、利用标准正态变换、一阶导数方法对平均荧光光谱进行预处理，得处理后的平均荧光光谱，样品集中全部样品的平均荧光光谱构成平均荧光光谱数据集；
B5、基于平均荧光光谱数据集、菌落总数数据集，利用偏最小二乘回归法构建基于菌落总数的新鲜度预测模型；
基于平均荧光光谱数据集、挥发性盐基氮数据集，利用偏最小二乘回归法构建基于挥发性盐基氮的新鲜度预测模型；
步骤三、利用新鲜度预测模型判定待测肉样品的新鲜度，具体为：
C1、采集待测肉样品的单条扫描线的荧光高光谱图像数据；
基于单条扫描线的荧光高光谱图像数据计算该扫描线的平均荧光光谱，
C2、利用标准正态变换、一阶导数方法对平均荧光光谱进行预处理，得处理后的荧光光谱数据；
C3、基于处理后的荧光光谱数据、菌落总数的新鲜度预测模型预测得出该单条扫描线的菌落总数；
基于处理后的荧光光谱数据、挥发性盐基氮的新鲜度预测模型预测得出该单条扫描线的挥发性盐基氮；
C4、重复步骤C1-C3，直至待测肉样品的每一条扫描线完毕；
C5、将每条扫描线得预测结果进行拼接，并将结果根据检测值大小进行伪彩化，得到待测肉样品的伪彩可视化检测结果；
根据待测肉样品每一条扫描线的菌落总数和挥发性盐基氮预测结果，计算平均结果，结合国家标准/行业标准规定的限值，判定该肉样的新鲜程度；
C6、重复C1-C5，进入下一个待测肉样品检测。
<方案2>
生鲜肉新鲜度的荧光高光谱检测方法，包括以下步骤：
步骤一、确定肉类的新鲜度荧光标志物，同<方案1>；
步骤二、构建PARAFAC模型，具体为：
利用新鲜度荧光标志物的标准品配置多个混合溶液、各新鲜度荧光标志物的单一溶液，其中，多个混合溶液中涵盖的每种新鲜度荧光标志物的浓度取值范围为0.5*C1-2*C2，每种新鲜度荧光标志物的浓度包括在该取值范围内的至少3个，式中，C1为<方案1>中步骤A3（获取新鲜度差异肉类样品的潜在荧光标志物含量）对应获得的新鲜度荧光标志物的最低含量，C2为<方案1>中步骤A3（获取新鲜度差异肉类样品的潜在荧光标志物含量）对应获得的新鲜度荧光标志物的最高含量；
采集各单一溶液、多个混合溶液的荧光光谱，其中，混合溶液的荧光光谱具体为三维荧光发射光谱，激发波长涉及全部新鲜度荧光标志物的激发波长；
以多个混合溶液的荧光光谱、新鲜度荧光标志物的激发波长和发射波长作为输入，每个新鲜度荧光标志物的荧光光谱为输出，构建PARAFAC模型，各新鲜度荧光标志物的单一溶液的荧光光谱为参照，其中，各新鲜度荧光标志物的单一溶液的荧光光谱为参照具体为：输出的每个新鲜度荧光标志物的荧光光谱分别与对应单一溶液的荧光光谱进行对比，谱峰中心位置偏移在2nm以内，且峰相对强度小于5%；
步骤三、基于每个新鲜度指标，构建固体肉样品的新鲜度预测模型，同<方案1>的步骤二，不同的是：
<方案1>步骤B4还包括：基于PARAFAC模型将处理后的平均荧光光谱解析为各新鲜度荧光标志物对应的单一荧光光谱；针对每个样品，将全部单一荧光光谱沿波长方向合并，得到合并荧光光谱，样品集中全部样品的合并荧光光谱构成合并荧光光谱数据集；
<方案1>步骤B5具体为：基于合并荧光光谱数据集、菌落总数数据集，利用偏最小二乘回归法构建基于菌落总数的新鲜度预测模型；
基于合并荧光光谱数据集、挥发性盐基氮数据集，利用偏最小二乘回归法构建基于挥发性盐基氮的新鲜度预测模型；
步骤四、利用新鲜度预测模型判定待测肉样品的新鲜度，同<方案1>的步骤三，不同的是：
<方案1>步骤C2还包括：基于PARAFAC模型将处理后的平均荧光光谱解析为各新鲜度荧光标志物对应的单一荧光光谱；
针对待测肉样品的该单条扫描线，将全部单一荧光光谱沿波长方向合并，得到合并荧光光谱；
<方案1>步骤C3具体为：基于合并荧光光谱数据、菌落总数的新鲜度预测模型预测得出该单条扫描线的菌落总数；
基于合并荧光光谱数据、挥发性盐基氮的新鲜度预测模型预测得出该单条扫描线的挥发性盐基氮。
<方案3>
生鲜肉新鲜度的荧光高光谱检测方法，包括以下步骤：
步骤一、确定肉类的新鲜度荧光标志物，同<方案1>，不同的是：
<方案1>中步骤A5.1.6具体为：确定相关系数≥第二阈值（0.95）的多元线性回归模型为菌落总数的新鲜度指标模型；确定该菌落总数的新鲜度指标模型对应的重点荧光标志物为肉类针对菌落总数的重点荧光标志物；
<方案1>中步骤A5.2.6具体为：确定相关系数≥第二阈值（0.95）的多元线性回归模型为挥发性盐基氮的新鲜度指标模型；确定该挥发性盐基氮的新鲜度指标模型对应的重点荧光标志物为肉类针对挥发性盐基氮的重点荧光标志物；
进行“A5.3、肉类针对菌落总数的重点荧光标志物、针对挥发性盐基氮的重点荧光标志物求并确定为新鲜度荧光标志物”步骤前还包括：
进一步确证重点荧光标志物，包括：
重新制备新鲜度差异肉类样品作为样本，分别基于A3-A4测定样本的各重点荧光标志物含量及菌落总数、挥发性盐基氮的实测值；
将样本的重点荧光标志物含量代入新鲜度指标模型，计算新鲜度指标预测值，即分别代入菌落总数的新鲜度指标模型、挥发性盐基氮的新鲜度指标模型，计算各样本的菌落总数、挥发性盐基氮预测值；
确定新鲜度指标的预测值与实测值的相关系数是否均大于第一阈值，即确认各样本的菌落总数预测值与实测值的相关系数、挥发性盐基氮预测值与实测值的相关系数是否均大于第一阈值；
若是，确认重点荧光标志物为有效荧光特征标志物，新鲜度指标模型为有效模型；
若否，确认重点荧光标志物为无效荧光特征标志物，新鲜度指标模型为无效模型，增加样本量，重新采用A1-A5.2.6的方式确定肉类的重点荧光标志物、新鲜度指标模型；
步骤二、构建PARAFAC模型，同<方案2>；
步骤三、针对任意一新鲜度荧光标志物，明确新鲜度荧光标志物的荧光信号响应规律，包括：
①、明确新鲜度荧光标志物的浓度和荧光强度的关系方程，具体为：
a1、以新鲜度荧光标志物的标准品为原料，配置不同浓度（具体可设置为浓度范围为0.1μg/ml-20μg/ml的至少8个样品）的单一荧光标志物溶液，其中，多个单一荧光标志物溶液的pH值调控为7；
a2、在温度为4℃的条件下，测定多个不同浓度的单一荧光标志物溶液的荧光光谱，获得荧光强度；
a3、基于单一荧光标志物溶液的浓度、荧光强度数据构建浓度、荧光强度关系方程Xc=KcC+Bc，其中，C为荧光标志物溶液的浓度，Xc为荧光标志物溶液的荧光强度，Kc为斜率，Bc为常数；
②、明确新鲜度荧光标志物的荧光强度在不同温度下的变化规律，具体为：
b1、以新鲜度荧光标志物的标准品为原料，配置荧光标志物溶液，溶液的pH值调控为7，在不同温度（具体可为：0℃、4℃、10℃、25℃）条件下测定荧光标志物溶液的荧光光谱，获得荧光强度；
b2、基于不同温度、不同温度下荧光标志物溶液的荧光强度构建温度、荧光强度关系曲线为XT=KTT+BT，其中，XT为温度为T时的荧光强度，T为样品温度，KT为斜率，BT为常数；
b3、以4℃为基准温度，计算荧光强度随温度变化的校正系数ΔX/℃=KT/XT(T=4℃)=KT/X4，即当将温度校正至4℃时，荧光强度随温度变化的校正系数为ΔX/℃=KT/X4；
③、明确各荧光标志物的荧光信号响应规律，还包括明确新鲜度荧光标志物的荧光强度在不同pH下的变化规律，具体为：
c1、以新鲜度荧光标志物的标准品为原料，配置同一浓度、不同pH的荧光标志物溶液，在温度为4℃的条件下，测定荧光标志物溶液的荧光发射光谱，获得荧光强度；
c2、基于不同pH下荧光标志物溶液的荧光强度构建pH、荧光强度关系曲线为XP=KPP+BP，其中，XP为荧光强度，P为样品pH，KP为斜率，BP为常数；
c3、以pH=7为基准pH，计算荧光强度随pH变化的校正系数ΔX/1pH=KP/XP(pH=7)=KP/X7即当将pH校正至7时，荧光强度随pH变化的校正系数为ΔX/1pH=KP/X7；
步骤四、基于每个新鲜度指标，构建固体肉样品的新鲜度预测模型，还包括：
d1、获得至少120个新鲜度差异肉类样品，作为样品集；
针对样品集中的每个样品，获得新鲜度指标数据，包括菌落总数数据、挥发性盐基氮数据；
d2、针对每一新鲜度差异肉类样品，取一定重量的样品，向样品中加入占样品质量3倍量的磷酸盐缓冲液，匀浆后离心，取上清，得待测液体样品；
d3、采集所有待测液体样品的荧光高光谱图像数据，并计算为平均荧光光谱；
d4、基于PARAFAC模型将每个待测液体样品的平均荧光光谱解析为各新鲜度荧光标志物对应的荧光光谱；
d5、基于ΔX/℃、ΔX/1pH将各新鲜度荧光标志物对应的荧光发射光谱校正至基准温度和基准pH条件下，得校正荧光光谱；
d6、基于新鲜度荧光标志物的浓度和荧光强度的关系方程、校正液体光谱，确定待测液体样品中各荧光标志物含量；
d7、基于确定的新鲜度指标模型、待测液体样品中各荧光标志物含量、新鲜度指标数据，计算新鲜度指标模型的相关系数，若相关系数大于0.85，则确定新鲜度指标模型为液体样品的新鲜度预测模型，否则增加样本数后重新采用<方案3>步骤一记载方式确定新鲜度荧光标志物，及对应的新鲜度指标模型；
步骤五：利用新鲜度预测模型判定待测肉样品的新鲜度，具体为：
e1、取一定重量的待测肉样品，向待测肉样品中加入待测肉样品3倍重的磷酸盐缓冲液（pH=6.5），匀浆后离心，取上清，得待测液体样品；
e2、采集待测液体样品的单条扫描线的荧光高光谱数据，并计算为平均荧光光谱；
e3、基于PARAFAC模型将待测液体样品荧光高光谱解析为各新鲜度荧光标志物对应的荧光光谱数据；
根据ΔX/℃、ΔX/1pH将荧光光谱数据校正至基准温度和基准pH条件下的条件下，得校正荧光光谱，进而得校正的荧光强度；
根据确定的各新鲜度荧光标志物的浓度和荧光强度关系方程、校正的荧光强度，确定待测液体样品中各荧光标志物含量；
e4、基于菌落总数的新鲜度预测模型（多元线性回归模型）、各荧光标志物含量预测待测液体样品菌落总数；
基于挥发性盐基氮的新鲜度预测模型（多元线性回归模型）、各荧光标志物含量预测待测液体样品挥发性盐基氮；
e5、基于预测的菌落总数、挥发性盐基氮含量，结合国家标准/行业标准规定的限值，判定待测肉样品的新鲜度。
<实施例1>
一种生鲜肉（羊肉）新鲜度的荧光高光谱检测方法，包括以下步骤：
步骤一、确证羊肉的新鲜度荧光标志物
A1，确定羊肉新鲜度的潜在荧光标志物为酪氨酸、色氨酸、维生素B2、三磷酸腺苷（ATP）、还原型辅酶Ⅰ（NADH）、卟啉、胶原蛋白；
A2，制备新鲜度差异肉类样品，具体的：将新鲜的一批羊肉样品分割为若干块，均置于0℃下进行贮藏，每块肉品分别贮藏0、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21天，得到新鲜度差异肉类样品；
A3，测定新鲜度差异肉类样品中各样品的潜在荧光特征品质标志物含量，测定结果如下表1所示，其中：
酪氨酸、色氨酸、胶原蛋白含量的测定均利用酸水解+高效液相色谱荧光法测定；
维生素B2含量的测定参考GB 5009.85—2016《食品安全国家标准 食品中维生素B2的测定》中的高效液相色谱法，称取2.0 g肉样测定；
ATP含量的测定利用试剂盒法进行测定；
NADH含量的测定利用吸光度法进行测定；
卟啉含量的测定利用荧光分光光度计测定；
表1、新鲜度差异肉类样品的潜在荧光特征品质标志物含量数据
图1为新鲜度差异肉类样品的还原型辅酶Ⅰ（μg/g）、三磷酸腺苷（μmol/g）的含量图，其中，横坐标为贮藏时间，左边纵坐标为还原型辅酶Ⅰ含量，右边纵坐标为三磷酸腺苷含量，图中A、B、C、D、a、b、c表示是否有显著性差异；
A4，测定新鲜度差异肉类样品中各样品的新鲜度指标数据，其中，新鲜度指标包括菌落总数、挥发性盐基氮，测定结果如下表2所示，具体的：
菌落总数的测定参照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》中的方法，称取10.0 g肉样进行测定；
挥发性盐基氮的测定参照GB 5009.228-2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》中的自动凯氏定氮法，称取10 g肉样进行测定；
表2、新鲜度差异肉类样品的菌落总数、挥发性盐基氮含量数据
图2为新鲜度差异肉类样品的菌落总数的含量图，其中，横坐标为贮藏时间，纵坐标为菌落总数，图中a、b、c、d、e、f、g表示是否有显著性差异；
A5、针对任意一新鲜度指标，基于新鲜度差异肉类样品的潜在荧光标志物含量、菌落总数、挥发性盐基氮数据，确定羊肉的新鲜度荧光标志物
A5.1、针对菌落总数的重点荧光标志物
针对任一潜在荧光标志物，以新鲜度差异肉类样品中各样品的潜在荧光标志物含量为自变量，菌落总数含量为因变量，建立一元线性回归模型，共包括关于[（酪氨酸 菌落总数）、（色氨酸 菌落总数）、（维生素B2菌落总数）、（三磷酸腺苷 菌落总数）、（还原型辅酶Ⅰ菌落总数）、（卟啉 菌落总数）、（胶原蛋白 菌落总数）]的7个一元线性回归模型；
基于7个一元线性回归模型获得潜在荧光标志物与菌落总数的相关系数，具体为：
相关系数（酪氨酸 菌落总数）=0.92；相关系数（色氨酸 菌落总数）=0.84；
相关系数（维生素B2 菌落总数）=0.03；相关系数（三磷酸腺苷 菌落总数）=0.76；
相关系数（还原型辅酶Ⅰ 菌落总数）=0.85；相关系数（卟啉 菌落总数）=0.74；
相关系数（胶原蛋白 菌落总数）=0.58；
A5.1.3、取相关系数高于第一阈值（0.8）的潜在荧光标志物酪氨酸、色氨酸、NADH为重点荧光标志物；
A5.1.4、基于新鲜度差异肉类样品中各样品的重点荧光标志物含量、菌落总数含量，建立菌落总数的多元线性回归模型（3级）YTVC=18.6286X1+16.0784X2+0.0005X3-7.9381，其中，YTVC为菌落总数，X1为酪氨酸含量，X2为色氨酸含量，X3为NADH含量；
A5.1.5、明确多元线性回归模型（3级）YTVC的相关系数为0.97，大于第二阈值（0.95），重点荧光标志物酪氨酸、色氨酸、NADH确定为羊肉的重点荧光标志物；
A5.2、确定肉类新鲜度基于挥发性盐基氮的重点荧光标志物；
A5.2.1、新鲜度差异肉类样品中各样品的潜在荧光标志物含量为自变量，挥发性盐基氮含量为因变量，建立一元线性回归模型；
A5.2.2、基于一元线性回归模型获得潜在荧光标志物与挥发性盐基氮的相关系数，具体为：
相关系数（酪氨酸 挥发性盐基氮）=0.91；相关系数（色氨酸 挥发性盐基氮）=0.84；
相关系数（维生素B2 挥发性盐基氮）=0.07；相关系数（ATP 挥发性盐基氮）=0.73；
相关系数（NADH 挥发性盐基氮）=0.80；相关系数（卟啉 挥发性盐基氮）=0.75；
相关系数（胶原蛋白 挥发性盐基氮）=0.62；
A5.2.3、取相关系数高于第一阈值（0.8）的潜在荧光标志物酪氨酸、色氨酸、VB2、卟啉为重点荧光标志物；
A5.2.4、基于新鲜度差异肉类样品中各样品的重点荧光标志物含量、挥发性盐基氮含量，建立挥发性盐基氮的多元线性回归模型（4级）YTVBN，YTVBN=40.2622X1+45.4198X2-18.3108X3+11.1598X4-17.5337，其中，YTVBN为挥发性盐基氮含量，X1为酪氨酸含量，X2为色氨酸含量，X3为VB2含量，X4为卟啉；
A5.2.5、明确多元线性回归模型（4级）的相关系数为0.97，判断相关系数大于第二阈值（0.95），重点荧光标志物酪氨酸、色氨酸、VB2、卟啉确定为羊肉的重点荧光标志物；
A5.3，进一步确证新鲜度荧光标志物、新鲜度指标模型，包括：
重新制备新鲜度差异肉类样品作为样本，分别基于A3-A4，测定样本的肉类的各新鲜度荧光标志物含量及菌落总数、挥发性盐基氮的实测值；
将样本的关于肉类的新鲜度荧光标志物含量代入确定的多元线性回归模型YTVC、YTVBN，以分别计算获得各样本的菌落总数、挥发性盐基氮预测值；
确定菌落总数的预测值与实测值的相关系数为0.92、挥发性盐基氮的预测值与实测值的相关系数为0.92，均大于第一阈值（0.8）；
确认步骤A5.1、A5.2确定的羊肉的新鲜度荧光标志物为有效荧光标志物，新鲜度指标模型YTVC、YTVBN为有效模型；
A5.4、将A5.1、A5.2确定并经A5.3确证的酪氨酸、色氨酸、NADH，酪氨酸、色氨酸、VB2、卟啉求并后确定为肉类的新鲜度荧光标志物，具体包括酪氨酸、色氨酸、VB2、NADH、卟啉5种物质；
确证多元线性回归模型（3级）YTVC为菌落总数的新鲜度指标模型；
确证多元线性回归模型（4级）YTVBN为挥发性盐基氮的新鲜度指标模型；
步骤二、针对任意一新鲜度荧光标志物，明确新鲜度荧光标志物的荧光信号响应规律，包括：
①、明确各新鲜度荧光标志物的浓度和荧光强度的关系方程，具体为：
a1、以新鲜度荧光标志物的标准品为原料，配置不同浓度（具体的可为：0.1μg/ml、0.5μg/ml、2.5μg/ml、4.5μg/ml、6.5μg/ml、8.5μg/ml、10.5μg/ml、15μg/ml、20μg/ml）的单一荧光标志物溶液，其中，多个单一荧光标志物溶液的pH值调控为7；
a2、在温度为4℃的条件下，测定多个不同浓度的单一荧光标志物溶液的荧光光谱，获得荧光强度；
a3、基于单一荧光标志物溶液的浓度、荧光强度数据构建浓度、荧光强度关系方程Xc=KcC+Bc，其中，C为荧光标志物溶液的浓度，Xc为单一荧光标志物溶液的荧光强度，Kc为斜率，Bc为常数；
具体的：色氨酸的浓度、荧光强度关系方程为：Xc=712.21C+230.18；
酪氨酸的浓度、荧光强度关系方程为：Xc=635.1C+18.37；
NADH的浓度、荧光强度关系方程为：Xc=61.353C+8.70；
VB2的浓度、荧光强度关系方程为：Xc=198.21C+23.45；
卟啉的浓度、荧光强度关系方程为：Xc=218.56C+16.59；
②、明确新鲜度荧光标志物的荧光强度在不同温度下的变化规律，具体为：
b1、以新鲜度荧光标志物的标准品为原料，配置荧光标志物溶液，溶液的pH值调控为7，在不同温度（具体可为：0℃、4℃、10℃、25℃）条件下测定荧光标志物溶液的荧光光谱，获得荧光强度；
b2、基于不同温度、不同温度下荧光标志物溶液的荧光强度构建温度、荧光强度关系曲线为XT=KTT+BT，其中，XT为温度为T时的荧光强度，T为样品温度，KT为斜率，BT为常数；
b3、以4℃为基准温度，计算荧光强度随温度变化的校正系数ΔX/℃=KT/XT(T=4℃)=KT/X4，即当将温度校正至4℃时，荧光强度随温度变化的校正系数为ΔX/℃=KT/X4；
具体的：不同物质的pH值校正系数不同，以pH=7为基准pH，以4℃为基准温度，色氨酸为例，计算荧光强度随温度变化的校正系数ΔX/℃=KT/XT(T=4℃)=-0.0381/12=-0.0032，即当将温度校正至4℃时，荧光强度随温度变化的校正系数为ΔX/℃=-0.0032=-0.32%，校正时，若测试温度为T，测试荧光强度为X，校正时应该用荧光强度X*(1+(-0.0032)*(T-4))，得到基准温度下的荧光强度，即色氨酸的荧光强度随温度的升高而降低，温度每升高1，色氨酸荧光强度降低幅度为0.32%；
酪氨酸的荧光强度随温度变化的校正系数为：-0.26%/℃；
NADH的荧光强度随温度变化的校正系数为：-1.43%/℃；
VB2的荧光强度随温度变化的校正系数为：-0.68%/℃；
卟啉的荧光强度随温度变化的校正系数为：-2.16%/℃；
③、明确各荧光标志物的荧光信号响应规律，还包括明确新鲜度荧光标志物的荧光强度在不同pH下的变化规律，具体为：
c1、以新鲜度荧光标志物的标准品为原料，配置同一浓度、不同pH（pH具体可为：5.2、5.8、6.4）的荧光标志物溶液，在温度为4℃的条件下，测定荧光标志物溶液的荧光发射光谱，获得荧光强度；
c2、基于不同pH下荧光标志物溶液的荧光强度构建pH、荧光强度关系曲线为XP=KPP+BP，其中，XP为荧光强度，P为样品pH，KP为斜率，BP为常数；
c3、以pH=7为基准pH，计算荧光强度随pH变化的校正系数ΔX/1pH=KP/XP(pH=7)=KP/X7即当将pH校正至7时，荧光强度随pH变化的校正系数为ΔX/1pH=KP/X7；
不同物质的pH值校正系数不同，以pH=7为基准pH，以4℃为基准温度，色氨酸为例，XP=-1.25P+20.083，其中，XP为pH为P时的荧光强度，P为样品pH；
荧光强度随pH变化的校正系数ΔX/1pH=KP/XP(pH=7)=KP/X7，即当将pH校正至7时，荧光强度随pH变化的校正系数为ΔX/1pH=KP/X7=-0.1042=-10.42%，校正时，若测试pH为P，测试荧光强度为X，校正时应该用荧光强度X*(1-0.1042)（P-7），得到基准pH下的荧光强度，即色氨酸的荧光强度随pH降低而升高，pH每降低1，色氨酸的荧光强度升高幅度为10.42%；
酪氨酸的校正系数为-15.28%/1pH；
NADH的校正系数为0；
VB2的校正系数为6.34%/1pH；
卟啉的校正系数为2.58%/1pH；
步骤三，构建PARAFAC模型，具体为：
d1、利用新鲜度荧光标志物的标准品配置多个混合溶液、各新鲜度荧光标志物的单一溶液，其中，多个混合溶液中涵盖的每种新鲜度荧光标志物的浓度取值范围为0.5*C1-2*C2，每种新鲜度荧光标志物的浓度包括在该取值范围内的至少3个，式中，C1为<方案1>中步骤A3（获取新鲜度差异肉类样品的潜在荧光标志物含量）对应获得的新鲜度荧光标志物的最低含量，C2为<方案1>中步骤A3（获取新鲜度差异肉类样品的潜在荧光标志物含量）对应获得的新鲜度荧光标志物的最高含量；
d2、采集各单一溶液、多个混合溶液的荧光光谱，其中，混合溶液的荧光光谱具体为三维荧光发射光谱，激发波长涉及全部新鲜度荧光标志物的激发波长，具体的：
色氨酸的激发波长为285 nm；酪氨酸的激发波长为280 nm；
NADH的激发波长为340 nm；VB2的激发波长为440 nm；
卟啉的激发波长为403 nm；
d3、以多个混合溶液的荧光光谱、新鲜度荧光标志物的激发波长和发射波长作为输入，每个新鲜度荧光标志物的荧光光谱为输出，构建PARAFAC模型，各新鲜度荧光标志物的单一溶液的荧光光谱为参照，其中，各新鲜度荧光标志物的单一溶液的荧光光谱为参照具体为：输出的每个新鲜度荧光标志物的荧光光谱分别与对应单一溶液的荧光光谱进行对比，谱峰中心位置偏移在2nm以内，且峰相对强度小于5%；
步骤四、构建羊肉新鲜度预测模型
①、针对整块待测肉样品
B1，获得至少120个新鲜度差异肉类样品，作为样品集；
B2、依据新鲜度荧光标志物的激发波长获取样品集中每个样品的荧光高光谱数据；
B3、针对每个样品选定感兴趣区域，测定每个样品感兴趣区域的新鲜度指标数据，其中，样品集中全部样品的菌落总数数据构成菌落总数数据集，样品集中全部样品的挥发性盐基氮数据构成挥发性盐基氮数据集；
提取感兴趣区域的荧光高光谱数据，基于提取的荧光高光谱数据，计算感兴趣区域的平均荧光光谱，其中，感兴趣区域为没有脂肪的圆形或者方形区域；
B4、利用标准正态变换、一阶导数方法对平均荧光光谱进行预处理，得处理后的平均荧光光谱，样品集中全部样品的平均荧光光谱构成平均荧光光谱数据集；
基于PARAFAC模型将处理后的平均荧光光谱解析为各新鲜度荧光标志物对应的单一荧光光谱；针对每个样品，将全部单一荧光光谱沿波长方向合并，得到合并荧光光谱，样品集中全部样品的合并荧光光谱构成合并荧光光谱数据集；
B5、基于合并荧光光谱数据集、菌落总数数据集，利用偏最小二乘回归法构建基于菌落总数的新鲜度预测模型；
基于合并荧光光谱数据集、挥发性盐基氮数据集，利用偏最小二乘回归法构建基于挥发性盐基氮的新鲜度预测模型；
②、针对待测肉样品被处理为待测液体的情况，包括以下步骤：
C1、获得至少120个新鲜度差异肉类样品，作为样品集；
C2、针对样品集中的每个样品，获得新鲜度指标数据，包括菌落总数数据、挥发性盐基氮数据；
C3、针对每一新鲜度差异肉类样品，取一定重量的样品，向样品中加入占样品质量3倍量的磷酸盐缓冲液，匀浆后离心，取上清，得待测液体样品；
C4、采集所有待测液体样品的荧光高光谱图像数据，并计算为平均荧光光谱；
C5、基于PARAFAC模型将每个待测液体样品的平均荧光光谱解析为各新鲜度荧光标志物对应的荧光光谱；
C6、基于ΔX/℃、ΔX/1pH将各新鲜度荧光标志物对应的荧光发射光谱校正至基准温度和基准pH条件下，得校正荧光光谱；
C7、基于新鲜度荧光标志物的浓度和荧光强度的关系方程、校正液体光谱，确定待测液体样品中各新鲜度荧光标志物含量；
C8、基于新鲜度指标模型YTVC、待测液体样品中各新鲜度荧光标志物含量、步骤C2测得的菌落总数，计算新鲜度指标模型YTVC的相关系数为0.88，大于0.85，确定新鲜度指标模型YTVC为菌落总数的新鲜度预测模型YTVC=18.6286X1+16.0784X2+0.0005X3-7.9381，其中，YTVC为菌落总数，X1为酪氨酸含量，X2为色氨酸含量，X3为NADH含量；
基于新鲜度指标模型YTVBN、待测液体样品中各新鲜度荧光标志物含量、步骤C2测得的挥发性盐基氮，计算新鲜度指标模型YTVBN的相关系数为0.90，相关系数大于0.85，则新鲜度指标模型YTVBN为挥发性盐基氮的新鲜度预测模型YTVBN=40.2622X1+45.4198X2-18.3108X3+11.1598X4-17.5337，其中，YTVBN为挥发性盐基氮含量，X1为酪氨酸含量，X2为色氨酸含量，X3为VB2含量，X4为卟啉；
步骤五、预测
①、针对整块待测肉样品
D1、采集待测肉样品的单条扫描线的荧光高光谱图像数据；
基于单条扫描线的荧光高光谱图像数据计算该扫描线的平均荧光光谱，
D2、利用标准正态变换、一阶导数方法对平均荧光光谱进行预处理，得处理后的荧光光谱数据；
基于PARAFAC模型将处理后的平均荧光光谱解析为各新鲜度荧光标志物对应的单一荧光光谱；
针对待测肉样品的该单条扫描线，将全部单一荧光光谱沿波长方向合并，得到合并荧光光谱；
D3、基于合并荧光光谱数据、菌落总数的新鲜度预测模型预测得出该单条扫描线的菌落总数；
基于合并荧光光谱数据、挥发性盐基氮的新鲜度预测模型预测得出该单条扫描线的挥发性盐基氮；
D4、重复步骤D1-D3，直至待测肉样品的每一条扫描线完毕；
D5、将每条扫描线得预测结果进行拼接，并将结果根据检测值大小进行伪彩化，得到待测肉样品的伪彩可视化检测结果；
根据待测肉样品每一条扫描线的菌落总数和挥发性盐基氮预测结果，计算平均结果，结合国家标准/行业标准规定的限值，判定该肉样的新鲜程度；
D6、重复D1-D5，进入下一个待测肉样品检测；
采用如上方法依次对10个待测肉样品，菌落总数检测结果如下表3所示：
表3 待测肉样品的菌落总数检测结果
挥发性盐基氮检测结果如下表4所示：
表4 待测肉样品的挥发性盐基氮检测结果
②、针对待测肉样品被处理为待测液体的情况
E1、取一定重量的待测肉样品，向待测肉样品中加入待测肉样品3倍重的磷酸盐缓冲液（pH=6.5），匀浆后离心，取上清，得待测液体样品；
E2、采集待测液体样品的单条扫描线的荧光高光谱数据，并计算为平均荧光光谱；
E3、基于PARAFAC模型将待测液体样品荧光高光谱解析为各新鲜度荧光标志物对应的荧光光谱数据；
根据ΔX/℃、ΔX/1pH将荧光光谱数据校正至基准温度和基准pH条件下的条件下，得校正荧光光谱，进而得校正的荧光强度；
根据确定的各新鲜度荧光标志物的浓度和荧光强度关系方程、校正的荧光强度，确定待测液体样品中各荧光标志物含量；
E4、基于菌落总数的新鲜度预测模型（多元线性回归模型）、各荧光标志物含量预测待测液体样品菌落总数；
基于挥发性盐基氮的新鲜度预测模型（多元线性回归模型）、各荧光标志物含量预测待测液体样品挥发性盐基氮；
E5、基于预测的菌落总数、挥发性盐基氮含量，结合国家标准/行业标准规定的限值，判定待测肉样品的新鲜度。
Claims (4)
1.生鲜肉新鲜度的荧光高光谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、获取新鲜度差异肉类样品的潜在荧光标志物含量和新鲜度指标数据；
S2、基于每个新鲜度指标、潜在荧光标志物含量利用线性回归方法确定重点荧光标志物，全部新鲜度指标对应的重点荧光标志物求并确定为新鲜度荧光标志物；
S3、基于每个新鲜度指标，构建肉样品的新鲜度预测模型，具体包括：
S3.1、获取新鲜度差异肉类样品感兴趣区域的新鲜度指标数据；
S3.2、依据新鲜度荧光标志物的激发波长获取新鲜度差异肉类样品感兴趣区域的荧光高光谱数据，并计算为平均荧光光谱；
S3.3、基于平均荧光光谱、新鲜度指标数据，利用偏最小二乘回归法构建新鲜度预测模型；
S4、利用新鲜度预测模型判定待测肉样品的新鲜度；
步骤S2中确定重点荧光标志物具体为：
以潜在荧光标志物含量为自变量、新鲜度指标含量为因变量，建立一元线性回归模型，确定相关系数高于第一阈值的一元线性回归模型对应的潜在荧光标志物为重点荧光标志物；
以重点荧光标志物含量为自变量、新鲜度指标含量为因变量，建立多元线性回归模型，判断多元线性回归模型的相关系数是否小于第二阈值；
若否，重点荧光标志物确定为肉类的重点荧光标志物；
若是，将剩余潜在荧光标志物分别逐渐增多补充至重点荧光标志物，形成新的重点荧光标志物，建立新的多元线性回归模型，至新的多元线性回归模型的相关系数不小于第二阈值，确定该新的重点荧光标志物为重点荧光标志物；
至新的多元线性回归模型的相关系数不小于第二阈值，确定多元线性回归模型为新鲜度指标模型；
步骤S2中确定重点荧光标志物还包括进一步确证重点荧光标志物，包括：
重新制备新鲜度差异肉类样品作为样本，分别测定样本的各重点荧光标志物含量及菌落总数、挥发性盐基氮的实测值；
将样本的重点荧光标志物含量代入新鲜度指标模型，计算新鲜度指标预测值；
确定新鲜度指标的预测值与实测值的相关系数是否均大于第一阈值；
若是，确认重点荧光标志物为有效荧光特征标志物，新鲜度指标模型为有效模型；
若否，确认重点荧光标志物为无效荧光特征标志物，新鲜度指标模型为无效模型；
构建新鲜度预测模型前还包括构建PARAFAC模型，具体为：
利用新鲜度荧光标志物的标准品配置多个混合溶液、各新鲜度荧光标志物的单一溶液，采集各单一溶液、多个混合溶液的荧光光谱；
以多个混合溶液的荧光光谱、新鲜度荧光标志物的激发波长和发射波长作为输入，每个新鲜度荧光标志物的荧光光谱为输出，各新鲜度荧光标志物的单一溶液的荧光光谱为参照，构建PARAFAC模型；
步骤S3.1还包括：基于PARAFAC模型将平均荧光光谱解析为各新鲜度荧光标志物对应的单一荧光光谱；针对每个样品，将全部单一荧光光谱沿波长方向合并，得到合并荧光光谱；
S3.3为基于合并荧光光谱、新鲜度指标数据，利用偏最小二乘回归法构建新鲜度预测模型；
针对任意一新鲜度荧光标志物还包括明确各新鲜度荧光标志物的荧光信号响应规律，包括：
明确新鲜度荧光标志物的浓度和荧光强度的关系方程，具体为：
a1、以新鲜度荧光标志物的标准品为原料，配置不同浓度的单一荧光标志物溶液；
a2、测定多个不同浓度的单一荧光标志物溶液的荧光光谱，获得荧光强度；
a3、基于单一荧光标志物溶液的浓度、荧光强度数据构建浓度、荧光强度关系方程Xc=KcC+Bc，其中，C为荧光标志物溶液的浓度，Xc为荧光标志物溶液的荧光强度，Kc为斜率，Bc为常数；
明确新鲜度荧光标志物的荧光强度在不同温度下的变化规律，具体为：
b1、以新鲜度荧光标志物的标准品为原料，配置荧光标志物溶液，在不同温度条件下测定荧光标志物溶液的荧光光谱，获得荧光强度；
b2、基于不同温度、不同温度下荧光标志物溶液的荧光强度构建温度、荧光强度关系曲线为XT=KTT+BT，其中，XT为温度为T时的荧光强度，T为样品温度，KT为斜率，BT为常数；
b3、以4℃为基准温度，计算荧光强度随温度变化的校正系数ΔX/℃=KT/X4；
明确各荧光标志物的荧光信号响应规律，还包括明确新鲜度荧光标志物的荧光强度在不同pH下的变化规律，具体为：
c1、以新鲜度荧光标志物的标准品为原料，配置同一浓度、不同pH的荧光标志物溶液，测定荧光标志物溶液的荧光发射光谱，获得荧光强度；
c2、基于不同pH下荧光标志物溶液的荧光强度构建pH、荧光强度关系曲线为XP=KPP+BP，其中，XP为荧光强度，P为样品pH，KP为斜率，BP为常数；
c3、以pH=7为基准pH，计算荧光强度随pH变化的校正系数ΔX/1pH=KP/X7；
步骤S3基于每个新鲜度指标，构建肉样品的新鲜度预测模型，还包括：
d1、获得新鲜度差异肉类样品的新鲜度指标数据；
d2、针对每一新鲜度差异肉类样品，取一定重量的样品，向样品中加入占样品质量3倍量的磷酸盐缓冲液，匀浆后离心，取上清，得待测液体样品；
d3、采集所有待测液体样品的荧光高光谱图像数据，并计算为平均荧光光谱；
d4、基于PARAFAC模型将每个待测液体样品的平均荧光光谱解析为各新鲜度荧光标志物对应的荧光光谱；
d5、基于ΔX/℃、ΔX/1pH将各荧光标志物对应的荧光发射光谱校正至基准温度和基准pH条件下，得校正荧光光谱；
d6、基于新鲜度荧光标志物的浓度和荧光强度的关系方程、校正液体光谱，确定待测液体样品中各荧光标志物含量；
d7、基于确定的新鲜度指标模型、待测液体样品中各荧光标志物含量、新鲜度指标数据，计算新鲜度指标模型的相关系数，若相关系数大于0.85，则确定新鲜度指标模型为液体样品的新鲜度预测模型，否则增加样本数后重新采用S2记载方式确定新鲜度荧光标志物，及对应的多元线性回归模型。
2.如权利要求1所述的生鲜肉新鲜度的荧光高光谱检测方法，其特征在于，潜在荧光标志物包括酪氨酸、色氨酸、维生素B2、三磷酸腺苷、还原型辅酶Ⅰ、卟啉、胶原蛋白。
3.如权利要求1所述的生鲜肉新鲜度的荧光高光谱检测方法，其特征在于，新鲜度指标包括菌落总数、挥发性盐基氮。
4.如权利要求1所述的生鲜肉新鲜度的荧光高光谱检测方法，其特征在于，各新鲜度荧光标志物的单一溶液的荧光光谱为参照具体为：
输出的每个新鲜度荧光标志物的荧光光谱分别与对应单一溶液的荧光光谱进行对比，谱峰中心位置偏移在2nm以内，且峰相对强度小于5%。
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