CN115869326A - 毛蕊花糖苷在制备抑制新型冠状病毒药物中的应用及筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,具体涉及毛蕊花糖苷在制备抑制新型冠状病毒药物中的应用及筛选方法。本发明通过研究发现,毛蕊花糖苷对SARS‑CoV‑2主蛋白酶具有显著的抑制作用,并首次发现毛蕊花糖苷对Omicron BA.1和BA.2病毒株具有显著的抑制作用,故可将其用于抑制新型冠状病毒的药物和抗奥密克戎病毒的药物。本发明还提供了新型冠状病毒主蛋白酶抑制剂的筛选方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及毛蕊花糖苷在制备抑制新型冠状病毒药物中的应用。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)属于β属冠状病毒,单股正链RNA,基因组包含约30000个核苷酸,编码29个开放阅读框(Open Reading Frame,ORFs),编码16种非结构蛋白(Nsps)以及4种结构蛋白,具有较高的传染性。新冠病毒变异毒株奥密克戎(Omicron)在支气管中的感染和繁殖速度远远高于新冠原始毒株,具有更强的传染性。目前已公开的针对新冠病毒的药物大多是处于对虚拟靶点进行虚拟筛选的阶段,然而经过以新冠病毒对这些药物验证后却发现,一部分药物在现有文献报道所公开的靶点并非是其真正能够发挥作用的靶点,导致其在应用于真正的新冠病毒时,并不能真正发挥抑制复制或杀灭作用。而能够对新冠病毒发挥抑制复制或杀灭作用的药物,由于变异毒株可能不具有该药物的作用靶点,导致这些药物对于新冠病毒的变异毒株不一定起效。而这也是抗病毒类药物需要随病毒变异而失效的原因之一。因此,需要通过更有效的方法筛选对新冠病毒及其变异毒株有作用的药物。
发明内容
针对以上问题,本发明提供毛蕊花糖苷在制备抑制新型冠状病毒药物中的应用。经试验研究发现,毛蕊花糖苷对SARS-CoV-2Mpro(SARS-CoV-2主蛋白酶)具有显著的抑制作用,并对Omicron BA.1和BA.2病毒株具有显著的抑制作用,可用于抑制新型冠状病毒的药物和抗奥密克戎病毒的药物。
为达到上述发明目的,本发明实施例采用了如下技术方案:
第一方面,本发明实施例提供了毛蕊花糖苷在制备抑制新型冠状病毒的药物中的应用。
毛蕊花糖苷的结构式如式I所示:
本发明通过以SARS-CoV-2Mpro为靶标蛋白,以SARS-CoV-2Mpro的His41和Cys145为对接活性口袋,建立体外酶活筛选体系,研究发现毛蕊花糖苷与SARS-CoV-2Mpro活性口袋结合;分子对接表明毛蕊花糖苷通过氢键等相互作用,结合在SARS-CoV-2Mpro催化活性区域,与原配体的结合能力相当,且与已报道的重要氨基酸残基Phe140、Cys145形成氢键相互作用。分子互作研究结果表明,毛蕊花糖苷对SARS-CoV-2Mpro活性具有显著的抑制作用。
此外,体外病毒抑制活性研究表明,毛蕊花糖苷对奥密克戎(Omicron)BA.1和BA.2病毒株具有一定的抑制效果,而目前尚未发现毛蕊花糖苷应用于奥密克戎病毒株的相关报道。
结合第一方面,所述抑制新型冠状病毒的药物为SARS-CoV-2Mpro非共价抑制剂。
第二方面,本发明实施例提供了毛蕊花糖苷在制备体外抑制新型冠状病毒产品中的应用。
结合第二方面,在所述产品中,毛蕊花糖苷的浓度为0.039μM~160μM。经试验验证,毛蕊花糖苷在0.039μM~160μM浓度范围内对SARS-Cov-2 Mpro具有显著的抑制作用。
第三方面,本发明实施例提供了毛蕊花糖苷在制备抗奥密克戎病毒的药物中的应用。
本发明通过体外药效学研究发现,毛蕊花糖苷对Omicron BA.1的EC50为41.29μM,对Omicron BA.2的EC50为70.37μM,可作为抗奥密克戎病毒的潜在药物。
结合第三方面,所述奥密克戎病毒的毒株包括BA.1和BA.2病毒株中的至少一种。
第四方面,本发明实施例还提供了新型冠状病毒主蛋白酶抑制剂的筛选方法,包括以下步骤:
步骤A、将SARS-CoV-2Mpro重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中,筛选阳性克隆;将所述阳性克隆扩增培养后收集菌液,破菌,收集上清液;
步骤B、将所述上清液去除蛋白后用人类鼻病毒3C蛋白酶酶切,收集蛋白并浓缩,获得SARS-CoV-2Mpro;
步骤C、将所述SARS-CoV-2Mpro和待筛选的化合物加入同一缓冲液中,加入荧光标记底物后检测所述缓冲液的荧光强度,根据荧光强度的变化筛选新型冠状病毒主蛋白酶抑制剂。
结合第四方面,所述筛选方法还包括虚拟筛选验证:包括以SARS-CoV-2Mpro为靶标蛋白,以SARS-CoV-2Mpro的His41和Cys145为对接活性口袋,虚拟验证步骤C筛选所得化合物与SARS-CoV-2Mpro活性口袋的结合情况。
优选地,所述虚拟筛选验证还包括验证步骤C筛选所得化合物与所述SARS-CoV-2Mpro的配合物稳定性。
优选地,所述虚拟筛选验证还包括验证步骤C筛选所得化合物与所述SARS-CoV-2Mpro的氢键数量。
本发明的有益效果是:发明人通过体外酶抑制活性筛选和虚拟筛选验证,首次发现了毛蕊花糖苷在0.039μM~160μM的浓度范围内对SARS-CoV-2Mpro具有显著的抑制作用。并且本发明通过病毒抑制研究首次发现,毛蕊花糖苷对Omicron BA.1和BA.2病毒株具有显著的抑制作用。
附图说明
图1为本发明实施例1中毛蕊花糖苷的IC50曲线;
图2为本发明实施例1中毛蕊花糖苷与SARS-CoV-2Mpro的分子对接;
图3为本发明实施例1中毛蕊花糖苷对SARS-CoV-2Mpro的分子动力学研究;
图4为本发明实施例1中基于等离子表面共振与等温滴定量热法评价毛蕊花糖苷对SARS-CoV-2Mpro的分子间相互作用;
图5为本发明实施例1中毛蕊花糖苷-SARS-CoV-2Mpro在298K下的量热滴定曲线;
图6为本发明实施例1中毛蕊花糖苷的1H NMR谱图;
图7为本发明实施例1中SARS-CoV-2Mpro的1H NMR谱图;
图8为本发明实施例1中毛蕊花糖苷与SARS-CoV-2Mpro结合的1H NMR谱图;
图9为本发明实施例1中毛蕊花糖苷和SARS-CoV-2Mpro的STD-NMR谱图;
图10为本发明实施例1中毛蕊花糖苷和SARS-CoV-2Mpro的WaterLOGSY-NMR谱图;
图11为本发明实施例2中毛蕊花糖苷对病毒的抑制作用研究。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明,并不用于限定本发明。
新型冠状病毒具有较高的传染性,其变异毒株奥密克戎在支气管中的感染和繁殖速度更高,传染性更强。目前已公开的针对新冠病毒的药物大多是基于对虚拟靶点进行虚拟筛选而得到,然而一部分药物在应用于真正的新冠病毒时并不能发挥抑制复制或杀灭作用,对于新冠病毒的变异毒株不一定起效。
针对该问题,发明人在生物安全防护三级实验室(P3实验室)以新冠病毒及其变异毒株进行了药物筛选和体外药效学验证。
中药在治疗新型病毒感染方面发挥了良好的治疗效果,但其发挥作用的活性成分及作用机制仍不明确。冠状病毒主蛋白酶(Mpro)是一种蛋白水解酶,可以水解加工复制酶前体多聚蛋白,并释放病毒RNA复制所需的聚合酶与解螺旋酶,参与病毒复制过程的关键步骤。发明人基于对Mpro结构的解析,将SARS-CoV-2Mpro重组质粒转化至大肠杆菌纯化获得SARS-CoV-2Mpro,采用体外酶活筛选方法,从数十种常用清热解毒类中草药中所含的数百种中药小分子进行酶抑制活性筛选,发现毛蕊花糖苷对SARS-CoV-2Mpro具有抑制作用。本发明通过建立分子对接模型,验证了毛蕊花糖苷对SARS-CoV-2Mpro的抑制作用,并验证了毛蕊花糖苷对SARS-CoV-2Mpro的结合能力与结合方式。
并且,发明人通过采用奥密克戎(Omicron)BA.1和BA.2病毒株侵染非洲绿猴肾细胞Vero E6(ATCC,CRL-1586),首次发现毛蕊花糖苷对奥密克戎毒株具有抑制作用,并根据细胞病变效应计算获得了毛蕊花糖苷的半数效应浓度(half-maximal effectiveconcentration,EC50)。
基于研究结果,本发明实施例提供了毛蕊花糖苷在制备抑制新型冠状病毒的药物、抗奥密克戎的药物中的应用。
该应用为对抗新型冠状病毒及其变异毒株奥密克戎提供新的选择。在临床应用中,可结合具体需求单独使用毛蕊花糖苷,或结合其作用靶点及作用机制来进行联合用药。
此外,本发明实施例还提供了新型冠状病毒主蛋白酶抑制剂的筛选方法,包括以下步骤:
步骤A、将SARS-CoV-2Mpro重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中,筛选阳性克隆;将所述阳性克隆扩增培养后收集菌液,破菌,收集上清液;
步骤B、将所述上清液去除蛋白后用人类鼻病毒3C蛋白酶酶切,收集蛋白并浓缩,获得SARS-CoV-2Mpro;
步骤C、将所述SARS-CoV-2Mpro和待筛选的化合物加入同一缓冲液中孵育一定时间,加入荧光标记底物后检测所述缓冲液的荧光强度,根据荧光强度的变化筛选新型冠状病毒主蛋白酶抑制剂。
以下通过具体实施例对本发明的方案进行说明。
以下实施例中所用到的中药小分子标准品均购自于上海源叶生物科技有限公司,HPLC纯度均大于98%。SARS-CoV-2Mpro重组质粒由上海科技大学免疫化学研究所饶子和院士课题组提供。
实施例1
本实施例以筛选、发现毛蕊花糖苷的过程来具体说明本发明提供的新型冠状病毒主蛋白酶抑制剂的筛选方法。该筛选方法中的实验结果同时证明了毛蕊花糖苷在抑制新型冠状病毒中的作用。
1、SARS-CoV-2Mpro的表达、纯化
将SARS-CoV-2Mpro重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中,并用LB平板(含100mg/L氨苄青霉素)筛选阳性克隆;SARS-CoV-2Mpro重组质粒的核苷酸序列(如SEQID NO.1所示)如下所示:
SGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDVVYCPRHVICTSEDMLNPNYEDLLIRKSNHNFLVQAGNVQLRVIGHSMQNCVLKLKVDTANPKTPKYKFVRIQPGQTFSVLACYNGSPSGVYQCAMRPNFTIKGSFLNGSCGSVGFNIDYDCVSFCYMHHMELPTGVHAGTDLEGNFYGPFVDRQTAQAAGTDTTITVNVLAWLYAAVINGDRWFLNRFTTTLNDFNLVAMKYNYEPLTQDHVDILGPLSAQTGIAVLDMCASLKELLQNGMNGRTILGSALLEDEFTPFDVVRQCSGVTFQ
从LB平板上挑取阳性克隆(在含有氨苄青霉素的LB平板上生长出来的单克隆),培养过夜,然后转入1L的LB培养基(含100mg/L氨苄青霉素),当OD600达到0.6–0.8时,加入1mM左右的IPTG,在16℃培养16小时左右;
4000rpm离心15-20min收集菌液,然后高压均质机破菌,菌液13000rpm离心40min后收集上清液;
上清液加入Tris-HCl预平衡的镍亲和层析柱中,用Tris-HCl(含20mM咪唑)淋洗5-10个柱体积去除杂蛋白,然后再用300mM咪唑洗脱,最后加入人类鼻病毒3C蛋白酶,在4℃酶切12-20小时,之后收集蛋白,并浓缩,得到SARS-CoV-2Mpro。
2、SARS-CoV-2Mpro抑制剂的筛选
SARS-CoV-2Mpro活性测定采用荧光底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2(纯度≥98%),该底物N端连接有MCA荧光基团(吸收波长320nm,发射波长405nm)。
(1)单点抑制率筛选:
对数十种常用清热解毒类中草药中所含的数百种中药小分子进行SARS-CoV-2Mpro的体外抑制活性考察。在含有SARS-CoV-2Mpro的不同缓冲溶液(50mM Tris-HCl(pH 7.3),1mMEDTA(含或不含DTT)中加入SARS-CoV-2Mpro(终浓度0.2μM))中,分别加入以上各中药小分子标准品,使终浓度均为40μM,室温孵育1h,然后立即加入荧光标记底物(MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2,终浓度20μM),激发波长和发射波长分别为320nm和405nm,温度保持在298K,每10秒钟记录一次荧光读数。以对照曲线为只加蛋白和底物、不加任何抑制剂时的测定曲线,曲线越低说明抑制作用越强。当主蛋白酶的抑制率大于90%时,进一步测定该化合物的IC50。
经实验证明毛蕊花糖苷对SARS-CoV-2Mpro抑制率大于90%。
(2)IC50的测定
将毛蕊花糖苷分别用13个连续梯度稀释浓度的抑制剂与0.2μMSARS-CoV-2Mpro在50mM Tris-HCl pH 7.4,1mM EDTA或(50mM Tris-HCl pH 7.4,1mM EDTA,0.01%Triton X-100)条件下混合,室温孵育1h,再加入20μM底物多肽,在室温进行反应,然后立即置于酶标仪进行检测。所有实验数据均采用GraphPad Prism进行分析,作图得到IC50。如图1所示,毛蕊花糖苷在0.039μM~160μM浓度范围内,对SARS-CoV-2Mpro具有显著的抑制作用。
3、基于SARS-CoV-2Mpro结构对毛蕊花糖苷进行活性虚拟筛选预测。
实验以SARS-CoV-2Mpro为靶标蛋白(PDB ID:6LU7),其三维结构数据来源于PDB数据库,以毛蕊花糖苷为对接配体,对接采用Discovery Studio 2020Client,PyMOL 2.3.0在配体-柔性模式下,对小分子和蛋白进行优化,包括蛋白质加氢、计算电荷、添加原子类型等。参考SARS-CoV-2Mpro的结合位点,以His41和Cys145为对接活性口袋,将优化后的小分子配体与病毒蛋白受体进行分子对接。毛蕊花糖苷分子对接结果如图2所示,毛蕊花糖苷与SARS-CoV-2Mpro活性口袋结合,对接能量为-68.78Kcal/mol,与原配体N3对接能量-72.88Kcal/mol无统计学差异。
4、毛蕊花糖苷对SARS-CoV-2Mpro的分子动力学研究
分子动力学模拟采用GROMACS 2018软件执行。蛋白质和配体拓扑文件分别由CHARMM36力场和ChARMM-GUI服务器进行预处理。配合物通过TIP3P水模型在一个十二面体周期盒内溶剂化。对每个系统进行了约50ns的微正则系综、恒压、恒温平衡模拟。采用Gromacs软件包GMX RMS、GMX RMSF、GMX gyration、GMX COVAR和GMX ANAeig模块对结果进行分析。
(1)均方根偏差(RMSD)和均方根涨落(RMSF)分析
本试验对毛蕊花糖苷和SARS-CoV-2Mpro的配合物进行了300ns的分子动力学模拟,包括RMSD和RMSF分析,以揭示配合物的稳定性能:
RMSD为均方根偏差,通过RMSD分析以确定构象差异程度或轨迹稳定程度,结果如图3所示,毛蕊花糖苷在分子对接的最佳构象下在大约20ns后相对于参照分子(SARS-CoV-2Mpro)达到平衡。在300ns下,毛蕊花糖苷的RMSD平均值为0.17±0.02nm,SARS-CoV-2Mpro的RMSD平均值约为0.15nm,表明毛蕊花糖苷结构随时间的位置变化程度(偏移)较小,说明毛蕊花糖苷与SARS-CoV-2Mpro具有稳定的结合。
RMSF为均方根涨落,通过RMSF计算每个原子相对于其平均位置的涨落(变化幅度),衡量原子运动自由程度,表征分子结构的柔性。结果如图3所示,与SARS-CoV-2Mpro的RMSF值相比,毛蕊花糖苷的RMSF值波动较小,表明毛蕊花糖苷对SARS-CoV-2Mpro的整体结构影响较小,对接稳定,与RMSD结果相吻合。
(2)氢键和回转半径(Rg)分析
蛋白质的回转半径(Rg)用于描述体系原子沿着特定轴向的分布特征,表征分子的紧密程度,是评价结合稳定性的有效指标。结果如图3所示,SARS-CoV-2Mpro的Rg为2.56±0.02nm。与毛蕊花糖苷对接后,复合物Rg仅增加了0.02~0.05nm,无统计学差异。
通过计算配合物的氢键(H键)相互作用,引入配体对蛋白质的亲和力,并通过分子对接研究预测其亲和力。在300ns的模拟时间内对氢键进行了分析,结果如图3所示,毛蕊花糖苷-SARS-CoV-2Mpro复合物在模拟开始时具有大量的氢键,并趋于稳定。
回转半径与氢键相互作用的结果均表明,毛蕊花糖苷是与SARS-CoV-2Mpro稳定结合的理想配体。
4、毛蕊花糖苷与SARS-CoV-2Mpro的分子互作研究
(1)基于表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)评价毛蕊花糖苷与SARS-CoV-2Mpro的相互作用。
实验采用Biacore T200进行实验,SARS-CoV-2Mpro通过氨基偶联反应与串联传感器芯片CM5偶联,毛蕊花糖苷用工作液(PBS-P,5%DMSO)逐级稀释至0.977~500mmol/L,以10μL/min的流速注入通道。耦合时间和解离时间设定在60~200s。利用Biacore T200评价软件对数据进行分析,拟合亲和曲线,得到平衡解离常数(KD)。
结果如图4所示,毛蕊花糖苷与SARS-CoV-2Mpro的KD值为4.67μM,与SARS-CoV-2Mpro具有较强的结合亲和力。
(2)基于等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry,ITC)评价毛蕊花糖苷与SARS-CoV-2Mpro的相互作用。
ITC测定是研究生物热力学和生物动力学的重要方法。将毛蕊花糖苷和SARS-CoV-2Mpro分别用相同的缓冲液在合适的浓度下溶解。将SARS-CoV-2Mpro注入样品池,去离子水注入参比池,毛蕊花糖苷作为配体样品溶液在设定的时间内连续滴定至SARS-CoV-2Mpro。收集相关参数,如热力学平衡常数(K)、自由能变化量(ΔG)、焓(ΔH)、熵变化量(ΔS)等。
结果如图5所示,在298K时,毛蕊花糖苷与SARS-CoV-2Mpro的热力学平衡常数(K)为0.129μM,与SPR值有良好的相关性,表明毛蕊花糖苷对SARS-CoV-2Mpro活性有显著的亲和作用。
(3)基于核磁共振波谱法(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy,NMR)评价毛蕊花糖苷与SARS-CoV-2Mpro的相互作用
本研究采用NRM法,采用STD-NMR谱和WaterLOGSY–NMR谱观察毛蕊花糖苷与SARS-CoV-2Mpro的结合位点。毛蕊花糖苷作为配体,与SARS-CoV-2Mpro分别溶解在氘代试剂(D2O)中,化合物的浓度为SARS-CoV-2Mpro浓度的100倍配制STD样品分析,化合物的浓度为SARS-CoV-2Mpro浓度的10倍配制WaterLOGSY样品分析。在600MHz下,扫描256次,温度为298K,数据采用mestrenova软件(Version 9.0)进行分析。结果如图6~图10所示。
STD-NMR谱结果分析表明毛蕊花糖苷与SARS-CoV-2Mpro结合,结合氢原子的信号位于δH=1.923ppm,鉴定为22位氢原子。WaterLOGSY-NMR谱结果表明只有δH=1.923ppm处的峰信号为负,其他为正,即在δH=1.923ppm处检测到毛蕊花糖苷与SARS-CoV-2Mpro有结合,且结合的位点可能是22位氢原子。
以上结果表明,毛蕊花糖苷可能作为SARS-CoV-2Mpro的非共价抑制剂发挥重要作用。
实施例2
本实施例提供了毛蕊花糖苷抗新冠病毒的体外药效学实验及结果。
实验采用非洲绿猴肾细胞Vero E6(ATCC,CRL-1586)细胞系,病毒株采用奥密克戎(Omicron)BA.1和BA.2病毒株,感染细胞的剂量是MOI=0.01,即104个细胞里感染100个病毒。
给药前向96孔板中每孔加入100μL Vero E6细胞,使每孔细胞数为2×104个,培养24h。
取化合物按最高浓度100μM逐级进行3倍梯度稀释,共稀释8个浓度梯度,每个浓度做8复孔,即重复8次。向每孔里加入Omicron BA.1或BA.2侵染细胞,分别在侵染48h后使用Celigo全视野细胞分析仪(Celigo Image Cytometer)读板,根据细胞病变效应计算半数效应浓度(half-maximal effective concentration,EC50)。结果如图11所示,毛蕊花糖对Omicron BA.1的EC50为41.29μM,对Omicron BA.2的EC50为70.37μM。
由结果可见,毛蕊花糖苷对奥密克戎(Omicron)BA.1和BA.2病毒株具有显著的抑制效果,可用于制备抗奥密克戎病毒的药物。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.毛蕊花糖苷在制备抑制新型冠状病毒的药物中的应用。
2.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述抑制新型冠状病毒的药物为SARS-CoV-2Mpro非共价抑制剂。
3.毛蕊花糖苷在制备体外抑制新型冠状病毒产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,在所述产品中,毛蕊花糖苷的浓度为0.039μM~160μM。
5.毛蕊花糖苷在制备抗奥密克戎病毒的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述奥密克戎病毒的毒株包括BA.1和BA.2病毒株中的至少一种。
7.一种新型冠状病毒主蛋白酶抑制剂的筛选方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤A、将SARS-CoV-2Mpro重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中,筛选阳性克隆;将所述阳性克隆扩增培养后收集菌液,破菌,收集上清液;
步骤B、将所述上清液去除蛋白后用人类鼻病毒3C蛋白酶酶切,收集蛋白并浓缩,获得SARS-CoV-2Mpro;
步骤C、将所述SARS-CoV-2Mpro和待筛选的化合物加入同一缓冲液中,加入荧光标记底物后检测所述缓冲液的荧光强度,根据荧光强度的变化筛选新型冠状病毒主蛋白酶抑制剂。
8.根据权利要求7所述的筛选方法,其特征在于,所述筛选方法还包括虚拟筛选验证:包括以SARS-CoV-2Mpro为靶标蛋白,以SARS-CoV-2Mpro的His41和Cys145为对接活性口袋,虚拟验证步骤C筛选所得化合物与SARS-CoV-2Mpro活性口袋的结合情况。
9.根据权利要求8所述的筛选方法,其特征在于,所述虚拟筛选验证还包括验证步骤C筛选所得化合物与所述SARS-CoV-2Mpro的配合物稳定性。
10.根据权利要求8所述的筛选方法,其特征在于,所述虚拟筛选验证还包括验证步骤C筛选所得化合物与所述SARS-CoV-2Mpro的氢键数量。
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