CN115851651A - 水稻als突变蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及水稻ALS突变蛋白及其编码基因和应用。本发明提供一种水稻ALS突变蛋白，所述ALS突变蛋白与水稻野生型ALS蛋白相比，含有第171位脯氨酸突变为谷氨酸的突变。该突变蛋白可使得植物对多种ALS抑制剂类除草剂均具有较高的抗性。

Description

水稻ALS突变蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及水稻ALS突变蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS；EC2.2.1.6)是催化植物体内支链氨基酸(异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸)合成起始步骤的关键酶(Herrera Estrella L,BlockM D,M essens E,et al.Chimeric genes as dominant selectable markers in plantcells.The EM BO Journal,1983,2(6):987-995.)，是植物特有酶，动物中没有该酶，因此可在对人畜无害的情况下，通过抑制ALS酶阻断支链氨基酸的生物合成达到清除植物杂草的目的。目前，已针对该酶研发和应用多种除草剂(如磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸和磺酰胺类除草剂等)。ALS的氨基酸序列发生改变可能会导致其蛋白结构发生改变，进而导致ALS抑制剂无法结合ALS，使得ALS对除草剂的敏感性降低，从而对某些除草剂产生抗性。目前报道的ALS突变基因多存在产生的除草剂抗性水平较低、抗除草剂种类有限的问题，且多需要依赖多位点突变才能实现较好的抗性效果。

发明内容

本发明的第一目的在于提供水稻ALS突变蛋白及其编码基因。

本发明的第二目的在于提供一种以植物内源基因作为筛选标记的植物转基因筛选表达盒和筛选载体。

本发明的第三目的在于提供一种转基因植物的制备方法。

具体地，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供水稻ALS突变蛋白，所述ALS突变蛋白与水稻野生型ALS蛋白相比，含有第171位脯氨酸(Pro)突变为谷氨酸(Glu)的突变。

现有的ALS突变蛋白通常含有多位点突变，通过多位点的组合突变才能够赋予植物较高的ALS抑制剂类除草剂抗性，单点突变的抗性水平通常较低且抗除草剂类型较为单一。本发明发现，ALS蛋白第171位脯氨酸突变为谷氨酸这一单点突变即可显著提高ALS蛋白对于ALS抑制剂类除草剂的抗性，同时增加ALS蛋白抗除草剂的种类，进而赋予植物对多种ALS抑制剂类除草剂的高抗性。

在本发明的一些实施方式中，所述水稻ALS突变蛋白与水稻野生型ALS蛋白相比的突变为第171位脯氨酸突变为谷氨酸。

在本发明的一些实施方式中，所述ALS突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供的上述水稻ALS突变蛋白对于嘧啶水杨酸类(例如双草醚)、咪唑啉酮类(例如咪唑乙烟酸、甲氧咪草烟)除草剂均具有较高的抗性。

第二方面，本发明提供编码以上所述的水稻ALS突变蛋白的核酸分子。

以上所述的核酸分子包括DNA或RNA。

基于水稻ALS突变蛋白的氨基酸序列以及密码子规则，本领域技术人员能够获得编码水稻ALS突变蛋白的核酸分子的核苷酸序列，基于密码子的简并性，上述核酸分子的核苷酸序列并不唯一，但所有能够编码产生水稻ALS突变蛋白的核酸分子均在本发明的保护范围内。

在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

第三方面，本发明提供包含所述核酸分子或表达所述水稻ALS突变蛋白的生物材料。

优选地，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。

其中，所述宿主细胞不包含能够发育为植物完整植株的植物细胞。所述宿主细胞可为微生物细胞或动物细胞。

在本发明的一些实施方式中，所述表达盒由启动子和所述核酸分子可操作性地连接得到。

在本发明的一些实施方式中，所述表达盒由启动子、所述核酸分子和终止子可操作性地连接得到。

在本发明的一些实施方式中，所述载体为质粒载体，包括复制型载体和非复制型载体。

在本发明的一些实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌或农杆菌，但宿主细胞的种类并不局限于此，可以为任意的微生物细胞或可用于蛋白表达的动物细胞。

第四方面，本发明提供一种植物转基因筛选表达盒，所述表达盒包含以上所述的核酸分子以及用于启动和终止所述核酸分子转录的启动子和终止子。

在本发明的一些实施方式中，所述植物转基因筛选表达盒包含氨基酸序列如SEQID NO.1所示的水稻ALS突变蛋白的编码基因。本发明发现，该水稻ALS突变蛋白更适于作为植物转基因筛选标记，在植物基因转化过程中能够更高效地发挥筛选标记的功能，实现较高的筛选效率。

在本发明的一些实施方式中，所述植物转基因筛选表达盒包含序列如SEQ IDNO.2所示的水稻ALS突变蛋白的编码基因。

上述表达盒中，启动子可为植物组成型启动子或植物组织特异性启动子，终止子为在植物中可以终止基因转录的DNA序列。

优选地，所述启动子为水稻ALS基因启动子，水稻或玉米的Ubi启动子、Actin启动子、Rubisco小亚基启动子或Cab启动子；所述终止子为水稻ALS基因终止子或Ubi终止子。

在本发明的一些实施方式中，所述启动子为水稻ALS基因启动子，所述终止子为水稻Ubi终止子。本发明发现，采用水稻ALS基因启动子和Ubi终止子配合调控上述水稻ALS突变蛋白编码基因的转录，能够更好地控制该基因的高效、稳定、适度表达，使得水稻ALS突变蛋白更好地发挥筛选标记的功能。

在本发明的一些实施方式中，所述植物转基因筛选表达盒的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

第五方面，本发明进一步提供一种植物遗传转化筛选载体，该载体包含以上所述的植物转基因筛选表达盒。

优选地，所述植物遗传转化筛选载体通过克隆其他表达盒进入该载体进行遗传转化，其中，其他表达盒是指除上述植物转基因筛选表达盒以外的表达盒，包括但不限于荧光蛋白表达盒、GUS报告基因表达盒、抗虫表达盒、抗除草剂表达盒等。

在本发明的一些实施方式中，所述植物遗传转化筛选载体为植物双元表达载体。

在本发明的一些实施方式中，所述植物遗传转化筛选载体还包含一系列多克隆位点如SbfI、AfeI、AvrII、PmlI、SnaBI、PmeI等，以便后续克隆目的基因的连入。

在本发明的一些实施方式中，所述植物遗传转化筛选载体的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

以上所述的植物遗传转化筛选载体可通过以下方法制备得到：

(1)构建植物转基因筛选表达盒：将序列如SEQ ID NO.2所示的ALS突变蛋白编码基因置于该基因自身启动子ALSpro驱动下表达，在其下游以水稻Ubi终止子终止表达，得到序列如SEQ ID NO.3所示所示的植物转基因筛选表达盒；

(2)将步骤(1)得到的植物转基因筛选表达盒连入植物双元表达载体pC0310-AAU，获得植物遗传转化筛选载体。

第六方面，本发明提供所述水稻ALS突变蛋白或所述核酸分子或所述生物材料或所述植物转基因筛选表达盒的以下任一种应用：

(1)在使植物具有ALS抑制剂类除草剂抗性中的应用；

(2)在提高植物对ALS抑制剂类除草剂抗性中的应用；

(3)在降低ALS抑制剂类除草剂对植物的药害中的应用；

(4)在杂草防治中的应用；

(5)在植物遗传育种或制种中的应用。

上述(1)、(2)、(3)中所述的应用，可通过使植物表达所述水稻ALS突变蛋白或导入所述核酸分子或包含所述核酸分子的表达盒或载体使植物具有ALS抑制剂类除草剂抗性、提高植物对ALS抑制剂类除草剂抗性或降低ALS抑制剂类除草剂对植物的药害。

上述(4)中所述的应用包括：使植物含有所述核酸分子或表达所述ALS突变蛋白，并且，在植物种植过程中施用有效剂量的ALS抑制剂类除草剂。

第七方面，本发明提供一种抗ALS抑制剂类除草剂植物的制备方法，所述方法包括：使植物含有所述核酸分子或表达所述水稻ALS突变蛋白。

本发明中，所述ALS抑制剂类除草剂包括但不限于咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸类、磺酰脲类或磺酰胺类除草剂。其中，咪唑啉酮类除草剂包括咪唑乙烟酸、甲氧咪草烟；嘧啶水杨酸类除草剂包括双草醚。

本发明中，所述植物包括但不限于水稻、玉米、小麦、大豆、高梁、花生、芝麻、棉花、亚麻子、茵宿、燕麦、油菜籽、大麦、黑麦、小米、烟草、青稞、拟南芥等。优选地，所述植物为水稻、玉米、小麦、大豆、高梁、花生或小米。

本发明的有益效果至少包括：本发明提供了水稻ALS突变蛋白，该突变蛋白可使得水稻、玉米、大豆等多种植物对多种ALS抑制剂类除草剂均具有较高的抗性，导入该突变蛋白基因的转基因植株具备嘧啶水杨酸类、咪唑啉酮类等除草剂的高抗性。该突变蛋白能够显著提高植物对ALS抑制剂类除草剂的抗性水平，同时显著增加了植物具有抗性的ALS抑制剂类除草剂的种类，在多种植物中均能够发挥较好的效果，可用于抗除草剂植物品种的培育，还可用于以除草剂抗性基因为筛选标记的植物遗传转化筛选系统的开发。

本发明还提供利用水稻ALS突变基因作为筛选标记的植物转基因筛选表达盒和植物遗传转化筛选载体。本发明的植物遗传转化筛选载体可作为转基因筛选载体附加其他功能元件使用进行植物基因转化，能够实现较高的阳性筛选效率，且该植物遗传转化筛选载体所含筛选标记为植物内源基因，在转基因过程中不引入菌源等外源筛选标记基因，不仅丰富了植物转基因筛选方法，还可有效降低外源基因引起的转基因植物的潜在安全风险，有利于转基因植物的商业化应用，具有较好的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中ALSm5目的基因分段扩增的电泳图；其中，M为Marker，1-3为ALSm5前半段扩增结果，片段大小约524bp；4-6为ALSm5后半段扩增结果，片段大小约1411bp；条带大小均正确，割胶回收DNA。

图2为本发明实施例1中pC0310-AAU经NcoI和StuI酶切的电泳图；其中，M为Marker，ck为未酶切的pC0310-AAU骨架载体，1-10为酶切的pC0310-AAU骨架载体，可切出大小约为9kb片段，割胶回收DNA。

图3为本发明实施例1中pC0310-AAU骨架载体图谱。

图4为本发明实施例1中pCALSm5重组质粒经XhoI酶切的电泳图；其中，M为Marker，CK1-5为pCALSm5重组质粒，1-5为酶切的pCALSm5重组质粒，可切出大小约为1.7kb片段，酶切条带正确。

图5为本发明实施例1中pCALSm5载体的载体图谱。

图6为本发明实施例2中转化后农杆菌的PCR检测电泳结果；其中，M为Marker，ck+为pCALSm5重组质粒阳性对照，1-10为转pCALSm5重组质粒农杆菌单克隆菌落PCR结果。

图7为本发明实施例5中pCALSm5转基因株系T0代水稻苗期双草醚一定浓度喷施结果；其中，双草醚10×代表300mg/L，双草醚20×代表600mg/L和双草醚50×代表1500mg/L，左侧为阴性对照ZH11，右侧为T1代pCALSm5转基因苗。

图8为本发明实施例5中pCALSm5转基因株系T0代水稻苗期咪唑乙烟酸一定浓度喷施结果；其中，咪唑乙烟酸5×代表375mg/L，咪唑乙烟酸10×代表750mg/L和咪唑乙烟酸30×代表2250mg/L，左侧为阴性对照ZH11，右侧为T1代pCALSm5转基因苗。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1含有水稻ALS突变蛋白的植物遗传转化筛选载体的构建

1、水稻ALS突变蛋白的获得

本发明对现有的植物ALS除草剂抗性突变位点进行了分析、筛选和验证，针对水稻ALS蛋白从大量携带不同突变位点、不同突变氨基酸的突变蛋白中筛选得到相对于水稻野生型ALS蛋白在171位由Pro突变为Glu的水稻ALS突变蛋白(ALSm5，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，与其他单点突变的突变蛋白相比，该突变蛋白具有更高的ALS抑制剂抗性，对于咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸类、磺酰脲类、磺酰胺类除草剂均具有较高的抗性，解决了现有单点突变蛋白抗除草剂类型较为单一的问题，该突变蛋白能够赋予植物对多种ALS抑制剂类除草剂的高抗性，可提供多种除草剂轮换的有效解决方案。

2、植物遗传转化筛选载体的构建

本发明的植物转基因筛选表达盒OsALSP-ALSm5-OsUbiT(序列如SEQ ID NO.3所示)和植物遗传转化筛选载体pCALSm5(序列如SEQ ID NO.4所示)的构建方法如下：

扩增目的片段序列(模板用水稻基因组DNA，位点的突变P171E(CCC-AAG)设计在引物中)，利用NcoI和StuI双酶切载体pC0310-AAU，再将目的片段与载体连接或分段连接。

(1)水稻ALS突变基因(ALSm5)的扩增

分两段扩增，设计引物0310-AA5U-F/0310-AA5U-Rv1从水稻基因组中扩增ALS基因前524bp片段；利用引物0310-AA5U-F2/0310-AA5U-Rv从水稻ALS基因片段中扩增获得目的基因ALS基因后1411bp片段；其中，引物0310-AA5U-F和0310-AA5U-Rv的5’端均有15个左右核苷酸序列与载体相应连接位置重复；相邻片段的上下游引物5’端也有15bp重复(0310-AA5U-Rv1与0310-AA5U-F2)，以便后续利用Gibson Assembly重组连接。

上述引物序列如下：

0310-AA5U-F:

GCCGCCACCACCCACcATGGCTACGACCGCCGC(SEQ ID NO.5)；

0310-AA5U-Rv1：

CGGTGCCGATCATGCGGCGCTCGACCTGGC(SEQ ID NO.6)；

0310-AA5U-F2：

CCGCATGATCGGCACCGACGCCTTCCA(SEQ ID NO.7)；

0310-AA5U-Rv：

GCGCCCACTTTGTGAGGcctTTAATACACAGTCCTGCCATCACC(SEQ ID NO.8)；

PCR扩增反应体系如表1所示。

表1 PCR扩增反应体系

PCR扩增程序如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，55-65℃退火30s，68℃延伸3min，35个循环；68℃延伸10min，16℃结束。

引物0310-AA5U-F和0310-AA5U-Rv1扩增的PCR产物为ALSm5前524bp片段，经1.2％琼脂糖凝胶电泳回收大小为524bp产物(图1)；引物0310-AA5U-F2和0310-AA5U-Rv扩增的PCR产物为ALSm5后1411bp片段，1.2％琼脂糖凝胶电泳回收大小为1411bp(图1)。

(2)载体构建

使用Gibson Assembly方法，将上述1中的ALSm5基因扩增产物插入到pC0310-AAU载体(pC0310为发明人依托pCAMBIA1300载体骨架，经过改造获得，其中主要删除了其潮霉素筛选元件及相邻区域不必要区域，以使得T-Border内部除多克隆位点外不含其它菌源序列，因此在T-Border中后续连入植物源序列，转入植物时降低安全风险，pC0310-AAU载体为在pC0310的基础上连接了由ALS启动子、ALSm1基因和水稻Ubi终止子构成的表达盒，其中，ALSm1基因的序列如CN111560396 A中记载的SEQ ID NO.1所示，pC0310-AAU载体的图谱见图3)。

具体方法如下：

①用NcoI+StuI对载体质粒pC0310-AAU进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后(图2)，利用E.Z.N.A.

Gel Extraction kit(Omega,下同)回收9kb左右大小条带，得到pC0310-AAU线性片段。

NcoI和StuI双酶切反应体系如表2所示。

表2双酶切反应体系

②2×Lightening Cloning Kit连接试剂盒(Gene-

)连接，连接体系如表3所示。

表3连接体系

连接程序：50℃，30min。

③转化：取上述连接产物1μl，加入到大肠杆菌感受态细胞中，轻微混匀；用电转仪1.8KV电击转化大肠杆菌感受态细胞；加入SOC培养基1ml，37℃、220rpm振荡培养1h，5000rpm离心30s，弃800μl上清，将剩余菌体与培养基混匀，涂布于含卡那霉素的LB平板上。37℃培养16h左右，挑取单菌落，用特异性引物(0309-F2和0309-R2)做菌落PCR验证，挑选阳性菌落，37℃、220rpm摇菌过夜，利用高纯质粒小提试剂盒(中科瑞泰)提取质粒，酶切检测正确的结果如图4所示，保菌并送测序，将验证正确的质粒命名为pCALSm5，载体图谱见图5所示。

引物序列如下：

0309-F2:GGGCCATACTTGTTGGATATCAT(SEQ ID NO.9)；

0309-R2:TTGTTCATGGCGTAATGTCTCC(SEQ ID NO.10)。

实施例2农杆菌转化、鉴定以及水稻遗传转化

取-80℃保存的农杆菌EHA105感受态细胞加入1μl实施例1中构建的测序正确pCALSm5质粒，2.5KV电击转化。涂布于含有卡那霉素、利福平和链霉素的YEP培养板上，28℃培养48h左右，挑取单菌落摇菌过夜，用特异性引物(0309-F2和0309-R2)进行菌液PCR验证(图6)，可扩增得到约950bp左右目的片段，挑选阳性克隆(工程农杆菌)，摇菌36～48h，保存菌液用于侵染。

以水稻为例，将上述得到的工程农杆菌通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，经双草醚(BS)、咪唑乙烟酸等筛选压下的筛选、分化、生根等环节。共筛选350粒愈伤，获得150粒阳性愈伤，阳性愈伤经分化、生根，最终获得转化效率为36.9％。

实施例3普通水稻苗期双草醚和咪唑乙烟酸的临界浓度测试

双草醚是稻田用除草剂，普通水稻对其具有抗性，因此在水稻上喷施药剂规定浓度的除草剂不会对水稻造成伤害，多数喷施安全浓度在30mg/L；咪唑乙烟酸属咪唑啉酮类除草剂，主要用于豆科作物防除禾本科杂草及阔叶杂草，具有选择性强、杀草谱广及活性高等优点，普通水稻对其抗性较弱，多数推荐浓度为75mg/L。

本实施例分析普通水稻对双草醚和咪唑乙烟酸抗性的临界浓度，通过实验测试得出：对于双草醚，粳稻中花11(ZH11)在苗期喷施推荐浓度的20×以上均枯萎死亡，因此以20×作为临界浓度；对于咪唑乙烟酸，粳稻中花11(ZH11)在苗期喷施推荐浓度的5×以上均枯萎死亡，因此以5×作为临界浓度。

实施例4转基因株系鉴定

为了鉴定获得的株系是否为转基因株系，本实施例对经上述实施例中的筛选培养、分化培养和生根培养获得的部分阳性转基因植株进行PCR验证。

首先提取样品DNA，DNA提取步骤如下：取约2cm长的水稻叶片置于2ml离心管中；在研钵中加入800μl 1.5×CTAB，研磨叶片至匀浆并倒回离心管内；65℃水浴20-30min，每5min颠倒混匀1次；12000rpm离心10min；吸取400μl上清液至新的离心管，加入2倍体积经冰预冷的无水乙醇，-20℃冰置20min；12000rpm离心10min；弃上清，加入500μl 75％乙醇，颠倒漂洗，8000rpm离心5min；弃上清，置于超净台吹干或自然晾干，加100μl ddH₂O溶解DNA。

为了区分水稻内源基因，设计一对引物(0310-F4/0310-R4)对转基因株系基因组DNA样品进行PCR扩增检测，该引物对以内源水稻基因组为模板无法扩增获得片段，以转基因表达盒为模板扩增获得片段大小为670bp左右。

引物序列如下：

0310-F4:CATTGAGAACCTCCCTGTG(SEQ ID NO.11)；

0310-R4:GACAAATTTGTTTGTCAGATCAA(SEQ ID NO.12)。

PCR反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性45s，55-65℃退火45s；72℃延伸1.5min；30-35个循环；72℃再延伸10min；16℃结束。

PCR反应体系如表4所示。

表4 PCR反应体系

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，电泳结果表明，大部分转基因样品中含有约670bp的转基因条带。

实施例5除草剂抗性表型鉴定

选取实施例4鉴定正确的水稻ALS突变基因(ALSm5)转基因水稻株系的部分生根材料在移栽7-14天后(3-5叶期左右)，分别喷施300mg/L(10×)、600mg/L(20×)和1500mg/L(50×)双草醚，以ZH11作为阴性对照(图7)。喷施后3-7天，野生型对照ZH11出现叶片枯黄。7至14天时，在双草醚10×浓度以上，野生型对照ZH11均枯黄致死，10×浓度下转基因植株生长正常，20×浓度下10株转基因植株有2株存活，50×浓度下转基因植株全部枯死(图7)。

选取实施例4鉴定正确的水稻ALS突变基因(ALSm5)转基因水稻株系的部分生根材料在移栽7-14天后(3-5叶期左右)，分别喷施375mg/L(5×)、750mg/L(10×)和2250mg/L(30×)咪唑乙烟酸(图8)，7至14天时，野生型对照ZH11出现不同程度的枯黄、枯萎或死亡，30×浓度下转基因株系出现枯黄，14天后，野生型对照ZH11及30×浓度下转基因敏感株系已完全枯死，10×浓度下15株转基因植株有10株存活，转基因株系中的存活株系为咪唑乙烟酸抗性株系(图8)。

实施例6玉米中除草剂抗性鉴定

利用实施例2中水稻遗传转化类似的方法，获得玉米转基因植株，对T0代转基因植株进行除草剂喷施验证，获得了高抗双草醚、咪唑乙烟酸植株。收取高抗这两种除草剂植株T0代种子并种植，获得T1代转基因植株并进行除草剂表型鉴定，获得高抗双草醚和咪唑乙烟酸T1代株系。

实施例7大豆中除草剂抗性鉴定

利用实施例2中水稻遗传转化类似的方法，获得大豆转基因植株，对T0代转基因植株进行双草醚喷施验证，获得了高抗双草醚植株。收取高抗双草醚植株T0代种子并种植，获得T1代转基因植株并进行双草醚表型鉴定，获得高抗双草醚T1代株系。

上述结果表明，水稻中通过转化ALS突变基因获得的转基因株系高抗双草醚，同时抗咪唑乙烟酸；玉米中通过转化ALS突变基因获得的转基因株系高抗双草醚及咪唑乙烟酸；大豆中通过转化ALS突变基因获得的转基因株系高抗双草醚。

上述两种除草剂仅为所属除草剂类别的代表，获得的转基因株系不仅具备这两种除草剂的高抗性，还具备其他磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸类除草剂(如苄嘧磺隆、氯磺隆、嘧硫草醚、嘧草醚等)的高抗性。

本发明获得的pCALSm5作为植物双元表达载体，可以通过克隆其他表达盒进入该载体，进行遗传转化，获得相应的性状。如：将荧光蛋白表达盒、GUS报告基因表达盒、抗虫表达盒、抗除草剂表达盒、其他功能基因等。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.水稻ALS突变蛋白，其特征在于，所述ALS突变蛋白与水稻野生型ALS蛋白相比，含有第171位脯氨酸突变为谷氨酸的突变。

2.根据权利要求1所述的水稻ALS突变蛋白，其特征在于，所述ALS突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的水稻ALS突变蛋白。

4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

5.生物材料，其特征在于，所述生物材料包含权利要求3或4所述的核酸分子或表达权利要求1或2所述的水稻ALS突变蛋白。

6.一种植物转基因筛选表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求3或4所述的核酸分子以及用于启动和终止所述核酸分子转录的启动子和终止子。

7.根据权利要求6所述的表达盒，其特征在于，所述启动子为水稻ALS基因启动子，水稻或玉米的Ubi启动子、Actin启动子、Rubisco小亚基启动子或Cab启动子；所述终止子为水稻ALS基因终止子或Ubi终止子；

优选地，所述启动子为水稻ALS基因启动子，所述终止子为水稻Ubi终止子。

8.根据权利要求7所述的植物转基因筛选表达盒，其特征在于，所述表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

9.权利要求1或2所述的水稻ALS突变蛋白或权利要求3或4所述的核酸分子或权利要求5所述的生物材料或权利要求6～8任一项所述的植物转基因筛选表达盒的以下任一种应用：

(1)在使植物具有ALS抑制剂类除草剂抗性中的应用；

(2)在提高植物对ALS抑制剂类除草剂抗性中的应用；

(3)在降低ALS抑制剂类除草剂对植物的药害中的应用；

(4)在杂草防治中的应用；

(5)在植物遗传育种或制种中的应用。

10.一种抗ALS抑制剂类除草剂植物的制备方法，其特征在于，所述方法包括：使植物含有权利要求3或4所述的核酸分子或表达权利要求1或2所述的水稻ALS突变蛋白。

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