CN115845056A - DHA通过抑制心肌细胞中p38/ET-1通路在防治放射性心肌纤维化中的应用 - Google Patents
DHA通过抑制心肌细胞中p38/ET-1通路在防治放射性心肌纤维化中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115845056A CN115845056A CN202210870641.7A CN202210870641A CN115845056A CN 115845056 A CN115845056 A CN 115845056A CN 202210870641 A CN202210870641 A CN 202210870641A CN 115845056 A CN115845056 A CN 115845056A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- radiation
- myocardial
- fibroblasts
- dha
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101800004490 Endothelin-1 Proteins 0.000 title claims abstract description 188
- 102400000686 Endothelin-1 Human genes 0.000 title claims abstract description 182
- 206010028594 Myocardial fibrosis Diseases 0.000 title claims abstract description 53
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 title claims abstract description 53
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 title claims abstract description 48
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title abstract description 22
- 230000037361 pathway Effects 0.000 title abstract description 18
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title abstract description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 title description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 96
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims abstract description 92
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 46
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 40
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 16
- MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N all-cis-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoic acid Chemical group CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCC(O)=O MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N 0.000 claims description 204
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 106
- 235000020669 docosahexaenoic acid Nutrition 0.000 claims description 96
- 229940090949 docosahexaenoic acid Drugs 0.000 claims description 95
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 76
- 210000001054 cardiac fibroblast Anatomy 0.000 claims description 43
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 42
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 26
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 25
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 20
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 20
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 20
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 20
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims description 16
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims description 16
- 102000010400 1-phosphatidylinositol-3-kinase activity proteins Human genes 0.000 claims description 14
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 claims description 14
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 11
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 11
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 11
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 10
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 10
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 7
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 7
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 claims description 7
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 claims description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 4
- 230000002477 vacuolizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 claims description 3
- 239000005414 inactive ingredient Substances 0.000 claims description 3
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims 2
- 208000021601 lentivirus infection Diseases 0.000 claims 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 11
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 10
- 208000013875 Heart injury Diseases 0.000 abstract description 9
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 7
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 abstract description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 4
- 102100026292 Asialoglycoprotein receptor 1 Human genes 0.000 description 46
- 101710200897 Asialoglycoprotein receptor 1 Proteins 0.000 description 46
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 40
- 102000002574 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Human genes 0.000 description 39
- 108010068338 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 39
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 37
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 15
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 10
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 8
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 7
- 210000000651 myofibroblast Anatomy 0.000 description 7
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 230000007730 Akt signaling Effects 0.000 description 6
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 6
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 6
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 6
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 5
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 102100030485 Platelet-derived growth factor receptor alpha Human genes 0.000 description 4
- 101710148465 Platelet-derived growth factor receptor alpha Proteins 0.000 description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 4
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 4
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 3
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 3
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 3
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 3
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 2
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 201000009053 Neurodermatitis Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 208000035868 Vascular inflammations Diseases 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 206010003119 arrhythmia Diseases 0.000 description 2
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 2
- 235000020660 omega-3 fatty acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000017940 prurigo nodularis Diseases 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 238000013424 sirius red staining Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 2
- DVSZKTAMJJTWFG-SKCDLICFSA-N (2e,4e,6e,8e,10e,12e)-docosa-2,4,6,8,10,12-hexaenoic acid Chemical compound CCCCCCCCC\C=C\C=C\C=C\C=C\C=C\C=C\C(O)=O DVSZKTAMJJTWFG-SKCDLICFSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GZJLLYHBALOKEX-UHFFFAOYSA-N 6-Ketone, O18-Me-Ussuriedine Natural products CC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCC(O)=O GZJLLYHBALOKEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000009020 BCA Protein Assay Kit Methods 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229940127291 Calcium channel antagonist Drugs 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007665 Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases Human genes 0.000 description 1
- 102100022086 GRB2-related adapter protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 1
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000004232 Mitogen-Activated Protein Kinase Kinases Human genes 0.000 description 1
- 101100405118 Mus musculus Nr4a1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100022679 Nuclear receptor subfamily 4 group A member 1 Human genes 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 241000282405 Pongo abelii Species 0.000 description 1
- 102100033810 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 101100405120 Xenopus laevis nr4a1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000006793 arrhythmia Effects 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002876 beta blocker Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 230000004641 brain development Effects 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 239000000480 calcium channel blocker Substances 0.000 description 1
- 230000005773 cancer-related death Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- KAUVQQXNCKESLC-UHFFFAOYSA-N docosahexaenoic acid (DHA) Natural products COC(=O)C(C)NOCC1=CC=CC=C1 KAUVQQXNCKESLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000019305 fibroblast migration Effects 0.000 description 1
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 235000021323 fish oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000000897 modulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxomolybdenum Chemical compound O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.OP(O)(O)=O DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及DHA通过抑制心肌细胞中p38/ET‑1通路在防治放射性心肌纤维化中的应用。本发明通过研究首次发现并证实，ET‑1是预防RIMF的有效靶点，而临床易获得且有益的DHA制剂可以通过靶向p38/ET‑1有效抑制放射性成纤维细胞活化、减轻RIMF。本发明为放射性心脏损伤这一类独特疾病的防治提供了实验证据和新思路，为解决放疗过程中产生的放射性心脏副反应难题提供了潜在的干预方案，因此具有重要的临床意义和社会价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及DHA通过抑制心肌细胞中p38/ET-1通路在防治放射性心肌纤维化中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
胸部放射治疗(RT)作为肺癌、食管癌等胸部恶性肿瘤的重要治疗策略，在治疗肿瘤病灶、提高患者生存期方面发挥着十分重要的作用。然而，RT不可避免地会导致多种并发症(包括放射性心脏损伤(RIHD))，可能导致非癌症相关的死亡。作为放射(IR)引起的迟发性心脏损伤，放射性心肌纤维化(RIMF)的发展是一个缓慢而持续的过程，在胸部放疗病人中其发病率高达20-80％。放射性心肌纤维化导致的心肌僵硬度增加、心肌收缩和舒张功能下降，可导致一些严重甚至致命的疾病，包括心律失常和心力衰竭等，进而严重影响病人生活质量、极大限制放疗的治疗作用。
必须指出的是，随着分子医学和精准医学的发展，肿瘤学界联合心脏学界已将放射性心脏损伤划分为一类病因独特、机制独特、治疗独特的射线副反应性疾病，显著区别于传统意义上的心血管疾病，而RIMF为放射性心脏损伤的晚期形式。心脏受放射损伤后，细胞内DNA和多种功能性大分子、细胞器被射线直接破坏(该过程具有一定随机性)，同时射线产生的氧自由基(包括大量ROS)也可随机性的破坏生物大分子，且心脏的不同细胞组分(如心肌细胞、血管内皮细胞、局部炎性细胞、成纤维细胞等)对射线的反应性也迥然不同，这就造成极其复杂且难以准确预测的细胞损伤，从而产生独特的放射性炎症、导致复杂细胞因子释放和多细胞组分相互作用改变，放射性炎症进一步发展，多因素共同激活成纤维细胞，逐步导致RIMF的出现。而心梗、糖尿病等疾病所引起的心肌纤维化，疾病转归过程明晰、发病机制确切，均属于传统心血管疾病范畴，临床已有多种明确的、规范化的药物对其进行预防和治疗，包括β受体阻断剂、钙离子通道阻断剂等。因此，RIMF的发病原因、进展机理与放射线的物理和生物学效应密切相关，而与其他原因导致的心肌纤维化截然不同，这导致目前临床上尚无针对RIMF的有效防治药物；同时，由于RIMF一般都是肿瘤病人放疗后出现的副反应而并非出现于心血管疾病人群，这又导致目前临床中可用的抗心肌纤维化药物难以应用于RIMF。所以，尽管多年来研究者一直在寻找RIMF的有效防治药物，但临床仍然没有相应药物可用；我们迫切需要进一步阐明RIMF的发病机制，寻找合适的干预靶点和药物。
发明内容
针对上述现有技术中存在的不足，发明人经长期的技术与实践探索，提供二十二碳六烯酸(DHA)通过抑制心肌细胞中p38/ET-1通路在防治放射性心肌纤维化中的应用。本发明通过研究首次发现并证实，内皮素-1(ET-1)是预防RIMF的有效靶点，而临床易获得且有益的DHA制剂可以通过靶向p38/ET-1有效抑制放射性成纤维细胞活化、减轻RIMF。该应用系首次公开，与已知的临床用药用途不同。
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面，提供抑制ET-1表达和/或活性降低的物质在如下任意一种或多种中的应用：
a1)抑制放射对心肌成纤维细胞的活化或制备抑制放射对心肌成纤维细胞活化的产品；
a2)抑制放射对心肌细胞p38的磷酸化或制备抑制放射对心肌细胞p38磷酸化的产品；
a3)抑制放射导致的心肌成纤维细胞中p-MEK,p-ERK,p-AKT和PI3K的上调表达或制备抑制放射导致的心肌成纤维细胞中p-MEK,p-ERK,p-AKT和PI3K的上调表达的产品；
a4)防治放射性心肌纤维化或制备防治放射性心肌纤维化的产品。
其中，
a1)中，所述放射对心肌成纤维细胞的活化包括放射促进心肌成纤维细胞的增殖和迁移。
a4)中，预防和/或治疗放射性心肌纤维化具体表现为减轻放射引起的心肌纤维紊乱、心肌细胞空泡变性、炎症细胞浸润，降低胶原沉积和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)水平。
所述抑制ET-1表达和/或活性降低的物质为二十二碳六烯酸。
本发明的第二个方面，提供一种组合物，所述组合物其活性成分至少包括抑制ET-1表达和/或活性降低的物质。
所述抑制ET-1表达和/或活性降低的物质为二十二碳六烯酸。
本发明的第三个方面，提供上述组合物在如下任意一种或多种中的应用：
a1)抑制放射对心肌成纤维细胞的活化或制备抑制放射对心肌成纤维细胞活化的产品；
a2)抑制放射对心肌细胞p38的磷酸化或制备抑制放射对心肌细胞p38磷酸化的产品；
a3)抑制放射导致的心肌成纤维细胞中p-MEK,p-ERK,p-AKT和PI3K的上调表达或制备抑制放射导致的心肌成纤维细胞中p-MEK,p-ERK,p-AKT和PI3K的上调表达的产品；
a4)防治放射性心肌纤维化或制备防治放射性心肌纤维化的产品。
本发明的第四个方面，提供一种预防和/或治疗放射性心肌纤维化的方法，所述方法包括向受试者施用有效量上述抑制ET-1表达和/或活性降低的物质或组合物。
与现有技术方案相比，上述一个或多个技术方案具有如下有益效果：
上述技术方案通过研究发现，放射通过增强心肌细胞中p38信号来上调ET-1表达/分泌，从而促进心脏成纤维细胞激活，导致放射性心肌纤维化。上述技术方案首次揭示了RIMF中IR/p38/ET-1调控轴线，为RIMF发病机制提供新的视野。
同时，上述技术方案首次发现ET-1是预防RIMF的有效靶点，而临床易获得且有益的DHA制剂可以通过靶向p38/ET-1有效抑制放射性成纤维细胞活化、减轻RIMF。通过实验数据证实DHA可用于RIMF的防治，为放射性心脏损伤这一类独特疾病的防治提供了实验证据和新思路，为解决放疗过程中产生的放射性心脏副反应难题提供了潜在的干预方案，因此具有重要的临床意义和社会价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中DHA可显著减轻放射诱导的小鼠心肌纤维化。
A,C57BL/6J小鼠暴露于16gy心脏放射，放射后使用DHA直到20周。将小鼠分为三组:对照组(CON)、放射组(IR)和处理组(IR+DHA)。B-E,三组小鼠心脏组织H&E染色(B)，天狼星红染色(C),马森染色(D)和免疫组织化学染色分析α-SMA(E)。F,三组小鼠心脏组织α-SMA和PDGFRA免疫荧光共定位。***p<0.001；
图2为本发明实施例中放射上调心肌细胞ET-1水平，ET-1激活心脏成纤维细胞。
A和B，通过western blotting(A)和免疫荧光(B)检测，在照射后48、72和96h,3、6和9Gy剂量的放射改变了HL-1细胞中ET-1的表达。C，照射后(3、6和9Gy)48、72和96h,ET-1在H9C2细胞中的表达。D和E,HL-1细胞(D)和H9C2细胞(E)照射72小时后(3,6和9Gy)，细胞上清中ET-1的浓度。图中显示的是0Gy相对于3Gy、6Gy和9Gy的显著性。F，胸部放疗后患者血清ET-1浓度的变化(n＝13)。G，患者血清中ET-1的增加幅度(放疗后与放疗前)与心脏平均受照剂量之间的相关性(n＝13)。H，用CCK-8法检测ET-1(5和10nM)作用后心肌原代成纤维细胞的增殖曲线。I和J，通过免疫荧光(I)和western blotting(J)检测ET-1对原代成纤维细胞α-SMA表达的影响。左边是有代表性的照片，右边是量化的照片。**p<0.01；***p<0.001；
图3为本发明实施例中心肌细胞的ET-1介导放射对成纤维细胞的作用。
A和B,使用三个siRNAs敲低HL-1细胞中ET-1表达，免疫印迹(A)和PCR(B)。C和D,用HL–1上清刺激成纤维细胞后，其增殖(C)和迁移(D)情况检测,包括CON组、IR组、IR+Si-3组、IR+Si-3+ET-1组、CON+Si-3组的上清。E和F，采用Western blotting(E)和免疫荧光(F)检测HL-1上清刺激原代成纤维细胞α-SMA的表达。***p<0.001；
图4为本发明实施例中DHA抑制放射引起的ET-1增加。
A-C,CON、IR、IR+DHA、CON+DHA组HL-1细胞(A、B)和H9C2细胞(C)ET-1蛋白水平。D和E,ELISA检测CON、IR、IR+DHA、CON+DHA组HL-1细胞(D)和H9C2细胞(E)上清中ET-1的浓度。F,免疫组化检测CON、IR、IR+DHA三组小鼠心脏组织中的ET-1表达(n＝6)。G,ELISA检测CON、IR、IR+DHA三组小鼠血清中的ET-1浓度(n＝6)。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图5为本发明实施例中DHA通过降低心肌细胞来源的ET-1抑制放射促进的成纤维细胞活化。
A，用CON,IR,IR+DHA,IR+DHA+ET-1以及CON+DHA组HL-1细胞上清刺激成纤维细胞，检测其增殖曲线。B-D，用CON,IR,IR+DHA,IR+DHA+ET-1以及CON+DHA组HL-1细胞上清刺激成纤维细胞，检测其α-SMA蛋白水平和迁移能力。α-SMA的western blotting和免疫荧光分别见(B和C)，成纤维细胞的Transwell测定见(D)。***p<0.001；
图6为本发明实施例中p38信号介导放射对ET-1表达的调控。
A和B，放射(3、6、9Gy)后48、72、96h，HL-1细胞(A)和H9C2细胞(B)p-p38和t-p38蛋白水平检测。C和D,CON、IR、IR+SB203580和CON+SB203580组HL-1细胞(C)和H9C2细胞(D)中p-p38、t-p38和ET-1蛋白表达水平。E,CON、IR、IR+SB203580和CON+SB203580组HL-1细胞中ET-1蛋白表达水平检测。F和G,HL-1细胞(F)、H9C2细胞(G)分别接受IR、IR+SB203580、SB203580处理及对照组上清ET-1浓度的变化。H和I,CON,IR,IR+DHA和CON+DHA组HL-1细胞中p-p38,t-p38和ET-1蛋白含量检测。J,CON、IR、IR+DHA组小鼠心脏组织中p-p38水平检测(n＝6)。SB，SB203580。***p<0.001；
图7为本发明实施例中MEK-ERK和PI3K-AKT通路是心脏成纤维细胞ET-1的下游效应通路。
A-C，原代成纤维细胞中t-MEK、p-mek、t-ERK、p-erk、PI3K-110α、t-AKT、p-AKT蛋白水平检测。A为外源ET-1对蛋白水平的影响。B为CON组、IR组、IR+Si-3组、IR+Si-3+ET-1组和CON+Si-3组HL-1上清处理的成纤维细胞中蛋白水平。C为CON组、IR组、IR+DHA组、IR+DHA+ET-1组和CON+DHA组HL-1上清处理的成纤维细胞中蛋白水平。D,RIMF中的IR/p38/ET-1轴以及DHA对RIMF的保护作用示意图。放射通过增强心肌细胞p38信号通路上调ET-1水平，心肌细胞来源的ET-1通过MEK-ERK和PI3K-AKT通路显著促进心脏成纤维细胞的活化，从而促进RIMF；而DHA可通过抑制心肌细胞中p38/ET-1轴显著减轻RIMF；
图8为本发明实施例中放射对原代心脏成纤维细胞的影响。
A和B，放射(0,3,6,9Gy)对成纤维细胞增殖(A)和迁移(B)的影响。C采用免疫荧光检测放射(0,3,6,9Gy)对成纤维细胞α-SMA表达的影响。ns,无统计意义；
图9为本发明实施例中不同浓度DHA对HL-1和H9C2细胞的影响，其中，A和B，用DHA-10μM,-20μM,-40μM,-80μM,和-160μM分别处理HL-1和H9C2细胞，检测其增殖曲线。图中显示的是CON vs DHA-20μM的p值。ns,无统计意义。
图10为本发明实施例中DHA对原代成纤维细胞的影响。
A和B，DHA-20μM和-40μM对成纤维细胞进行处理，检测其增殖(A)和迁移(B)。C，DHA-20μM和-40μM对成纤维细胞进行处理，检测其α-SMA表达。ns,无统计意义。
图11为本发明实施例中采用CCK-8检测SB203580对HL-1(A)和H9C2(B)细胞生长情况的影响，图中显示的是CON vs SB203580-10μM的p值。ns,无统计意义。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的一个典型具体实施方式中，抑制ET-1表达和/或活性降低的物质在如下任意一种或多种中的应用：
a1)抑制放射对心肌成纤维细胞的活化或制备抑制放射对心肌成纤维细胞活化的产品；
a2)抑制放射对心肌细胞p38的磷酸化或制备抑制放射对心肌细胞p38磷酸化的产品；
a3)抑制放射导致的心肌成纤维细胞中p-MEK,p-ERK,p-AKT和PI3K的上调表达或制备抑制放射导致的心肌成纤维细胞中p-MEK,p-ERK,p-AKT和PI3K的上调表达的产品；
a4)防治放射性心肌纤维化或制备防治放射性心肌纤维化的产品。
其中，
a1)中，所述放射对心肌成纤维细胞的活化包括放射促进心肌成纤维细胞的增殖和迁移。
a4)中，预防和/或治疗放射性心肌纤维化具体表现为减轻放射引起的心肌纤维紊乱、心肌细胞空泡变性、炎症细胞浸润，降低胶原沉积和α-SMA水平。
所述产品可以为药物或试验试剂，所述试验试剂供基础研究使用，从而可用于构建相关细胞或动物模型，从而用于对放射性心肌纤维化等相关疾病的发病机制等进行基础研究。
其中，所述抑制ET-1表达和/或活性降低的物质包括但不限于针对ET-1RNA干扰分子或反义寡核苷酸、化合物、siRNA，实施慢病毒感染或基因敲除的物质以及针对ET-1多肽本身或其上下游分子的特异性抗体，如抗ET-1抗体。
在本发明的一个具体实施方式中，所述抑制ET-1表达和/或活性降低的物质为二十二碳六烯酸。
二十二碳六烯酸是一种ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3PUFA)，主要存在于深海鱼类中，对婴幼儿大脑发育至关重要。研究已经证明DHA对一些心血管疾病有益，包括血管炎症和动脉粥样硬化疾病等。然而，作为一类显著区别于传统心血管疾病的、发展机理独特的射线副反应性疾病，RIMF是否能够用DHA进行干预尚不可知。本发明通过研究首次ET-1是预防RIMF的有效靶点，而临床易获得且有益的DHA制剂可以通过靶向p38/ET-1有效抑制放射性成纤维细胞活化、减轻RIMF。
本发明的第二个方面，提供一种组合物，所述组合物其活性成分至少包括抑制ET-1表达和/或活性降低的物质。
本发明的又一具体实施方式中，所述抑制ET-1表达和/或活性降低的物质包括但不限于针对ET-1RNA干扰分子或反义寡核苷酸、化合物、siRNA，实施慢病毒感染或基因敲除的物质以及针对ET-1多肽本身或其上下游分子的特异性抗体，如抗ET-1抗体。
在本发明的一个具体实施方式中，所述抑制ET-1表达和/或活性降低的物质为二十二碳六烯酸。
本发明的第三个方面，提供上述组合物在如下任意一种或多种中的应用：
a1)抑制放射对心肌成纤维细胞的活化或制备抑制放射对心肌成纤维细胞活化的产品；
a2)抑制放射对心肌细胞p38的磷酸化或制备抑制放射对心肌细胞p38磷酸化的产品；
a3)抑制放射导致的心肌成纤维细胞中p-MEK,p-ERK,p-AKT和PI3K的上调表达或制备抑制放射导致的心肌成纤维细胞中p-MEK,p-ERK,p-AKT和PI3K的上调表达的产品；
a4)防治放射性心肌纤维化或制备防治放射性心肌纤维化的产品。
其中，
a1)中，所述放射对心肌成纤维细胞的活化包括放射促进心肌成纤维细胞的增殖和迁移。
a4)中，预防和/或治疗放射性心肌纤维化具体表现为减轻放射引起的心肌纤维紊乱、心肌细胞空泡变性、炎症细胞浸润，降低胶原沉积和α-SMA水平。
所述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可以供基础研究使用。
根据本发明，当所述产品为药物时，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。
所述药物非活性成分可以是药学上可接受的辅料或载体。所述载体可以为液体或固体。所述药物制剂可以为口服制剂和肠胃外给药制剂，可以为片剂、丸剂、胶囊或注射剂等等。
可使用本领域技术人员公知的技术将本发明的化合物配制成药物组合物或制剂。合适的药用辅料可以是本领域已知的，例如参见2005年版的药用辅料手册(原著第四版)。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩，人是优选的。
本发明的第四个方面，提供一种预防和/或治疗放射性心肌纤维化的方法，所述方法包括向受试者施用有效量上述抑制ET-1表达和/或活性降低的物质或组合物。
本发明所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。
本发明所述“有效量”是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物或人的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。
以下结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
实施例
方法
细胞培养
HL-1和H9C2心肌细胞购买于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉，中国)。HL-1细胞在含有10％胎牛血清的MEM中培养，H9C2细胞在含有10％胎牛血清的DMEM中培养。采用青霉素G和链霉素(100U/ml)双抗培养细胞。
心脏成纤维细胞从3-5日龄的C57BL/6J小鼠心脏中分离而得。简单地说，我们取出并将新生小鼠心脏切成碎片。然后，将心脏组织与胶原酶II一起在高压灭菌的锥形瓶中孵育，在4℃下过夜。用胰蛋白酶消化这些心脏组织成细胞悬液，收集在培养瓶中。在37℃下，成纤维细胞在2h后可粘附在培养瓶底部。心脏成纤维细胞在含10％胎牛血清的DMEM中培养，进行后续实验。
细胞转染
在HL-1细胞中使用小干扰RNA(siRNA)敲除ET-1基因(序列为siRNA-1:GCTGTTCCTGTTCTTCCTT,SEQ ID NO.1；siRNA-2:CCTGTTCCAAGTTGGGAAA,SEQ ID NO.2；siRNA-3:CCATCAGCAATAGCATCAA,SEQ ID NO.3)。使用Lipofectamine 3000(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)将siRNA或阴性对照转染至HL-1细胞。Western blotting和实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)验证敲除效率。最后选择siRNA-3进行后续实验。
试剂和抗体
DHA购自Cayman Chemical(Ann Arbor,USA)。一抗:抗p38购自中国武汉Proteintech；抗PDGFRA和抗ET-1购自Abcam；抗p-ERK1/2、抗ERK1/2、抗PI3K-110α和抗p-p38购自Cell Signaling Technology公司；抗p-MEK1/2、抗MEK1/2、抗p-AKT、抗AKT购自Affinit；抗β-actin购自ZSGB-Bio。山羊抗兔、山羊抗鼠二抗购自ZSGB-Bio。偶联山羊抗小鼠DyLight 594和偶联山羊抗兔Alexa Fluor 488抗体购自GeneCopoeia。
体外实验
HL-1和H9C2细胞接受6MV X射线照射。我们最初使用的剂量为3,6和9gy，最后选择6gy进行后续实验。增殖实验时分别用10、20、40、80、160μM DHA或溶剂刺激HL-1和H9C2细胞，以确定合适的浓度，并选择20μM DHA作为最终浓度进行后续实验。同样，我们也使用溶剂或5、10、20、40和80μM浓度的SB203580溶液(MCE，上海，中国)对HL-1和H9C2细胞进行了增殖实验检测，最后选择10μM浓度用于后续研究。收集HL-1细胞经各种处理后的上清，-80℃保存，后续用以刺激心脏成纤维细胞。
细胞增殖实验
我们接种3或5×103细胞于96孔板，重复3次，并进行不同处理，包括HL-1细胞上清液、ET-1、SB203580、DHA以及相应的对照处理。使用Cell Counting Kit-8试剂盒每天检测细胞的生长。用分光光度计测量450nm处的吸光度并绘制生长曲线。
细胞迁移试验
心脏成纤维细胞(3或5×104)经各种处理后悬浮于约200μl无血清DMEM中，并接种于24孔Transwell系统(Corning,New York,USA)的上室，下室为800μl含20％胎牛血清的DMEM。26h后，用甲醇固定，用0.1％的结晶紫溶液染色，在100×显微镜下计数迁移的细胞。
蛋白印迹检测(WB)
用含有PMSF(1mM)的RIPA缓冲液裂解细胞，然后用超声匀浆。用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。细胞裂解液与上样缓冲液混合，在95℃变性10分钟。蛋白样品在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后转移到PVDF膜。用5％牛奶封闭，然后一抗在4℃孵育过夜。在室温下与二抗孵育1h后，进行曝光。
免疫荧光(IF)
细胞用甲醇固定，0.2％Triton X-100处理，5％山羊血清阻断。然后用抗et-1(1:200)和抗-α-SMA(1:200)一抗孵育细胞，4℃孵育过夜。用二抗(1:500)在室温下孵育细胞1小时，用DAPI标记细胞核10分钟。最后用荧光显微镜(200×)对细胞拍照。
用免疫荧光技术在小鼠心脏组织切片上对血小板源性生长因子受体α(PDGFRA)和α-SMA进行共定位。石蜡包埋组织进行脱蜡和水化，然后抗原修复和封闭。兔抗-α-SMA(1:200)和鼠抗PDGFRA(1:200)在4℃孵育组织过夜。然后使用二抗(偶联山羊抗小鼠DyLight594和山羊抗兔Alexa Fluor 488的二抗)在室温下孵育组织1h。细胞核DAPI染色，荧光显微镜(400×)。
定量实时聚合酶链反应
使用RNAFast 2000从细胞中分离RNA，并检测其浓度和纯度。使用SureScriptFirst-Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录，并使用BlazeTaq SYBR Green qPCR mix2.0Kit进行qRT-PCR。所用引物序列为:ET-1-F，TCTGCCACCTGGACATCATCT,SEQ ID NO.4；ET-1-R，AACGCTTGGACCTGGAAGAAC,SEQ ID NO.5；GAPDH-F,gcaccgtcaaggctgagaac,SEQ IDNO.6,GAPDH-R,tggtgaagacgccagtgga,SEQ ID NO.7。
动物模型
8周龄C57BL/6J雌性小鼠购自Vital River。小鼠随机分为三组(每组n＝6):放疗组(IR)，放疗后每天灌胃一次DHA (IR+DHA)，对照组(CON)。IR和IR+DHA组小鼠进行累积剂量为16Gy的心脏放射(6MV x射线)。放射场为10.6×15.0mm，身体其余部分用3mm厚的铅板遮挡。CON组给予假放射。IR+DHA组每天灌胃1g/kg体重的DHA,CON和IR组灌胃等量的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)。在放疗后20周处死小鼠，取血清和心脏组织，保存、用于后续实验。
组织学分析
对小鼠心脏组织进行苏木精-伊红(H&E)染色，观察组织病理学变化。采用Siriusred染色法和Masson’s三色染色法评价心脏组织胶原沉积，ImageJ软件进行分析。
免疫组织化学(IHC)
将石蜡包埋的小鼠心脏组织切片为4mm片。组织脱蜡、水化、抗原修复，过氧化物酶阻断并封闭。相应一抗孵育组织4℃过夜,然后,将组织与HRP结合的二抗孵育。免疫组化染色采用DAB，细胞核染色采用苏木素染色。α-SMA的表达通过ImageJ软件进行评估，而p-p38和ET-1的表达则通过染色强度和阳性细胞比例进行评估。染色强度分为:0(无染色)、1(弱染色)、2(中染色)、3(强染色)。阳性细胞比例评定如下:0(<10％阳性细胞)，1(10％-30％阳性细胞)，2(30％-70％阳性细胞)，3(>70％阳性细胞)。最后的分数用两个分数的算乘积计算出。
酶联免疫吸附试验(ELISA)
收集小鼠血清、人血清、HL-1和H9C2细胞上清，-80℃保存，用ELISA试剂盒检测ET-1浓度。人血清取自食管癌患者，在其接受胸部放射治疗计划前(第一次放射治疗前1-3天)和后(最后一次放射治疗后1-3天)取得。
统计分析
采用GraphPad Prism 8.0进行统计分析。使用t检验进行两组之间的统计比较。当有三组或三组以上时，采用方差分析(正态分布数据)或Kruskal-Wallis方差分析(非正态数据)计算显著性差异，然后根据不同情况进行Dunnett’s或Bonferroni检验矫正。结果以均数±标准差(SD)表示。p值<0.05为有统计学意义。
结果
DHA可显著减轻放射诱导的小鼠心肌纤维化
C57BL/6J小鼠接受16Gy心脏放射，建立放射诱导心肌纤维化动物模型。小鼠在放疗后每天接受DHA或PBS治疗，直到放疗后20周(图1A)。为了评价心肌纤维化程度和DHA在预防放射性心肌纤维化中的作用，我们进行了病理染色和IHC(n＝6)。H&E染色显示CON组心肌纤维结构正常，排列有序，而IR组心肌纤维紊乱，心肌细胞空泡变性，炎症细胞浸润，但这些变化可被DHA逆转(图1B)。天狼星红染色(p<0.001；图1C)和Masson三色染色(p<0.001；图1D)显示，与CON小鼠相比，IR小鼠的胶原沉积显著增加，而DHA显著降低了IR增强的胶原沉积。α-SMA是肌成纤维细胞形成的公认特征性表现，通过免疫组化(IHC)评估α-SMA水平以确定成纤维细胞活性和纤维化程度。α-SMA蛋白水平在IR小鼠中显著上调，在IR+DHA小鼠中被有效逆转(p<0.001；图1E)。此外，我们对小鼠心脏组织中的α-SMA和PDGFRA(成纤维细胞标记物)进行联合染色，观察它们之间共定位(图1F)。我们验证了IR组的总成纤维细胞和高α-SMA表达的成纤维细胞数量均大于CON组，并且这种变化可以被DHA抵消(图1F)。体内实验结果表明DHA可抑制心脏成纤维细胞的增加和放射引起的活化，并有效地减弱RIMF。
放射上调心肌细胞ET-1水平，ET-1可激活心脏成纤维细胞
为了研究放射促进心肌纤维化的潜在机制，考虑到ET-1与纤维化的发展密切相关，我们聚焦于ET-1。由于心肌细胞ET-1旁分泌/自分泌信号增强在ET-1相关病理情况中发挥重要作用，我们检测了心肌细胞ET-1的改变。HL-1细胞中，ET-1的表达在放射后显著增加，特别是在6Gy或9Gy(图2A和2B)。H9C2细胞系中也有类似的趋势(图2C)。重要的是，HL-1(图2D)和H9C2(图2E)上清液中的ET-1浓度放射后明显增多，提示IR促进了ET-1的分泌。通过检测接受胸部放射治疗的食管癌患者血清中ET-1的浓度，我们发现大多数患者(11/13)在放射治疗后ET-1浓度明显升高(p<0.01；图2F)，ET-1上升幅度与心脏平均受照剂量呈正相关(p<0.05,R＝0.331；图2G)。
然后，我们用外源性ET-1处理C57BL/6J新生小鼠原代心脏成纤维细胞，评估ET-1的功能，发现ET-1在5和10nM浓度下促进了成纤维细胞的增殖能力(图2H)。ET-1处理后，成纤维细胞中α-SMA蛋白表达明显增加，提示肌成纤维细胞转化(图2I和2J)。与对照组相比，ET-1对成纤维细胞迁移能力有显著促进作用(p<0.001；图2k)。ET-1在5nM和10nM浓度下促进成纤维细胞生长、迁移和α-SMA表达的能力相似(图2H-2K)。这些发现揭示了放射可上调心肌细胞ET-1的表达和分泌，以及ET-1在心肌成纤维细胞活化中的重要作用。
心肌细胞来源的ET-1介导了放射对成纤维细胞的作用
为了验证放射是否通过上调心肌细胞ET-1水平来促进成纤维细胞活化，我们用siRNA转染，敲低HL-1细胞系ET-1的表达(蛋白水平见图3A,mRNA水平见图3B)。在比较了三种siRNA的敲低效果后，我们选择siRNA-3(Si-3)进行进一步的实验。用IR或IR+Si-3组中HL-1细胞的上清液刺激原代心脏成纤维细胞。
我们发现，IR组上清可以促进成纤维细胞的增殖，而ET-1敲除后，IR组上清的这种作用明显减弱，且这种减弱可以通过补充外源性ET-1来挽救(图3C)。在细胞迁移中也观察到类似的趋势(图3D)。此外，IR组上清刺激可增加成纤维细胞α-SMA的表达，而ET-1可有效恢复被Si-3转染显著削弱的IR组上清对成纤维细胞α-SMA表达的促进作用(图3E和3F)。此外，我们评估了放射对成纤维细胞表型的影响。即使在9gy剂量下，也未观察到成纤维细胞的增殖、细胞迁移或α-SMA表达的显著变化(图8A-C)。这些结果表明放射通过促进心肌细胞ET-1的分泌激活成纤维细胞。
DHA抑制放射引起的ET-1增加
鉴于ET-1在成纤维细胞活化中的重要作用，我们进一步研究了DHA对心肌细胞ET-1的调控作用。通过检测在不同浓度DHA处理下HL-1和H9C2细胞的生长，我们发现高浓度DHA对两种细胞的生长具有明显抑制，如80和160μM；而20μM的DHA无明显的增殖抑制作用，用于进行后续实验(图9A和9B)。照射后HL-1细胞ET-1表达显著上调，而DHA(20μM)处理可逆转这一现象(图4A和4B)。这一趋势在H9C2细胞中得到了验证(图4C)。我们还观察到照射后HL-1上清中ET-1的浓度显著增加，而DHA抵消了IR增强的HL-1的ET-1分泌(图4D)。H9C2细胞中也出现了类似的现象(图4E)。体内模型显示，放射后小鼠心脏ET-1水平增强，而DHA的应用降低了IR组小鼠心脏的ET-1水平(图4F)，这与小鼠血清ET-1浓度的变化趋势一致(图4G)。综上所述，这些结果表明DHA可抑制IR引起的心肌细胞ET-1表达和分泌增强。
DHA通过降低心肌细胞来源的ET-1抑制放射促进的成纤维细胞活化
如上所述，IR通过上调心肌细胞来源的ET-1促进成纤维细胞的活化，而DHA抑制IR诱导的ET-1增加。然后，我们进行挽救实验，探讨DHA对成纤维细胞活化的抑制作用。我们用IR或IR+DHA组HL-1细胞的上清液以及外源性ET-1刺激原代心脏成纤维细胞。CCK-8增殖实验显示，IR组上清显著促进成纤维细胞增殖，而IR+DHA组上清对成纤维细胞增殖无明显促进作用，但可通过添加外源性ET-1来挽救其促进作用(图5A)。IR组上清可增加α-SMA表达(图5B和5C)和成纤维细胞迁移(图5D)，而IR+DHA组上清则不具有该促进作用；补充ET-1可恢复IR+DHA组上清的促进作用(图5B-5D)。为排除DHA对心脏成纤维细胞的作用，我们直接用DHA(20μM和40μM)处理成纤维细胞并检测表型改变。我们发现DHA不影响心脏成纤维细胞的增殖、迁移和α-SMA的表达(图10A至10C)。这些结果证实DHA可以通过降低心肌细胞来源的ET-1来抑制放射增强的心脏成纤维细胞的活化。
p38信号通路介导放射调控的ET-1表达
我们进一步研究了放射调控ET-1表达的潜在途径。已有研究报道了结节性痒疹和ARDS大鼠模型中p38通路与ET-1表达的潜在关系。western blotting结果显示，在HL-1细胞和H9C2细胞中，放射在48、72和96h可促进p38磷酸化，但总p38水平不受影响(图6A和6B)。p38磷酸化抑制剂SB203580用于进一步的挽救实验。首先，我们通过HL-1(图11A)和H9C2(图11B)细胞的CCK-8检测来确定SB203580浓度，最后选择对两个细胞系都没有明显的增殖抑制作用的10μM浓度作为后续使用浓度。
在HL-1细胞和H9C2细胞中，放射上调了ET-1蛋白水平，而通过SB203580阻断p38磷酸化后，ET-1蛋白水平没有上调(图6C-6E)。ELISA检测结果显示，放射后上清液中ET-1的浓度明显升高，而该趋势可以被SB203580显著逆转(图6F)。H9C2上清中ET-1的变化与HL-1相似(图6G)。这些结果表明，放射通过激活p38信号促进ET-1的表达
为了确定DHA是否会影响IR调节的p38信号激活，我们检测了DHA处理后心肌细胞中的p-p38水平。从结果可以看出，在HL-1细胞(图6H)和H9C2细胞(图6I)中，放射上调了p-p38的水平，而DHA显著降低了IR诱导的p-p38的升高(t-p38的水平没有改变)。对小鼠心脏组织的免疫组化分析显示，IR组p-p38水平最高，而IR+DHA组中p-p38明显降低，表明DHA可以显著降低放射引起的p-p38水平升高(图6J)。结果表明，放射可通过增加心肌细胞p38磷酸化来增强ET-1的表达，而DHA可阻断该现象。
MEK-ERK和PI3K-AKT通路是心脏成纤维细胞中ET-1的下游效应通路
为了确定ET-1改变心脏成纤维细胞表型的下游效应通路，我们对成纤维细胞进行了进一步的通路分析。我们使用上述不同的HL-1细胞上清液和外源性ET-1来处理成纤维细胞。我们观察到ET-1处理的心肌成纤维细胞中，p-MEK,p-ERK,p-AKT和PI3K水平均上调，而MEK、ERK和AKT总表达水平未发生变化(图7A)。HL-1细胞的IR上清对成纤维细胞中MEK-ERK和PI3K-AKT通路的影响与ET-1刺激相同(图7B)。相比与IR组上清处理的成纤维细胞,敲除ET-1后的IR组上清处理的成纤维细胞中，p-MEK,p-ERK,p-AKT和PI3K水平的上调趋势明显减弱,而该现象可被外源性ET-1逆转(图7B),确认放射引起的下游通路变化是依赖ET-1的。此外，IR上清液组成纤维细胞中p-MEK、p-ERK、p-AKT和PI3K的升高水平显著强于IR+DHA上清液组，而补充外源性ET-1可挽救该趋势(图7C)。结果表明，MEK-ERK和PI3K-AKT是ET-1在心脏成纤维细胞中的下游效应通路，介导了IR/ET-1对成纤维细胞激活的促进作用。
RIMF是胸部放射治疗引起的严重射线性延迟副反应，可导致一系列异常症状的出现，不仅影响患者的生活质量，也限制了放疗疗效。然而，RIMF作为区别于传统心血管疾病的单独一类放射性心脏损伤病症，其发病机制、发展过程与其他疾病导致的心肌纤维化相差甚远且尚不明确，临床上也没有可用的有效防治药物。DHA虽有报道表明其对于一些心血管疾病有积极作用，但由于RIMF的独特性和发病机理的不确定性，DHA能否用于干预RIMF不得而知，亟需实验探索。在本研究中，心脏照射明显诱导小鼠心肌纤维化，而DHA治疗可逆转放射性心肌纤维化。在体外实验中，IR通过增强p38磷酸化上调心肌细胞ET-1的表达，进一步促进心脏成纤维细胞的增殖、迁移和肌成纤维细胞转化，而DHA通过阻断p38/ET-1通路减轻了成纤维细胞上述表型改变。结果表明，MEK-ERK和PI3K-AKT信号通路是ET-1活化成纤维细胞的下游效应通路。因此，研究验证了IR/p38/ET-1调控轴在RIMF中的作用，且DHA对RIMF具有显著保护作用。
RIMF是射线引起的副反应，是放射性炎症以及多细胞相互作用的结果，包括急性期变化和慢性期变化。在放射后的几分钟内，射线破坏了多种细胞DNA以及其他大分子且具有一定随机性，细胞出现难以精准预测的复杂损伤，导致多种生长因子和粘附分子出现改变、激活急性放射性炎症，最终造成多种促纤维化因子的释放。炎症因子/趋化因子、内皮素-1和活性氧(ROS)等多种因素均参与放射性心肌纤维化的过程。转基因小鼠模型显示过表达ET-1可通过上调胶原纤维和层粘连蛋白的表达与心肌纤维化密切相关。考虑到心肌纤维化中ET-1的作用，有必要在RIMF中检测IR对ET-1表达的影响以及ET-1对心肌成纤维细胞的作用。在本研究中，C57小鼠被用于构建RIMF模型。IR组小鼠心脏的胶原沉积和α-SMA表达明显升高，提示心肌纤维化。放射显著上调小鼠心脏ET-1水平。胸腔放疗后食管癌患者血清ET-1水平明显升高，且ET-1升高与平均心脏受照剂量呈正相关。而以心肌细胞为中心的ET-1旁分泌/自分泌活性增强是ET-1相关病理情况中重要机制。考虑到心肌细胞在疾病条件下ET-1生成和分泌方面的重要作用，我们利用两种心肌细胞细胞系检测其上清中ET-1的表达和浓度，发现放射后ET-1的表达和分泌呈上升趋势。这些结果表明，IR可以通过心肌细胞依赖的方式上调ET-1的水平。
ET-1在RIMF中的调节功能目前尚不清楚，而成纤维细胞则与RIMF密切相关。肌成纤维细胞高表达α-SMA，是一种形态和代谢特征独特的成纤维细胞，具有很强的合成细胞外基质蛋白的能力，加速纤维化过程。作为心肌纤维化的主要因素，肌成纤维细胞表现出增强的增殖、迁移和过量的ECM成分产生。ET-1可诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞转化。在本研究中，我们使用外源性ET-1刺激心脏成纤维细胞，发现ET-1显著激活心脏成纤维细胞，包括增强增殖和迁移，上调α-SMA的表达。考虑到ET-1主要以旁分泌的方式发挥作用，我们进一步用心肌细胞上清刺激成纤维细胞，观察到在心肌细胞中敲除ET-1可以逆转放射组心肌细胞上清引起的成纤维细胞活化。这些结果表明，放射诱导心肌细胞分泌的ET-1增加可以激活成纤维细胞，进而参与RIMF的发展。
DHA作为鱼油的主要活性成分之一，被认为是一些心血管疾病的保护剂，包括血栓形成、血管炎症、动脉粥样硬化和心律失常。然而，作为一类单独的疾病，放射性心脏损伤发生发展过程显著不同于心血管疾病及其他纤维化，因此DHA是否能缓解放射性心肌纤维化不得而知，需要实验验证。在这里，我们构建了RIMF小鼠模型，并从放射后第一天到20周给予DHA处理。结果证明，DHA显著减轻放射引起的心肌纤维紊乱、心肌细胞空泡变性、炎症细胞浸润，降低胶原沉积和α-SMA水平，从而有效缓解放射性纤维化过程，抑制RIMF的发展。在我们的小鼠模型中，DHA也可以逆转IR上调的ET-1水平。此外，DHA可以抑制放射诱导的心肌细胞系(包括H9C2和HL-1)ET-1水平的升高。因此，我们首次揭示了DHA在体内和体外均能消除放射诱导的ET-1升高。据我们所知，还没有研究以ET-1依赖性的方式探讨DHA在预防RIMF中的作用。我们的拯救实验表明，IR处理的心肌细胞上清能显著激活成纤维细胞，而IR+DHA处理的心肌细胞上清则不能，且ET-1的补充恢复了IR+DHA处理的心肌细胞上清的成纤维细胞激活功能。此外，在这项研究中，DHA对心脏成纤维细胞表型没有直接影响。这一发现提示DHA通过降低心肌细胞ET-1水平来抑制放射性成纤维细胞活化、发挥预防RIMF的作用。
放射如何上调心肌细胞ET-1的表达？有研究表明，在肺癌细胞中，通过抑制p38MAPK通路，Nur77可下调ET-1的表达。此外，Wong L-S等证实IL-17A可以通过激活结节性痒疹中的p38通路来调节ET-1的产生。这一证据提示p38和ET-1之间的潜在联系。我们发现放射可以显著提高p-p38蛋白水平，而t-p38没有明显变化。SB203580(一种p38磷酸化抑制剂)处理明显降低了放射诱导的ET-1的表达增强，提示IR通过促进p38磷酸化来增加ET-1的表达。由研究提示DHA可能对p38 MAPK信号通路具有调控作用。因此，DHA可能通过抑制p38MAPK磷酸化来抑制ET-1的表达。由此我们进行了验证，在心肌细胞系和小鼠模型中观察到DHA可以显著降低IR诱导的p38磷酸化上调。这一发现可以解释DHA对IR诱导的ET-1增加的抑制作用。
由于ET-1在放射性心肌纤维化中起着重要作用，ET-1活化心脏成纤维细胞的下游机制有待进一步研究。MEK-ERK和PI3K-AKT是在细胞生长/运动和发育过程中参与各种生物过程的经典和强大的通路。研究证实抑制ERK可抑制心脏成纤维细胞增殖和α-SMA表达，而ERK的持续激活是成纤维细胞G1/S转变所必需的。心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化可以通过PI3K/AKT信号通路增强。我们的研究结果表明ET-1可以激活心肌成纤维细胞的MEK-ERK和PI3K-AKT通路，而PI3K-AKT和MEK-ERK通路是成纤维细胞响应IR/p38/ET-1信号轴的内源性靶点。
综上，我们的研究结果表明，放射通过增强心肌细胞中p38信号来上调ET-1表达/分泌，从而促进心脏成纤维细胞激活，导致放射性心肌纤维化；首次揭示了RIMF中IR/p38/ET-1调控轴线，为RIMF发病机制提供新的视野(图7D)。重要的是，我们首次发现ET-1是预防RIMF的有效靶点，而临床易获得且有益的DHA制剂可以通过靶向p38/ET-1有效抑制放射性成纤维细胞活化、减轻RIMF。我们通过实验数据创新性的证实DHA可用于RIMF的防治，为放射性心脏损伤这一类独特疾病的防治提供了实验证据和新思路，为解决放疗过程中产生的放射性心脏副反应难题提供了潜在的干预方案。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.ET-1表达和/或活性降低的物质在如下任意一种或多种中的应用：
a1)抑制放射对心肌成纤维细胞的活化或制备抑制放射对心肌成纤维细胞活化的产品；
a2)抑制放射对心肌细胞p38的磷酸化或制备抑制放射对心肌细胞p38磷酸化的产品；
a3)抑制放射导致的心肌成纤维细胞中p-MEK,p-ERK,p-AKT和PI3K的上调表达或制备抑制放射导致的心肌成纤维细胞中p-MEK,p-ERK,p-AKT和PI3K的上调表达的产品；
a4)防治放射性心肌纤维化或制备防治放射性心肌纤维化的产品。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，
a1)中，所述放射对心肌成纤维细胞的活化包括放射促进心肌成纤维细胞的增殖和迁移；
a4)中，预防和/或治疗放射性心肌纤维化具体表现为减轻放射引起的心肌纤维紊乱、心肌细胞空泡变性、炎症细胞浸润，降低胶原沉积和α-SMA水平。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，
所述产品为药物或试验试剂。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，
所述抑制ET-1表达和/或活性降低的物质包括针对ET-1RNA干扰分子或反义寡核苷酸、化合物、siRNA，实施慢病毒感染或基因敲除的物质以及针对ET-1多肽本身或其上下游分子的特异性抗体；
优选的，所述抑制ET-1表达和/或活性降低的物质为二十二碳六烯酸。
5.一种组合物，其特征在于，所述组合物其活性成分至少包括抑制ET-1表达和/或活性降低的物质。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，
所述抑制ET-1表达和/或活性降低的物质包括针对ET-1RNA干扰分子或反义寡核苷酸、化合物、siRNA，实施慢病毒感染或基因敲除的物质以及针对ET-1多肽本身或其上下游分子的特异性抗体；
优选的，所述抑制ET-1表达和/或活性降低的物质为二十二碳六烯酸。
7.权利要求5或6所述组合物在如下任意一种或多种中的应用：
a1)制备抑制放射对心肌成纤维细胞活化的产品；
a2)制备抑制放射对心肌细胞p38磷酸化的产品；
a3)制备抑制放射导致的心肌成纤维细胞中p-MEK,p-ERK,p-AKT和PI3K的上调表达的产品；
a4)制备防治放射性心肌纤维化的产品。
8.如权利要求7所述应用，其特征在于，
a1)中，所述放射对心肌成纤维细胞的活化包括放射促进心肌成纤维细胞的增殖和迁移；
a4)中，预防和/或治疗放射性心肌纤维化具体表现为减轻放射引起的心肌纤维紊乱、心肌细胞空泡变性、炎症细胞浸润，降低胶原沉积和α-SMA水平。
9.如权利要求7所述应用，其特征在于，所述产品为药物或者实验试剂。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于，当所述产品为药物时，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210870641.7A CN115845056A (zh) | 2022-07-22 | 2022-07-22 | DHA通过抑制心肌细胞中p38/ET-1通路在防治放射性心肌纤维化中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210870641.7A CN115845056A (zh) | 2022-07-22 | 2022-07-22 | DHA通过抑制心肌细胞中p38/ET-1通路在防治放射性心肌纤维化中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115845056A true CN115845056A (zh) | 2023-03-28 |
Family
ID=85660353
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210870641.7A Pending CN115845056A (zh) | 2022-07-22 | 2022-07-22 | DHA通过抑制心肌细胞中p38/ET-1通路在防治放射性心肌纤维化中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115845056A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103200939A (zh) * | 2010-09-03 | 2013-07-10 | 弗雷泽纽斯卡比德国有限公司 | 用于在化学疗法开始之前给予的包含dha和epa的组合的组合物 |
| WO2013116194A2 (en) * | 2012-01-30 | 2013-08-08 | O'connell Timothy D | Method of treating or limiting development of heart failure with preserved ejection fraction and tissue fibrosis |
| US20190054126A1 (en) * | 2017-06-13 | 2019-02-21 | Houn Simon Hsia | Compositions and methods for enhancing cancer radiotherapy |
-
2022
- 2022-07-22 CN CN202210870641.7A patent/CN115845056A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103200939A (zh) * | 2010-09-03 | 2013-07-10 | 弗雷泽纽斯卡比德国有限公司 | 用于在化学疗法开始之前给予的包含dha和epa的组合的组合物 |
| WO2013116194A2 (en) * | 2012-01-30 | 2013-08-08 | O'connell Timothy D | Method of treating or limiting development of heart failure with preserved ejection fraction and tissue fibrosis |
| US20190054126A1 (en) * | 2017-06-13 | 2019-02-21 | Houn Simon Hsia | Compositions and methods for enhancing cancer radiotherapy |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YUCHEN LIU MD等: "Docosahexaenoic Acid Attenuates Radiation-Induced Myocardial Fibrosis by Inhibiting the p38/ET-1 Pathway in Cardiomyocytes", INT J RADIAT ONCOL BIOL PHYS, vol. 115, no. 5, pages 1229 - 1243 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Liu et al. | Hesperetin suppresses RANKL‐induced osteoclastogenesis and ameliorates lipopolysaccharide‐induced bone loss | |
| Liu et al. | Vascular peroxidase 1 is a novel regulator of cardiac fibrosis after myocardial infarction | |
| JP5033624B2 (ja) | ＧＳＫ−３βの変更および増殖性疾患の治療方法 | |
| Jiang et al. | IL-6/STAT3 signaling promotes cardiac dysfunction by upregulating FUNDC1-dependent mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes formation in sepsis mice | |
| WO2017067454A1 (zh) | Lsd1抑制剂用于防治三阴性乳腺癌的医药用途和药物产品 | |
| Zhang et al. | Microglia-derived extracellular vesicles carrying miR-711 alleviate neurodegeneration in a murine Alzheimer’s disease model by binding to Itpkb | |
| Wang et al. | HSP27 regulates TGF-β mediated lung fibroblast differentiation through the Smad3 and ERK pathways | |
| Yang et al. | FOXM1 accelerates wound healing in diabetic foot ulcer by inducing M2 macrophage polarization through a mechanism involving SEMA3C/NRP2/Hedgehog signaling | |
| Lyu et al. | Exosomes derived from M2 macrophages induce angiogenesis to promote wound healing | |
| Wu et al. | Recombinant adiponectin peptide promotes neuronal survival after intracerebral haemorrhage by suppressing mitochondrial and ATF4‐CHOP apoptosis pathways in diabetic mice via Smad3 signalling inhibition | |
| Yao et al. | Kangfuxin Oral Liquid Attenuates Bleomycin‐Induced Pulmonary Fibrosis via the TGF‐β1/Smad Pathway | |
| Zhou et al. | Magnolol prevents ossified tendinopathy by inhibiting PGE2-induced osteogenic differentiation of TDSCs | |
| Liu et al. | MiR-let-7a/f-CCR7 signaling is involved in the anti-metastatic effects of an herbal formula comprising Sophorae Flos and Lonicerae Japonicae Flos in melanoma | |
| Liu et al. | Polydatin inhibits mitochondrial damage and mitochondrial ROS by promoting PINK1‐Parkin‐mediated mitophagy in allergic rhinitis | |
| Wang et al. | Inhibition of CACNA1H can alleviate endoplasmic reticulum stress and reduce myocardial cell apoptosis caused by myocardial infarction. | |
| US11819535B2 (en) | Composition and methods for regulating extracellular matrix accumulation | |
| Liu et al. | Ferric Ion Induction of Triggering Receptor Expressed in Myeloid Cells‐2 Expression and PI3K/Akt Signaling Pathway in Preosteoclast Cells to Promote Osteoclast Differentiation | |
| EP3445779A1 (en) | Methods and pharmaceutical composition for the treatment of inflammatory skin diseases associated with desmoglein-1 deficiency | |
| CN115845056A (zh) | DHA通过抑制心肌细胞中p38/ET-1通路在防治放射性心肌纤维化中的应用 | |
| WO2022095976A1 (zh) | 小分子sr9009在抗衰老以及减轻衰老引起的慢性炎症中的用途 | |
| CN113398246B (zh) | eIF3I-PDL1-IRS4轴在制备难治性溃疡药物中的应用 | |
| Chen et al. | Inhibiting the Cytosolic Phospholipase A2–Arachidonic Acid Pathway With Arachidonyl Trifluoromethyl Ketone Attenuates Radiation-Induced Lung Fibrosis | |
| Wang et al. | Preventive effect of LCZ696 on hypoxic pulmonary hypertension in rats via regulating the PI3K/AKT signaling pathway | |
| WO2021013911A1 (en) | Inhibitors of the sting pathway for the treatment of hidradenitis suppurativa | |
| Huang et al. | STRAP reduces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in cardiomyocytes and attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury by activating PI3K/PDK1/Akt signaling pathway. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |