CN115838716A - 一种固定化酶膜、制备方法以及在制备稀少糖中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种固定化酶膜、制备方法以及在制备稀少糖中的应用，属于酶催化技术领域。本发明通过调控膜表面电荷后利用RDPE与TMC交联，制备了固定化酶膜，正电膜更有利于负电RDPE的负载，该固定化酶膜极大地提高了酶的稳定性并且实现了酶的重复利用和回收，在正渗透模式下测试了游离酶膜与固定化酶膜，固定化酶膜能够实现产物的原位分离，固定化酶膜能够打破反应平衡的限制。
Description
技术领域
本发明涉及一种固定化酶膜、制备方法以及在制备稀少糖中的应用，属于酶催化技术领域。
背景技术
由于高脂肪和高糖食物的摄入，高血糖、高血脂、糖尿病等疾病的发病率在世界范围内持续增长。稀少糖因其热量低且具有独特的生物学功能引起了研究者们的广泛关注。根据国际稀有糖协会(ISRS)的定义，稀有糖是自然界中极少量存在的单糖及其衍生物。如D-塔格糖、D-阿洛酮糖、D-阿洛糖等，虽然在自然界中很少存在，但因具备降血糖血脂、抗炎症、提高免疫力等生物学功能，其在食品与制药等领域有着广阔的应用前景[1]。其中，D-阿洛酮糖在2011年被美国食品局认证为达到美国食品添加剂指标的物质，并且可以通过差向异构酶可逆转化廉价的D-果糖制得。
酶催化技术因具有反应条件温和、特异性强、绿色环保、效率高等优势，成为了当今制备稀少糖的主流方法。虽然如此，酶一些自身固有的缺点如易因结构变性而丧失活性，溶于水而导致难以重复利用和自聚集等限制了其进一步应用[2]。除此之外，一般都是通过酶催化单糖间的可逆转化制备稀少糖，可逆反应以及反应物与产物间的分子尺寸差异小进一步加大了其困难性。
[1]Bilal M,Iqbal H M N,Hu H,et al.Metabolic engineering pathways forrare sugars biosynthesis,physiological functionalities,and applications—areview[J].Critical Reviews in Food Science&Nutrition,2017.
[2]Liu C,Saeki D,Matsuyama H.Anovel strategy to immobilize enzymes onmicroporous membranes via dicarboxylic acid halides[J].Rsc Advances,2017,7(76):48199-48207.
发明内容
本发明的目的是：解决现有技术中酶法合成稀少糖的过程中存在着反应效率低、酶的可回收率低的问题。本发明提出了一种酶膜反应器，将RDPE固定于膜表面，够实现产物原位分离从而促进反应朝正向进行突破反应平衡的限制等优势。
技术方案是：
一种固定化酶膜，包括基膜，其表面涂覆有带有阳离子聚合物层，阳离子聚合物层的表面负载有稀少糖合成酶与酰氯类单体聚合后得到的固定化酶层。
所述的基膜为多孔聚合物膜，材质为聚酰亚胺。
所述的阳离子聚合物层为聚乙烯亚胺层。
所述的稀少糖合成酶是D-阿洛酮糖3差向异构酶(RDPE)。
所述的酰氯类单体是均苯三甲酰氯。
上述的固定化酶膜的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，在基膜的表面涂覆含有阳离子聚合物的溶液，使阳离子聚合物在基膜表面交联；
步骤2，将步骤1中得到的膜与含有稀少糖合成酶的溶液接触，使稀少糖合成酶在膜的表面负载；
步骤3，将步骤2中得到的膜与含有酰氯类单体的溶液接触，使稀少糖合成酶与酰氯类单体交联后固定。
所述的步骤1中，阳离子聚合物的溶液为浓度0.5-5wt％的聚乙烯亚胺的醇溶液，交联时间5-30h。
所述的步骤2中，含有稀少糖合成酶的溶液是含有0.1-5mg/mL D-阿洛酮糖3差向异构酶 (RDPE)的水溶液。
所述的步骤3中，含有酰氯类单体的溶液是含有0.05-0.5wt％的均苯三甲酰氯的有机溶液，且接触时间5-15min。
一种通过固定化酶膜制备稀少糖的方法，包括如下步骤：
采用上述的固定化酶膜，将固定化酶层与D-果糖溶液接触，进行反应；
通过正渗透方法，收集渗透侧获得的稀少糖。
反应过程的温度范围40-80℃。
正渗透过程中，在固定化酶膜的渗透侧使用的汲取液是PBS溶液。
有益效果
本发明首先通过调控膜表面电荷使其与D-阿洛酮糖3-差向异构酶(RDPE)之间形成静电作用，以此增大RDPE的负载密度,随后利用TMC进一步交联固定酶以提高固定化酶膜的稳定性。本文利用静电吸附-交联的方法将RDPE固定于膜表面，实验结果表明，利用正电聚电解质(如聚乙烯亚胺(PEI))调控膜表面电荷能够增大酶的负载密度。
该固定化酶膜实现了酶的重复使用并有着较高的稳定性。在利用正渗透反应过程中，通过与游离酶膜反应器对比，突出了固定化酶膜能够实现产物原位分离从而促进反应朝正向进行突破反应平衡的限制等优势。
以膜为固定化酶载体最大的优势在于能够将反应于分离一体化，有望实现产物原位分离，从而促进热力学受限反应的平衡向产物侧转移。反应正向进行，减缓产物抑制和可逆反应的发生。
附图说明
图1：制备固定化酶膜示意图
图2：(a)PI和PI-PDA膜的照片，(b)PI和PI-PEI膜的FTIR光谱
图3：(a)不同改性聚酰亚胺(PI)基膜固定化RDPE的活性，(b)不同改性后PI基膜的Zeta电位
图4：(a)PI@RDPE膜的荧光图像，(b)PI-PDA@RDPE膜的荧光图像，(c)PI-PEI@RDPE膜的荧光图像，(d)PI@RDPE的RDPE负载密度，PI-PDA@RDPE和PI-PEI@RDPE膜
图5：(a)PI@RDPE膜的SEM显微照片，(b)PI-PDA@RDPE膜的SEM显微照片， (c)PI-PEI@RDPE膜的SEM显微照片
图6：(a)RDPE和TMC反应示意图，(b)Pristine、PI-PEI、PI-PEI@RDPR、PI-PEI@RDPE&TMC 膜的FTIR光谱
图7：(a)PI-PEI@RDPE&TMC膜在超声前的荧光图像，(b)PI-PEI@RDPE&TMC膜在超声后的荧光图像，(c)PI-PEI@RDPE膜在超声前的荧光图像，(d)荧光图像PI-PEI@RDPE膜超声后的荧光强度，(e)PI-PEI@RDPE和PI-PEI@RDPE&TMC膜超声前后的平均荧光强度，(f)超声前后PI-PEI@RDPE和PI-PEI@的相对活性RDPE&TMC膜
图8：TMC浓度对PI-PEI@RDPE&TMC膜相对活性的影响
图9：(a)游离和固定化RDPE的活性随时间变化趋势，(b)PI-PEI@RDPE&TMC在pH8.0和 60℃下用于D-果糖转化的可重复使用性，(c)PI-PEI@RDPE&TMC的储存稳定性
图10：(a)反应分离耦合过程示意图，(b)渗透侧固定化酶膜反应器和游离酶膜反应器中D-阿洛酮糖的量，(c)渗透侧和进料侧D-阿洛酮糖的分布,(d)固定化酶和游离酶的转化率比较
具体实施方式
材料
聚酰亚胺(PI)、聚乙二醇400(PEG 400)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、聚乙烯亚胺70000(PEI 70000Da)、D-果糖、D-阿洛酮糖、K2HPO4、KH2PO4、盐酸多巴胺、均苯三甲酰氯(TMC)、正己烷等均通过购买后无需进一步提纯，可直接使用。D-阿洛酮糖3差向异构酶(RDPE) 由天津生工所提供。
基膜的制备和修饰
本专利中所采用的聚酰亚胺基膜是通过现有技术中的相转化方法获得。主要的步骤是：配置PI基膜的铸膜液，在静置除泡后，在光滑的玻璃板上刮膜，然后浸入纯水凝固浴中通过相转化制膜。
将PI基膜浸泡在纯水中过夜以除去多余的溶剂，然后将其浸入2wt％PEI溶液(以异丙醇为溶剂)中交联16h。而后用纯水清洗并储存于纯水中，以备后续的酶固定化(将PEI交联膜命名为PI-PEI)。
在1bar压力辅助下在PI基膜表面涂覆多巴胺(2g/L,pH8.5的磷酸缓冲液)，该膜命名为 PI-PDA。
酶的固定
将PI-PEI交联膜浸泡在RDPE酶液中(约0.5mg/mL)24h后利用pH7.5的磷酸缓冲液清洗三次后得到名为PI-PEI@RDPE的膜，将浸泡后的酶液以及清洗液收集起来以用于后续的酶浓度测试。用正己烷配置0.1wt％的TMC，将PI-PEI@RDPE膜放置一段时间以去除膜表面多余水分，随后将其浸入TMC溶液中反应10min(记作PI-PEI@RDPE&TMC)。 PI-PDA@RDPE&TMC膜依照上述步骤制得。后将酶膜放置在缓冲溶液中(pH＝7.5)于4℃下储存用于后续实验与表征。
膜表征方法
通过场发射扫描电子显微镜(FESEM,S4800,Hitachi,Japan)观察改性膜以及固定化酶膜的表面和断面形貌。使用Zeta电位(SurPASSTM3,AntonPaar,Austria)分析基膜以及改性膜表面电荷随pH的变化情况。用傅里叶变换衰减全反射红外光谱仪(ATR-FTIR,ThermoScientific,Nicolet iS50)分析基膜的交联以及RDPE与TMC间的缩聚反应。利用异硫氰光荧光素(FTIC)将酶染色后，使用荧光显微镜观察酶在膜表面的分布情况。染色过程如下：以二甲基亚砜(DMSO)为溶剂配置1mg/mL的FTIC溶液。取0.15mL的FTIC溶液逐滴加入 30mLRDPE溶液中(5mg/mL)，在室温下搅拌1h进行染色，随后通过添加2mL NH4Cl(50 mM)使反应停止。最终，未反应的FTIC通过在20mM PBS缓冲液中透析48h后去除。
测定酶的负载量的测试方法
利用质量平衡法计算膜上固定化酶的量，利用Bradeford法，使用分光光度计(UV-Vis) 在595nm处测定酶浓度。质量平衡方程式如下：
其中，Qe是单位面积的膜上负载的RDPE的量(mg/cm2),Co和Ce分别为酶负载前后溶液中的酶浓度(mg/mL)，Cw为PBS清洗液中酶浓度(mg/mL)，Vo和Vw分别为负载酶所用的体积以及清洗液的体积(mL),A为膜面积
游离和固定化条件下RDPE活性测试方法
取80μg游离RDPE于80mL D-果糖溶液(pH＝8)中，在60℃下反应,在不同时间取样(10min 20min 30min 1h 2h 3h 4h)后通过煮沸5min以终止反应。随后，将反应液稀释 10倍后利用HPLC测试D-阿洛酮糖的含量以此来计算游离酶活性。其中，一个单位酶活性定义为在上述条件下每分钟产生1μmol D-阿洛酮糖所需要的酶量。固定化RDPE膜的活性也通过上述步骤来测试其活性。根据Michaelis-Menten方程和Lineweaver-Burk图计算游离酶与固定化酶的动力学参数(Km和Vmax)
其中，V和Vmax分别表示酶催化反应的初始速率和最大反应速率，Km为Michaelis常数， S表示反应物D-果糖浓度，动力学参数在60℃，pH 8.0下测得。
本实验色谱条件：Agilent 1260型高效液相色谱仪,检测器为ELSD,色谱柱为Waters Sugar Park1(6.5mm×300mm)，测试条件：流动相为超纯水，流速0.48mL min-1，进样量10μL, 柱温80℃，ELSD条件：Evaporator Temperature 80℃,Nebulizer Temperature80℃,PMT Gain 5。 D-果糖与D-阿洛酮糖的浓度通过外标法做标准曲线测得。
固定化RDPE膜的稳定性测试方法
为了测试固定化RDPE膜的重复使用性能，将酶膜置于2.5中叙述的反应条件下反应 10min后取出并将其存于4℃下pH7.5的磷酸缓冲液中以供下一次使用。取反应后溶液稀释 10倍后通过HPLC测试固定化RDPE活性并且以第一次测试活性为100％。此实验一式三份，但最终只提供实验平均值。为了检测超声清洗是否会破坏RDPE与TMC的界面聚合层，在第一次测试后将酶膜进行30min超声清洗，随后进行第二次测试。
固定化酶膜的原位分离测试方法
将固定化RDPE膜放置在H型渗透装置中，进料侧为40mL D-果糖溶液(20mM PBS,pH8)，渗透侧为20Mm PBS溶液。将渗透装置加热到60℃反应，在不同时间取0.2mL两侧溶液稀释后利用HPLC测试D-果糖与D-阿洛酮糖的浓度。用以下公式计算D-果糖转化率：
其中,K是D-果糖的转化率(％)，Co和Cp分别是初始和反应后D-果糖浓度(mg/mL)。不同修饰膜的形貌以及固定化RDPE的分布
用吸附手段将RDPE负载于膜表面，为了研究膜表面电荷情况对RDPE负载的影响，利用不同的单体对PI基膜进行修饰以调控膜表面电荷(图1)。首先利用多巴胺(PDA)在微碱性条件下氧化自聚后具有黏附性，在压力辅助下在PI基膜表面涂覆聚多巴胺，在涂覆完成后，膜表面明显附着一层黑色的聚多巴胺(图2的(a))，除此之外，通过SEM断面图也能明显看到在基膜表面堆积了一层聚多巴胺颗粒。使用聚乙烯亚胺(PEI)对PI基膜进行交联。从图2的(b)的红外图可以看到原始PI基膜经过PEI交联后，交联膜在1716cm-1和1361cm-1处酰亚胺的C＝O和C-N键特征峰明显减弱，并且在1651cm-1和1542cm-1处出现了酰胺C＝O 和C-N键的振动峰。以上说明了PEI与基膜PI的成功交联。
对原始膜以及两种修饰膜进行Zeta电位表征，如图3的(b)所示，原本未修饰的PI基膜在pH 3-9的范围内荷负电，在涂覆PDA后，其负电性稍有减弱。而使用阳离子聚电解质PEI交联之后，交联膜的正电性显著提高，并且在pH 7-8的范围内呈现正电，这是因为膜表面NH2质子化导致其荷正电，并且随着pH减小，质子化程度增大从而正电性就越高。这恰好能与带负电的RDPE产生静电吸附使其更容易负载于膜表面。三种不同表面电荷的膜在固定RDPE后对其进行固定化酶膜测试，并以酶活最大为100％，如图3的(a)所示，PEI交联后的PI-PEI膜国定酶后的酶活性远高于其他两种负电膜。为了探究其高活性的原因，随后，我们对PI@RDPE、PI-PDA@RDPE、PI-PEI@RDPE进行了SEM表征以及将其利用异硫氰光荧光素(FTIC)染色后利用荧光显微镜表征。
如图4的(a,b,c)所示，酶经过FTIC染色后，通过荧光显微镜观察呈现绿色荧光。然而PI@RDPE与PI-PDA@RDPE膜上荧光强度明显小于PI-PEI@RDPE膜，这可能是因为PI-PEI@RDPE膜由于与RDPE之间的静电吸附导致其负载密度高，这一结论与图3的(a) 的活性测试相吻合。同时通过定量测定膜表面酶的负载密度也印证了该结论，图4的(d)为三种膜表面的酶负载密度，PI-PEI膜表面的酶负载密度为0.18mg/cm2,远大于PI膜和PI-PDA 膜0.07mg/cm2和0.05mg/cm2的酶负载密度。因此选取PI-PEI膜为后续固定化RDPE膜的载体。
TMC与酶交联对固定化酶膜稳定性的影响
为了增强固定化酶膜的稳定性，我们选用TMC与RDPE交联，使其在膜表面形成一层聚酰胺活性反应层(如图6的(a)所示)。在图6的(b)的红外光谱中，在利用TMC交联后， PI-PEI@RDPE&TMC膜NH2的特征峰比PI-PEI@RDPE膜小，这是因为酶和PEI中的NH2与TMC反应形成酰胺导致了特征峰的减小。一般通过吸附固定酶时，酶活降低的主要原因时是泄漏。为了验证TMC交联后固定化酶稳定性的增强，我们将膜置于超声环境下超声30 min，随后比较超声前后酶膜的催化活性以及膜表面酶的固定情况。如图7的(f)所示， PI-PEI@RDPE&TMC膜在超声前后酶活性并无明显衰减，相反PI-PEI@RDPE膜在超声后酶活衰减到初始活性的54％。活性的明显降低主要是由于非共价固定导致酶很容易从膜表面脱落，从荧光图片可以明显看出PI-PEI@RDPE膜在超声后荧光强度从初始的17.58将为0.98，而PEI@RDPE&TMC膜只是略有降低(图7的(a,b,c,d,e)),其中酶的平均荧光强度通过ImageJ 计算得出。除此之外，我们能够明显的发现超声前PI-PEI@RDPE膜的荧光强度几乎是 PEI@RDPE&TMC膜的两倍，这可能是因为FTIC染色是利用酶中赖氨酸上的NH2与FTIC，因此在利用TMC交联后，酶膜上的NH2数量减少导致了荧光强度的降低，这与红外谱图得出的结论相吻合。
通过改变TMC浓度来探究交联程度对酶活性的影响，如图8，随着TMC浓度的增大，固定化RDPE的活性大幅度降低，原因是本实验中利用PEI交联PI基膜导致膜表面残留的NH2在交联反应，而PEI上NH2的活性高于大分子酶上的NH2，导致形成一层聚酰胺薄层包裹住酶，随着TMC浓度增加，形成的聚酰胺薄层约致密，这阻碍了酶与底物之间的接触，从而使活性降低。
PI-PEI@RDPE&TMC膜的稳定性以及重复使用性能
为了考察游离酶与固定化酶的酶活衰减情况，将两者置于60℃下催化D-果糖转化，通过在不同时间点取样测试产物D-阿洛酮糖量来检测酶活性。从图9的(a)中，我们可以明显地看出，相比于游离酶，固定化酶的稳定性得到了很大程度上的提升。在连续反应4h后，游离酶的活性降至其初始的20％以下，而固定化酶膜的活性仍保持初始活性的90％以上。固定化酶稳定性的显著提高主要归因于利用TMC与RDPE聚合将其限定在了膜表面，很大程度上限制了酶三维构象上的变化，从而缓解了其失活。固定化不仅使酶的稳定性得到了很大提升，它也使其能够方便地重复利用，图9的(b)中显示了在循环使用PI-PEI@RDPE&TMC膜50次之后，固定化酶膜的活性仍能保持初始活性的95％。由于在每次反应之后会利用缓冲液冲洗以及超声清洗等手段清洗膜以防止反应物富集在膜表面形成膜污染，因此即使循环使用50次，固定化酶膜酶活性并没有大幅度地降低。除此之外，另一个可能的原因是PEI与基膜的交联，在TMC与RDPE的聚合反应过程中，TMC也会与PEI发生反应因此增强了界面聚合层与基膜的粘合力，从而是固定化酶膜在循环使用过程中没有出现酶泄露以及界面聚合层脱落等情况。图9的(c)是测试PI-PEI@RDOPE&TMC膜的存储稳定性，实验结果表明固定化膜在储存两个月后酶活仍保持初始酶活的60％(每隔一天测试一次活性)。
游离酶膜反应器与固定化酶膜反应器——反应与分离
如图10的(a)所示，将酶膜置于渗透液装置中间，在浓度差驱动下，D-果糖由溶液主体向酶膜表面扩散，在RDPE催化下转化成D-阿洛酮糖。随后，D-阿洛酮糖渗透过酶膜最终到达渗透侧。在不同时间分别取原料侧与渗透侧样检测其中D-果糖与D-阿洛酮糖的含量，实验结果显示，在测试期间内在原料侧并没有检测到D-阿洛酮糖，而渗透侧D-阿洛酮糖量随时间累积。这表明了底物在经酶催化反应成产物后，产物全部渗透到了渗透侧，实现了D-阿洛酮糖的原位分离(图10的(c))。为了与游离酶膜相比较，取与固定化酶膜当量的RDPE放入原料侧，相同条件下反应4h后发现渗透侧D-果糖：D-阿洛酮糖的比例为6：1，而固定化酶膜渗透侧中原料与产物的比例为1.5：1。这说明了将酶固定于膜表面，对于可逆反应而言，可以及时分离产物，以提高渗透侧中产物的比例。除此之外，在反应过程中，渗透侧中D-阿洛酮糖的量也高于游离酶状态的酶膜反应器(如图10的(b)所示)。对于游离酶膜反应器而言，在反应4h后，反应转化率维持在23％。这主要有两方面原因，一方面是该反应本身存在热力学平衡限制，导致其存在平衡反应率；而另一方面是因为游离酶易失活导致后续时间转化率不再上升。而固定化酶膜由于能够实现产物原位物分离，从而促进了反应正向进行导致反应转化率的提升，打破了平衡转化率的限制(图10的(d))。
综上，本发明通过调控膜表面电荷后利用RDPE与TMC交联，制备了固定化酶膜，实验结果表明，正电膜更有利于负电RDPE的负载，是其负载密度增大了6倍。该固定化酶膜极大地提高了酶的稳定性并且实现了酶的重复利用和回收，在循环使用50次后，固定化酶膜的活性仍能保持初始活性的95％，并且再储存并测试两个月后，酶活性保持在初始活性的60％以上。在正渗透模式下测试了游离酶膜与固定化酶膜，实验数据证明了固定化酶膜能够实现产物的原位分离，从而将渗透侧原料于产物比例由6：1降至1.5：1。除此之外，固定化酶膜能够打破反应平衡的限制，将反应转化率由23％提高至33％。
Claims (10)
1.一种固定化酶膜，其特征在于，包括基膜，其表面涂覆有带有阳离子聚合物层，阳离子聚合物层的表面负载有稀少糖合成酶与酰氯类单体聚合后得到的固定化酶层。
2.根据权利要求1所述的固定化酶膜，其特征在于，所述的基膜为多孔聚合物膜，材质为聚酰亚胺。
3.根据权利要求1所述的固定化酶膜，其特征在于，所述的阳离子聚合物层为聚乙烯亚胺层。
4.根据权利要求1所述的固定化酶膜，其特征在于，所述的稀少糖合成酶是D-阿洛酮糖3差向异构酶(RDPE)。
5.根据权利要求1所述的固定化酶膜，其特征在于，所述的酰氯类单体是均苯三甲酰氯。
6.权利要求1所述的固定化酶膜的的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，在基膜的表面涂覆含有阳离子聚合物的溶液，使阳离子聚合物在基膜表面交联；
步骤2，将步骤1中得到的膜与含有稀少糖合成酶的溶液接触，使稀少糖合成酶在膜的表面负载；
步骤3，将步骤2中得到的膜与含有酰氯类单体的溶液接触，使稀少糖合成酶与酰氯类单体交联后固定。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤1中，阳离子聚合物的溶液为浓度0.5-5wt％的聚乙烯亚胺的醇溶液，交联时间5-30h。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤2中，含有稀少糖合成酶的溶液是含有0.1-5mg/mL D-阿洛酮糖3差向异构酶(RDPE)的水溶液。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤3中，含有酰氯类单体的溶液是含有0.05-0.5wt％的均苯三甲酰氯的有机溶液，且接触时间5-15min。
10.一种通过固定化酶膜制备稀少糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用权利要求1所述的固定化酶膜，将固定化酶层与D-果糖溶液接触，进行反应；通过正渗透方法，收集渗透侧获得的稀少糖。
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