CN115825448A - 基于cd27的生物标志物组合在鉴别结核病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于CD27的生物标志物组合在鉴别结核病中的应用，涉及生物医学技术领域，本发明通过将分离出的活动性结核患者或潜伏结核患者的新鲜的外周血单核细胞经ESAT 6/CFP 10特异性刺激16小时，采用多色流式细胞术评估结核特异性CD4⁺T细胞上CD 27、CD 38、HLA‑DR三种生物标志物的表达情况，CD4⁺IFN‑γ⁺细胞的百分比大于0.05％时视为刺激成功。采用Graphpad及SPSS软件进行统计学分析。基于CD 27的三种生物标志物联合应用有较高的敏感性和特异性，可以较好地鉴别活动性结核与潜伏结核。

Description

基于CD27的生物标志物组合在鉴别结核病中的应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体是基于CD27的生物标志物组合在鉴别结核病中的应用。

背景技术

结核病是一种由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病，是全球十大死亡原因之一。常侵染人体肺部，多称为肺结核。通常，含有M.tb的液滴通过飞沫传播，致使机体发生结核潜伏感染。潜伏结核感染患者并不表现出临床症状。但如果不采取预防和控制措施，约有5-10％的LTBI会因免疫功能下降而罹患活动性肺结核。结核分枝杆菌感染人体会导致潜伏结核感染的发生，且约5％-10％的潜伏结核感染有发展成活动性结核的潜在风险。潜伏结核感染是患者感染结核分枝杆菌后尚未发病的状态，有或没有结核中毒症状，体格检查也无阳性发现。但长期的潜伏结核感染可能发展成活动性结核，出现咳嗽、发热、盗汗、疲倦等临床表现和阳性体格检查表现。

目前活动性结核和潜伏结核感染人群的早期快速诊断的灵敏度和检出率均较低且临床上没有有效的区分方法。细菌学诊断方法有痰涂片镜检和结核分枝杆菌培养，是临床诊断结核的经典检查方法。痰涂片具有操作便捷、诊断快速等优势，成本低，利于肺结核早期诊断。但临床实践发现，痰涂片的敏感性低，特异性差，准确率一般，假阴性率高，容易出现误诊。痰培养可以有效直观地观察菌落特征，判断感染情况，不受痰液来源影响，是目前结核病诊断的金标准。痰培养检查的特异性高，但需要等待菌落生长，培养时间长，不能及时快速的给出诊断方案延误治疗。

结核感染患者体内存在特异的效应T淋巴细胞，受到结核抗原再次刺激时，些细胞会分泌多种细胞因子(如γ-干扰素)。针对这一条件，结核免疫学检测主要采用的方法有结核菌素皮肤试验,γ-干扰素释放试验,结核分枝杆菌抗体检测。免疫学试验阳性意味着受试者感染了或感染过结核菌，但不一定患有ATB，在检测潜伏性结核感染及儿童等不咳痰患者中有很重要的诊断价值。TST成本低、操作简单，在世界范围内得到了广泛的应用，但多种因素，如年龄、免疫状况、合并症和既往接种过卡介苗等，都会导致TST的假阳性。尽管免疫学检测多用于LITB的检测，但它不能区分LITB和ATB。因此，对区分活动性结核和潜伏结核新方法的研究具有重要的现实意义。

CD27调节特异性CD4+T细胞产生IFN-γ⁺，在疾病活跃期间下调。有研究发现，在LTBI与ATB之间结核特异CD4+T细胞存在显著差异，而且在治疗开始9周后，CD38+细胞显著下调，且CD27+细胞在接受治疗的患者和LTBI间存在显著差异，这意味着结核特异T细胞的表型变化可以作为衡量结核治疗效果的潜在替代标志物，有助于区分ATB、治疗成功患者和LTBI。人类HLA-DR是MHC-I I类细胞表面受体，参与抗原呈递，在活化的抗原特异性T细胞上高度表达。

因此，本发明提出了基于CD27的生物标志物组合在鉴别结核病中的应用。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一；为此，本发明提出了基于CD27的生物标志物组合在鉴别结核病中的应用。

基于CD27的生物标志物组合在鉴别结核病中的应用，所述的生物标志物组合包括：CD 27、CD 38、HLA-DR三种生物标志物，还包括所述的生物标志物组合在鉴别活动性结核与潜伏结核的试剂盒中的应用。

进一步地，所述试剂盒应用于通过ESAT 6/CFP 10对外周血单核细胞进行特异性刺激16小时。

进一步地，经所述试剂盒处理后的外周血单核细胞，再通过多色流式细胞术评估结核特异性CD4⁺T细胞上CD 27、CD 38、HLA-DR三种生物标志物的表达情况。

进一步地，所述生物标志物的表达情况采用Graphpad及SPSS软件进行统计学分析。

进一步地，试剂盒用来鉴别活动性结核与潜伏结核的指标为：CD4⁺I FN-γ⁺细胞的百分比。

进一步地，进行统计学分析后，CD4⁺IFN-γ⁺细胞的百分比大于0.05％时视为刺激成功。

进一步地，所述外周血单核细胞从分离出的活动性结核患者或潜伏结核患者的新鲜的外周血中获得。

进一步地，采用鉴别算法构建活动性结核与潜伏结核鉴别模型；所述鉴别算法包括以下步骤：

分离出的活动性结核患者或潜伏结核患者的新鲜的外周血单核细胞；

将外周血单核细胞经ESAT 6/CFP 10特异性刺激16小时；

采用多色流式细胞术评估结核特异性CD4⁺T细胞上CD 27、CD 38、HLA-DR三种生物标志物的表达情况；

CD4⁺I FN-γ⁺细胞的百分比大于0.05％时视为刺激成功。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

通过将外周血单核细胞经ESAT 6/CFP 10特异性刺激16小时，采用多色流式细胞术评估结核特异性CD4⁺T细胞上CD 27、CD 38、HLA-DR三种生物标志物的表达情况，CD4⁺IFN-γ⁺细胞的百分比大于0.05％时视为刺激成功；基于CD 27的三种生物标志物联合应用有较高的敏感性和特异性，可以较好地鉴别活动性结核与潜伏结核。

附图说明

图1为本发明实施例中的表达频率示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

研究纳入了60名确诊的初治活动性结核患者及49名T.SPOT阳性的潜伏结核患者，并采用本申请的技术方案进行鉴别。本申请提供了基于CD27的生物标志物组合在鉴别结核病中的应用，包括；

基于CD27的生物标志物组合在鉴别结核病中的应用，所述的生物标志物组合包括：CD 27、CD 38、HLA-DR三种生物标志物，还包括所述的生物标志物组合在鉴别活动性结核与潜伏结核的试剂盒中的应用，基于CD 27的三种生物标志物联合应用有较高的敏感性和特异性，可以较好地鉴别活动性结核与潜伏结核。

作为本发明提供的一个实施例，优选的，所述试剂盒应用于通过ESAT6/CFP 10对外周血单核细胞进行特异性刺激16小时。

作为本发明提供的一个实施例，优选的，经所述试剂盒处理后的外周血单核细胞，再通过多色流式细胞术评估结核特异性CD4⁺T细胞上CD 27、CD 38、HLA-DR三种生物标志物的表达情况。

作为本发明提供的一个实施例，优选的，所述生物标志物的表达情况采用Graphpad及SPSS软件进行统计学分析。

作为本发明提供的一个实施例，优选的，试剂盒用来鉴别活动性结核与潜伏结核的指标为：CD4⁺IFN-γ⁺细胞的百分比。

作为本发明提供的一个实施例，优选的，进行统计学分析后，CD4⁺I FN-γ⁺细胞的百分比大于0.05％时视为刺激成功，结核特异性CD4+T细胞上CD27、CD 38、HLA-DR在活动性结核与潜伏结核中表达不同。活动性结核的结核特异性CD4+T细胞上CD 27表达频率低于潜伏结核组；CD38+IFN-γ+细胞的表达频率为高于潜伏结核组；HLA-DR+IFN-γ+的表达频率高于潜伏结核组。同时，CD 27诊断活动性结核和潜伏结核的ROC曲线下面积为0.865，敏感度为82.3％，特异度为81.7％；CD 38诊断活动性结核和潜伏结核的ROC曲线下面积为0.865，敏感度为82.3％，特异度为81.7％；HLA-DR诊断活动性结核和潜伏结核的ROC曲线下面积为0.865，敏感度为82.3％，特异度为81.7％。所以，基于CD 27的三种生物标志物联合应用有较高的敏感性和特异性，可以较好地鉴别活动性结核与潜伏结核。

作为本发明提供的一个实施例，优选的，所述外周血单核细胞从分离出的活动性结核患者或潜伏结核患者的新鲜的外周血中获得。

作为本发明提供的一个实施例，优选的，采用鉴别算法构建活动性结核与潜伏结核鉴别模型；所述鉴别算法包括以下步骤：

分离出的活动性结核患者或潜伏结核患者的新鲜的外周血单核细胞；

将外周血单核细胞经ESAT 6/CFP 10特异性刺激16小时；

采用多色流式细胞术评估结核特异性CD4⁺T细胞上CD 27、CD 38、HLA-DR三种生物标志物的表达情况；

CD4⁺IFN-γ⁺细胞的百分比大于0.05％时视为刺激成功。

活动性结核的结核特异性CD4⁺T细胞上CD 27表达频率为(41.95％，34.5-56.8％)，低于潜伏结核组(70.7％，58.325-73.7％)；CD38⁺IFN-γ⁺细胞的表达频率为(57.95％，50.375-66.8％)，高于潜伏结核组(65.55％，50.9-73.55％)；HLA-DR⁺IFN-γ⁺的表达频率为(57.95％，50.375-66.8％)；高于潜伏结核组(51.65％，35.1-65.9％)。CD 27诊断活动性结核和潜伏结核的ROC曲线下面积为0.865，敏感度为82.3％，特异度为81.7％；CD38诊断活动性结核和潜伏结核的ROC曲线下面积为0.865，敏感度为82.3％，特异度为81.7％；HLA-DR诊断活动性结核和潜伏结核的ROC曲线下面积为0.865，敏感度为82.3％，特异度为81.7％。

研究结果显示，活动性结核组的CD27⁺IFN-γ⁺的表达频率低于潜伏结核组(P＝0.039),CD38⁺IFN-γ⁺的表达频率高于潜伏性结核组(P<0.001)，HLA-DR⁺IFN-γ⁺的表达频率高于潜伏结合组(P<0.001)，如图1所示。

通过将外周血单核细胞经ESAT 6/CFP 10特异性刺激16小时，采用多色流式细胞术评估结核特异性CD4⁺T细胞上CD 27、CD 38、HLA-DR三种生物标志物的表达情况，CD4⁺IFN-γ⁺细胞的百分比大于0.05％时视为刺激成功；基于CD 27的三种生物标志物联合应用有较高的敏感性和特异性，可以较好地鉴别活动性结核与潜伏结核。

上述公式中的部分数据均是去除量纲取其数值计算，公式是由采集的大量数据经过软件模拟得到最接近真实情况的一个公式；公式中的预设参数和预设阈值由本领域的技术人员根据实际情况设定或者通过大量数据模拟获得。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方法而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方法进行修改或等同替换，而不脱离本发明技术方法的精神和范围。

Claims (8)

1.基于CD27的生物标志物组合在鉴别结核病中的应用，其特征在于，所述的生物标志物组合包括：CD 27、CD 38、HLA-DR三种生物标志物，还包括所述的生物标志物组合在鉴别活动性结核与潜伏结核的试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的基于CD27的生物标志物组合在鉴别结核病中的应用，其特征在于，所述试剂盒应用于通过ESAT 6/CFP 10对外周血单核细胞进行特异性刺激16小时。

3.根据权利要求2所述的基于CD27的生物标志物组合在鉴别结核病中的应用，其特征在于，经所述试剂盒处理后的外周血单核细胞，再通过多色流式细胞术评估结核特异性CD4⁺T细胞上CD 27、CD 38、HLA-DR三种生物标志物的表达情况。

4.根据权利要求3所述的基于CD27的生物标志物组合在鉴别结核病中的应用，其特征在于，所述生物标志物的表达情况采用Graphpad及SPSS软件进行统计学分析。

5.根据权利要求4所述的基于CD27的生物标志物组合在鉴别结核病中的应用，其特征在于，试剂盒用来鉴别活动性结核与潜伏结核的指标为：CD4⁺IFN-γ⁺细胞的百分比。

6.根据权利要求5所述的基于CD27的生物标志物组合在鉴别结核病中的应用，其特征在于，进行统计学分析后，CD4⁺IFN-γ⁺细胞的百分比大于0.05％时视为刺激成功。

7.根据权利要求2所述的基于CD27的生物标志物组合在鉴别结核病中的应用，其特征在于，所述外周血单核细胞从分离出的活动性结核患者或潜伏结核患者的新鲜的外周血中获得。

8.根据权利要求1所述的基于CD27的生物标志物组合在鉴别结核病中的应用，其特征在于，采用鉴别算法构建活动性结核与潜伏结核鉴别模型；所述鉴别算法包括以下步骤：

分离出的活动性结核患者或潜伏结核患者的新鲜的外周血单核细胞；

将外周血单核细胞经ESAT 6/CFP 10特异性刺激16小时；

采用多色流式细胞术评估结核特异性CD4⁺T细胞上CD 27、CD 38、HLA-DR三种生物标志物的表达情况；

CD4⁺IFN-γ⁺细胞的百分比大于0.05％时视为刺激成功。

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