CN116400077A - 鉴别活动性结核病和潜伏性结核病的抗原组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了鉴别活动性结核病和潜伏性结核病的抗原组合物及其应用,所述抗原组合物包括HBHA蛋白、Rv2028c蛋白和Rv2029c蛋白中的至少2种。本发明一些实例的抗原组合物或重组蛋白,用于结核病检测时,可以准确、灵敏的区分活动结核与潜伏结核。
Description
技术领域
本发明涉及诊断领域,具体涉及鉴别活动性结核病和潜伏性结核病的抗原组合物及其应用。
背景技术
结核潜伏感染(latent tuberculosis infection, LTBI) 是导致结核病成为全球高感染率传染病的主要原因之一,是结核病防治的关键。结核潜伏感染是机体对结核分枝杆菌抗原刺激产生的持久性的免疫反应,临床上没有任何活动性结核的征象,全球多达20亿的结核杆菌潜伏感染人群是结核防控的巨大威胁。世界卫生组织将消除潜伏结核感染人群作为结核病控制策略的重要内容,开展筛查并进行预防性干预,是全球结核病控制策略目标的一项重要举措。及时从潜伏感染群体中分辨出活动性结核患者,及时隔离,将大大减少传染源,同时,临床研究发现,及时准确的诊断及规范化疗程的治疗,可使大多数结核病患者得以治愈,从而减少了这种慢性传染病的进一步传播,所以区分活动性结核与潜伏感染对结核病的防控有极大的帮助。
目前,LTBI的鉴诊主要依靠结核菌素(PPD)和γ干扰素释放(IGRA)方法,前者由于接种卡介苗而呈现假阳性,检出率为45%左右,而后者检测较准,检出率20%左右,但两者均无法有效鉴别诊断结核潜伏感染与活动性结核,活动性结核仍需再结合临床表现、影像学、细菌学等方式进行综合分析诊断。
目前IGRA使用的抗原ESAT-6和CFP-10也存在于几种NTM (非结核分枝杆菌)中,无法区分这几种NTM与MTB (结核分枝杆菌)感染;并且,即便对于病原学阳性的结核病患者,IGRA的敏感度也达不到100%,换言之,IGRA阴性也不能完全排除LTBI和ATB (活动性结核病)。另一方面,IGRA检测阳性无法区分LTBI和ATB。
从2000年到2020年,多达1500多篇科研文章对区分结核杆菌潜伏感染和活动性结核进行了研究,这些研究证实了潜伏感染状态与活动性结核状态大不一样,一个是厌氧休眠状态,一个是活动繁殖状态,他们表达的蛋白谱系有很大区别。潜伏性结核感染者体内的Mtb 通常以休眠菌的形式存在巨噬细胞内,通过改变自身特征和代谢途径适应宿主体内环境长期存活于人体内。 休眠的 Mtb 在宿主免疫力下降时被激活、增殖、播散,最终发展为活动性结核。报道中具有区分性的蛋白有:HBHA,Rv2028c,Rv1886c,Rv0288,Rv0978c和Rv1917c等,这些相关抗原主要的应用在于两个方面:第一、潜伏感染相关抗原与细胞免疫介导的IFN-γ释放试验,检测方法为一是基于外周血单核淋巴细胞(PBMCs)培养的酶联免疫斑点技术(ELISPOT)检测 Mtb 抗原刺激后特异性分泌 IFN-γ的 T 淋巴细胞数量,检测方法二是基于全血培养的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测 Mtb 抗原刺激后特异性分泌的IFN-γ水平。现有凯杰公司开发的四代QFT产品尝试利用CD8淋巴细胞对ESAT6和CFP10抗原的反应来区分远期感染和近期感染, QuantiFERON®-TBGold Plus(QFT-Plus)提供两个TB特异性抗原管(TB1和TB2)。TB1引起CD4 T细胞反应,而TB2被设计成引起CD4和CD8 T细胞反应,有报道QFT-Plus TB2-TB1水平能有效区分ATB患者和LTBI人群,其ROC曲线下面积(AUC)为0.771,由于灵敏度仅能达到60%, 尚无法很好的区分潜伏性结核与活动性结核感染。
迪澳双因子检测(专利IFN-γ/IL-2),DeFine.TB,选取了存在于结核分枝杆菌,但在卡介苗和大多数非结核分枝杆菌中普遍缺失的RD1区和RD2区编码的ESAT-6、CFP-10、Rv1985c蛋白,应用基因工程技术将其表达成为融合蛋白(ESAT-6-CFP-10-Rv1985c),在检测时,将人外周血单个核细胞从全血样本中分离出来 ,消除血液本底干扰因素,通过计数单个核细胞数量,排除人群中免疫细胞数量的个体差异影响。将定量的单个核细胞与融合蛋白ESAT-6-CFP-10-Rv1985c在细胞培养板上共培养,结核特异性 T 细胞由于记忆反应而分泌γ-干扰素及白细胞介素-2因子,再利用双抗体夹心酶联免疫法,检测培养上清中的γ-干扰素、白细胞介素-2的浓度,来判断其是否存在结核分枝杆菌特异性的细胞免疫反应。
在2021年7月初出版的Journalof Translational Medicine杂志(2020年影响因子5.531)刊登了首都医科大学附属北京胸科医院联合广州市胸科医院、湖南省胸科医院和新疆维吾尔自治区胸科医院共同开展的一项前瞻性多中心诊断研究成果,该项研究在2017年7月至2018年12月期间连续纳入了3245例疑似结核患者,最终,2536例被诊断为活动性肺结核和718例非结核病例,其中活动性肺结核病例有1092例为结核病确诊病例,1444例为临床诊断病例。对患者同时采取痰液样本和血液样本,针对每位受试者采集外周血单个核细胞经结核特异性蛋白ESAT-6–CFP-10-Rv1985c刺激后,分析其IFN-γ和IL-2的释放水平,建立活动性结核预测模型。研究结果发现IFN-γ的ROC 曲线下面积为0.859,而IL-2 的ROC 曲线面积0.865 ,IFN-γ的总体敏感性和特异性分别为83.8% 和81.5%,IL-2的特异性为94.3%,灵敏度为72.6%。
张文宏教授2018年报道利用Anda Biologicals TB试剂盒和Pathozyme TBComplex Plus试剂盒串联检测,可区分活动性结核和潜伏结核感染,这两个试剂盒用的抗原分别是抗原60和Rv0394,Rv2031c; Bum-Joon Kim在2020年报导利用Ag85B和CFP10可区分活动性结核和潜伏结核感染。
国内外研究人员不断地筛选替代或者补充ESAT-6/CFP-10的抗原组合。比如分泌抗原Rv3615c [6, 7]、Rv3879c 、EspC(aa54-103)/EspF(aa9-44) 、Rv3615c和Rv3879c的抗原组合,以及基于肝磷脂结合红血球凝集素(HBHA)建立的HBHA-IGRA。但仍未能有效解决区分LTBI和ATB的关键问题 。
此外,国内研究者发现,基于IGRA衍生指标如TBAg/PHA比值,即ELISPOT试验中抗原A孔(ESAT-6)和抗原B孔(CFP-10)两者中的较大者与阳性对照植物血凝素(PHA)孔的比值,具有提高区分ATB与LTBI的性能 ,但仍需要多中心大样本的临床验证。
要区分活动性结核与潜伏性结核,IGRA 应通过应用源自结核分枝杆菌 RD 相关和潜伏期相关抗原的多种抗原来进一步改进。文献中,在结核分枝杆菌的 16 个 RD 中,共报道过 124 种潜伏期相关抗原,分为 6 类:54 种休眠存活调节子抗原 (DosRs)、7 种营养饥饿 (NS) 相关抗原、20 种再激活抗原 (RAs)、5 种复苏促进因子 (RPF) 抗原、八种毒素-抗毒素系统相关抗原 (TAS) 和 30 种其他与 LTBI 相关的抗原。然而全面检测的成本高昂,操作复杂。
鉴于结核杆菌的抗原众多,且不同的抗原对IFN-γ的表达均有一定的刺激作用,如何有效区分LTBI和ATB是公认的难题,开发可以有效鉴别LTBI和ATB试剂存在相当大的挑战。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足,提供一种可以有效鉴别活动性结核病和潜伏性结核病的抗原组合物及其应用。
本发明所采取的技术方案是:
本发明的第一个方面,提供:
鉴别活动性结核病和潜伏性结核病的抗原组合物,所述抗原组合物包括HBHA蛋白、Rv2028c 蛋白和Rv2029c蛋白中的至少2种。
在一些抗原组合物的实例中,所述抗原组合物具体为:
1) HBHA蛋白和Rv2028c 蛋白;
2) HBHA蛋白和Rv2029c蛋白;
3) Rv2028c 蛋白和Rv2029c蛋白;
4) HBHA蛋白、Rv2028c 蛋白和Rv2029c蛋白。
在一些抗原组合物的实例中,所述抗原组合物具体为:
1) HBHA蛋白和Rv2028c 蛋白,质量混合比为1:(3~9);
2) HBHA蛋白和Rv2029c蛋白,质量混合比为1:(3~9);
3) Rv2028c 蛋白和Rv2029c蛋白,混合比为1:(1~3);
4) HBHA蛋白、Rv2028c 蛋白和Rv2029c蛋白,质量混合比为1:(1~3):(1~3)。
本发明的第二个方面,提供:
鉴别活动性结核病和潜伏性结核病的重组蛋白,所述重组蛋白由HBHA蛋白、Rv2028c 蛋白和Rv2029c蛋白中至少2种的核心区融合得到。
在一些重组蛋白的实例中,所述HBHA蛋白的核心区氨基酸序列为:SNIDDIKAPLLAALGAADLALATVNELITNLRERAEETRTDTRSRVEESRARLTKLQEDLPEQLTELREKFTAEELRKAAEGYLEAATSRYNELVERGEAALERLRSQQSFEEVSARAEGYVDQAVELTQEALGTVASQTRAVGERAAKLVGIELPKKAAPAKKAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK;
所述Rv2028c 蛋白的核心区氨基酸序列为:SIVVGIDGSKPAVQAALWAVDEAASRDIPLRLLYAIEPDDPGYAAHGAAARKLAAAENAVRYAFTAVEAADRPVKVEVEITQERPVTSLIRASAAAALVCVGAIGVHHFRPERVGSTAAALALSAQCPVAIVRPHRVPIGRDAAWIVVEADGSSDIGVLLGAVMAEARLRDSPVRVVTCRQSGVGDTGDDVRASLDRWLARWQPRYPDVRVQSAAVHGELLDYLAGLGRSVHMVVLSASDQEHVEQLVGAPGNAVLQEAGCTLLVVGQQYL;
所述Rv2029c蛋白的核心区氨基酸序列为:GKPRIITLTMNPALDITTSVDVVRPTEKMRCGAPRYDPGGGGINVARIVHVLGGCSTALFPAGGSTGSLLMALLGDAGVPFRVIPIAASTRESFTVNESRTAKQYRFVLPGPSLTVAEQEQCLDELRGAAASAAFVVASGSLPPGVAADYYQRVADICRRSSTPLILDTSGGGLQHISSGVFLLKASVRELRECVGSELLTEPEQLAAAHELIDRGRAEVVVVSLGSQGALLATRHASHRFSSIPMTAVSGVGAGDAMVAAITVGLSRGWSLIKSVRLGNAAGAAMLLTPGTAACNRDDVERFFELAAEPTEVGQDQYVWHPIVNPEASPL。
在一些重组蛋白的实例中,所述重组蛋白具体融合方式为:
1) HBHA蛋白和Rv2028c 蛋白;
2) HBHA蛋白和Rv2029c蛋白;
3) Rv2028c 蛋白和Rv2029c蛋白;
4) HBHA蛋白、Rv2028c 蛋白和Rv2029c蛋白。
本发明的第三个方面,提供:
本发明第一方面所述抗原组合物在制备鉴别活动性结核病和潜伏性结核病诊断试剂中的应用。
本发明的第四个方面,提供:
本发明第二方面所述重组蛋白在制备鉴别活动性结核病和潜伏性结核病诊断试剂中的应用。
本发明的第五个方面,提供:
一种鉴别活动性结核病和潜伏性结核病的试剂盒,包括阴性对照管、阳性对照管、特异性刺激管一,所述特异性刺激管一的主要成分为本发明第一方面所述抗原组合物,或本发明第二方面所述重组蛋白。
在一些试剂盒的实例中,还包括特异性刺激管二,所述特异性刺激管二的主要成分为CFP10-ESAT6融合蛋白。
在一些试剂盒的实例中,阴性对照管主要成分为Tris溶液。
在一些试剂盒的实例中,阳性对照管主要成分为外源凝集素。
本发明的有益效果是:
本发明一些实例的抗原组合物或重组蛋白,用于结核病检测时,可以准确、灵敏的区分活动结核与潜伏结核。
附图说明
图1是SDS-PAGE 分析纯化的抗原。
图2是单一抗原刺激的IFNγ释放实验结果。
图3是ROC 分析Rv0475, Rv2028 和 Rv2029的IFNγ释放实验结果。
图4是多抗原组合的IFNγ释放实验结果。
图5是不同抗原组合的ROC曲线分析及截止值确定。
图6是HBHA单抗原刺激健康人、LTBI和ATB 患者样本后IFN-γ浓度的散点图。
图7是Rv2028单抗原刺激健康人、LTBI和ATB 患者样本后IFN-γ浓度的散点图。
图8是Rv2029单抗原刺激健康人、LTBI和ATB 患者样本后IFN-γ浓度的散点图。
图9是Rv0081单抗原刺激健康人、LTBI和ATB 患者样本后IFN-γ浓度的散点图。
图10是Rv1886单抗原刺激健康人、LTBI和ATB 患者样本后IFN-γ浓度的散点图。
图11是Rv3804单抗原刺激健康人、LTBI和ATB 患者样本后IFN-γ浓度的散点图。
图12是传统IGRA方法与几种抗原组合的IGRA方法联用对区分LTBI和ATB的效果比较。
具体实施方式
下面结合实例,进一步说明本发明的技术方案。
抗原的基因设计与克隆
蛋白质序列经过翻译,成为核苷酸序列,通过密码子优化,一端增加His 标签序列(用于重组蛋白表达后的纯化),两端增加酶切位点后,进行基因合成,克隆到原核表达质粒pET28中。
蛋白序列:
HBHA表达序列(4-198):
SNIDDIKAPLLAALGAADLALATVNELITNLRERAEETRTDTRSRVEESRARLTKLQEDLPEQLTELREKFTAEELRKAAEGYLEAATSRYNELVERGEAALERLRSQQSFEEVSARAEGYVDQAVELTQEALGTVASQTRAVGERAAKLVGIELPKKAAPAKKAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK (SEQ ID NO.:1)
Rv2028c表达序列(10-280):
SIVVGIDGSKPAVQAALWAVDEAASRDIPLRLLYAIEPDDPGYAAHGAAARKLAAAENAVRYAFTAVEAADRPVKVEVEITQERPVTSLIRASAAAALVCVGAIGVHHFRPERVGSTAAALALSAQCPVAIVRPHRVPIGRDAAWIVVEADGSSDIGVLLGAVMAEARLRDSPVRVVTCRQSGVGDTGDDVRASLDRWLARWQPRYPDVRVQSAAVHGELLDYLAGLGRSVHMVVLSASDQEHVEQLVGAPGNAVLQEAGCTLLVVGQQYL (SEQ ID NO.:2)
Rv2029c表达序列(12-341):
GKPRIITLTMNPALDITTSVDVVRPTEKMRCGAPRYDPGGGGINVARIVHVLGGCSTALFPAGGSTGSLLMALLGDAGVPFRVIPIAASTRESFTVNESRTAKQYRFVLPGPSLTVAEQEQCLDELRGAAASAAFVVASGSLPPGVAADYYQRVADICRRSSTPLILDTSGGGLQHISSGVFLLKASVRELRECVGSELLTEPEQLAAAHELIDRGRAEVVVVSLGSQGALLATRHASHRFSSIPMTAVSGVGAGDAMVAAITVGLSRGWSLIKSVRLGNAAGAAMLLTPGTAACNRDDVERFFELAAEPTEVGQDQYVWHPIVNPEASPL (SEQ ID NO.:3)
目标蛋白的表达和纯化
结核特异性基因Rv0475(HBHA)、Rv0081、Rv1886c、Rv2028c、Rv2029c和Rv3804的合成都是由Genescript完成的。将带有N或C末端His标签的基因子克隆到pET28表达载体中,三个蛋白表达质粒分别转化到原核表达细菌BL21(DE3)中,进行IPTG的诱导表达。可溶性蛋白直接通过Ni亲和层析纯化,而不溶性蛋白则在6M尿素中溶解并通过Ni亲和层析纯化,然后进行梯度稀释重折叠。检测纯化蛋白的蛋白纯度、浓度和内毒素水平,蛋白纯度通过4-12%梯度SDS-PAGE凝胶电泳验证,蛋白浓度使用BCA方法定量,内毒素水平使用Limulus检测法检测。符合要求(内毒素水平低于0.5 EU)的蛋白被用于细胞刺激实验。
Rv2028是不溶性蛋白,需要重折叠和纯化。 Rv3804,Rv0081,Rv1886和Rv0475(HBHA)是可溶性蛋白。Rv2029是半可溶性蛋白,只有可溶性部分被纯化用于试剂开发。
图1是表达与纯化后的6种抗原的SDS-PAGE图。
抗原的特异性刺激与检测实验:
实验方法:
1、抗原准备:
通过比较一系列单蛋白浓度的梯度来优化刺激性蛋白的浓度,而使用矩阵梯度优化组合蛋白的浓度。这种结核特异性抗原同时与IGRA方法一起刺激。
抗原分为单抗原组(0.5ug, 1ug,1.5ug, 3ug, 6ug/ml终浓度),双抗原组(0.2ug/ml:1ug/ml 到1ug/ml:0.2ug/ml)和三抗原组(HBHA蛋白 0.5ug/ml到1ug/ml:Rv2028蛋白1ug/ml到3ug/ml:Rv2029蛋白1ug/ml到3ug/ml),每组再按不同的浓度进行分组,进行实验。
2、样本准备:
使用基于ESAT6和CFP10的IGRA方法来区分感染和未感染结核病的健康个体。将样本分为健康对照组,潜伏性结核感染组与活动性结核组,采用肝素真空采血管采集不少于3ml的肝素抗凝全血,新鲜的含肝素静脉血被倒置8次混合血样。
健康对照组(IGRA阴性样本):样本来源于健康人群,其采用结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫法)(广州市雷德生物科技有限公司)经过IGRA试验(γ-干扰素释放试验)排除结核感染人群。
潜伏性结核感染组:样本来源于IGRA阳性样本中排除了临床确诊的活动性结核(痰培养阳性或痰涂片阳性)人群。
活动性结核组:样本来源于临床确诊的结核活动性结核人群(痰培养阳性或痰涂片阳性)。
3、刺激:准备好含有上述抗原的刺激管,将0.6毫升的血样转移到标有N、T、P的管中与刺激物混合。管子被倒置5次以确保外周血和结核刺激物完全接触。管子放入37℃孵育器孵育20小时。管子以1000g离心5分钟,上清液转移到EP管(避免红细胞)中进行ELISA检测或储存在-20℃以下的冰箱中。
4、IFN-γ检测及结果判读
刺激结束后,将刺激管在1000g 离心1min,收集血浆至新的EP管,可以在-20℃长期保存,也可立即进行IFN-γ浓度检测。IFN-γ浓度的检测采用广州市雷德生物科技有限公司开发的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫法)中的γ-干扰素检测试剂盒检测,具体方法为:
S1) 加样:样本和样本稀释液1:1稀释,加入100ul至酶标板;室温,250rpm摇动孵育60min;
S2) 洗涤:每孔加入250ul的洗涤液,室温静置1min,掉到,拍干,重复3次;
S3) 二抗孵育:每孔加入100ul抗体液与酶标液混合后的酶结合液,室温250rpm摇动孵育60min;
S4) 洗涤:每孔加入250ul的洗涤液,室温静置1min,掉到,拍干,重复5次;
S5) 显色:每孔加入100ul显色液,避光显色20±2min;
S6) 终止:加入100ul终止液,终止显色;
S7) 读数:使用酶标仪在关吸收模式下以450nm、630 nm双波长测定关吸收(OD)值各孔OD值;通过测定各孔的450nm、630 nm的OD值计算OD450-630值;
S8) 结果分析与判读:用仪器的4参数(4-Qarameter)软件分析数据,使用GraphPad Prism 6.0进行ROC分析和绘图。所有数据均以X ± SD形式呈现。使用两样本t检验进行两个完全随机样本的平均值比较,P值<0.05表示统计学上有显著差异。
单一抗原刺激的IFNγ释放实验结果:
共招募了38例确诊结核病(TB)患者,30例潜在结核感染(LTBI)患者和60名健康个体进行分析。
测定中使用的Rv0475(HBHA)的最终浓度为1ug/ml。在Rv0475刺激后LTBI,ATB和健康个体血清中IFNγ的平均浓度分别为129.9 pg/ml,37.5 pg/ml和85.8 pg/ml。在LTBI和ATB组之间观察到IFNγ浓度差异具有统计学意义(p<0.0001)(见图2a)。
测定中使用的Rv2028的最终浓度为3ug/ml。在Rv2028刺激后LTBI,ATB和健康个体血清中IFNγ的平均浓度分别为233.6 pg/ml,49.7 pg/ml和184.7 pg/ml。在LTBI和ATB组之间观察到IFNγ浓度差异具有统计学意义(p<0.0001)(见图2b)。
测定中使用的Rv2029的最终浓度为3ug/ml。在Rv2029刺激后LTBI,ATB和健康个体血清中IFNγ的平均浓度分别为190.5 pg/ml,64.7 pg/ml和145.1 pg/ml。在LTBI和ATB组之间观察到IFNγ浓度差异具有统计学意义(p<0.0001)(见图2c)。
测定中使用的Rv0081的最终浓度为3ug/ml。在Rv0081刺激后LTBI,ATB和健康个体血清中IFNγ的平均浓度分别为21.9 pg/ml,26.3 pg/ml和5.5 pg/ml。LTBI和ATB组间IFNγ浓度没有统计学差异(p=0.692)(见图2d)。
测定中使用的Rv1886的最终浓度为3ug/ml。在Rv1886刺激后LTBI,ATB和健康个体血清中IFNγ的平均浓度分别为15.4 pg/ml,16.2 pg/ml和11.8 pg/ml。LTBI和ATB组间IFNγ浓度没有统计学差异(p=0.816)(见图2e)。
测定中使用的Rv3804的最终浓度为3ug/ml。在Rv3804刺激后LTBI,ATB和健康个体血清中IFNγ的平均浓度分别为47.7 pg/ml,63.9 pg/ml和25.8 pg/ml。LTBI和ATB组间IFNγ浓度没有统计学差异(p=0.322)(见图2f)。
ROC分析Rv0475, Rv2028和Rv2029的IFNγ释放实验结果:
对38例确诊结核病(TB)患者、22例潜在结核感染(LTBI)患者和60名健康个体进行了测定截止值的研究。基于临床诊断绘制了接收者操作特征(ROC)曲线,Rv0475的曲线下面积(AUC)为0.802 [95%CI (0.696, 0.908)]。
共有38例确诊结核病患者、22例潜在结核感染患者和60名健康个体进行了临界值确定测试。根据临床诊断绘制了Rv0475-IGRA的ROC曲线,曲线下面积(AUC)为0.802 [95%CI(0.696,0.908)]。当临界值设置为41pg/mL时, Rv0475-IGRA的敏感性为65.8%,特异性为85.2%(见图3a)。
共有38例确诊结核病患者、30例潜在结核感染患者和60名健康个体进行了临界值确定测试。根据临床诊断绘制了Rv2028-IGRA的ROC曲线,曲线下面积(AUC)为0.834 [95%CI(0.733, 0.936)]。当临界值设置为40.3pg/mL时, Rv0475-IGRA的敏感性为68.4%,特异性为83.3% (图3b)。
共有38例确诊结核病患者、27例潜在结核感染患者和60名健康个体进行了临界值确定测试。根据临床诊断绘制了Rv0475-IGRA的ROC曲线,曲线下面积(AUC)为0.79 [95%CI(0.678, 0.902)]。当临界值设置为37.0pg/mL时,Rv2029-IGRA的敏感性为68.4%,特异性为92.6%(图3c)。
多抗原组合的IFNγ释放实验结果
混合Rv0475+Rv2028的比例为1:3。刺激中使用的浓度为3ug/ml。在Rv0475+Rv2028刺激后LTBI,ATB和健康个体血清中IFNγ的平均浓度分别为355.4, 42.9和211.0 pg/ml。在LTBI和ATB组之间观察到IFNγ浓度差异具有统计学意义(p<0.0001)(见图4a)。
混合Rv0475+Rv2029的比例为1:3。刺激中使用的浓度为3ug/ml。在Rv0475+Rv2029刺激后LTBI,ATB和健康个体血清中IFNγ的平均浓度分别为273.3, 57.4和181.6 pg/ml。在LTBI和ATB组之间观察到IFNγ浓度差异具有统计学意义(p<0.0001)(见图4b)。
混合Rv2028+Rv2029的比例为1:1。刺激中使用的浓度为3ug/ml。在Rv2028+Rv2029刺激后LTBI,ATB和健康个体血清中IFNγ的平均浓度分别为274.1, 60.36和198.3 pg/ml。在LTBI和ATB组之间观察到IFNγ浓度差异具有统计学意义(p<0.0001)(见图4c)。
混合Rv0475+Rv2028+Rv2029的比例为1:3:3。刺激中使用的浓度为3ug/ml。在Rv0475+Rv2028+Rv2029刺激后LTBI,ATB和健康个体血清中IFNγ的平均浓度分别为317.7,59.9和233.5 pg/ml。在LTBI和ATB组之间观察到IFNγ浓度差异具有统计学意义(p<0.0001)(见图4d)。
不同抗原组合的ROC曲线分析及截止值确定
经过确诊的38名结核病患者,27名潜在结核感染患者和60名健康个体样本进行了截止值确定测试。根据临床诊断绘制了ROC曲线,Rv0475+Rv2028的AUC为0.931 [95%CI(0.866,0.994)]。当截止值为64.5pg/mL时,(Rv0475+Rv2028)-IGRA的敏感性为78.9%,特异性为88.9%(图5a)。
Rv0475+Rv2029的AUC为0.856 [95%CI(0.762,0.949)]。当截止值为80.4pg/mL时,(Rv0475+Rv2029)-IGRA的敏感性为78.9%,特异性为88.9%(图5b)。
Rv2028+Rv2029的AUC为0.901 [95%CI (0.830, 0.973)]。当截止值为69.9pg/mL时,(Rv2028+Rv2029)- IGRA的敏感性为81.6%,特异性为89.3%(图5c)。
Rv0475+Rv2028+Rv2029的AUC为0.927 [95%CI (0.864, 0.991)]。当截止值为86.9 pg/mL时,(Rv0475+Rv2028+Rv2029)-IGRA的敏感性为76.3%,特异性为92.6%(图5d)。
HBHA、Rv2028、Rv2029单独刺激不同样本后IFN-γ浓度的散点图分别如图6~8所示。从图6~8中可以看出,抗原单独使用无法有效区分健康人、LTBI和ATB患者。
发明人同时使用其他已经报导的对LTBI和ATB患者区分作用的抗原Rv0081、Rv1886 和Rv3804单独刺激不同样本,其IFN-γ浓度的散点图分别如图9~11所示,发现Rv0081、Rv1886 和Rv3804单独使用同样无法有效区分健康人、LTBI和ATB患者。
传统IGRA方法与几种抗原组合的IGRA方法联用对区分LTBI和ATB的效果:
重新招募30例活动性结核,30例LTBI患者,80例健康体检者,抽取静脉血10ml用于IGRA刺激实验,传统IGRA方法的T管(ESAT6和CFP10抗原组合),N管(阴性对照管),P管(阳性对照管),新抗原组合的刺激管(Rv2028+0475; Rv2029+0475; Rv2028+2029; Rv2028+2029+0475); 各管均加入0.6ml肝素抗凝血,37°C刺激20小时后,离心收集上清,用于IFNγ检测,检测结果如图12。
在80例健康人中,有3例T-N值高于20, 2例T-N值在临界值附近,一同纳入新抗原组合验证,结果这5例在新抗原组合中,刺激值均高于临界值,判断为LTBI,结果不影响LTBI与ATB的区分。
在30例ATB和30例LTBI的新抗原刺激验证实验中,根据不同抗原组合的不同cutoff值的计算,结果如下表:
Cutoff(pg/mL) | LTBI准确率(%) | ATB准确率(%) | |
Rv2028+0475 | 64.5 | 86.7 | 77.8 |
Rv2029+0475 | 80.4 | 86.7 | 80.0 |
Rv2028+2029 | 69.9 | 86.7 | 83.3 |
三抗原组合 | 86.9 | 90.0 | 80.0 |
发现这些抗原组合对LTBI和ATB进行区分性检测时,在LTBI群组中,几种双抗原组合的准确率都达到了86.7%,三抗原组合达到了90%。在ATB群组中,三种双抗原组合的准确率分别为77.8%,80%,83.3%; 三抗原组合的准确率为80%。说明本发明在对LTBI的区分较好,但在临床活动性结核患者的区分验证中,特异性有待进一步提高。
以上是对本发明所作的进一步详细说明,不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的简单推演或替换,都在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.鉴别活动性结核病和潜伏性结核病的抗原组合物,其特征在于,所述抗原组合物包括HBHA蛋白、Rv2028c 蛋白和Rv2029c蛋白中的至少2种。
2.根据权利要求1所述的抗原组合物,其特征在于,所述抗原组合物具体为:
1) HBHA蛋白和Rv2028c 蛋白;
2) HBHA蛋白和Rv2029c蛋白;
3) Rv2028c 蛋白和Rv2029c蛋白;
4) HBHA蛋白、Rv2028c 蛋白和Rv2029c蛋白。
3.根据权利要求2所述的抗原组合物,其特征在于,所述抗原组合物具体为:
1) HBHA蛋白和Rv2028c 蛋白,质量混合比为1:(3~9);
2) HBHA蛋白和Rv2029c蛋白,质量混合比为1:(3~9);
3) Rv2028c 蛋白和Rv2029c蛋白,混合比为1:(1~3);
4) HBHA蛋白、Rv2028c 蛋白和Rv2029c蛋白,质量混合比为1:(1~3):(1~3)。
4.鉴别活动性结核病和潜伏性结核病的重组蛋白,其特征在于,所述重组蛋白由HBHA蛋白、Rv2028c 蛋白和Rv2029c蛋白中至少2种的核心区融合得到。
5.根据权利要求4所述的重组蛋白,其特征在于,所述HBHA蛋白的核心区氨基酸序列为:SNIDDIKAPLLAALGAADLALATVNELITNLRERAEETRTDTRSRVEESRARLTKLQEDLPEQLTELREKFTAEELRKAAEGYLEAATSRYNELVERGEAALERLRSQQSFEEVSARAEGYVDQAVELTQEALGTVASQTRAVGERAAKLVGIELPKKAAPAKKAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK;
所述Rv2028c 蛋白的核心区氨基酸序列为:SIVVGIDGSKPAVQAALWAVDEAASRDIPLRLLYAIEPDDPGYAAHGAAARKLAAAENAVRYAFTAVEAADRPVKVEVEITQERPVTSLIRASAAAALVCVGAIGVHHFRPERVGSTAAALALSAQCPVAIVRPHRVPIGRDAAWIVVEADGSSDIGVLLGAVMAEARLRDSPVRVVTCRQSGVGDTGDDVRASLDRWLARWQPRYPDVRVQSAAVHGELLDYLAGLGRSVHMVVLSASDQEHVEQLVGAPGNAVLQEAGCTLLVVGQQYL;
所述Rv2029c蛋白的核心区氨基酸序列为:GKPRIITLTMNPALDITTSVDVVRPTEKMRCGAPRYDPGGGGINVARIVHVLGGCSTALFPAGGSTGSLLMALLGDAGVPFRVIPIAASTRESFTVNESRTAKQYRFVLPGPSLTVAEQEQCLDELRGAAASAAFVVASGSLPPGVAADYYQRVADICRRSSTPLILDTSGGGLQHISSGVFLLKASVRELRECVGSELLTEPEQLAAAHELIDRGRAEVVVVSLGSQGALLATRHASHRFSSIPMTAVSGVGAGDAMVAAITVGLSRGWSLIKSVRLGNAAGAAMLLTPGTAACNRDDVERFFELAAEPTEVGQDQYVWHPIVNPEASPL。
6.根据权利要求4或5所述的重组蛋白,其特征在于,所述重组蛋白具体融合方式为:
1) HBHA蛋白和Rv2028c 蛋白;
2) HBHA蛋白和Rv2029c蛋白;
3) Rv2028c 蛋白和Rv2029c蛋白;
4) HBHA蛋白、Rv2028c 蛋白和Rv2029c蛋白。
7.抗原组合物在制备鉴别活动性结核病和潜伏性结核病诊断试剂中的应用,所述抗原组合物如权利要求1~3任一项所述。
8.重组蛋白在制备鉴别活动性结核病和潜伏性结核病诊断试剂中的应用,所述重组蛋白如权利要求4~6任一项所述。
9.一种鉴别活动性结核病和潜伏性结核病的试剂盒,包括阴性对照管、阳性对照管、特异性刺激管一,其特征在于,所述特异性刺激管一的主要成分为权利要求1~3任一项所述的抗原组合物,或权利要求4~6任一项所述的重组蛋白。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,还包括特异性刺激管二,其中,阴性对照管主要成分为Tris溶液,阳性对照管主要成分为外源凝集素,所述特异性刺激管二的主要成分为CFP10-ESAT6融合蛋白。
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