CN115819418A

CN115819418A - Plk1激酶抑制剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115819418A
Application number: CN202310108131.0A
Authority: CN
Inventors: 叶亮; 张剑钊; 王文艳; 马明旭; 芦静; 白信法; 雷慧; 于大伟; 田京伟
Original assignee: Shandong Luye Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shandong Luye Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2023-02-14
Filing date: 2023-02-14
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2043-02-14
Also published as: CN115819418B

Abstract

本发明涉及一类PLK1激酶活性的化合物。本发明还提供了含有所述化合物的药物组合物，以及所述化合物及其药物组合物在制备预防或治疗因PLK1激酶活性失调导致和/或与之相关的疾病的药物中的用途。

Description

PLK1激酶抑制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于药物技术领域，涉及一类可作为PLK1激酶抑制剂的化合物、药物组合物及其用途。

背景技术

PLK1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，随有丝分裂进程定位于不同位点，调节中心体成熟、有丝分裂分裂期进入、纺锤体形成和胞质分裂等过程，在不同时间、空间被激活以满足其在细胞周期中的不同功能。PLK1控制G2/有丝分裂（G2/M）检查点，抑制PLK1可导致有丝分裂停滞和随后的细胞死亡。PLK1还参与了G2和M期DNA损伤监测点的调节，是DNA损伤恢复后重新进入有丝分裂期的必需条件。但过度活跃的PLK1的表达可以使细胞越过DNA损伤诱导的G2阻滞检查点，导致遗传不稳定，最终导致致癌转化。

PLK1水平升高会导致PLK1在多种癌症中过度表达，包括结直肠癌、非小细胞肺癌和胰腺导管腺癌，影响肿瘤侵袭和转移。异常的PLK1信号与肿瘤患者的复发和不良愈后显著相关。因此，PLK1有望成为有效的抗肿瘤药物靶点，特异性抑制该激酶可强效阻断有丝分裂。如Onvansertib、Volasertib、Rigosertib和BAL0891，已在临床试验中用于治疗各种癌症。国际专利申请WO2009040399A1公开了一类PLK1激酶抑制剂，其中化合物A1C3M2具有较好的PLK1激酶抑制活性。

A1C3M2

为了满足广阔的临床需求，该领域仍需要活性更高、安全性更好的化合物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有更高PLK1激酶抑制作用，活性更高的化合物。

本发明的技术方案如下。

在本发明的一个实施方案中，提供了式（I）所示的化合物、其药学上可接受的盐或立体异构体：

（I）

其中，

R₁、R₂各自独立地选自H、C_1-4烷基；或R₁和R₂以及相连的碳原子形成C_3-6环烷基；

R₃、R₄各自独立地选自H、C_2-6卤代烷基或C_1-6烷基。

在本发明的一些实施方案中，上述R₁、R₂各自独立地选自H、甲基、乙基；或R₁和R₂以及相连的碳原子形成环丙基或环丁基。

在本发明的一些实施方案中，上述R₃为H或C_1-3烷基。

在本发明的一些实施方案中，上述R₃选自H、甲基或乙基。

在本发明的一些实施方案中，上述R₄选自H、C_1-3烷基或C_2-3卤代烷基。

在本发明的一些实施方案中，上述R₄选自H、甲基、乙基、-CH₂CF₃或-CH₂CH₂CF₃。

在本发明的一些实施方案中，上述R₁、R₂各自独立地选自H、甲基、乙基；或R₁和R₂以及相连的碳原子形成环丙基；R₃选自H、甲基或乙基；R₄选自H、甲基、乙基或-CH₂CF₃。

本发明的一些方案中，上述化合物、其药学上可接受的盐或立体异构体，选自：

、

、

、

、

。

本发明还提供了一种药物组合物，包括上述任意一种化合物、其药学上可接受的盐或立体异构体和药学上可接受的载体。所述药物组合物可以制备成药学上可接受的各种剂型，如片剂、胶囊剂、口服液剂、颗粒剂、注射剂或各种缓控释制剂等。所述药物组合物可通过口服或胃肠外方式（如静脉内、皮下或局部等）给药。给药剂量可根据患者的年龄、性别和疾病类型进行适当调整，一般每日剂量约为1-200 mg。

本发明还提供了上述化合物、其药学上可接受的盐或立体异构体或药物组合物在制备预防或治疗因PLK1激酶活性失调导致和/或与之相关的疾病的药物中的用途。所述疾病选自癌症、细胞增殖性疾病、病毒感染、自身免疫性和神经变性疾病。

所述癌症包括但不限于：癌瘤例如膀胱、乳腺、结肠、肾、肝、肺(包括小细胞肺癌)、食道、胆囊、卵巢、胰腺、胃、子宫颈、甲状腺、前列腺和皮肤(包括鳞状细胞癌)；淋巴系的造血性肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B-细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤（Hodgkin's lymphoma）、非-霍奇金氏淋巴瘤（Non-Hodgkin's lymphoma）、毛细胞淋巴瘤和Burkett氏淋巴瘤；骨髓系的造血性肿瘤，包括急性和慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征和前髓细胞性白血病；间质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；中枢和外周神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；其他肿瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎瘤、骨肉瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、甲状腺滤泡癌和卡波西氏肉瘤。

所述细胞增殖性疾病，例如良性前列腺增生、家族性腺瘤、息肉病、神经纤维瘤、牛皮癣、与动脉粥样硬化有关的血管平滑细胞增殖、肺纤维化、关节炎、肾小球性肾炎以及手术后狭窄和再狭窄。

本发明提供的化合物具有以下技术优势：

1.具有更高的PLK1激酶抑制作用；

2.具有更强的细胞增殖作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例和试验例，进一步阐述本发明，但不以任何形式限制本发明的范围。

除非另有说明，本文所用的术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。

本发明所说的“药学上可接受的”，是针对化合物、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。

本发明所说的“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸碱制备。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与这类化合物的中性形式接触的方式获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括无机酸盐、有机酸盐；还包括氨基酸（如精氨酸等）的盐，以及如葡糖醛酸等有机酸的盐。本发明的某些特定的化合物含有碱性的官能团，从而可以被转换成任一酸加成盐。

本发明的某些化合物可以具有不对称碳原子（光学中心）或双键。外消旋体、非对映异构体、几何异构体和单个的异构体都包括在本发明的范围之内。

本发明的化合物可以存在特定的几何或立体异构体形式。本发明设想所有的这类化合物，包括顺式和反式异构体、(-)- 和 (+)-对映体、(R)- 和 (S)-对映体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体，及其外消旋混合物和其他混合物，例如对映异构体或非对映体富集的混合物，所有这些混合物都属于本发明的范围之内。烷基等取代基中可存在另外的不对称碳原子。所有这些异构体以及它们的混合物，均包括在本发明的范围之内。

本发明的药学上可接受的盐可由含有酸根或碱基的母体化合物通过常规化学方法合成。一般情况下，盐的制备方法为：在水或有机溶剂或两者的混合物中，经由游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备。

术语“药学上可接受的载体”是指能够递送本发明有效量活性物质、不干扰活性物质的生物活性并且对宿主或者患者无毒副作用的任何制剂或载体介质代表性的载体，包括但不限于：粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂、润湿剂、分散剂、增溶剂、助悬剂等。

本发明意欲包括存在于本发明化合物中的原子的所有同位素。同位素包括原子数相同但质量数不同的那些原子。作为一般实例且非限制性地，氢的同位素包括氘和氚。碳的同位素包括13C和14C。本发明的同位素标记化合物一般可通过本领域技术人员已知的常规技术或通过类似于本文所述的方法，使用适当同位素标记试剂代替另外使用的非标记试剂来制备。

除非另有规定，术语“烷基”用于表示直链或支链的饱和烃基, 可以是单取代（如-CH2F）或多取代的（如-CF3），可以是一价（如甲基）、二价（如亚甲基）或者多价（如次甲基）。例如C1-C6表示1至6个碳，C1-6选自C1、C2、C3、C4、C5、C6；烷基的例子包括甲基(Me)，乙基(Et)，丙基(如，n-丙基和异丙基)，丁基(如，n-丁基，异丁基，s-丁基，t-丁基)，戊基(如，n-戊基，异戊基，新戊基，1-乙基丙基)，己基(如，n-己基，异己基、1，1-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基和2-乙基丁基)等。

除非另有规定，术语“卤代素”或“卤素”本身或作为另一取代基的一部分表示氟、氯、溴或碘原子。“卤代烷基”用于表示单卤代/多卤代直链或支链的烷基。典型的卤代烷基包括C1-6卤代烷基，例如：C1、C2、C3、C4、C5、C6的卤代烷基。例如，C1-C6卤代烷基的实例包括但不仅限于：氟甲基、氯甲基、二氟甲基、二氯甲基、三氟甲基、三氯甲基、2,2-二氟乙基、2,2-二氯乙基、3,3,3-三氟乙基、3,3,3-三氯乙基、五氟乙基、和五氯乙基。

除非另有规定，环烷基包括任何稳定的环状或多环烃基，任何碳原子都是饱和的，可以是单取代或多取代的，可以是一价、二价或者多价。这些环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。

化合物经手工或者ChemDraw®软件命名，市售化合物采用供应商目录名称。

实施例1 化合物1的合成

1.1 中间体1-2的合成

将化合物1-1 (30.0 g, 117 mmol)、Pd₂(dba)₃ (1.07 g, 1.17 mmol) 及DavePhos (0.922 g, 2.34 mmol)溶于四氢呋喃（120 mL），氮气保护下，加入LiHMDS (1 M,293 mL)和N-甲基哌嗪 (18.8 g, 187 mmol)。86 ℃下反应2 h。降至室温，加水淬灭反应，加入二氯甲烷（300 mL◊3）萃取。收集有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。剩余物经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚=10~50%），得中间体1-2（11.8 g，收率36.8%，棕色固体）。MS m/z(ESI) = 276.2 [M+H]⁺。

1.2 中间体1-3的合成

将中间体1-2（4.00 g, 14.5 mmol）与NaNO₂（4.11 g, 59.6 mmol）溶于DMSO（100mL），氮气保护下，加入HI（10.3 g, 36.3 mmol, 45%），控温在10 ℃。35 °C反应6 h。加水淬灭反应，用饱和NaHCO₃溶液调pH = 7，用二氯甲烷（100 mL×3）萃取，有机相用10%亚硫酸氢钠溶液（200 mL×2）洗两次，然后用水（200 mL）洗一次。收集有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。剩余物经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚=10~30%），得中间体1-3（1.11 g，收率19.9 %，棕色固体）。MS m/z(ESI) = 387.0 [M+H]⁺。

1.3 中间体1-5的合成

将化合物1-4（15.0 g, 89.2 mmol，购自购自上海毕得医药科技股分有限公司）溶于氢溴酸的醋酸溶液（300 mL, 33%），加入Br₂（12.8 g, 80.3 mmol），控温在0 ℃且氮气保护。0 ℃反应3 h。缓慢加入冰水（1500 mL）淬灭反应，加入乙酸乙酯（300 mL×4）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。得中间体1-5（22.0 g，粗品，黄色固体），直接用于下一步。

1.4 中间体1-6与1-6a的合成

将中间体1-5（20.0 g, 80.9 mmol）溶于乙醇（800 mL），加入2,4-二哌啶酮-1-甲酸叔丁酯（17.3 g, 80.9 mmol）与醋酸铵（31.2 g, 405 mmol），氮气保护且控温在10 ℃。室温反应16 h。反应液减压浓缩，剩余物溶于乙酸乙酯（800 mL），过滤，收集滤液。滤液用加入稀盐酸（1N，400 mL），加入乙酸乙酯（100 mL× 3）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。剩余物经制备液相纯化 (C18 250*100 mm*10 μm; 流动相: [水 (10mM NH₄HCO₃)-乙腈]; B%: 35%-70%, 20 min)。得中间体 1-6（7.20 g，收率24.7 %，黄色固体）。MS (ESI) m/z = 361.1 [M+H]⁺。得中间体 1-6a（13.2 g，收率43.2 %，黄色固体）。MS(ESI) m/z = 380.1 [M+H]⁺。

1.5 中间体1-7的合成

将中间体1-6（5.00 g, 13.8 mmol）溶于DMF（100 mL），加入Cs₂CO₃（6.78 g, 20.8mmol）与碘甲烷（(2.36 g, 16.7 mmol），氮气保护且控温在10 ℃。33 ℃反应12 h。反应液过滤，收集滤液。缓慢加入饱和氯化铵溶液（700 mL），加入乙酸乙酯（200 mL× 3）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。得中间体 1-7（5.23 g，粗品，黄色固体）。MS (ESI) m/z = 375.1 [M+H]⁺。

1.6 中间体1-8的合成

将中间体1-7（5.10 g, 13.6 mmol）溶于二氯甲烷，氮气保护且控温在10 ℃，加入m-CPBA（7.34 g, 34.1 mmol, 80%）。10 ℃反应12 h。加入焦亚硫酸钠溶液（160 mL，10%）淬灭反应，加入二氯甲烷（100 mL× 3）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，滤液减压浓缩。得中间体 1-8（5.53 g，粗品，黄色固体）。MS (ESI) m/z = 407.1 [M+H]⁺。

1.7 中间体1-9的合成

将中间体1-8（2.00 g, 4.92 mmol）溶于二氧六环（45 mL），加入氨水（25 mL）。在15 Psi下80 ℃反应5 h。反应液减压浓缩，剩余物溶于二氯甲烷（100 mL），加入饱和Na₂CO₃(60 mL)萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，滤液减压浓缩。得中间体 1-9（1.69 g，粗品，黄色固体）。MS (ESI) m/z = 344.2 [M+H]⁺。

1.8 中间体1-10的合成

将中间体1-9（1.96 g, 5.70 mmol）与中间体1-3（2.00 g, 5.18 mmol）溶于二氧六环（80 mL），氮气保护下加入Cs₂CO₃ (3.38 g, 10.36 mmol)，Xantphos (0.599 g, 1.04mmol)，Pd₂(dba)₃ (0.474 g, 0.518 mmol)。110 ℃反应5 h。反应液减压浓缩，剩余物硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚=10~50%），得中间体1-10（1.45 g, 收率42.4 %，褐色色固体）。MS(ESI) m/z = 602.3 [M+H]⁺。

1.9 中间体1-11的合成

将中间体1-10（1.00 g, 1.66 mmol）溶于四氢呋喃（30 mL），加入盐酸二氧六环（4M, 15 mL）。室温反应16 h。反应液减压浓缩，得中间体1-11（1.10 g，粗品，白色固体）。MS(ESI) m/z = 502.3 [M+H]⁺。

1.10 化合物1的合成

将中间体 1-11（200 mg, 0.398 mmol）与DDQ（226 mg, 0.997 mmol）溶于二氧六环（20 mL），110 ℃反应8 h。加饱和NaHCO₃（20 mL）淬灭，加入乙酸乙酯（20 mL×3）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，有机相减压浓缩。剩余物经制备液相纯化 (C18 150*40mm*10 μm; 流动相: [水(0.04% HCl)-ACN]; B%: 10%-40%,10 min)，得化合物1的盐酸盐。经制备液相纯化[水 (0.05% NH₃H₂O+10 mM NH₄HCO₃)-CAN; B%: 5%-65%, 8 min]，得化合物 1（5 mg，收率2.51 %，淡黄色固体）。MS (ESI) m/z = 500.2 [M+H]⁺。¹H NMR (400MHz,MeOD) δ 8.42 (d, J = 5.20 Hz, 1 H) 7.69 (d, J = 2.80 Hz, 1 H), 7.42 (s, 1 H),7.28 (d, J = 5.20 Hz, 1 H), 7.22 - 7.26 (m, 2 H), 6.81 (dd, J = 9.20, 3.01Hz, 1 H), 6.74 (d, J = 7.20 Hz, 1 H), 4.02 (s, 3 H), 3.23 - 3.28 (m, 4 H),2.61 - 2.65 (m, 4 H), 2.36 (s, 3 H)。

实施例2 化合物2的合成

2.1 中间体2-1的合成

将中间体1-6（3.00 g, 8.32 mmol）溶于DMF（60 mL），氮气保护且控温在10 ℃下加入NIS(2.43 g, 10.8 mmol)。40 ℃反应12 h。加水（200 mL）淬灭反应，加入乙酸乙酯（100 mL× 3）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，有机相减压浓缩。得中间体2-1（4.15 g, 粗品，黄色固体）。MS (ESI) m/z = 487.0 [M+H]⁺。

2.2 中间体2-2的合成

将中间体2-1（4.00 g, 8.22 mmol）溶于DMF（40 mL），加入Cs₂CO₃（4.02 g, 12.3mmol）与碘甲烷（1.40 g, 9.87 mmol），氮气保护且控温在10 ℃。33 ℃反应12 h。反应液过滤，收集滤液。缓慢加入饱和氯化铵溶液（200 mL），加入乙酸乙酯（100 mL× 3）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。得中间体 2-2（3.96 g，粗品，黄色固体）。MS(ESI) m/z = 501.0 [M+H]⁺。

2.3 中间体2-3的合成

将化合物2-2（3.80 g, 7.59 mmol）与乙烯基硼酸频哪醇酯溶于四氢呋喃（100mL）与水（20 mL），氮气保护且控温10 ℃下，加入Pd(PPh₃)₄ (1.76 g, 1.52 mmol) 和Na₂CO₃ (1.61 g, 15.2 mmol)。80 ℃下反应12 h。降至室温，加水淬灭反应，加入二氯甲烷（300 mL× 3）萃取。反应液减压浓缩，剩余物经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚=10~50%），得中间体2-3（1.02 g，收率33.5%，黄色固体）。MS m/z(ESI) = 401.2 [M+H]⁺。

2.4 中间体2-4的合成

将化合物2-3（0.45 g, 1.12 mmol）溶于三氟乙酸（30 mL），氮气保护且控温10 ℃下，加入Et₃SiH (7.19 g, 61.8 mmol)。60 ℃下反应3 h。降至室温，加水淬灭反应，用饱和NaHCO₃调pH = 8，加入乙酸乙酯（50 mL× 3）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，液减压浓缩。得中间体2-4（0.34 g，粗品，黄色油状物）。MS (ESI) m/z = 303.0 [M+H]⁺。

2.5 中间体2-5的合成

将中间体2-4（500 mg, 1.65 mmol）溶于二氯甲烷（30 mL），氮气保护且控温在0℃，加入m-CPBA（749 mg, 3.47 mmol, 80%）。0 ℃反应1 h。加入焦亚硫酸钠溶液（20 mL，10%）淬灭反应，加入二氯甲烷（40 mL× 4）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，滤液减压浓缩。得中间体 2-5（552 mg，粗品，黄色固体）。MS (ESI) m/z = 335.1 [M+H]⁺。

2.6 中间体2-6的合成

将中间体2-5（300 mg, 0.897 mmol）溶于二氧六环（10 mL），加入氨水（6 mL）。在15 Psi下80 ℃反应5 h。反应液减压浓缩。得中间体 2-6（245 mg，粗品，黄色固体）。MS(ESI) m/z = 272.1 [M+H]⁺。

2.7 化合物2的合成

将中间体2-6（13.0 mg, 0.479 mmol）与中间体1-3（185 mg, 0.479 mmol）溶于二氧六环（30 mL），氮气保护下加入Cs₂CO₃ (312 mg, 0.958 mmol)，Xantphos (55.4 mg,0.0958 mmol)，Pd₂(dba)₃ (43.8 mg, 0.0479 mmol)。110 ℃反应5 h。反应液减压浓缩，剩余物经制备液相纯化 (C18 150*40 mm*10 μm; 流动相: [水(0.2% FA)-ACN]; B%: 20% -60%, 8 min)，得化合物2的盐酸盐。经制备液相纯化[水 (10 mM NH₄HCO₃)-ACN; B%: 25% -60%, 8 min]，得化合物 2（5 mg，收率1.97%，淡黄色固体）。MS (ESI) m/z = 530.2 [M+H]⁺。¹HNMR (400MHz, DMSO-d₆) δ 8.80 (s, 1 H) 8.40 (d, J = 5.20 Hz, 1 H), 7.30 (br d,J = 7.60 Hz, 1 H), 7.16 (d, J = 9.20 Hz, 1 H), 6.94 (s, 1 H), 6.72 - 6.82 (m,2 H), 3.51 (s, 3 H), 3.28 - 3.34 (m, 4 H), 3.10 (br s, 3 H), 2.67 - 2.78 (m,4 H), 2.40 (br s, 3 H), 2.18 (s, 3 H), 1.05 (t, J = 6.80 Hz, 3 H)。

实施例3 化合物3的合成

将化合物2（20.0 mg, 37.7 μmol）与DDQ（21.4 mg, 94.4 μmol）溶于二氧六环（20mL）。氮气保护，60 ℃反应6 h。加饱和NaHCO₃（20 mL）淬灭，加入乙酸乙酯（20 mL×3）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，有机相减压浓缩。剩余物经制备液相纯化 (C18 150*40 mm*10 μm; 流动相: [水(0.04% HCl)-ACN]; B%: 25%-65%, 8 min)，得化合物3的盐酸盐。经制备液相纯化[水 (0.05% NH₃H₂O+10 mM NH₄HCO₃)-CAN; B%: 5%-65%, 8 min]，得化合物3（6 mg,，收率31.6 %，白色固体）。MS (ESI) m/z = 528.2 [M+H]⁺。¹H NMR (400MHz,MeOD) δ 8.55 (d, J = 5.20 Hz, 1 H), 7.93 (d, J = 2.80 Hz, 1 H), 7.18 - 7.26(m, 2 H), 7.05 (d, J = 5.20 Hz, 1 H), 6.75 (dd, J = 9.20, 2.86 Hz, 1 H), 6.66(d, J = 7.2 Hz, 1 H), 3.78 (s, 3 H), 3.15 - 3.25 (m, 4 H), 3.01 (q, J = 7.20Hz, 2 H), 2.53 - 2.68 (m, 4 H), 2.28 - 2.37 (m, 3 H), 1.28 (t, J = 7.20 Hz, 3H)。

实施例4 化合物4的合成

4.1 中间体4-2的合成

将化合物4-1（2.00 g, 9.40 mmol）与4-溴-2-硝基三氟甲氧基苯（2.96 g, 10.3mmol）溶于甲苯（30 mL），氮气保护下加入叔丁醇钠 (1.80 g, 18.8 mmol)，BINAP (0.59g, 0.94 mmol)，Pd₂(dba)₃ (0.86 g, 0.90 mmol)。100 ℃且氮气保护下反应5 h。反应液减压浓缩，剩余物硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚=0~10%），得中间体4-2（2.30 g, 收率58.5%，油状物）。MS (ESI) m/z = 418.2 [M+H]⁺。

4.2 中间体4-3的合成

将中间体4-2（800 mg, 1.92 mmol）溶于氯化氢乙酸乙酯溶液（6 mL），氮室温反应3 h。反应液减压浓缩。得中间体4-3（600 mg，粗品，黄色油状物）。MS m/z(ESI) = 318.1 [M+H]⁺。

4.3 中间体4-4的合成

将中间体4-3（1.10 g, 3.50 mmol）与多聚甲醛（1.05 g, 350 mmol）溶于甲醇（30mL），加入10滴醋酸。室温搅拌30 min后加入NaBH₃CN (0.66 g, 10.5 mmol)，50 ℃反应2h。反应液减压浓缩，剩余物硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚=0~50%），得中间体4-4（0.99 g,收率85.7 %，油状物）。MS (ESI) m/z = 332.1 [M+H]⁺。

4.4 中间体4-5的合成

将中间体4-4（1.10 g, 3.30 mmol）溶于甲醇（20 mL），加入Pd/C（200 mg）。通入氢气，室温反应8 h。反应液过滤，滤液减压浓缩，剩余物硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚=10~80%），得中间体4-5（0.90 g, 收率90.9 %，油状物）。MS (ESI) m/z = 302.1 [M+H]⁺。

4.5 中间体4-7的合成

将化合物4-6（2.40 g, 19.3 mmol, 购自上海毕得医药科技股分有限公司）溶于四氢呋喃（30 mL），加入三乙胺（5.86 g, 57.9 mmol）、DMAP（0.24 g, 1.9 mmol）与Boc₂O（6.32 g, 28.9 mmol）。室温反应2 h。反应液减压浓缩，剩余物硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚= 0~20%），得中间体4-7（1.88 g, 收率43.5 %，油状物）。MS (ESI) m/z = 225.1 [M+H]⁺。

4.6 中间体4-8的合成

将中间体4-7（2.00 g, 8.90 mmol）溶于四氢呋喃（30 mL），控温在0 ℃，加入LiAlH₄（1.35 g, 35.6 mmol）。70 ℃反应2 h。降至室温，滴加水（1.35 mL）与氢氧化钠水溶液（4.05 mL, 15%）淬灭反应。无水硫酸钠干燥，过滤。滤液减压浓缩，得中间体4-8（1.30 g,粗品，油状物）。MS (ESI) m/z = 139.2 [M+H]⁺。

4.7 中间体4-9的合成

将中间体4-8（1.30 g, 9.40 mmol）溶于DMF（20 mL），加入NIS（3.17 g, 14.1mmol）。室温反应2 h。加入饱和Na₂SO₃溶液（30 mL）淬灭反应，加入乙酸乙酯（100 mL×3）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液减压浓缩，剩余物硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚= 0~20%），得中间体4-9（2.24 g, 产率90.4%，白色固体）。MS (ESI) m/z = 265.1 [M+H]⁺。

4.8 中间体 4-10 的合成

将Pd (PPh₃)₂Cl₂（130 mg, 0.200 mmol）、CuI（70 mg, 0.300 mmol）与三乙胺（10mL）溶于四氢呋喃（10 mL），氮气保护下加入中间体4-9（1.00 g, 3.80 mmol）与三异丙基硅基乙炔（1.04 g, 5.70 mmol）。室温反应4 h。加入盐酸（10 mL, 1M）淬灭反应，加入乙酸乙酯（100 mL×3）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液减压浓缩，剩余物硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚= 0~20%），得中间体4-10（1.18 g, 产率97.3%，黄色固体）。MS (ESI)m/z = 319.2 [M+H]⁺。

4.9 中间体4-11的合成

将中间体4-10（1.50 g, 4.70 mmol）溶于四氢呋喃（30 mL），加入中间体TBAF的四氢呋喃溶液（6.1 mL, 1 M）。室温反应1 h。加入水（30 mL）淬灭反应，加入乙酸乙酯（50 mL×3）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液减压浓缩，剩余物硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚= 0~20%），得中间体4-11（0.70 g, 产率91.5%，蜡状体）。MS (ESI) m/z = 163.1[M+H]⁺。

4.10 中间体4-12的合成

将Pd (PPh₃)₂Cl₂（130 mg, 0.19 mmol）、PPh₃（97.0 mg, 0.37 mmol）与三乙胺（10mL）溶于四氢呋喃（10 mL），氮气保护下加入2,4-二氯嘧啶（660 mg, 4.44 mmol）、CuI（70.0mg, 0.37 mmol）与中间体4-11（600 mg, 3.70 mmol）。室温反应4 h。加入盐酸（10 mL, 1M）淬灭反应，加入乙酸乙酯（100 mL×3）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液减压浓缩，剩余物硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚= 0~30%），得中间体4-12（810 mg, 产率79.7%，黄色固体）。MS (ESI) m/z = 275.1 [M+H]⁺。

4.11 中间体4-13的合成

将中间体4-12（230 mg, 0.84 mmol）溶于DMF（10 mL），加入叔丁醇钠 (38.0 mg,0.34 mmol)。室温反应1 h。加入水（30 mL）淬灭反应，加入乙酸乙酯（30 mL×3）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液减压浓缩，剩余物硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚= 0~30%），得中间体4-13（130 mg, 产率56.5%，黄色固体）。MS (ESI) m/z = 275.1 [M+H]⁺。

4.12 中间体4-14的合成

将中间体4-13（500 mg, 1.83 mmol）与中间体4-5（500 mg, 1.66 mmol）溶于甲苯（30 mL），氮气保护下加入Cs₂CO₃ (1.08 g, 3.32 mmol)，BINAP (104 mg, 0.17 mmol)，Pd(OAc)₂ (75.0 mg, 0.33 mmol)。氮气保护，100 ℃反应6 h。降至室温，反应液减压浓缩，剩余物硅胶柱层析（甲醇：二氯甲烷= 0~5%），得中间体4-14（485 mg, 产率54.2%，黄色固体）。MS (ESI) m/z = 540.2 [M+H]⁺。

4.13 化合物4的合成

将中间体 4-14（600 mg, 1.11 mmol）溶于乙腈（20 mL），加入TMSI（445 mg, 2.22mmol）。50 ℃反应2 h。加饱和NaHCO₃（20 mL）淬灭，加入乙酸乙酯（20 mL×3）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，有机相减压浓缩。剩余物经制备液相纯化 (C18 150*40 mm*10 μm; 流动相: [水(0.1% NH₃·H₂O)-ACN]; B%: 35%-65%, 8 min)，得化合物3（179 mg,，收率30.7 %，白色固体）。MS (ESI) m/z = 526.2 [M+H]⁺。¹HNMR (400MHz, DMSO-d₆) δ 10.93 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 8.96 (s, 1H), 8.36 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 7.33 (s,1H), 7.27 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 7.20 (m, 2H), 7.16 - 7.09 (m, 1H), 6.78 (dd, J= 8.8, 2.8 Hz, 1H), 6.55 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.18 - 3.10 (m,2H), 2.95 (s, 2H), 2.93 - 2.87 (m, 2H), 2.26 (s, 3H), 0.62 (t, J = 5.2 Hz,2H), 0.45 (t, J = 5.2 Hz, 2H)。

实施例5 化合物5的合成

5.1 中间体5-2的合成

将化合物5-1（1.70 g, 11.4 mmol）溶于四氢呋喃（30 mL），加入DMAP（1.68 g,13.7 mmol）与Boc₂O（3.00 g, 13.7 mmol）。室温反应12 h。加入水（80 mL）淬灭反应，加入乙酸乙酯（100 mL×3）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液减压浓缩，得中间体5-2（2.7 g, 粗品，蜡状体）。MS (ESI) m/z = 249.1 [M+H]⁺。

5.2 中间体5-3的合成

将中间体5-2（3.50 g, 14.1 mmol）溶于四氢呋喃（140 mL），加入LDA（2M, 42.2mL），控温-30 ℃，搅拌1 h。-30 ℃下加入硼酸三异丙酯（10.6 g, 56.3 mmol）。-30 ℃反应3 h。加入饱和氯化铵（200 mL）淬灭反应，加入乙酸乙酯（100 mL×3）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液减压浓缩，剩余物硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚= 0~20%），得中间体5-3（2.30 g, 产率55.8%，蜡状体）。MS (ESI) m/z = 293.1 [M+H]⁺。

5.3 中间体5-4的合成

将中间体5-3（1.68 g, 5.75 mmol）与2-甲硫基-4-氯嘧啶（1.85 g, 11.5 mmol）溶于四氢呋喃（30 mL）与水（6 mL），氮气保护下，加入Pd(PPh₃)₄ (66.4 mg, 57.5 μmol) 和K₃PO₄ (2.44 g, 11.5 mmol)。70 ℃下反应12 h。降至室温，加水淬灭反应，加入二氯甲烷（300 mL× 3）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。剩余物经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚=0~50%），得中间体5-4（0.84 g，收率39.2%，黄色固体）。MS m/z(ESI) =373.1 [M+H]⁺。

5.4 中间体5-5的合成

将中间体5-4（1.00 g, 2.68 mmol）溶于甲醇（15 mL），氮气保护下，加入甲醇钠(0.435 g, 8.05 mmol)。室温反应12 h。加水（80 mL）淬灭反应，加入二氯甲烷（50 mL× 3）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。剩余物经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚=0~50%），得中间体5-5（0.60 g，收率82.0 %，白色固体）。MS m/z(ESI) = 273.1 [M+H]⁺。

5.5 中间体5-6的合成

将中间体5-5（500 mg, 1.84 mmol）与2-碘-1,1,1-三氟乙烷（1.16 g, 5.51mmol）溶于DMF（10 mL），加入碳酸钾（507 mg, 3.67 mmol）。120 ℃反应12 h。降至室温，加水（100 mL）淬灭反应，加入乙酸乙酯（90 mL× 3）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。得中间体5-6（610 mg，粗品，蜡状体）。MS m/z(ESI) = 355.1 [M+H]⁺。

5.6 中间体5-7的合成

将中间体5-6（0.35 g, 0.987 mmol）溶于DMF（10 mL），加入过氧单磺酸钾（1.82g, 2.96 mmol）。室温反应16 h。加水（100 mL）淬灭反应，加入乙酸乙酯（50 mL× 3）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。得中间体5-7（0.40 g，粗品，蜡状体）。MS m/z(ESI) = 387.1 [M+H]⁺。

5.7 中间体5-8的合成

将中间体5-7（280 mg, 0.724 mmol）与中间体1-2（299 mg, 1.09 mmol）溶于DMF（10 mL），加入叔丁醇钾（162 mg, 1.45 mmol）。45 ℃反应12 h。加水（100 mL）淬灭反应，加入乙酸乙酯（50 mL× 3）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。剩余物经制备液相纯化 (C18 150*40 mm*10 μm; 流动相: [水(TFA)-ACN; B%: 20 %-65 %, 10min]，得中间体5-8（80 mg,，收率18.9 %，棕色固体）。MS (ESI) m/z = 582.2 [M+H]⁺。

5.7 化合物5的合成

将中间体5-8（60.0 mg, 103 μmol）溶于正丁醇（5 mL），加入对甲苯磺酸（17.7mg, 103 μmol）。120 ℃反应24 h。降至室温，反应液减压浓缩。剩余物经制备液相纯化(C18 150*40 mm*10 μm; 流动相: [水(TFA)-ACN]; B%: 0%-60%, 35 min]，得化合物5（13mg, 收率21.5 %，黄色固体）。MS (ESI) m/z = 568.2 [M+H]⁺。¹H NMR (400MHz, DMSO-d₆)δ 11.12 (br d, J = 5.8 Hz, 1H), 9.17 (s, 1H), 8.38 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 7.54- 7.47 (m, 1H), 7.32 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 7.23 - 7.16 (m, 2H), 6.84 (dd, J =2.8, 8.9 Hz, 1H), 6.74 (br d, J = 7.3 Hz, 1H), 5.95 - 5.65 (m, 2H), 3.18 -3.12 (m, 3H), 2.47 - 2.40 (m, 3H), 2.21 (s, 2H), 1.24 (s, 2H), 0.93 - 0.77(m, 1H)。

实施例6 化合物7的合成

6.1 中间体7-1的合成

将中间体1-6a（10.0 g, 26.4 mmol）溶于乙酸（100 mL），加入醋酸铵（20.3 g,264 mmol）。100 ℃反应12 h。加入水（100 mL）淬灭反应，用饱和碳酸氢钠溶液调pH = 7，加入二氯甲烷（200 mL× 3）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。剩余物溶于乙酸乙酯打浆，搅拌30 min，过滤，干燥。得中间体7-1（6.4 g，粗品）。直接用于下一步。MSm/z(ESI) = 262.1 [M+H]⁺。

6.2 中间体7-2的合成

将中间体7-1（6.40 g, 20.8 mmol, 85.0% purity）溶于二氯甲烷（100 mL），氮气保护且控温在0 ℃，加入m-CPBA（9.30 g, 45.8 mmol, 85.0% ）。20 ℃反应12 h。加入焦亚硫酸钠溶液（160 mL，10%）淬灭反应，加入二氯甲烷（100 mL× 3）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，滤液减压浓缩。得中间体 7-2（6.0 g，粗品）。MS (ESI) m/z = 294.0 [M+H]⁺。

6.3 中间体7-3的合成

将中间体7-2（500 mg, 1.70 mmol）溶于二氧六环（4 mL），加入氨水（4 mL）。在15Psi下80 ℃反应5 h。反应液减压浓缩，剩余物溶于二氯甲烷（100 mL），加入饱和Na₂CO₃ (60mL)萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，滤液减压浓缩。得中间体 7-3（200 mg，粗品，黄色固体）。MS (ESI) m/z = 231.1 [M+H]⁺。

6.4 化合物7的合成

将中间体7-3（200 mg, 518 μmol）与中间体1-3（143 mg, 622 μmol）溶于二氧六环（5 mL），氮气保护下加入Cs₂CO₃ (338 mg, 1.04 mmol)，Xantphos (59.9 mg, 104 μmol)，Pd₂(dba)₃ (94.9 mg, 104 μmol)。110 ℃且氮气保护下反应5 h。反应液减压浓缩，剩余物经制备液相纯化 (C18 75*30 mm*3 μm; 流动相: [水(10mM NH₄HCO₃)-ACN]; B%:25%-55%,12 min]，得化合物7（21.2 mg,，收率8.4 %，黄色固体）。MS (ESI) m/z = 589.2 [M+H]⁺。¹H NMR (400MHz, DMSO-d₆) δ 8.65 (s, 1H), 8.48 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 8.19 (s,1H), 8.02 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 7.69 - 7.57 (m, 2H), 7.19 (br, 1H), 6.72 (dd,J =2.9, 9.1 Hz, 1H), 3.47 (br, 2H), 3.20 - 3.11 (m, 5H), 2.96 (br, 3H), 2.44(br, 2H), 2.22 (s, 3H)。

实施例7 化合物8的合成

7.1 中间体8-1的合成

将中间体5-3（1.0 g, 3.42 mmol）与2,4-二氯嘧啶（1.0 g, 6.71 mmol）溶于四氢呋喃（10 mL）与水（2 mL），氮气保护下，加入Pd(PPh₃)₄ (0.20 g, 0.173 mmol) 和 K₃PO₄(1.82 g, 6.85 mmol)。70 ℃下反应5 h。降至室温，加水淬灭反应，加入二氯甲烷（300 mL× 3）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。剩余物经硅胶柱层析（甲醇：二氯甲烷=0~10%），得中间体8-1（0.23 g，收率25.8%，黄色固体）。MS m/z(ESI) = 261.0 [M+H]⁺。

7.2 化合物8的合成

将化合物8-1（120 mg, 0.332 mmol）与中间体1-2（130 mg, 0.472 mmol）溶于叔丁醇（10 mL），加入对甲苯磺酸（115 mg, 0.668 mmol）。130 ℃反应4 h。加水（100 mL）淬灭反应，加入乙酸乙酯（50 mL× 3）萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。剩余物经硅胶柱层析（甲醇：二氯甲烷=0~10%），得化合物8（20 mg，收率12.4%，黄色固体）。MS m/z(ESI) = 486.2 [M+H]⁺。¹H NMR (400MHz, MeOD) δ 8.32 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 8.02(d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.38 (s, 1H), 7.19 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.12 - 7.07 (m,2H), 6.63 - 6.61 (m, 1H), 6.57 - 6.56 (m, 1H), 3.19 - 3.17 (m, 4H), 2.58 -2.56 (m, 4H), 2.28 (s, 3H)。

试验例1. 对PLK1激酶抑制作用的测试

1.试验方法：

根据PerkinElmer推荐的方案，使用LANCE TR-FRET方法评价化合物对PLK1激酶的抑制活性。通过Echo机器进行化合物系列稀释（1：3倍比稀释），最高测试浓度为1 μM。PLK1激酶由Carna Biosciences（#05-157）提供，每孔加入5 µL。加入5 µL/孔的 ATP 溶液启动反应，孵育1小时后，用EDTA停止激酶反应。铕抗磷底物抗体（PerkinElmer #TRF0218-M），孵育1小时，使EnVision检测读板。使用XLFIT5软件分析测试结果，计算化合物对PLK1激酶达到50%抑制效果时的浓度IC₅₀。

2.试验结果：见表1

表1 PLK1激酶测试结果

化合物编号	IC<sub>50</sub>（nM）
		1-11*	4.07
1	0.89
		2	455.85
4	12.50
		5	2.49
5-8	>1000
		8	1.52

*即WO2009040399A1公开的化合物A1C3M2

结论：本发明多个化合物相对于WO2009040399A1公开的化合物A1C3M2具有更强的PLK1激酶抑制作用。

试验例2. 化合物对细胞增殖抑制的活性检测

1.试验方法：

将对数生长期的HCT116细胞，以每孔720个细胞的密度接种于白壁透底96孔板中，37℃，5% CO₂培养箱培养过夜，第二天，将待测化合物加入细胞中，测试化合物最高检测浓度为10 μM，3倍浓度梯度稀释。加入药物后，37℃，5% CO₂培养箱继续培养72 h后，将与细胞液等体积的ATPlite 1step Luminescence试剂（PerkinElmer）加入细胞中，室温避光孵育3min,微量振荡器500 r震荡2 min，BioTek酶标仪检测发光强度，计算细胞抑制率。用GraphPad Prism 7.0处理数据，得出细胞抑制率曲线并计算半数抑制浓度IC₅₀。

细胞抑制率(%) = [100- (Lum_待测样品-Lum_培养液)/ (Lum_阴性对照-Lum_培养液)×100]%。

2. 试验结果：见表2

表2 本发明化合物对HCT116细胞的IC₅₀

化合物编号	IC<sub>50</sub>（μM）
		1	0.032
3	3.815
		4	2.017
5	0.410
		8	0.283

结论：本发明多个化合物显示出对HCT116细胞增殖具有较好的抑制作用。