CN115814062A - Ctrp7在制备抗肿瘤血管新生药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了CTRP7在制备抗肿瘤血管新生药物中的应用。本发明中CTRP7可促进内皮细胞增殖、迁移、成管，从而促进血管新生，进而成为预防和/或治疗肿瘤发生与发展过程中抗肿瘤血管新生的新靶点。

Description

CTRP7在制备抗肿瘤血管新生药物中的应用

技术领域

本发明涉及CTRP7的应用，尤其涉及CTRP7在制备抗肿瘤血管新生药物中的应用。

背景技术

人C1q肿瘤坏死因子相关蛋白7，英文名称为CTRP7，别名为C1q And TumorNecrosis Factor-Related Protein 7；Complement-C1q Tumor Necrosis Factor-Related Protein 7；Complement C1q Tumor Necrosis Factor-Related Protein 7；包含289个氨基酸，其分子量为30683Da。NCBI参考序列号:NP_001128642.1，氨基酸序列如下：

MFVLLYVTSFAICASGQPRGNQLKGENYSPRYICSIPGLPGPPGPPGAN

GSPGPHGRIGLPGRDGRDGRKGEKGEKGTAGLRGKTGPLGLAGEKGDQG

ETGKKGPIGPEGEKGEVGPIGPPGPKGDRGEQGDPGLPGVCRCGSIVLKSA

FSVGITTSYPEERLPIIFNKVLFNEGEHYNPATGKFICAFPGIYYFSYDITLAN

KHLAIGLVHNGQYRIKTFDANTGNHDVASGSTVIYLQPEDEVWLEIFFTDQ

NGLFSDPGWADSLFSGFLLYVDTDYLDSISEDDEL

近年来，补体C1q/TNF相关蛋白(C1q/TNF-relatedproteins，CTRPs)

家族成员针对代谢紊乱性疾病的研究引起了极大的关注，其中包括代谢综合征和糖尿病。CTRP7是CTRPs家族成员中一种新型脂肪因子，其参与对心血管及代谢相关疾病的调控作用。研究表明血糖水平影响CTRP13的表达，来自不同群体的多条证据已经证明，在包括脂肪肝、糖尿病在内的代谢性疾病中，血清CTRP13的表达水平明显上升。目前尚不明确是否CTRP13可以作为抗肿瘤及血管新生药物应用的潜能。

新生血管的生成和恶性实体肿瘤的生长、侵袭、转移密切相关，而抗肿瘤血管生成药物主要作用于血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体及成纤维细胞生长因子等血管生成因子，影响肿瘤新生血管的生成，以达到抑制肿瘤增殖或转移的目的。另外，抗血管生成治疗可以使肿瘤血管正常化，改善肿瘤微环境中缺氧、间质高压等特性，从而提高放化疗、靶向治疗及免疫治疗的疗效，改善患者的预后。内皮细胞(EC)排列在所有血管的管腔内，在维持血管系统的屏障功能方面起着关键作用。在肿瘤血管的生长过程中，当其获得的营养不能够满足自身的生长需求时，肿瘤及周围间质细胞表达各种血管生长因子如血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor，FGF)及血小板衍生生长因子(PLateletderivedgrowthfactor，PDGF)等促进新生血管生成，为肿瘤生长提供营养。其中，VEGF和VEGFR起到尤为重要的作用。目前，抗肿瘤血管生成药物主要分为4类：①单靶点针对VEGF的抗体如贝伐珠单抗，其可与VEGF结合并阻断其生物活性，从而影响肿瘤血管生成；②针对VEGFR的抗体如雷莫芦单抗，可抑制VEGFR，并阻断血管生成信号转导通路的激活，从而起到抗肿瘤血管生成的作用；③多靶点的小分子血管内皮细胞生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂如索拉非尼，可抑制VEGFR、PDGFR及c-Kit等多种信号通路，从而抑制肿瘤的生长、转移；④广谱类血管内皮因子抑制剂如重组人血管内皮抑制素，作用于血管内皮细胞，抑制血管内皮细胞的迁移，从而抑制新生血管的生成，达到抑制肿瘤增殖或转移的目的。已有的研究表明CTRP7具有调节细胞信号分子及转录协调节活性，其在肿瘤相关血管新生中的作用尚无研究。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的问题，而提出的CTRP7在制备抗肿瘤血管新生药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

CTRP7在制备抗肿瘤血管新生药物中的应用。

优选的是，所述应用为CTRP7在制备抗肿瘤血管新生药物中作为VEGFR1分子信号通路激活剂的应用。

优选的是，所述应用为CTRP7在制备抗肿瘤血管新生药物中作为血管新生靶点的应用。

优选的是，所述血管新生为肿瘤血管新生。

优选的是，所述应用为CTRP7在制备抗肿瘤血管新生药物中的应用。

本发明还提供一种VEGFR1信号通路激活剂，其有效成分包括CTRP7。

本发明还提供一种抗肿瘤血管新生的防治药物的新靶点，其有效成分包括CTRP7。

本发明具有的有益效果是：

CTRP7对VEGFR1信号通路有激活作用，因此CTRP7可以成为抗肿瘤血管新生的新靶点，从而预防和/或治疗肿瘤的发生及发展；

CTRP7可作为治疗内皮细胞参与的相关疾病如视网膜血管新生、血管损伤等疾病的药物而广泛应用。

附图说明

图1为对照组和处理组小鼠肿瘤生长情况情况；

图2为对照组和处理组利用EdU实验检测HUVEC增殖情况的统计图；

图3为对照组和处理组利用成管实验检测HUVEC增殖情况；

图4为对照组和处理组利用划痕实验检测HUVEC增殖情况；

图5为对照组和处理组利用Transwell法检测HUVEC增殖情况；

图6为VEGF受体1(VEGFR1)信号通路分子蛋白的表达。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

本发明主要为CTRP7在制备抗肿瘤血管新生药物中的应用。

进一步地，所述应用为CTRP7在制备抗肿瘤血管新生药物中作为VEGFR1分子信号通路新靶点的应用。

进一步地，所述应用为CTRP7在制备抗肿瘤血管新生药物中作为血管新生激活剂的应用。

进一步地，所述血管新生为肿瘤血管新生。

进一步地，所述应用为CTRP7在制备防治抗肿瘤血管新生药物中的应用。

本发明还提供一种VEGFR1信号通路激活剂，其有效成分包括CTRP7。

本发明还提供一种抗肿瘤血管新生防治药物，其有效成分包括CTRP7。

本发明应用细胞实验研究该药物对内皮细胞增殖、迁移、成管的促进作用，本发明测试使用的VEGF购自金斯瑞，型号Z03073。分别采用下述步骤中的方法检测上述中内皮细胞的增殖、迁移、成管。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

其中和/或表示确定保护的方案内容时，各技术特征既能择其一也可两者并存。

应用EdU细胞增殖实验检测HUVEC细胞增殖情况，应用细胞划痕和transwell实验检测HUVEC细胞迁移情况，应用腺病毒转染进行CTRP7蛋白的过表达。检测方法参见HuangD,WangY,WangL,ZhangF,DengS,WangR,ZhangY,HuangK.Poly(ADP-ribose)polymerase1isindispensablefor transforminggrowthfactor-βInducedSmad3activationinvascularsmoothmuscle cell.PLoSOne.2011；6(10):e27123.应用成管实验检测HUVEC细胞成管情况。检测方法参见MariaTeresaGentile,OlgaPastorino,MaurizioBifulco,Luca Colucci-D'Amato.HUVECTube-formationAssaytoEvaluatetheImpactof NaturalProductsonAngiogenesis.JVisExp.2019；(148).

具体过程如下：

EdU细胞增殖实验：将人来源的原代脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种于96孔板中，分别使用siRNA敲低对照、siRNA敲低CTRP7、腺病毒对照和腺病毒过表CTRP7处理细胞24h。EdU的掺入分析按照制造商的说明进行(EdU染色试剂盒(C10310，广州瑞博生物))，结果用OlympuscellSensEntry拍摄。

细胞划痕实验：将HUVEC接种于6孔板中，培养至80％密度。细胞使用siRNA敲低对照、siRNA敲低CTRP7、腺病毒对照和腺病毒过表CTRP7分别处理细胞24h后，细胞单层用200μl移液管尖端划伤，大约每隔0.5-1cm一条线，划完后用PBS洗细胞3次，以去除划下的细胞，放入37度、5％CO₂培养箱培养，饥饿1h后加入VEGF(25ng/ml)刺激，分别于0、6、12、24h使用OlympuscellSensentry观察细胞，使用ImageJ程序测量伤口闭合率。

Transwell法测定细胞迁移：取200μl鼠尾胶原((C7661，Sigma，0.5mg/ml)均匀涂抹在小室的下面，自然风干；将小室放入培养板中，在上室加入200μl预温的无血清培养基，室温下静置15-30min，使基质胶水化再吸去剩余培养液。将HUVEC接种于6孔板中，培养至80％密度。细胞分别使用siRNA敲低对照、siRNA敲低CTRP7、腺病毒对照和腺病毒过表CTRP7分别处理细胞24h后，播种到上气室，然后在含有体积浓度比为10％的胎牛血清的M199中培养，500μLM199和体积浓度比为10％的胎牛血清和VEGF(25ng/ml)(对照组为等体积的DSMO)放置到下气室中。12h后，下气室用质量浓度为4％的甲醛固定细胞20min，质量浓度为0.1％的结晶紫染色20min。使用Olympus cellSens通道对迁移的细胞进行拍照。

腺病毒包装及转染：293细胞接种于1个60mm培养盘中，当细胞密度为50-70％时，将6μg质粒通过PEI转染细胞，培养6-8h后，移去培养基，加入2-3mlDMEM完全培养基(体积密度10％的FBS)，在转染后7到10天将细胞用移液器吹下来。收集溶液，离心弃上清，将细胞重悬于2.0mlPBS，于液氮中冻结细胞，37℃水浴中溶解，剧烈振荡。此步骤共进行3次，得到含病毒上清液。将293细胞以50-70％的汇合率铺于60mm培养盘中，以30-50％的体积比加入含病毒上清液。在感染后2-3天即可看到明显的细胞裂解或细胞病变效应(cytopathiceffect，CPE)现象，再次收集病毒上清。进行3轮扩增得到滴度足够的病毒。人原代HUVEC细胞培养至细胞密度为70-80％，将收集的病毒感染HUVEC细胞，24-48h后，显微镜下观测细胞荧光。

腺病毒处理：尾静脉注射小鼠，每两周一次，每次5×10⁸pfu，总量为200μl，空病毒作为空白对照；六孔板每孔细胞加腺病毒30-100μl。

内皮细胞成管实验：将50μl融化的ECM胶(356234，BD)加入96孔板中，37℃孵育30min，随后将HUVEC接种于96孔板，37℃培养4h，使用Olympus cellSens通道对成管的细胞进行拍照，并用ImageJ软件统计结果。

小鼠移植瘤生长模型实验：拟接种肿瘤前按照需要肿瘤细胞数量养好相应细胞，提前一天从－20℃取出Matrigel(BD)埋于冰中在4℃过夜融化。接种肿瘤当天将细胞消化成游离细胞悬液，清洗离心弃上清后用少许HBSS缓冲液重悬计数，按照每只小鼠0.5×10⁴个细胞，50μlMatrigel的比例按照需要量在冰上配好基质胶/肿瘤细胞悬液于洁净离心管中，冰上存放。在异氟烷吸入麻醉下，去除小鼠背部待接种部位皮肤表面毛发，用注射器抽取基质胶/肿瘤细胞悬液50μl皮下接种于小鼠背上(可见清晰隆起)，不同组小组作好相应标记。实验组及对照组小鼠采用同一环境相同饲养条件14天后观察不同组小鼠接种肿瘤生长情况，处死小鼠取出肿瘤组织观察肿瘤实体大小。

免疫荧光：取出OCT包埋的冰冻组织块，在冰冻切片机上将组织中间完整部分切取厚度为5μm的组织切片，0℃柄酮中浸泡固定2min。若为石蜡切片则先脱蜡处理后在封闭前用抗原修复液(10mM枸橼酸钠,0.05％Tween-20,pH6.0)煮沸20min再恢复至室温；用含0.025％Triton-X100的TBS缓冲液漂洗切片2×5min，滴加10％二抗来源血清(含1％BSA的TBS稀释)充分覆盖组织，室温静置2h。甩掉封闭液，用洁净滤纸轻柔醮干切片周围液体，滴加1：1000稀释的一抗(含1％BSA的TBS稀释)充分覆盖组织，4℃过夜。用含0.025％Triton-X100的TBS缓冲液漂洗切片3×5min，滴加对应荧光标记连接的二抗(1：2000稀释于含1％BSA的TBS中)，室温避光孵育1h。用含0.025％Triton-X100的TBS缓冲液漂洗切片3×5min，避光干燥后滴加含DAPI核染料的抗荧光淬灭封片剂(VECTOR)覆盖组织表面，盖上盖坡片挤压至没有气泡，用透明指甲油在盖坡片周围封片。荧光显微镜下观察：荧光显微镜下调取荧光标记对应的激发光观察切片荧光染色，拍照记录。

以下结合相关实施例来具体说明CTRP7在制备抗肿瘤血管新生药物中的应用。

实施例1

所有动物实验均按照标准程序进行，并经华中科技大学同济医学院动物伦理委员会批准。。

图1中A为8周龄雄性C57BL/6小鼠，分别给予对照(Ad-Null)、CTRP7过表腺病毒(Ad-CTRP7),鼠尾静脉注射，后肿瘤细胞悬浮液皮下接种于小鼠背上。于接种后第五天、接种后第九天、接种后第十四天、接种后第十六量取实体瘤大小。小鼠肿瘤大小变化统计图。

图1中B为8周龄雄性C57BL/6背景CTRP7敲除对照(CTRP7^flox/flox组)小鼠和内皮特异性敲除CTRP7(CTRP7ECKO)小鼠。对小鼠肿瘤细胞悬浮液皮下接种于小鼠背上。分别于接种后第五天、接种后第九天、接种后第十四天、接种后第十六天量取实体瘤大小。小鼠肿瘤大小变化统计图。

实施例2

HUVEC细胞分别给予siRNA敲低对照、siRNA敲低CTRP7、腺病毒对照和腺病毒过表CTRP7处理后，利用EdU实验检测HUVEC增殖情况。

图2中A为siRNA敲低对照组(si-Control组)和siRNA敲低CTRP7处理组(siCTRP7)利用EdU实验检测人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖情况。

图2中A为siRNA敲低对照组(si-Control组)和siRNA敲低CTRP7处理组(siCTRP7)利用EdU实验检测HUVEC增殖情况的统计图。

由图2中A可知，敲低CTRP7，抑制HUVEC细胞增殖。

图2中B为腺病毒对照组(Null组)和腺病毒过表CTRP7处理组(Ad-CTRP7)利用EdU实验检测HUVEC增殖情况。

图2中B为腺病毒对照组(Null组)和腺病毒过表CTRP7处理组(Ad-CTRP7)利用EdU实验检测HUVEC增殖情况的统计图。

由图2中B可知，过表CTRP7，促进HUVEC细胞增殖。

实施例3

图3中A为HUVEC给予siRNA敲低对照、siRNA敲低CTRP7、腺病毒对照和腺病毒过表CTRP7处理后检测HUVEC细胞成管情况。

图3中A为siRNA敲低对照组(si-Control组)和siRNA敲低CTRP7处理组(si-CTRP7)利用成管实验检测HUVEC增殖情况的统计图。

由图3中A可知，敲低CTRP7，抑制HUVEC细胞成管。

图3中B为腺病毒对照组(Null组)和腺病毒过表CTRP7处理组(Ad-CTRP7)利用成管实验检测HUVEC增殖情况。

图3中B为腺病毒对照组(Null组)和腺病毒过表CTRP7处理组(Ad-CTRP7)利用成管实验检测HUVEC增殖情况的统计图。

由图3中B可知，过表CTRP7，促进HUVEC细胞成管。

实施例4

HUVEC细胞分别用SiRNA敲低对照、siRNA敲低CTRP7、腺病毒对照和腺病毒过表CTRP7处理后，通过细胞划痕实验检测HUVEC细胞增殖迁移能力。

图4中A为siRNA敲低对照组(si-Control组)和siRNA敲低CTRP7处理组(si-CTRP7)利用划痕实验检测HUVEC增殖迁移情况统计图。

由图4中A可知，敲低CTRP7，抑制HUVEC细胞迁移增殖。

图4中B为腺病毒对照组(Null组)和腺病毒过表CTRP7处理组(Ad-CTRP7)利用划痕实验检测HUVEC增殖迁移情况统计图。

由图4中B可知，敲低CTRP7，抑制HUVEC细胞迁移增殖。

实施例5

HUVEC分别给予siRNA敲低对照、siRNA敲低CTRP7、腺病毒对照和腺病毒过表CTRP7处理24h后，给予生长因子VEGF(25ng/ml)处理12h，通过Transwell法检测细胞增殖情况。

图5中为HUVEC分别给予siRNA敲低对照组(si-Control组)和siRNA敲低CTRP7处理组(si-CTRP7)处理后，给予生长因子VEGF(25ng/ml)处理12h后，通过Transwell法检测细胞增殖情况统计图；

由图5中A可知，敲低CTRP7，显著抑制VEGF诱导的HUVEC细胞增殖。

图5中B为HUVEC分别给予腺病毒对照组(Null组)和腺病毒过表CTRP7处理组(Ad-CTRP7)处理后，给予生长因子VEGF(25ng/ml)处理12h后，通过Transwell法检测细胞增殖情况统计图。

由图5中B可知，过表CTRP7，进一步显著促进VEGF诱导的HUVEC细胞增殖。

实施例6

HUVEC分别给予siRNA敲低对照、siRNA敲低CTRP7、腺病毒对照和腺病毒过表CTRP7处理24h后，用VEGF处理后，利用蛋白免疫印迹检测VEGFR信号通路蛋白表达情况。

图6中A为HUVEC分别给予siRNA敲低对照组(si-Control组)和siRNA敲低CTRP7处理组(si-CTRP7)处理后，分别用VEGF(25ng/ml)处理0、5、15、30分钟后，利用蛋白印迹实验检测VEGF受体2(VEGFR1)信号通路蛋白的表达。

由图6中A可知，VEGF促进VEGFR1的磷酸化增加，而敲低CTRP7后，VEGF的促进作用被抑制。

图6中B为HUVEC分别给予腺病毒对照组(Null组)和腺病毒过表CTRP7处理组(Ad-CTRP7)处理后，分别用VEGF(25ng/ml)处理0、5、15、30分钟后，利用蛋白印迹实验检测VEGF受体1(VEGFR1)信号通路蛋白的表达。

由图6中B可知，VEGF促进VEGFR1的磷酸化增加，而过表CTRP7后，VEGF的促进作用被进一步激活。

综上实验结果可知，CTRP7能够直接激活VEGF诱导的VEGFR1信号通路，促进HUVEC细胞增殖、迁移、成管，促进肿瘤血管新生，加速肿瘤的生长。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.CTRP7在制备抗肿瘤血管新生药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用为CTRP7在制备抗肿瘤血管新生药物中作为VEGFR1分子信号通路激活剂的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述应用为CTRP7在制备抗肿瘤血管新生药物中作为血管新生新靶点的应用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述血管新生为肿瘤血管新生。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用为CTRP7在制备防治抗肿瘤血管新生药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的抗肿瘤血管新生药物，其特征在于：所述CTRP7为肿瘤血管新生中VEGFR1分子信号激活的激活剂。

7.一种VEGFR1信号通路激活剂，其特征中在于：有效成分包括CTRP7。

8.一种抗肿瘤血管新生药物，其特征在于：有效成分包括CTRP7。

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