CN115812671A - 帕金森病动物模型的建立方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种帕金森病动物模型的建立方法及其应用,属于神经生物学领域。本发明基于经典PD动物模型中的炎症因子水平,首次明确了趋化因子1(CXCL1)静脉注射能够导致小鼠黑质区的多巴胺能神经元的损伤,可作为PD病理研究的一种新型动物模型,并且该模型在有效模拟经典PD模型的慢性病理进展过程的基础上将慢性PD小鼠模型的给药处理从5周甚至2月的时长缩短到了2周,更是在处理仅3天就观测到了PD早期的病理改变,大大缩短了PD慢性病程研究的耗时,有效提高研究效率。
Description
技术领域
本发明属于神经生物学领域,涉及一种帕金森病动物模型,尤其涉及一种基于炎症因子(趋化因子1(CXCL1))的静脉注射入小鼠模型在帕金森病研究中的应用。
背景技术
帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种缓慢不可逆的中老年神经系统退行性疾病,其主要病理学特征为黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元进行性的缺失,残存的神经元内出现以alpha-突触核蛋白为主要成分的路易小体。黑质区DA能神经元的尸检结果是确诊PD的金标准,但临床诊断无法获得病人的脑组织,因此研究者们使用动物和体外培养的细胞开发了各种各样的实验模型,这些模型可以模仿PD的不同方面。目前的研究显示,神经炎症、脑铁异常沉积、alpha-突触核蛋白的异常沉积等均参与了PD的发病,且它们之间存在相互作用。
目前应用于PD研究的模型分为在体模型与离体模型两种,其中离体模型多应用于在体研究基础上的深入分子机制探讨,而在体动物模型的研究是临床前期研究的必要环节。在体研究的动物模型从物种上分主要有:啮齿类动物、非人灵长类动物和非哺乳动物几类。综合易操作性、可获得性、成本、以及与人类物种亲缘性等因素,啮齿类动物在帕金森病的疾病研究中应用最为广泛。
从PD模型发病机制的角度讲,现有的啮齿类动物研究模型主要分为神经毒素诱导的模型及遗传学模型。遗传学模型,例如α-突触核蛋白、parkin、LRRK2、PINK1或DJ-1等PD相关突变基因的转基因小鼠,可用于研究家族遗传性PD中特定突变的关联,但这些模型的局限性在于其难于重现PD完整的病理特征,尤其是大多数遗传模型未能诱导出PD最主要的病理特征—多巴胺能神经元的减少。另外,家族遗传型PD在PD人群中的占比本就较低,仅有约5%。而神经毒素诱导的模型,例如6-羟基多巴胺(6-OHDA),1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP),百草枯和鱼藤酮模型等,通常会产生神经炎症及氧化应激,并导致多巴胺能神经元损伤,对于环境因素导致的PD研究具有重要作用。
根据给药处理的剂量、频次及成模时间长短的不同,PD的神经毒素模型又分为急性、亚急性以及慢性模型三类,此三类模型均在PD的发病机制及防治研究中被广泛应用且各有优劣。由于PD是一种慢性的神经退行性疾病,神经毒素诱导的慢性模型通常被认为能够更好地模拟PD的病理损伤进展过程,尤其是便于研究疾病的早期病理改变。然而,现有的慢性模型耗时较长,效率低下,严重影响了研究进度。例如MPTP诱导的慢性模型需要5周以上的处理时间,而鱼藤酮的慢性模型则需要2月以上的时间。因此,构建一种耗时较短,又能有效模拟PD病理进展过程的新型慢性动物模型对于改良PD的病理研究具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种帕金森病动物模型的建立方法及其应用,该方法在有效模拟经典PD模型的慢性病理进展过程的基础上大大缩短了PD慢性病程研究的耗时,有效提高了研究效率。
为了达到上述目的,本发明提供了一种帕金森病动物模型的建立方法,通过向动物尾静脉注射趋化因子1-CXCL1,即得帕金森病动物模型。
作为优选,连续3天、每天以20ng/kg或200ng/kg的剂量向动物尾静脉注射CXCL1,以选取动物能够良好模拟经典帕金森病动物模型血清中的CXCL1含量水平。
作为优选,连续3天、每天以20ng/kg的剂量向动物尾静脉注射CXCL1,动物表现出包括神经炎症和脑铁沉积在内的帕金森病早期的病理改变。
作为优选,连续2周、每天以20ng/kg的剂量向动物尾静脉注射CXCL1,动物表现出多巴胺能神经元损伤、运动功能障碍。
作为优选,所述动物为非人哺乳动物,所述非人哺乳动物为小鼠。
本发明还提供了一种趋化因子1-CXCL1在建立帕金森病动物模型中的应用。
作为优选,所述应用为将趋化因子1-CXCL1通过动物尾静脉注射,观察动物帕金森病的表现。
作为优选,连续3天、每天以20ng/kg的剂量向动物尾静脉注射CXCL1。
作为优选,连续2周、每天以20ng/kg的剂量向动物尾静脉注射CXCL1。
本发明还提供了一种根据上述任一项技术方案所建立的帕金森病动物模型在帕金森病研究中的应用。
与现有技术相比,本发明的优点和积极效果在于:
1、本发明基于经典PD动物模型中的炎症因子水平,首次明确了趋化因子1(CXCL1)静脉注射能够导致小鼠黑质区的多巴胺能神经元的损伤,可作为PD病理研究的一种新型动物模型。
2、本发明所建立的模型了表现出PD类似的慢性病理改变过程,给药3天表现出PD早期的病理改变,例如神经炎症、脑铁沉积等;而延长给药时长至2周时,小鼠表现出多巴胺能神经元损伤、运动功能障碍等。
3、本发明在有效模拟经典PD模型的慢性病理进展过程的基础上将慢性PD小鼠模型的给药处理从5周甚至2月的时长缩短到了2周,更是在处理仅3天就观测到了PD早期的病理改变,大大缩短了PD慢性病程研究的耗时,有效提高研究效率。
附图说明
图1是本发明提供的鱼藤酮诱导的经典PD小鼠模型血清中CXCL1含量图;
图2是本发明提供的CXCL1尾静脉注射剂量选择与血清水平关系图;
图3是本发明提供的CXCL1静脉注射(20ng/kg/天)3天后,小鼠黑质区铁异常沉积图;
图4是本发明提供的CXCL1静脉注射(20ng/kg/天)3天后,小鼠黑质区小胶质细胞被显著激活图;
图5是本发明提供的CXCL1静脉注射(20ng/kg/天)3天后,小鼠黑质区铁转入蛋白DMT1阳性细胞数目增多图;
图6是本发明提供的CXCL1静脉注射(20ng/kg/天)3天后,小鼠黑质区铁转出蛋白FPN1阳性细胞数目显著减少图;
图7是本发明提供的CXCL1静脉注射(20ng/kg/天)3天后,小鼠黑质区PPAR信号通路被显著抑制图;
图8是本发明提供的CXCL1静脉注射(20ng/kg/天)3天后,小鼠黑质区GPX4阳性细胞数目显著减少,提示可能存在铁死亡;
图9是本发明提供的CXCL1静脉注射(20ng/kg/天)延长至1周后的小鼠爬杆实验结果图;
图10是本发明提供的CXCL1静脉注射(20ng/kg/天)延长至2周后的小鼠爬杆试验结果图;
图11是本发明提供的CXCL1静脉注射(20ng/kg/天)延长至2周后的小鼠转棒试验结果图;
图12是本发明提供的自CXCL1静脉注射开始前1周,每日记录小鼠体重,直至静脉注射2周,结果显示小鼠体重无明显改变;
图13是本发明提供的CXCL1静脉注射(20ng/kg/天)延长至2周后,小鼠黑质区TH阳性细胞计数减少,提示多巴胺能神经元损伤;
图14是本发明提供的CXCL1静脉注射(20ng/kg/天)延长至2周后的小鼠纹状体多巴胺转化率升高图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实验动物
12月龄的C57BL/6J雄性小鼠购买于北京维通利华实验动物技术有限公司,将小鼠单笼饲养于清洁小鼠房内,鼠笼具有独立通风系统,温度条件19±2℃,空气湿度50±5%,昼夜循环光照(12:12h),自由进食和饮水。
实验试剂
动物造模处理用试剂:趋化因子1(Chemokines 1,CXCL1,小鼠源),美国,R&Dsystem,453-KC-010;溶剂灭菌生理盐水(normal saline,NS)为国产。按照CXCL1说明书将蛋白冻干粉溶解为储存液并分装冻存于-40℃,注射前将储存液转移至室温并以灭菌NS稀释为注射液(注射液浓度分别为2ng/mL、20ng/mL),之后按10ul/g的用量分别将NS及不同浓度的CXCL1注射液尾静脉注射至相应的小鼠体内,注射液现配现用,每天给药1次。
麻醉剂:三溴乙醇(Tribromoethanol,又称阿佛丁),购自SIGMA公司,75-80-9。以15.5ml叔戊醇与25g三溴乙醇避光室温搅拌12小时,混合均匀制成储存液;取0.5ml存储液以39.5ml生理盐水稀释为1.25%的阿佛丁溶液,过滤后4℃避光保存;腹腔注射麻醉用量为0.2ml/10g。
Perls'铁染色试剂:亚铁氰化钾(sigma,CAS#:14459-95-1)、多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)、氯化钠(NaCl)、蔗糖:均为北京化工厂产品。过氧化氢(H2O2)、DAB显色试剂盒(中杉金桥,北京,ZLI-9019):为国产。中性树胶:Biosharp公司,韩国。
免疫组织化学检测试剂:酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)抗体(兔源):CST公司,58844,美国;TH抗体(鸡源):GeneTex公司,GTX85470,美国;Iba1抗体(兔源):CST公司,17198,美国;DMT1抗体(兔源):OriGene公司,TA324527,美国;膜铁转运蛋白1(ferroportin1,FPN1)抗体(兔源):GeneTex公司,GTX85744,美国;山羊抗兔二抗(goatanti-rabbit IgG):absin公司,abs20002,中国;驴抗兔红色荧光二抗:Thermo FisherScientific公司,A31572,美国;山羊抗鸡绿色荧光二抗:Thermo Fisher Scientific公司,A11039,美国;4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色液:碧云天公司,C1006,中国;Triton X-100:Biosharp公司,韩国;封闭用驴血清normaldonkey serum:Jackson Immuno Research公司,017-000-001,美国;牛血清白蛋白(Albumin bovine serum,BSA):北京索莱宝科技有限公司,A8010,中国;NaCl、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、多聚甲醛、蔗糖:北京化工厂;甘油:北京索莱宝科技有限公司,G8190,中国。
高效液相(HPLC)检测试剂:HClO4为国产,C6H5K3O7、K2HPO4、EDTA·2Na以及多巴胺(dopamine,DA,PHR1090-1G),高香草酸(homovanillic acid,HVA,69673-25MG)和二羟苯乙酸(3,4-Dihydroxyphenylacetic acid,DOPAC,11569-25MG)均购自SIGMA公司。
实施例1动物处理药物浓度的选定
(1)动物处理:首先依据鱼藤酮介导的经典PD慢性小鼠模型处理2周后血清中CXCL1的含量,估算CXCL1静脉注射剂量(约20ng/kg);随后将12月龄的C57BL/6J雄性小鼠随机分为3组,分别为NS组、20ng/kg/天CXCL1组以及200ng/kg/天CXCL1组,每组各5只,分别给予灭菌NS、2ng/mL CXCL1、20ng/mL CXCL1尾静脉注射(10ul/g,qd)。给药3天,最后1次给药后24h将小鼠处死取材。
(2)不同给药浓度的小鼠血清CXCL1含量评估:
酶联免疫检测(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)血清样品处理:小鼠麻醉后剪掉胡须,内眦取血于Ep管内,室温静置30min以上,4℃、3000rpm离心5min后保留血清进行检测。ELISA检测时,血清样本在冰上化开,CXCL1的含量检测按照小鼠CXCL1ELISA检测试剂盒(abcam公司,ab216951)说明书中的protocol进行。
检测步骤:将血清样本取出,置于冰上化开;配制标准品、洗涤液等液体;将8个标准品及待测样本依次加入各检测孔,每孔加入50μL;每孔加入50ul Capture AntibodyCocktail,室温孵育30min;倒掉孔内液体,每孔加入350μL清洗液,静置30s,倒掉清洗液并在纸上拍干,共清洗3遍;每孔加入100μL Detector Antibody Cocktail,室温孵育30min;倒掉孔内液体,清洗3遍;每孔加入100μL TMB Development Solution,室温孵育10min;每孔加入100μL Stop Solution;用酶标仪读取450nm的吸光度值;参照标准曲线计算各样本的CXCL1含量并进行统计分析。
统计处理:本项目所涉及所有数据均用SPSS19.0软件进行统计分析,两组均数的比较采用独立样本t检验进行分析;而多组均数的比较时则采用单因素方差分析(One-WayANOVA),并通过Student-Newman-Keuls进行两两组间均数的比较,结果以均数±标准误表示,P<0.05表示结果有统计学意义。
由图1-2可知,低剂量(20ng/kg/天)的CXCL1第3天静脉注射后血清CXCL1含量平均值约为43.2pg/ml,高剂量(200ng/kg/天)的CXCL1第3天静脉注射后血清CXCL1含量平均值约为91.6pg/ml(图2)。由于低剂量组小血清CXCL1含量与经典PD模型的血清水平接近(如图1所示,模型组在给药2周时血清CXCL1含量平均值约为59.8pg/ml),因此选定低剂量组(20ng/kg/天)进行后续研究。
实施例2低剂量CXCL1给药3天后小鼠黑质区出现PD早期病理改变
实验仪器:冰冻切片机(Leica公司,德国,型号CM1900);超纯水机(Millipore公司,美国);数字病理切片扫描系统(Olympus公司,日本,型号VS120)。
溶液配制:
0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS):分别称取Na2HPO4·12H2O 27.2g,NaH2PO4·2H2O 2.8g,NaCl 9g,用双蒸水溶解并定容至1000mL。
0.01mol/L PBS:分别称取Na2HPO4·12H2O 2.72g,NaH2PO4·2H2O 0.28g,NaCl0.9g,用双蒸水充分溶解并定容至1000mL。
PBST:在0.01mol/L的PBS中按3‰的浓度加入Triton X-100并充分溶解混匀。
70%甘油:以双蒸水稀释甘油液体并混匀。
4% PFA溶液:40g PFA以0.1mol/L的PBS溶液定容至1000mL,磁力搅拌器搅拌过夜(必要时50℃加热)至溶液澄清(PH为7.4)。在通风橱内过滤后使用。
20%蔗糖溶液:以0.1mol/L的PBS溶液充分溶解20g蔗糖并最终定溶至100mL。
30%蔗糖溶液:以0.1mol/L的PBS溶液将30g蔗糖充分溶解并最终定溶至100mL。
2%亚铁氰化钾溶液:称取0.5g亚铁氰化钾,以24.5mL双蒸水充分溶解。
2%盐酸溶液:用移液枪吸取36.8%的浓盐酸溶液至双蒸水中,稀释并混匀为2%的浓度。
DAB溶液:按照说明书,将预混的检测液按照1滴/mL的浓度进行稀释并混匀。
组织样品处理:用质量分数1.25%的三溴乙醇腹腔注射将小鼠麻醉(用量20mL/kg)。充分麻醉后的小鼠固定于泡沫平板上,用皮剪自胸骨剑突下剪开皮肤及皮下组织并沿肋弓剪开至腋下,再用眼科剪剪开腹壁肌层以及腹膜。随之剪开膈肌、充分暴露胸腔。固定心尖,将以NS排气后的注射针头经心尖插入小鼠的左心室,剪开右心耳。匀速推注常温NS直至小鼠肝脏颜色变白,且右心耳流出液体基本无色,然后改用预冷的4%多PFA溶液继续灌注,直至小鼠头部、四肢以及肝脏均发硬为止。将小鼠断头,取出完整的鼠脑,并将其置于4% PFA溶液中,4℃静置6h以固定,再以20%及30%蔗糖溶液先后对脑组织进行充分脱水。参照小鼠脑立体定位图谱,用冰冻切片机沿鼠脑冠状面进行连续切片(脑片厚度为20μm)。将切好的脑片按先后顺序置于0.01mol/L的PBS中,稍后转移储存于冻存液中备用,可用于下述Perls'铁染色及免疫组织化学检测。
(1)Perls'铁染色:一种常用的组织化学染色方法,通过铁与酸化的亚铁氰化钾溶液反应形成蓝色的铁氰化铁沉淀(普鲁士蓝)以检测组织细胞中的Fe3+。但由于脑组织铁含量较少,蓝色沉淀生成过少,难以观察到。为了提高反应灵敏度,在此基础上加入二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)强化,从而使Fe3+阳性细胞显示为棕褐色沉淀。本实验使用Perls’铁染色联合DAB强化的方法对脑铁进行检测,探讨CXCL1诱导的PD模型小鼠脑内铁沉积在脑内分布情况。
铁染色程序:将脑片(从黑质的第二组冻存脑片中随机选取2-3片)捞至4% PFA溶液内固定5min;随后将脑片捞至去离子水中漂洗30s;将2%亚铁氰化钾与2% HCl溶液等体积混合(现配现用),然后将用去离子水漂洗过的脑片捞入其中室温摇床孵育30min;随后以0.01mol/L的PBS漂洗3遍(5min/次);再将脑片以1% H2O2-甲醇溶液室温摇床孵育20min,以灭活假阳性过氧化物酶和内源性过氧化氢酶;用0.01mol/L的PBS漂洗脑片3遍(5min/次);随后将脑片捞至DAB显色液中避光显色(15min),首次显色时需显微镜下观察显色情况以选取合适的显色时长;双蒸水终止显色;将终止显色的后的脑片展平并铺于洁净的载玻片上;待脑片充分干燥后以中性树胶封片;以Olympus数字病理切片扫描系统明场显微镜下观察并拍片存档。
铁阳性细胞计数及统计:每个脑区铁阳性细胞最明显处,在20倍物镜下取3个视野,采用Image J软件对每个视野内的铁阳性细胞进行计数,取其平均值用以反映小鼠该脑区的铁阳性细胞水平。
由图3所示,CXCL1静脉注射(20ng/kg/天)3天后,小鼠黑质区铁阳性细胞计数显著增加,提示小鼠黑质出现了异常的铁沉积。
(2)免疫组织化学检测
FPN1、GPX4免疫组织化学染色程序:在24孔板中加入4% PFA溶液,将切好的脑片捞入其中固定5min;0.01mol/L PBS漂洗10min×3遍;以PBST溶解稀释的5% BSA溶液封闭脑片30-60min;随后将脑片捞至用封闭液稀释的FPN1一抗中,并置于4℃摇床上孵育过夜;随后以0.01mol/L的PBS漂洗10min×3遍;山羊抗兔二抗(以PBST 1:500稀释)室温摇床孵育2h;0.01mol/L的PBS漂洗10min×3遍;DAB溶液显色(1min),显微镜下观察显色情况;双蒸水及时终止显色;随后将显色后的脑组织切片铺展于载玻片上,充分干燥后中性树胶封片。
Iba1、DMT1及PPARγ的免疫荧光检测程序:封闭、一抗、二抗孵育步骤同免疫组织化学检测,二抗为山羊抗鸡绿色荧光二抗和山羊抗兔红色或绿色荧光二抗。二抗孵育结束后在二抗孵育液中加入DAPI染色液(体积比约为2:1),震荡混匀后放回室温摇床上继续孵育5min;0.01mol/L的PBS漂洗10min×3遍后将脑片平铺至洁净的载玻片上并吸走多余水分。在完全干燥前及时用70%甘油进行封片,注意避免产生气泡。
细胞计数及统计:以Olympus数字病理切片扫描系统明场或荧光显微镜下观察并拍片存档Iba1、DMT1、FPN1、PPARγ及GPX4阳性细胞染色结果,在20倍物镜下取3个黑质区的视野,采用Image J软件对每个视野内的铁阳性细胞进行计数,取其平均值用以反映小鼠该脑区的相应蛋白表达水平。
由图4-8可知,低剂量(20ng/kg/天)的CXCL1注射3天后,小鼠黑质区Iba1阳性细胞计数显著增加(图4),提示小胶质细胞被激活;铁转入蛋白DMT1阳性细胞计数显著增加(图5),铁转出蛋白FPN1阳性细胞计数显著减少(图6),提示小鼠黑质铁代谢紊乱;PPARγ阳性细胞计数显著减少(图7),提示PPAR信号通路被抑制;GPX4阳性细胞计数显著减少(图8),提示小鼠黑质可能存在铁死亡。以上结果提示尾静脉注射CXCL1(20ng/kg/天)3天后,小鼠黑质区表现出PD早期病理改变,例如神经炎症以及黑质区的脑铁铁异常沉积。
实施例3低剂量CXCL1给药延长至2周后小鼠出现显著的PD样运动症状
(1)低剂量组延长给药处理时间:另设低剂量(20ng/kg/天)的CXCL1静脉注射组与NS对照组,每天持续给药1周后,进行运动行为学检测。在第2周给药结束后,检测到小鼠运动协调能力下降。给药期间每日对小鼠的体重进行监测记录。
(2)运动行为学检测,包括爬杆试验和旋转棒试验,具体如下:
爬杆实验
实验仪器:定制的爬杆设备,杆长100cm,顶端带有一直径3cm的圆球,杆垂直于地面,底部牢固焊接于金属底座之上,杆及顶部圆球表面包裹缠绕医用布胶带,便于小鼠攀抓。
实验目的:对小鼠的运动协调性进行测试。
操作步骤:实验时将爬杆装置置于100cm×50cm左右大小的笼筐内,并以干净的新垫料铺于笼底,没过爬杆的金属底座。正式实验前1天对小鼠进行训练,具体操作为:将小鼠以头朝下的方向放于杆的顶部,小鼠自杆顶爬至杆底,如此反复2-3次。正式实验时,将小鼠以头向上的方向放于杆的顶部,小鼠会先调转方向头朝下然后顺着杆爬下。对小鼠调转方向、顺杆爬下的过程进行分段计时。重复3次,对3次记录的调头时间、爬下时间以及总用时取平均值并分析。
由图9-10可知,CXCL1静脉注射(20ng/kg/天)在延长至1周后,小鼠爬杆实验结果显示小鼠调头时间延长,提示小鼠运动协调性有一定程度的降低(图9);延长至2周后,小鼠爬杆试验结果显示小鼠调头时间及调头并爬下的总时长均显著延长,提示小鼠运动协调性显著降低(图10)。
旋转棒试验
实验仪器:Med Associates,Inc.,型号为ENV-574M,美国。
实验目的:主要对小鼠的运动协调性进行测试。
操作步骤:将旋转棒转速设为4~40转/分(rpm),时长5分钟。将小鼠面向墙壁放于放于旋转棒上适应2分钟,仪器静止并避免小鼠滑落。适应时间结束后启动仪器,小鼠开始在转动的旋转棒上爬行,旋转棒在5min的时间内从4rpm匀加速旋转至40rpm,系统自动记录小鼠在旋转棒上坚持停留的时间(retention time)以及小鼠跌落时的旋转棒转速(endspeed)。采用非连续性测量法测定两次,两次测试间隔1小时以上,取两次测量数值的平均值。小鼠在旋转棒上坚持的时间越短,跌落时的转速越慢,表示小鼠的运动协调能力越差。
由图11-12可知,CXCL1静脉注射(20ng/kg/天)在延长至2周后,小鼠转棒试验结果显示小鼠棒上停留时间及掉下时的转棒转速均显著缩,(图11),提示小鼠运动协调性显著降低;小鼠体重没有显著差别(图12),提示CXCL1静脉注射未对小鼠体重产生影响。
实施例4低剂量CXCL1给药延长至2周后小鼠出现显著的多巴胺能神经元损伤
仪器设备及溶液配制:参考实施例2。
样本处理:在参考实施例2的基础上将黑质脑组织切片留取方式改为每间隔3片留取1片(共4套)。
TH免疫荧光染色程序:参考实施例2,每只小鼠对1套脑片进行染色计数。
黑质区TH阳性细胞计数:对每只小鼠1套脑片的单侧黑质TH阳性细胞数的总数计数后乘以4,以该数值反应小鼠黑质多巴胺能神经元的数量。DAPI染色用于标记细胞核,辅助识别阳性细胞。
由图13可知,CXCL1静脉注射(20ng/kg/天)在延长至2周后,小鼠黑质区TH阳性细胞数显著减少,提示小鼠黑质区多巴胺能神经元被显著损伤。
实施例5低剂量CXCL1给药延长至2周后小鼠出现显著的多巴胺代谢异常
仪器设备:Thermo Scientific,UltiMate 3000。
试剂:甲醇等流动相配制时使用的试剂均需达到分析纯纯度,配好的流动相需要以0.22μm孔径的滤膜过滤并超声处理后再上机使用。检测用标准品多巴胺(DA,PHR1090),3,4-二羟基苯乙酸(DOPAC,11569)和高香草酸(HVA,69637)均购自sigma公司。
样品处理:将纹状体置于EP管中并称重,每管加入120μL A液(0.4M HClO4),充分研磨后冰上静置1小时,随后进行离心(4℃,12000转,30分钟)。将80μL上清转移到空的EP管中,然后加入40μL液体B(1.6g C6H5K3O7,13.06g K2HPO4,0.185g EDTA·2Na溶于250mL双蒸馏水中)。把混合好的样品放在冰上1小时,然后再次离心。过滤上清液,最后用HPLC仪器检测。
由图14可知,CXCL1静脉注射(20ng/kg/天)在延长至2周后,小鼠纹状体中DA含量降低,代谢产物DOPAC及HVA含量显著增多,DA转化率(DOPAC+HVA)/DA显著升高。
Claims (10)
1.帕金森病动物模型的建立方法,其特征在于,通过向动物尾静脉注射趋化因子1-CXCL1,即得帕金森病动物模型。
2.根据权利要求1所述的建立方法,其特征在于,连续3天、每天以20ng/kg或200ng/kg的剂量向动物尾静脉注射CXCL1,以选取动物能够良好模拟经典帕金森病动物模型血清中的CXCL1含量水平。
3.根据权利要求2所述的建立方法,其特征在于,连续3天、每天以20ng/kg的剂量向动物尾静脉注射CXCL1,动物表现出包括神经炎症和脑铁沉积在内的帕金森病早期的病理改变。
4.根据权利要求1所述的建立方法,其特征在于,连续2周、每天以20ng/kg的剂量向动物尾静脉注射CXCL1,动物表现出多巴胺能神经元损伤、运动功能障碍。
5.根据权利要求1-4任一项所述的建立方法,其特征在于,所述动物为非人哺乳动物,所述非人哺乳动物为小鼠。
6.趋化因子1-CXCL1在建立帕金森病动物模型中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述应用为将趋化因子1-CXCL1通过动物尾静脉注射,观察动物帕金森病的表现。
8.根据权利要求6或7所述的应用,其特征在于,连续3天、每天以20ng/kg的剂量向动物尾静脉注射CXCL1。
9.根据权利要求6或7所述的应用,其特征在于,连续2周、每天以20ng/kg的剂量向动物尾静脉注射CXCL1。
10.权利要求1-5任一项所建立的帕金森病动物模型在帕金森病研究中的应用。
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