CN115808525A - RabGGTase在肌萎缩侧索硬化诊断和治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学领域，具体涉及RabGGTase在肌萎缩侧索硬化诊断和治疗中的应用。本发明发现，与健康者比较，ALS患者的外周血单核‑巨噬细胞中RabGGTA和RabGGTB水平均高表达，并且伴随炎症因子IL‑6、TNF‑α、IL‑1β的表达水平升高；给予RabGGTB的抑制剂NE10790处理细胞后，能够选择性抑制巨噬细胞中RabGGTB的表达，同时明显地减少了炎症因子IL‑6、TNF‑α、IL‑1β的表达，对神经元起到保护作用。

Description

RabGGTase在肌萎缩侧索硬化诊断和治疗中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及RabGGTase在肌萎缩侧索硬化诊断和治疗中的应用。

背景技术

肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一种慢性、进行性、致死性神经变性疾病，发病率约为5/10万-7/10万。表现为脊髓前角细胞、脑干、大脑皮层的运动神经元发生退行性改变。平均生存期3-5年，最终因肌肉萎缩无力、呼吸衰竭而死亡。甘油三酯、胆固醇、尿酸、肌酐、铁蛋白、白蛋白等多种生物标记物被提议作为ALS预后的因素，然而，仍未达成共识。自噬是一种高度保守的降解机制，有助于维持细胞稳态。在真核细胞中有三种自噬途径：巨自噬、伴侣介导的自噬和微自噬。越来越多的证据支持ALS存在自噬功能障碍，自噬在ALS发病中发挥重要作用。有研究发现抑制甲羟戊酸通路加重SOD1G93A小鼠自噬通量的损伤，导致SOD1蛋白的聚集增加，并且通过抑制Rab7活化而阻断自噬体与溶酶体融合。Rab7异戊二烯化修饰异常可能是加重ALS模型细胞自噬异常的重要原因之一。Rab7受到异戊二烯化转移酶(RabGGTase)的修饰而活化。

ALS仍是一种无法治愈的疾病，目前缺乏有效的治疗方法，美国FDA认证的力如太、依达拉奉对其治疗作用非常有限，因此迫切需要早期诊断，早期治疗，寻找有效的治疗靶点开发药物来延缓疾病的进程，延长生存期。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种诊断肌萎缩侧索硬化的生物标志物RabGGTase(包括RabGGTA、RabGGTB)，使用该生物标志物RabGGTase，可以评估受试者是否患有肌萎缩侧索硬化或者存在发展肌萎缩侧索硬化的风险；同时本发明发现RabGGTB的抑制剂可用来治疗肌萎缩侧索硬化。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了检测样本中RabGGTase的试剂在制备诊断肌萎缩侧索硬化、判断神经元细胞活性的产品中的应用。

进一步，所述检测样本中RabGGTase的试剂包括检测样本中RabGGTase的蛋白表达水平的试剂、检测样本中RabGGTase的mRNA表达水平的试剂。

进一步，所述检测样本中RabGGTase的试剂为检测样本中RabGGTase的蛋白表达水平的试剂。

进一步，所述检测样本中RabGGTase的蛋白水平表达的试剂为流式细胞术中所使用的试剂，或者是以下方法中所使用试剂：蛋白质印迹法、酶联免疫吸附测定、放射性免疫测定、夹心测定、免疫组织化学染色、质谱检测法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法或蛋白质芯片法。

进一步，所述样本选自组织、血液、尿液、脑脊液、细胞系、细胞培养物或组织间液。

进一步，所述血液包括血液衍生的细胞、血小板、血清、血浆。

进一步，所述血液衍生的细胞包括有核细胞；所述有核细胞包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、淋巴细胞、粒细胞。

进一步，所述样本为单核细胞、巨噬细胞。

进一步，所述RabGGTase包括RabGGTA、RabGGTB。

进一步，所述检测样本中RabGGTase的试剂包括检测单核细胞中RabGGTA或RabGGTB的试剂、检测巨噬细胞中RabGGTB的试剂。

进一步，所述神经元细胞活性包括以下特征：细胞活力、细胞凋亡程度。

本发明的第二方面提供了一种诊断肌萎缩侧索硬化、判断神经元细胞活性的产品，所述产品包括检测RabGGTase的表达水平所使用的试剂。

进一步，所述产品包括制剂、试剂盒、芯片或核酸膜条。

进一步，所述试剂盒包括通过RT-PCR法、RT-qPCR法、生物芯片检测法、DNA印迹法、原位杂交法、蛋白质印迹法、流式细胞术、免疫荧光法、免疫组化法、ELISA、电化学发光法等检测RabGGTase蛋白或mRNA表达水平的试剂。

进一步，所述产品还包括处理样本的试剂。

进一步，所述处理样本的试剂包括分离单核细胞的试剂或促进单核细胞分化为巨噬细胞的试剂。

进一步，所述分离单核细胞的试剂包括淋巴细胞分离液、单核细胞分离液。

进一步，所述分离单核细胞的试剂为淋巴细胞分离液。

进一步，所述促进单核细胞分化为巨噬细胞的试剂包括巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞刺激因子、佛波酯。

进一步，所述促进单核细胞分化为巨噬细胞的试剂为巨噬细胞集落刺激因子。

本发明的第三方面提供了RabGGTase在制备治疗肌萎缩侧索硬化、保护神经元的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括RabGGTase的抑制剂。

进一步，所述抑制剂特异性抑制RabGGTase的表达。

进一步，所述抑制剂包括核酸抑制物、蛋白抑制物、化合物抑制物；所述核酸抑制物包括shRNA、siRNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸；所述蛋白抑制物包括蛋白水解酶、蛋白结合分子；所述化合物抑制物包括二磷酸利塞磷酸盐的磷酸酯类似物。

进一步，所述二磷酸利塞磷酸盐的磷酸酯类似物包括NE10790。

进一步，所述保护神经元包括提高细胞活力、抑制细胞凋亡。

进一步，所述RabGGTase包括RabGGTA、RabGGTB。

进一步，所述RabGGTase为RabGGTB。

本发明的第四方面提供了一种治疗肌萎缩侧索硬化、保护神经元的药物组合物，所述药物组合物包括RabGGTase的抑制剂。

进一步，所述抑制剂特异性抑制RabGGTase的表达。

进一步，所述抑制剂包括核酸抑制物、蛋白抑制物、化合物抑制物；所述核酸抑制物包括shRNA、siRNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸；所述蛋白抑制物包括蛋白水解酶、蛋白结合分子；所述化合物抑制物包括二磷酸利塞磷酸盐的磷酸酯类似物。

进一步，所述二磷酸利塞磷酸盐的磷酸酯类似物包括NE10790。

进一步，所述RabGGTase包括RabGGTA、RabGGTB。

进一步，所述RabGGTase为RabGGTB。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

本发明的第五方面提供了如下任一种方法：

1)保护神经元的方法，所述方法包括抑制RabGGTase的表达。

2)判断神经元细胞活性的方法，所述方法包括检测RabGGTase的表达水平。

进一步，1)中所述的方法为非治疗目的保护神经元的方法。

进一步，2)中所述的方法为非诊断目的判断神经元细胞活性的方法。

进一步，所述神经元细胞包括哺乳动物神经元细胞。

进一步，所述哺乳动物神经元细胞包括狗神经元细胞、猪神经元细胞、兔神经元细胞、啮齿目动物神经元细胞或灵长类神经元细胞。

进一步，所述啮齿目动物神经元细胞包括鼠神经元细胞。

进一步，所述鼠神经元细胞包括NSC34鼠神经元细胞。

进一步，所述RabGGTase包括RabGGTA、RabGGTB。

进一步，所述RabGGTase为RabGGTB。

本发明的第六方面提供了一种肌萎缩侧索硬化诊断系统，所述诊断系统包含：

检测构件：所述检测构件用于检测RabGGTase的表达水平；

结果判断构件：所述结果判断构件用于根据所述检测构件检测得到的RabGGTase的表达水平的结果，输出受试者是否患有肌萎缩侧索硬化的风险。

进一步，所述生物标志物RabGGTase的表达水平包括RabGGTase的mRNA表达水平、RabGGTase的蛋白表达水平。

进一步，所述检测构件包括qPCR试剂盒、ELISA试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、电化学发光检测试剂盒、qPCR仪、ELISA检测装置、免疫印迹检测装置、流式细胞分析装置、免疫组化检测装置、免疫层析检测装置或电化学发光检测装置。

进一步，所述结果判断构件含有输入模块、分析模块和输出模块；输入模块用于输入RabGGTase的表达水平；分析模块用于根据RabGGTase的表达水平，分析出受试者是否患有肌萎缩侧索硬化的风险；输出模块用于输出分析模块的分析结果。

本发明的第七方面提供了RabGGTase在筛选治疗肌萎缩侧索硬化的候选药物中的应用。

进一步，筛选治疗肌萎缩侧索硬化的候选药物的方法如下：用待筛选物质处理表达或含有RabGGTase基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中RabGGTase基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质抑制RabGGTase基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是治疗肌萎缩侧索硬化的候选药物。

进一步，所述RabGGTase包括RabGGTA、RabGGTB。

进一步，所述RabGGTase为RabGGTB。

本发明的第八方面提供了一种筛选治疗肌萎缩侧索硬化的候选药物的方法，所述方法包括用待筛选物质处理表达或含有RabGGTase基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中RabGGTase基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质抑制RabGGTase基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是治疗肌萎缩侧索硬化的候选药物。

进一步，所述RabGGTase包括RabGGTA、RabGGTB。

进一步，所述RabGGTase为RabGGTB。

本发明的第九方面提供了本发明第四方面所述的药物组合物在制备降低炎症因子表达的产品中的应用。

进一步，所述炎症因子包括IL-6、TNF-α、IL-1β。

本发明的优点和有益效果：

本发明发现了一种与肌萎缩侧索硬化的发生发展相关的分子标志物-RabGGTase(包括RabGGTA、RabGGTB)基因，通过检测受试者外周血单核-巨噬细胞中RabGGTase的表达水平，可以判断受试者是否患有肌萎缩侧索硬化，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案；利用分子标记物来实现疾病的诊断和治疗，相比传统手段，具有更高的特异性和灵敏度。

本发明同时发现RabGGTB的抑制剂NE10790处理ALS患者的巨噬细胞后，可以促进神经元细胞的增殖、提高神经元细胞的活性、减少神经元细胞的凋亡，提示可以将RabGGTB应用于ALS的治疗。

附图说明

图1是流式细胞术检测RabGGTB、RabGGTA蛋白表达的结果图，其中1A是RabGGTB蛋白在对照的流式检测图，1B是RabGGTB蛋白在ALS组的流式检测图，1C是RabGGTB蛋白表达结果统计图，1D是RabGGTA蛋白在对照组的流式检测图，1E是RabGGTA蛋白在ALS组的流式检测图，1F是RabGGTA蛋白表达结果统计图；

图2是免疫荧光染色检测RabGGTB及炎症相关因子的表达水平的结果图，其中，2A是RabGGTB及IL-1β表达水平的结果图，2B是RabGGTB表达水平的统计图，2C是IL-1β表达水平的统计图，2D是IL-6及TNF-α表达水平的结果图，2E是IL-6表达水平的统计图，2F是TNF-α表达水平的统计图；

图3是ELISA检测炎症相关因子的差异表达的结果图，其中，3A是IL-6在对照组和ALS组的差异表达统计图，3B是TNF-α在对照组和ALS组的差异表达统计图，3C是IL-1β在对照组和ALS组的差异表达统计图，3D是IL-6在ALS组和ALS+NE10790组的差异表达统计图，3E是TNF-α在ALS组和ALS+NE10790组的差异表达统计图，3F是IL-1β在ALS组和ALS+NE10790组的差异表达统计图；

图4是CCK-8检测神经元细胞生存率的统计图，其中4A是NSC34-E神经元细胞生存率统计图，4B是NSC34-SOD1G93A神经元细胞生存率统计图；

图5是免疫荧光检测神经元细胞凋亡的情况图，其中5A是NSC34-E神经元细胞凋亡的结果图，5B是NSC34-SOD1G93A神经元细胞凋亡的结果图；

图6是EDU检测神经元细胞增殖的情况图，其中6A是NSC34-SOD1G93A神经元细胞增殖的结果图，6B是NSC34-SOD1G93A神经元细胞增殖的统计图；

图7是诊断效能曲线图，其中7A是RabGGTA的ROC曲线图，7B是RabGGTB的ROC曲线图.

具体的实施方式

本发明通过广泛而深入的研究，通过收集ALS患者以及健康体检者的外周血样本，发现RabGGTase(包括RabGGTA、RabGGTB)在ALS患者外周血中的含量显著高于健康体检者，同时伴有炎症水平的升高。采用NE10790抑制RabGGTB的表达发现可以改善炎症反应、保护神经元细胞。

“基因标志物”也称为“生物标志物”或“分子标志物”，在本发明中三者可互换使用，基因标志物是指在组织或细胞中的表达水平与正常或健康细胞或组织的表达水平相比发生改变的任何基因或蛋白。

基因标志物可以在任何水平上差异地存在，但是一般以如下的水平存在，所述水平增加了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、或更多；或一般以如下的水平存在，所述水平减少了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％(即不存在)。

在本发明的具体实施方式中，所述基因标志物为RabGGTase(包括RabGGTA、RabGGTB)。

RabGGTA包括野生型、突变型或其片段。该术语涵盖全长，未加工的RabGGTA，以及源自细胞中加工的任何形式的RabGGTA。该术语涵盖RabGGTA的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。该术语涵盖例如RabGGTA基因，人的RabGGTA以及来自任何其它脊椎动物来源，包括哺乳动物，诸如灵长动物和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的RabGGTA。作为一种优选的实施方案，在本发明中，RabGGTA为人的基因，基因ID为5875。

RabGGTB包括野生型、突变型或其片段。该术语涵盖全长，未加工的RabGGTB，以及源自细胞中加工的任何形式的RabGGTB。该术语涵盖RabGGTB的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。该术语涵盖例如RabGGTB基因，人的RabGGTB以及来自任何其它脊椎动物来源，包括哺乳动物，诸如灵长动物和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的RabGGTB。作为一种优选的实施方案，在本发明中，RabGGTB为人的基因，基因ID为5876。

在本发明中，术语“诊断”指预测性的过程，其中评价了疾病、疾患或其他医学病症的存在、不存在、严重性或治疗进程。为了本发明的目的，诊断还包括用于确定治疗结果的预测性的过程。类似的，术语“诊断”指确定受治疗者是否展现病症或疾病的一个或多个特征。术语“诊断”包括确立例如靶抗原或结合试剂的靶的存在或不存在，或确立或以其他方式确定病症或疾病的一个或多个特征，包括类型、等级、阶段、或类似情况。术语“诊断”包括最初的诊断或检测，预后，和病症或疾病的监控。另外，例如在“疾病或病症进程的监控”中的术语“监控”指进行中的对从具有或疑似具有疾病或病症的受治疗者获得的样本的诊断。

在本发明中，术语“肌萎缩侧索硬化”即amyotrophic lateral sclerosis，通常缩写为ALS，亦称为运动神经元病(motor neuron disease，MND)，后一名称英国常用，法国又叫夏科(Charcot)病，而美国也称卢伽雷(Lou Gehrig)病。我国通常将肌萎缩侧索硬化和运动神经元病混用。以上术语皆为相同含义，在本发明中可以互换使用。优选地，所述肌萎缩侧索硬化包括SOD1突变型肌萎缩侧索硬化，所述SOD1突变后易错误折叠并形成聚集体，在本发明的具体实施例中，肌萎缩侧索硬化的模型为SOD1发生G93A突变而产生的肌萎缩侧索硬化。

本发明包含用于检测RabGGTase的表达的现有技术中任何可用方法。本发明RabGGTase的表达可在mRNA水平或蛋白质水平上被检测。通过“检测RabGGTase的表达”旨在确定RNA转录产物或其RabGGTase基因的表达产物的数量或存在。“检测RabGGTase的表达”包含RabGGTase被确定不能被表达、不能被检测表达，表达在低水平、表达在正常水平或过表达的实例。

本发明可以使用本领域普通技术人员已知的多种mRNA以及蛋白技术进行检测。优选地，mRNA检测技术包括但不限于：RT-PCR法、RT-qPCR法、生物芯片检测法、DNA印迹法、原位杂交法(ISH)。优选地，蛋白检测技术包括但不限于：蛋白质印迹法、流式细胞术、免疫组化法、免疫沉淀分析法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、电化学发光法、夹心测定、质谱检测法、荧光免疫测定(FIA)、放射免疫测定(RIA)、补体结合分析法或蛋白质芯片法。

在本发明中，术语“表达水平”是指生物标记物分子或基因组的量、积累或速率。表达水平可以例如由以下来表示：由基因编码的信使RNA(mRNA)的量或合成速率、由基因编码的多肽或蛋白质的量或合成速率、或在细胞或生物流体中积累的生物分子的量或合成速率。

在本发明中，提供了一种诊断肌萎缩侧索硬化、判断神经元细胞活性的产品，所述产品包括能够检测RabGGTase表达水平的制剂、试剂盒、芯片或核酸膜条。

“芯片”包括基因芯片、蛋白芯片；所述基因芯片包括固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于RabGGTase所示的部分或全部序列。所述蛋白芯片包括固相载体，以及固定在固相载体上的RabGGTase编码的蛋白的特异性结合剂。所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

特异性结合剂是例如蛋白质RabGGTase的受体、结合蛋白质RabGGTase的凝集素、针对蛋白质RabGGTase的抗体、针对蛋白质RabGGTase的肽抗体(peptidebody)、双特异性双重结合剂或双特异性抗体形式。

“试剂盒”可用于检测RabGGTase基因或蛋白的表达水平，包含用于RabGGTase检测和/或定量的引物、寡核苷酸探针、配体、和/或芯片。选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对疾病发展进行判断、对治疗方案进行选择。

试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

“核酸膜条”包括基底和固定于所述基底上的特异性识别RabGGTase的探针；所述基底可以是任何适于固定探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。

在本发明中，术语“样本”是指获得自或衍生自受试者(例如感兴趣的个体)的组合物，其包含有待根据例如物理、生化、化学和/或生理特点来表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。样本包括但不限于：组织样本、原代或培养的细胞或细胞系、细胞上清、细胞裂解物、血小板、血清、血浆、玻璃体液、淋巴液、滑液、滤泡液、精液、羊水、乳、血液、血液衍生的细胞、尿液、脑脊髓液、唾液、痰、泪、汗液、粘液、组织培养液、组织提取物如匀浆化的组织、细胞提取物及其组合；优选地，所述血液衍生的细胞包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、淋巴细胞、粒细胞；在本发明的具体实施例中，所述样本为单核细胞、巨噬细胞。

单核细胞是骨髓源免疫效应细胞，其循环于血液、骨髓和脾脏中并且在稳态条件中具有有限的增殖。单核细胞发现于外周血单核细胞(PBMC)中，所述外周血单核细胞还包含其他造血细胞和免疫细胞(例如B细胞、T细胞、NK细胞等)。通过来自称为单核母细胞的造血干细胞前体的骨髓来产生单核细胞。在本发明的阐述中，单核细胞可经由巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)分化成巨噬细胞。术语“单核细胞”涵盖未分化单核细胞以及由其分化的细胞类型(包括巨噬细胞和树突状细胞)。在一些实施方案中，术语“单核细胞”可指未分化单核细胞。

术语“巨噬细胞”通常是指一种由单核细胞穿出血管后发育而来的髓样免疫细胞，广泛分布于机体组织的各个脏器中。其在正常组织中的主要生理作用是：通过加工和呈递抗原的方式介导特异性免疫反应；以固定细胞或游离细胞的形式吞噬并降解坏死细胞、碎片和异物，继而参与机体内非特异性反应；通过分泌炎症因子激活淋巴球或其他免疫细胞，进而协调炎症过程。

术语“淋巴细胞分离液”可为本领域公知的淋巴细胞分离液，例如可以是索莱宝LTS1077。在本领域中，淋巴细胞分离液的成分是一致的，如在本发明的实施方案中是指由葡聚糖和泛影葡胺组成的混合物，是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞的分离纯化的常用试剂，其密度为1.077g/mL。

术语“巨噬细胞集落刺激因子”或短形式“M-CSF”是指分泌的造血生长因子，其参与单核细胞、巨噬细胞和骨髓祖细胞的增殖、分化和存活。它与集落刺激因子1受体结合。在一些实例中、分化培养基中的M-CSF的浓度为约1至约500ng/ml、或约10至约450ng/ml、或约20至约400ng/ml、或约30至约350ng/ml、或约40至约300ng/ml、或约50至约250ng/ml、或约60至约200ng/ml、或约70至约180ng/ml、或约80至约160ng/ml、或约90至约140ng/ml、或约100至约120ng/ml、或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480或500ng/ml。在本发明具体实施例中，分化培养基中的M-CSF浓度为20ng/ml。

在本发明中，术语“治疗”通常涉及治疗和理疗人或动物，其中实现一些期望的治疗效果，例如抑制疾病进展，并包括降低进展率、停止进展率、减轻疾病症状、改善疾病和治愈疾病。也包括作为预防性手段(即，预防)的治疗。例如，术语“治疗”也包括对尚未发生疾病但是有发生疾病的危险的病人的应用。

在本发明中，术语“药物组合物”指包含至少一种生物活性化合物。本发明所述的药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。本发明的药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。在某些情况下，药用酸、碱或缓冲剂可用来调节制剂的pH以提高所配制的化合物或其给药剂型的稳定性。本发明所用术语非胃肠道包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞠内、损伤部位内、和颅内注射或输注技术。只要能达到目标组织，本发明所述药物组合物可以通过任何途径给予受体。

在本发明中，术语“抑制剂”是指任何可降低RabGGTase蛋白的活性、降低RabGGTase基因或蛋白的稳定性、下调RabGGTase蛋白的表达、减少RabGGTase蛋白有效作用时间、或抑制RabGGTase基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调RabGGTase有用的物质，从而可用于预防或治疗ALS。例如所述的抑制剂包括核酸抑制物、蛋白抑制物、化合物抑制物；所述核酸抑制物包括但不限于：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；所述蛋白抑制物包括蛋白水解酶、蛋白结合分子；所述化合物抑制物包括二磷酸利塞磷酸盐的磷酸酯类似物；优选地，所述二磷酸利塞磷酸盐的磷酸酯类似物包括NE10790；优选地，所述抑制剂为NE10790。

在本发明中，术语“神经元细胞”被定义为包含树突、轴突、以及细胞体中的至少一种或组合的细胞、或可替代地，从神经系统组织中分离的任何细胞或细胞群。在一些实施方案中，神经元细胞是包含轴突或能够形成轴突的任何细胞。在一些实施方案中，神经元细胞是施旺细胞、胶质细胞、神经胶质、皮层神经元、从神经元组织中分离或获得的或已经分化成具有神经元表型或与神经元细胞的表型基本上类似的表型的细胞的胚胎细胞、已经分化成神经元表型的诱导多能干细胞(iPS)、或源自于神经元组织或分化成神经元表型的间充质干细胞。在一些实施方案中，神经元细胞是来自成年、青少年、幼年或胎儿受试者的背根神经节(DRG)组织、视网膜组织、脊髓组织、或脑组织的神经元。在一些实施方案中，神经元细胞是从受试者的神经元组织中分离的任何一个或多个细胞。在一些实施方案中，所述神经元细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是人类细胞。在一些实施方案中，所述细胞是非人类哺乳动物细胞或衍生自从非人类哺乳动物分离的细胞。如果从作为所述细胞的来源的原始动物分离或解离，那么神经元细胞可以包含来自多于一种物种的分离的神经元。优选地，所述非人类哺乳动物包括狗、猪、兔或啮齿目动物；所述啮齿目动物包括鼠；优选地，所述神经元细胞为鼠神经元细胞，所述鼠神经元细胞包括突变型鼠神经元细胞、野生型鼠神经元细胞；优选地，所述鼠神经元细胞包括NSC34鼠神经元细胞。

在本发明中，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

在本发明中，术语“诊断系统”是指在其中需要监控一个或多个终点设备的运行的系统。诊断系统包含彼此传输和/或接收数据的至少两个设备。诊断系统可以是任何尺寸的系统，包括但不限于少则两个装置、多则如产生LAN、WAN、SAN、互联网、局域网等等所需的多个装置。

本发明提供的系统可以以编程来体现。技术的多个方面可以被认为是通常呈一种机器可读介质执行或体现的机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据的形式的产品。机器可执行代码可以被存储于电子存储单元诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘上。

本发明进一步提供了一种筛选治疗肌萎缩侧索硬化的候选药物的方法，所述方法包括用待筛选物质处理表达或含有RabGGTase基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中RabGGTase基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质抑制RabGGTase基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是治疗肌萎缩侧索硬化的候选药物。优选地，所述RabGGTase包括RabGGTA、RabGGTB。更优选地，所述RabGGTase为RabGGTB。

在本发明中，所述的方法还包括：对上面步骤获得的候选药物进一步测试其抑制肌萎缩侧索硬化的效果，若测试化合物对肌萎缩侧索硬化有显著的抑制效果，则说明该候选药物为治疗肌萎缩侧索硬化的候选药物。

所述培养体系包括(但不限于)细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

术语“炎症因子”是指细胞因子，包括但不限于TNF-α、IL-1β、INF-γ、IL-2、IL-4、IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β、Tbet、GATA3和NFκB，以及免疫球蛋白，例如IgE和IgGl。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例RabGGTase对ALS的影响

1、样本来源

收集2021年1月至2022年10月在河北医科大学第二医院神经内科诊断的ALS患者的数据，包括详细的病史、查体、实验室检查、电生理检查等，所有患者均符合修订的ALS诊断标准。同时期收集体检科健康体检者对应信息，包括性别、年龄、身高、体重、既往史、家族史、实验室检查等。所有入选病例均排除急性或慢性炎症性疾病，如急性肺炎、类风湿性关节炎等，均签署知情同意书。受试者样本如表1所示。

2、流式细胞术

收集ALS患者及体检者常规化验剩余的外周血标本，取2支流式细胞专用管，在每支试管中加入monoclonal mouse anti-human CD14(BD，555399)5μL，monoclonal mouseanti-human CD16(BD，560717)2.5μL，FC block(BD，564219)5μL，每支试管中加入抗凝外周血150μL，室温避光反应15min，然后加入红细胞裂解液(BD，1208824)2mL，室温避光反应30min，300g离心5min，弃上清液，加入生理盐水2mL洗涤，300g 5min离心，弃上清液，加入破膜剂(BD，554722)500μL，室温避光反应30min，加入perm/wash 500μL，室温避光反应1min，300g离心5min，弃上清液，加入anti-RabGGTB(GTX105874)0.5μL或anti-RABGGTA(proteintech CatNo:14448-1-AP)0.5μL，室温避光反应30min，加入perm/wash 2mL，室温避光反应30min，300g离心5min，弃上清液，加入FITC-Goat anti-Rabbit IgG(H+L)(PROTEINTECH，SA00003-2)，室温避光反应20min，加入生理盐水2mL，300g离心5min，弃上清液，加入250μL生理盐水，悬浮细胞，立即应用BD流式细胞仪检测。

3、分离外周血单核细胞

将人外周血淋巴细胞分离液(索莱宝LTS1077)加入PBMC高效离心(601002天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)中，室温下200g离心2min，加入收集的外周血标本，800g离心30min，小心吸取中间呈白膜状的单核细胞层到新的离心管中，300g离心13min，吸去上清，1×PBS重复洗涤，将PBMC重新悬浮在含有90％v/v胎牛血清(cellmax，SA211.02)和10％二甲基亚砜(sigma，D2650-100ML)的冻存液中，并转移到1.8mL冻存管中，-80℃过夜，次日转移到液氮中保存。

4、外周血单核细胞诱导分化为巨噬细胞

将冻存的外周血单核细胞解冻到RPMI-1640完全培养基中(gibco，C11875500BT，含10％胎牛血清cellmax，SA211.02，1％青霉素-链霉素)，室温，500g离心5min，然后吸去上清，细胞沉淀重悬于RPMI-1640完全培养基，在培养基中加入20ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(peprotech，300-25-10)，细胞接种于48孔板中，于37℃培养箱中培养7天，每隔3天更换一次培养液。第7天，收集巨噬细胞培养的条件培养基(巨噬细胞上清液)，4％多聚甲醛固定液固定细胞。

5、NE10790体外干预巨噬细胞

根据实验目的，分为对照组(健康体检者)、病例组(ALS组)、病例干预组(ALS+NE10790组)。病例干预组分别于巨噬细胞培养第5天加入NE10790(MCE，HY-16011)100μM/mL，48h后收集巨噬细胞条件培养基，4％多聚甲醛固定液固定细胞备用。

6、体外巨噬细胞培养液干预神经元

将NSC34-E(鼠运动神经元样杂交细胞系)及ALS模型细胞系NSC34-SOD1G93A以1×10⁵个/mL接种于48孔板给予DMEM完全培养基(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA，USA；Cat.No.21063-029，1％青霉素-链霉素(P/S)和10％FBS)中培养48h，48h后更换为预先收集的巨噬细胞条件培养基(巨噬细胞上清液)继续培养48h，4％多聚甲醛固定液固定细胞备用。

7、CCK-8

细胞活力通过CCK-8(MCE，HY-K0301)测定法进行评估，分别将NSC34-E细胞和NSC34-SOD1G93A细胞接种于96孔板给予DMEM完全培养基培养48h，48h后更换为收集的巨噬细胞条件培养基(巨噬细胞上清液)继续培养48h，在避光条件下加入10μL CCK-8溶液反应2h。使用微孔板读取器在450nm波长处测量吸光度值。

8、EDU

细胞增殖通过EDU(Invitrogen，LOT2246604)进行评估，分别将NSC34-E细胞和NSC34-SOD1G93A细胞接种于48孔板给予DMEM完全培养基培养48h，48h后更换为收集的巨噬细胞条件培养基(巨噬细胞上清液)继续培养48h，加入EDU试剂A液后继续培养24h，依据试剂说明书操作流程染片。

9、免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜成像

4％多聚甲醛固定液固定巨噬细胞常温20min，用含有0.3％Triton-X 100的PBS进行渗透15min，用含有10％羊血清PBS室温封闭1h，然后与一抗CD68(abcam，ab53444)、F4/80(ab6640)、RabGGTB(GTX105874)、IL-6(immunoway，YT5348)、TNF-α(proteintech，26405-1-AP)、IL-1β(proteintech，16806-1-AP)共孵育4℃过夜。过夜后用1×PBS洗涤细胞3次，然后在室温下添加荧光二抗Alexa Fluor 488-conjugated Goat anti-Rabbit secondaryantibody(1:1000，Thermo Fisher，#A-11034)，AlexaFluor 594-conjugated Goat anti-Mouse secondary antibody(1:1000，Thermo Fisher，#A-11032)，Alexa Fluor 647-conjugated Donkey anti-Goat secondary antibody(1:1000，Thermo Fisher，#A211447)和DAPI共孵育1h。再用1×PBS洗涤细胞3次，使用封片剂封片。4％多聚甲醛固定液固定神经元细胞，用含有0.3％Triton-X 100的1×PBS常温孵育15min，10％羊血清室温封闭1h，然后与一抗MAP2(1:2000，BOSTER，M01201-3)、active-casepase3(1:200，Affinity，AF7022)共孵育，4℃过夜。过夜后用1×PBS洗涤细胞3次，然后在室温下与二抗AlexaFluor488-conjugated Goat anti-Chicken IgYH&L(1:1000，ab150169)，Goat anti-Rabbitsecondary antibody labeledwithAlexaFluor 647(1:1000，Invitrogen，A21245)和DAPI共孵育1h。再用1×PBS洗涤细胞3次后封片。用Zeiss激光共聚焦显微镜拍照。

10、ELISA

分别用Human IL-6ELISA KIT(JEH-02)、Human TNF-αELISA KIT(JEH-12-48T)、Human IL-1βELISAKIT(JEH-02)试剂盒检测细胞培养上清液中这些细胞因子的蛋白浓度。

11、诊断效能分析

分析ALS组和健康对照组RABGGTB、RABGGTB表达水平，进行ROC曲线分析，AUC值即为诊断效能，AUC值越靠近左上角，诊断效能越强。

计算方法：根据ROC曲线分析，得出约登指数(约登指数＝敏感度+特异性-1)，约登指数最大的数值即为临界值，临界值对应的敏感度即为AUC的敏感度，特异性即为AUC的特异性。

12、统计分析

所有计数资料以均数±标准差表示，并使用Shapiro-Wilk正态检验进行正态检验。对于符合正态分布的数据，两组间的差异采用非配对t检验，对于不符合正态分布的数据，两组间的差异采用Mann-Whitney U检验。所有统计分析使用GraphPadPrism 9(GraphPad软件)及SPSS软件进行。*P<0.05被认为具有统计学意义。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

13、实验结果

流式细胞术检测结果见表1、图1所示，结果表明，与对照组相比，RabGGTB、RabGGTA在ALS病人外周血单核细胞中高表达，差异具有统计学意义。

表1ALS患者及体检者一般资料

	对照组(健康体检者)	ALS患者	Pvalue
				受试者人数	34	50
年龄，均值(SD)，y	54.26(7.833)	57.80(11.25)	P＝0.1161
				女性人数	14	18
男性人数	20	32
				RabGGTB	5.671(2.932)	17.53(8.363)	P<0.0001
RabGGTA	1.491(0.312)	3.297(0.979)	P<0.0001

免疫荧光染色检测巨噬细胞中RabGGTB及炎症相关因子的表达水平的结果如图2所示，结果显示，与对照组相比，ALS患者的巨噬细胞中RabGGTB高表达，伴有IL-6、TNF-α、IL-1β水平升高，差异具有统计学意义；NE10790处理巨噬细胞后，RabGGTB表达水平下调并伴有IL-6、TNF-α、IL-1β水平下调。

ELISA检测结果如图3所示，结果显示，与对照组相比，ALS患者的巨噬细胞条件培养基(巨噬细胞上清液)中的IL-6、TNF-α、IL-1β表达上调；给与NE10790干预后IL-6、TNF-α、IL-1β表达下调。

CCK-8检测结果如图4所示，结果显示，NSC34-E和NSC34-SOD1G93A神经元在给予ALS病人巨噬细胞来源的条件培养基(巨噬细胞上清液)培养细胞后，细胞活力均下降；给予NE10790处理后的巨噬细胞条件培养基培养细胞后，细胞活力均有增加。

免疫荧光染色检测NSC34-E及NSC34-SOD1G93A神经元细胞凋亡的情况如图5所示，结果显示，NSC34-E及NSC34-SOD1G93A神经元在给予ALS病人巨噬细胞来源的条件培养基培养细胞后，凋亡细胞数量表达明显增加；给予NE10790处理后的巨噬细胞条件培养基培养细胞后，凋亡细胞数量减少。

EDU检测结果如图6所示，结果显示，NSC34-SOD1G93A在给予ALS病人巨噬细胞来源的条件培养基培养细胞后，细胞增殖能力下降；给予NE10790处理后的巨噬细胞条件培养基培养细胞后增殖能力增强。

ROC曲线结果如图7所示，结果显示，RabGGTA的AUC为0.9821，敏感度0.875，特异性1；RabGGTB的AUC为0.9335，敏感度0.8，特异性0.9412。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.检测样本中RabGGTase的试剂在制备诊断肌萎缩侧索硬化、判断神经元细胞活性的产品中的应用；

优选地，所述检测样本中RabGGTase的试剂包括检测样本中RabGGTase的蛋白表达水平的试剂、检测样本中RabGGTase的mRNA表达水平的试剂；

优选地，所述检测样本中RabGGTase的试剂为检测样本中RabGGTase的蛋白表达水平的试剂；

优选地，所述检测样本中RabGGTase的蛋白水平表达的试剂为流式细胞术中所使用的试剂，或者是以下方法中所使用试剂：蛋白质印迹法、酶联免疫吸附测定、放射性免疫测定、夹心测定、免疫组织化学染色、质谱检测法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法或蛋白质芯片法；

优选地，所述样本选自组织、血液、尿液、脑脊液、细胞系、细胞培养物或组织间液；

优选地，所述血液包括血液衍生的细胞、血小板、血清、血浆；

优选地，所述血液衍生的细胞选自有核细胞；所述有核细胞包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、淋巴细胞、粒细胞；

优选地，所述样本为单核细胞、巨噬细胞；

优选地，所述RabGGTase包括RabGGTA、RabGGTB；

优选地，所述检测样本中RabGGTase的试剂包括检测单核细胞中RabGGTA或RabGGTB的试剂、检测巨噬细胞中RabGGTB的试剂；

优选地，所述神经元细胞活性包括以下特征：细胞活力、细胞凋亡程度。

2.一种诊断肌萎缩侧索硬化、判断神经元细胞活性的产品，其特征在于，所述产品包括检测RabGGTase的表达水平所使用的试剂；

优选地，所述产品包括制剂、试剂盒、芯片或核酸膜条；

优选地，所述试剂盒包括通过RT-PCR法、RT-qPCR法、生物芯片检测法、DNA印迹法、原位杂交法、蛋白质印迹法、流式细胞术、免疫荧光法、免疫组化法、ELISA、电化学发光法检测RabGGTase蛋白或mRNA表达水平的试剂。

3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品还包括处理样本的试剂；

优选地，所述处理样本的试剂包括分离单核细胞的试剂或促进单核细胞分化为巨噬细胞的试剂；

优选地，所述分离单核细胞的试剂包括淋巴细胞分离液、单核细胞分离液；

优选地，所述分离单核细胞的试剂为淋巴细胞分离液；

优选地，所述促进单核细胞分化为巨噬细胞的试剂包括巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞刺激因子、佛波酯；

优选地，所述促进单核细胞分化为巨噬细胞的试剂为巨噬细胞集落刺激因子。

4.RabGGTase在制备治疗肌萎缩侧索硬化、保护神经元的药物组合物中的应用；

优选地，所述药物组合物包括RabGGTase的抑制剂；

优选地，所述抑制剂特异性抑制RabGGTase的表达；

优选地，所述抑制剂包括核酸抑制物、蛋白抑制物、化合物抑制物；

优选地，所述核酸抑制物包括shRNA、siRNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸；

优选地，所述蛋白抑制物包括蛋白水解酶、蛋白结合分子；

优选地，所述化合物抑制物包括二磷酸利塞磷酸盐的磷酸酯类似物；

优选地，所述二磷酸利塞磷酸盐的磷酸酯类似物包括NE10790；

优选地，所述保护神经元包括提高细胞活力、抑制细胞凋亡；

优选地，所述RabGGTase包括RabGGTA、RabGGTB；

优选地，所述RabGGTase为RabGGTB。

5.一种治疗肌萎缩侧索硬化、保护神经元的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括RabGGTase的抑制剂；

优选地，所述抑制剂特异性抑制RabGGTase的表达；

优选地，所述抑制剂包括核酸抑制物、蛋白抑制剂、化合物抑制物；

优选地，所述核酸抑制物包括shRNA、siRNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸；

优选地，所述蛋白抑制物包括蛋白水解酶、蛋白结合分子；

优选地，所述化合物抑制物包括二磷酸利塞磷酸盐的磷酸酯类似物；

优选地，所述二磷酸利塞磷酸盐的磷酸酯类似物包括NE10790；

优选地，所述RabGGTase包括RabGGTA、RabGGTB；

优选地，所述RabGGTase为RabGGTB；

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

6.如下任一种方法：

1)保护神经元的方法，所述方法包括抑制RabGGTase的表达；

2)判断神经元细胞活性的方法，所述方法包括检测RabGGTase的表达水平；

优选地，所述神经元细胞包括哺乳动物神经元细胞；

优选地，所述哺乳动物神经元细胞包括狗神经元细胞、猪神经元细胞、兔神经元细胞、啮齿目动物神经元细胞或灵长类动物神经元细胞；

优选地，所述啮齿目动物神经元细胞包括鼠神经元细胞；

优选地，所述鼠神经元细胞包括NSC34鼠神经元细胞；

优选地，所述RabGGTase包括RabGGTA、RabGGTB；

优选地，所述RabGGTase为RabGGTB。

7.一种肌萎缩侧索硬化诊断系统，其特征在于，所述诊断系统包含：

检测构件：所述检测构件用于检测RabGGTase的表达水平；

结果判断构件：所述结果判断构件用于根据所述检测构件检测得到的RabGGTase的表达水平的结果，输出受试者是否患有肌萎缩侧索硬化的风险；

优选地，所述生物标志物RabGGTase的表达水平包括RabGGTase的mRNA表达水平、RabGGTase的蛋白表达水平；

优选地，所述检测构件包括qPCR试剂盒、ELISA试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、电化学发光检测试剂盒、qPCR仪、ELISA检测装置、免疫印迹检测装置、流式细胞分析装置、免疫组化检测装置、免疫层析检测装置或电化学发光检测装置；

优选地，所述结果判断构件含有输入模块、分析模块和输出模块；输入模块用于输入RabGGTase的表达水平；分析模块用于根据RabGGTase的表达水平，分析出受试者是否患有肌萎缩侧索硬化的风险；输出模块用于输出分析模块的分析结果。

8.RabGGTase在筛选治疗肌萎缩侧索硬化的候选药物中的应用；

优选地，筛选治疗肌萎缩侧索硬化的候选药物的方法如下：用待筛选物质处理表达或含有RabGGTase基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中RabGGTase基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质抑制RabGGTase基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是治疗肌萎缩侧索硬化的候选药物；

优选地，所述RabGGTase包括RabGGTA、RabGGTB；

优选地，所述RabGGTase为RabGGTB。

9.一种筛选治疗肌萎缩侧索硬化的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括用待筛选物质处理表达或含有RabGGTase基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中RabGGTase基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质抑制RabGGTase基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是治疗肌萎缩侧索硬化的候选药物；

优选地，所述RabGGTase包括RabGGTA、RabGGTB；

优选地，所述RabGGTase为RabGGTB。

10.权利要求5所述的药物组合物在制备降低炎症因子表达的产品中的应用；

优选地，所述炎症因子包括IL-6、TNF-α、IL-1β。

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