CN115807051A - 检测幽门螺杆菌耐药性的培养基及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

检测幽门螺杆菌耐药性的培养基及其制备方法和应用，以哥伦比亚培养基为基础，添加10%～15%小牛血清、尿素1.2～2.4mg/mL、酚红0.004～0.016mg/mL、氯化镍10～100µmol/L、占培养基总体积1%的幽门螺杆菌选择性添加剂，同时加入检测耐药的抗生素，调节pH至7.15～7.35。本发明提供一种培养基快速检测H.pylori耐药的方法，能在36h内得出药敏检测结果，明显的缩短了药敏检测的时间，且准确性高，成本低，适合基层广泛推广使用。

Description

检测幽门螺杆菌耐药性的培养基及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药卫生领域，具体涉及一种检测幽门螺杆菌耐药性的培养基及其制备方法和应用。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是一种微需氧革兰氏阴性菌，人群感染率约为50％，可导致胃炎、胃溃疡、胃癌、淋巴瘤等多种疾病，对人类的健康构成严重威胁。目前临床指南推荐治疗H.pylori的方案为四联疗法(PPI+铋剂+两种抗生素)，可供选择的常用抗生素有阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星等。但随着抗生素的广泛使用，H.pylori产生的耐药越来越严重，特别是对甲硝唑、克拉霉素，耐药率高达70％和37％，甚至部分地区甲硝唑耐药率高达90％。这导致H.pylori的根除率越来越低，对抗生素耐药是患者单次或多次根除治疗失败的主要原因。为了应对日益严峻的耐药挑战，通过药敏检测来指导临床合理用药十分必要。
目前H.pylori耐药检测手段主要是传统的细菌培养和耐药基因检测。但细菌培养法条件苛刻，周期长，检测需要9～12天左右，容易延误患者的治疗时机。此外，有文献报道，人体活检标本中的H.pylori，经传代培养3-5代后容易出现球形变等改变，难于检测“原位”H.pylori的特征，易出现结果偏差。传统培养法容易污染也是较突出的问题。综合这些不利因素，传统药敏耐药检测在临床开展不广泛，只有少部分有条件的医院或科研机构开展这项药敏检查工作。H.pylori耐药基因检测方法，有数字芯片、PCR等技术，检测样本多样，可以是胃黏膜或粪便，其特点是快速、灵敏等，但存在耐药基因的基因型与表型不完全一致的情况，只能检测已知的少部分研究比较清楚的耐药基因，如左氧氟沙星耐药基因gryA、克拉霉素耐药基因A2142G、A2143G等，尚有一些耐药基因未发现或未能检测，检测结果并不能完全代表实际结果。并且基因检测设备要求比较高、成本较大，所以推广应用范围较小。因此探索一种快速、有效、低成本、易推广的H.pylori耐药检测的方法意义重大。
为了快速的判定胃内H.pylori有无耐药，有研究者对传统的检测方法作改进。将活检标本直接在含有抗生素的固体培养基上涂板，若有H.pylori生长，则可判断胃内H.pylori产生耐药，但这种检测方法的前提是活检标本要有1×106CFU/mL的菌量。实际上活检标本很难达到这个菌量，结果容易出现假阴性，而且这种检测方法的周期是3～5天，比较耗时。为了提高活检标本中H.pylori的菌量，活检组织破碎后离心、浓缩、重悬，可使接种的初始菌量有效提高。为了使这种培养法的检测结果更准确，我们探索了菌量为1×105CFU/mL时的MIC值，并根据NICSL、CLSI(菌量为1×106CFU/mL)判断H.pylori耐药的MIC值为依据，推算出H.pylori菌量为1×105CFU/mL时的耐药折点。同时用实验室不同的标准菌株、临床菌株反复验证所推算折点的准确性。再结合临床用快速尿素酶试验判断H.pylori存在的方法，在不影响H.pylori生长的情况下，在哥伦比亚固体培养中加入酚红、尿素、氯化镍、改变pH值等，使得最后制作的固体培养基具有明显的变色反应(局部变紫红色)。活检标本经培养36h后，可根据培养基的变色反应，检测出H.pylori对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星是否产生耐药。
为了验证这种方法的可靠性，每一份活检标本同时取100μL涂布于哥伦比亚培养基培养上，三气培养箱内37℃培养72h以确定标本的初始菌量，并且用传统方法检测其MIC。结果传统药敏检测法与本发明方法判断细菌耐药的结论一致。
本方法所制备的固体培养基涂活检组织后，放入三气培养箱内37℃恒温培养36h，取出后于自然环境中静置30min，便可根据固体培养基的显色反应结果，判断细菌是否产生耐药。该检测方法比传统方法更快速，且准确性好、设备要求不高，对检测H.pylori耐药有非常大的应用价值，适合在基层广泛推广使用。
发明内容
解决的技术问题：为了提高临床上对H.pylori耐药检测的时效性和准确性，本发明提供一种培养基快速检测H.pylori耐药的方法，能在36h内得出药敏检测结果，明显的缩短了药敏检测的时间，且准确性高，成本低，适合基层广泛推广使用。
技术方案：检测幽门螺杆菌耐药性的培养基，组成以哥伦比亚培养基为基础，添加占培养基10wt.％～15wt.％的小牛血清、尿素含量1.2～2.4mg/mL、酚红含量0.004～0.016mg/mL、氯化镍含量10～100μmol/L、占培养基总体积1％的幽门螺杆菌选择性添加剂，同时加入检测耐药的抗生素，调节pH至7.15～7.35。
优选的，上述哥伦比亚培养基4g，小牛血清为14mL，尿素160mg，幽门螺杆菌选择性添加剂(Dent，SR0147E)1mL，酚红0.8mg，氯化镍10μmol，加无菌水配成100mL体系，pH调节剂为5wt.％氢氧化钠溶液。
优选的，上述抗生素为左氧氟沙星0.5μg/mL、克拉霉素0.5μg/mL、甲硝唑4μg/mL或阿莫西林0.0625μg/mL。
优选的，上述培养基的pH为7.35。
上述培养基的制备方法，步骤为：称取哥伦比亚培养基，加入纯水，高压灭菌后自然冷却至50℃，加入小牛血清、20wt.％无菌尿素溶液、幽门螺杆菌选择性添加剂、0.2wt.％酚红溶液、氯化镍，用5wt.％氢氧化钠溶液滴定法调节培养基的pH至7.35，再加入耐药检测抗生素，在培养基凝固前倒板，10mL/个。
上述培养基在制备检测幽门螺杆菌耐药性产品中的应用。
有益效果：首先，本发明利用培养基能快速检测H.pylori的耐药情况，36h即可得到结果，时效性明显优于传统药敏培养；第二，本发明所选用的培养基比目前有关用固体培养基检测H.pylori耐药检测方法，明确了活检样本中菌量的要求，结果更准确、直观；第三，本发明直接检测H.pylori耐药表型，克服了耐药基因检测时因为基因型与表型不一致、基因突变而出现的假阴性问题；第四，本发明提供的检测方法，设备要求不高，培养基成本低，容易操作，能在基层广泛推广使用，对临床合理使用抗生素治疗H.pylori感染有良好的指导作用。
附图说明
图1为检测幽门螺杆菌耐药性的固体培养基制作示意图。
图2为在哥伦比亚培养基内加入尿素剂量明确的前提下，酚红对幽门螺杆菌菌株G27(1×105cfu)局部涂板后培养24h后的变色反应。
图3为在哥伦比亚培养基内加入尿素、酚红剂量明确的前提下，NiCl2对幽门螺杆菌菌株G27、287(1×105cfu)局部涂板后培养24h的变色反应。
图4为幽门螺杆菌菌株G27在菌量为1×105cfu时，局部涂在特色培养基上培养36h的变色反应。
图5为幽门螺杆菌菌株287在菌量为1×105cfu时，局部涂在特色培养基上培养36h的变色反应。
图6为幽门螺杆菌菌株289在菌量为1×105cfu时，局部涂在特色培养基上培养36h的变色反应。
图7为幽门螺杆菌菌株286在菌量为1×105cfu时，局部涂在特色培养基上培养36h的变色反应。
图8为幽门螺杆菌菌株159在菌量为1×105cfu时，局部涂在特色培养基上培养36h的变色反应。
图9为临床幽门螺杆菌菌株FY-31在特色培养基培养36h的变色反应效果。
图10为临床幽门螺杆菌菌株FY-43在特色培养基培养36h的变色反应效果。
图11为临床幽门螺杆菌菌株FY-44在特色培养基培养36h的变色反应效果。
图12为临床幽门螺杆菌菌株FY-52在特色培养基培养36h的变色反应效果。
图13为PCR产物电泳图，验证临床幽门螺杆菌菌株FY-31的CagA基因(
Figure BDA0003972613360000041
处为260bp)。
图14为检测幽门螺杆菌耐药性的操作流程图。
具体实施方式
一、制备特色培养基
第一步，配制0.2wt.％的酚红溶液10mL，高压灭菌锅灭菌30min，待冷却至室温后保存备用；配制20wt.％的尿素溶液50mL、配制5wt.％的NaOH溶液10mL，配制100mmol/L的NiCl2溶液10mL，所有配制的溶液均过滤除菌后-20℃保存备用；第二步，称量哥伦比培养基4.0g、纯水84mL，倒入三角瓶，混匀，密封后，高压灭菌锅灭菌30min，冷却至55℃左右备用；第三步，在55℃左右的哥伦比亚培养基内，依次加入0.2％的酚红溶液400μL，小牛血清14mL，H.pylori选择性添加剂1mL，5％的NaOH溶液调节pH至7.35，充分混合摇匀，配成培养基a；第四步，培养基a加入左氧氟沙星0.5μg/mL配成特色培养基b，培养基a加入克拉霉素0.5μg/mL配成特色培养基c，培养基a加入甲硝唑4μg/mL配成特色培养基d，培养基a加入阿莫西林0.0625μg/mL配成特色培养基e；第五步，待液态培养基a、b、c、d、e冷却至45℃左右，快速加入20％的无菌尿素溶液800μL、100mmol/L的NiCl2溶液100μL，充分混匀；第六步，混匀后的液态培养基a、b、c、d、e快速倒入平皿中，约10mL/个，形成快速检测H.pylori耐药的特色固体培养基A、B、C、D、E，做好相应标记备用。
二、样本采集及H.pylori培养
询问病史，选择近期未使用抗生素等药物或者已停用抗生素4周、质子泵抑制剂2周的病例。经13C呼气试验确诊为H.pylori阳性，在征得患者知情同意并签知情同意书后，经胃镜活检孔道，于胃窦、胃体小弯侧各活检织组1块，匀浆仪破碎处理、离心、浓缩、重悬后得到含H.pylori的标本混悬液，分别取10μL混悬液滴于特色培养基A、B、C、D、E上，将特色培养基置于三气(85％氮气，10％二氧化碳，5％氧气)培养箱37℃培养36h后观察实验结果。另取100μL标本混悬液涂于哥伦比亚固体培养基中培养72h，用于计数标本初始菌量，并分离出单菌落，增菌，最后用微量稀释法检测临床标本的MIC，验证这两种方法判断结果的一致性。
三、观察结果
经过三气培养箱37℃恒温培养36h的特色培养基(A、B、C、D、E)，移出并于自然环境下放置30min，观察培养基中滴有样本处有无颜色变化。若ABCDE均不变色，则判断为无H.pylori生长；若A局部变红色而BCDE不变色，则判断标本中的H.pylori对左氧氟沙星、克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林敏感；若A局部变红色，同时BCDE中的任意一块培养基变红色，则判断标本中的H.pylori对变色培养基所含的抗生素耐药(B含左氧氟沙星，C含克拉霉素，D含甲硝唑，E含阿莫西林)。另取100μL标本涂于哥伦比亚固体培养基，三气培养箱37℃恒温培养3～5天，计数平皿上的菌落数用于确定接种初始菌量。用微量稀释法检测临床标本H.pylori的MIC，当不含菌的阴性对照孔内细菌无生长和有菌无抗生素阳性孔有菌生长实验才有意义，以完全抑制细菌生长的最低药物浓度作为MIC。记录结果，并比较微量稀释法和特色培养基对临床H.pylori菌株耐药性评价是否一致。
实施例1
一、培养基配制：
以哥伦比亚培养基为基础，辅以尿素、酚红、H.pylori选择性添加剂、氢氧化钠、氯化镍、选择性抗生素，加无菌水配成总体积为100mL体系。具体配方：
哥伦比亚培养基 4g
小牛血清 14mL
20％尿素溶液800μL
0.2％酚红溶液400μL
100mmol/L氯化镍溶液100μL
H.pylori选择性添加剂(Dent，SR0147E)1mL
5％氢氧化钠溶液调节pH至7.35
选择性抗生素分别为左氧氟沙星0.5μg/mL、克拉霉素0.5μg/mL、甲硝唑4μg/mL、阿莫西林0.0625μg/mL
第一步，配制0.2wt.％的酚红溶液10mL，高压灭菌锅灭菌30min，待冷却至室温室温后保存备用；配制20wt.％的尿素溶液50mL、配制5％wt.的NaOH溶液10mL，配制100mmol/L的NiCL2溶液10mL，所有配制的溶液均过滤除菌后-20℃保存备用；
第二步，称量哥伦比培养基4.0g、纯水84mL，倒入三角瓶，混匀，密封后，高压灭菌锅灭菌30min，冷却至55℃左右备用；
第三步，在55℃左右的哥伦比亚培养基内，依次加入0.2％的酚红溶液400μL，小牛血清14mL，H.pylori选择性添加剂1mL，5％的NaOH溶液，调节pH至7.35，充分摇匀，配成培养基a；
第四步，培养基a加入左氧氟沙星0.5μg/mL配成特色培养基b；培养基a加入克拉霉素0.5μg/mL配成特色培养基c；培养基a加入甲硝唑4μg/mL配成特色培养基d；培养基a加入阿莫西林0.0625μg/mL配成特色培养基e；
第五步，待培养基a、b、c、d、e冷却至45℃左右，快速加入20％的无菌尿素溶液800μL、100mmol/L的NiCl2溶液100μL，充分混匀；
第六步，混匀后的液态培养基a、b、c、d、e快速倒入平皿中，约10mL/个，形成快速检测H.pylori耐药特色固体培养基A、B、C、D、E，并做好相应标记，用于后续检测。
二、样本采集和H.pylori培养：
第一步，灭菌并冷却至室温的BHI，加入10％的小牛血清，再加入30％甘油和1％H.pylori选择性添加剂，制备成H.pylori转移液；
第二步，选择近期未使用抗生素等药物或者已停用抗生素4周、质子泵抑制剂2周的病例，经13C呼气试验确诊为H.pylori阳性，征得患者知情同意并签知情同意书；
第三步，经胃镜活检孔道，在患者胃窦、胃体小弯侧各取织组1块放入EP管中，(严格无菌操作)；
第四步，将含组织的EP管放于匀浆仪中破碎处理，离心、浓缩、重悬制作成菌悬液；
第五步，取10μL混悬液滴加至特色培养基(共5块)，三气培养箱37℃培养36h移出，放置30min后判读结果。
实施例2
一、培养基配制：
以脑心浸液(BHI)琼脂培养基为基础，辅以尿素、H.pylori选择性添加剂、酚红、氢氧化钠、氯化镍、选择性抗生素，加无菌水配成100mL体系。具体配方：
BHI琼脂培养基 4g
小牛血清 14mL
20％尿素溶液800μL
0.2％酚红溶液400μL
100mmol/L氯化镍溶液100μL
H.pylori选择性添加剂(Dent，SR0147E)1mL
5％氢氧化钠溶液调节pH至7.35
选择性抗生素分别为左氧氟沙星0.5μg/mL、克拉霉素0.5μg/mL、甲硝唑4μg/mL、阿莫西林0.0625μg/mL
第一步，配制0.2％的酚红溶液10mL，高压灭菌锅灭菌30min，待冷却至室温后保存备用；配制20％的尿素溶液50mL、配制5％的NaOH溶液10mL，配制100μmol/L的NiCl2溶液10mL，所有配制的溶液均过滤除菌后-20℃保存备用；
第二步，称量脑心浸液(BHI)琼脂培养基4.0g、纯水84mL，倒入三角瓶，混匀，密封后，高压灭菌锅灭菌30min，冷却至55℃左右备用；
第三步，在55℃左右的BHI琼脂内，依次加入0.2％的酚红溶液400μL，小牛血清14mL，H.pylori选择性添加剂，5％的NaOH溶液，调节pH至7.35；充分摇匀成混合培养基；
第四步，培养基a加入左氧氟沙星0.5μg/mL配成特色培养基b，培养基a加入克拉霉素0.5μg/mL配成特色培养基c，培养基a加入甲硝唑4μg/mL配成特色培养基d，培养基a加入阿莫西林0.0625μg/mL配成特色培养基e；
第五步，待混合培养基a、b、c、d、e冷却至45℃左右，快速加入20％的无菌尿素溶液800μL、100的NiCl2溶液100μL，充分混匀；
第六步，混匀后的液态培养基a、b、c、d、e快速倒入平皿中，约10mL/个，形成快速检测H.pylori耐药特色固体培养基A、B、C、D、E，并做好相应标记，用于后续检测。
二、样本采集和H.pylori培养：
第一步，灭菌并冷却至室温的BHI培养基，加入10％的小牛血清，再加入30％甘油和1％H.pylori选择性添加剂，制备成H.pylori转移液；
第二步，选择近期未使用抗生素等药物或者已停用抗生素4周、质子泵抑制剂2周的病例，经13C呼气试验确诊为H.pylori阳性，征得患者知情同意并签知情同意书；
第三步，经胃镜活检孔道，在患者胃窦、胃体小弯侧各取织组1块放入EP管中，(严格无菌操作)；
第四步，将含组织的EP管放于匀浆仪中破碎处理，离心、浓缩、重悬制作成菌悬液；
第五步，取10μL混悬液滴加至特色培养基(共5块)，三气培养箱37℃培养36h移出，放置30min后判读结果。
实施例3
一、培养基配制：
以哥伦比亚培养基为基础，辅以H.pylori选择性添加剂、尿素、酚红、氢氧化钠、氯化镍、选择性抗生素和水。具体配方：
哥伦比亚培养基 4g
小牛血清 14mL
20％尿素溶液800μL
0.2％酚红溶液400μL
100mmol/L氯化镍溶液100μL
H.pylori选择性添加剂(Dent，SR0147E)1mL
5％氢氧化钠溶液调节pH至7.35
选择性抗生素分别为左氧氟沙星0.5μg/mL、克拉霉素0.5μg/mL、甲硝唑4μg/mL、阿莫西林0.0625μg/mL
第一步，配制0.2％的酚红溶液10mL，高压灭菌锅灭菌30min，待冷却至室温后保存备用；配制20％的尿素溶液50mL、配制5％的NaOH溶液10mL，配制100μmol/L的NiCl2溶液10mL，所有配制的溶液均过滤除菌后-20℃保存备用；
第二步，称量哥伦比培养基2.0g、纯水42mL，倒入三角瓶，混匀，密封后，高压灭菌锅灭菌30min，冷却至55℃左右备用；
第三步，在55℃左右的哥伦比亚培养基内，依次加入0.2％的酚红溶液400μL，小牛血清14mL，100mmol/L的NiCl2溶液100μL，H.pylori选择性添加剂，5％的NaOH溶液，调节pH至7.35；充分摇匀成混合培养基；
第四步，在配制的培养基(5瓶)中，分别加入左氧氟沙星0.5μg/mL、克拉霉素0.5μg/mL，甲硝唑4μg/mL，阿莫西林0.0625μg/mL和等体积的PBS，做好标记ABCDE；
第五步，待混合培养基自然冷却至45℃左右，快速加入20％的尿素溶液(无菌)800μL，充分混匀；
第六步，混匀后的培养基倒入平皿中，约10mL/个，形成H.pylori耐药快速检测固体培养基，做好标记用于后续检测。
二、样本采集和H.pylori培养：
第一步，灭菌并冷却至室温的BHI培养基，加入10％的小牛血清，再加入30％甘油和1％H.pylori选择性添加剂，制备成H.pylori转移液；
第二步，选择近期未使用抗生素等药物或者已停用抗生素4周、质子泵抑制剂2周的病例，经13C呼气试验确诊为H.pylori阳性，征得患者知情同意并签知情同意书；
第三步，经胃镜活检孔道，在患者胃窦取织组2块放入EP管中，(严格无菌操作)；
第四步，将含组织的EP管放于匀浆仪中破碎处理，离心、浓缩、重悬制作成菌悬液；
第五步，取10μL混悬液滴加至特色培养基(共5块)，三气培养箱37℃培养36h移出，放置30min后判读结果。
本发明检测幽门螺杆菌耐药性的培养基及其制备方法和应用实施例1进一步详细的说明
1.材料
1.1样品
(1)哥伦比亚培养基，购买于成都瑞芬思生物科技有限公司；
(2)小牛血清，购买于成都瑞芬思生物科技有限公司；
(3)尿素，购买上海麦克林生物科技有限公司；
(4)酚红，购买于上海源叶生物科技有限公司；
(5)阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星，购买上海麦克林生物科技有限公司；
(6)NaOH，购买上海麦克林生物科技有限公司；
(7)NiCL2，购买上海麦克林生物科技有限公司。
1.2菌株
敏感H.pylori菌株G27、26695和耐药H.pylori菌株159、161、162、163、286、287、289、290均由右江民族医学院耐药微生物感染防治研究中心提供，临床菌株由右江民族医学院附属医院提供。
1.3主要培养基和试剂：哥伦比亚培养基、无菌水、DMSO。
1.4主要仪器：三气培养箱、离心机、酶标仪、电子天平、紫外分光光度计、超净工作台、旋涡振荡器、匀浆仪、高压灭菌锅等。
1.5耗材：EP管、离心管、接种环、无菌平皿、三角瓶、微量产气袋等。
2.方法与结果
2.1培养基各组分对H.pylori生长的影响
(1)药液配制：配制0.2wt.％的酚红溶液10mL，高压灭菌锅灭菌30min后，待冷却至室温后保存备用；配制20wt.％的尿素溶液50mL、配制5wt.％的NaOH溶液10mL，配制100μmol/L NiCl2溶液10mL，所有配制的溶液均过滤除菌后-20℃保存备用。
(2)快速耐药固体培养基的制作：称量哥伦比培养基2.0g、纯水42mL，倒入三角瓶，混匀，密封后，高压灭菌锅灭菌30min，冷却至55℃左右加入小牛血清7mL；再分别加入0.2％的酚红溶液，20％尿素溶液，100μmol/LNiCl2溶液，5％的NaOH溶液，调节pH，以探索发明培养基需要加入各组分的条件。
(3)菌液制备：取固体平板上对数期生长的H.pylori(G27和287)，用BHI培养基制作成菌悬液，调整菌液浓度为1×108CFU/mL(OD600为0.3)，稀释10倍，备用。
(4)菌液涂板：分别取10μL菌液局部涂布于探索的特色固体培养基上。
(5)细菌培养：将已经涂板的特色培养基置于三气培养箱内37℃培养72h，观察培养基上细菌的生长情况。
(6)结果：在50mL哥伦比亚培养基中，单独加入尿素60mg～240mg时，当加入60mg的尿素对H.pylori生长无影响；加入120～240mg的尿素时，生长欠佳；在尿素的量为60～120mg时，进一步探索了80mg和100mg的尿素对H.pylori的影响，最终发现，加入尿素且不影响H.pylori生长的最大值为80mg。在50mL哥伦比亚培养基中单独加入酚红0.2～0.8mg，对H.pylori生长无影响；但当哥伦比亚培养基中加入80mg尿素时，再加入0.8mg酚红，对H.pylori生长无影响且辨识度最佳，灵敏度欠佳；当哥伦比亚培养基中同时加入80mg的尿素、0.4mg的酚红，对H.pylori生长无影响且辨识度好，灵敏度佳；当哥伦比亚培养基中同时加入80mg尿素和0.2mg的酚红，对H.pylori生长无影响但辨识度差，灵敏度也欠佳(见表1和图2)。在哥伦比亚培养基中同时加入80mg尿素、0.4mg酚红的基础之上，调节pH值，发现pH为7.15～7.35时，H.pylori可生长且变色更明显。在此基础上，加入1～200μmol/L的NiCl2，变色反应的灵敏度和辨识度都有了进一步提升，且加入100μmol/L的NiCl2变色反应的辨识度已达最大(见表2和图3)。
(7)结论：制作特殊培养基100mL的总体系，最佳配方为含哥伦比亚培养基4g、小牛血清14mL、尿素160mg、酚红0.8mg、氯化镍10μmol、最适pH值7.35。
表1尿素和酚红对哥伦比亚培养基上H.pylori的影响
Figure BDA0003972613360000101
备注(“++”指细菌生长良好，“+”指细菌可生长，“-”指细菌不生长；“△△”指细菌生长，变色辨识度好，但灵敏度差，“△”指细菌可生长，变色度好，灵敏度好，“◇”指细菌可生长，变色辨识度佳，但灵敏度差；H.pylori菌量为1×105CFU/mL)。
表2pH和NiCl2对培养基上H.pylori的影响
Figure BDA0003972613360000111
备注(“**”指细菌培养36h可生长，并且变色明显，“*”指细菌培养36h生长好，但变色不明显；“+”指细菌培养36h生长好，可变色，“++”指细菌培养36h生长好，并且变色明显；培养基指为50mL哥伦比亚培养基加入80mg尿素、0.4mg酚红；H.pylori菌量为1×105CFU/mL)。
2.2微量稀释法检测低菌量时的最低抑菌浓度(MIC)
(1)配备药液：分别陪阿莫西林4mg/mL、克拉霉素4mg/mL、甲硝唑4mg/mL、左氧氟沙星4mg/mL，备用。
(2)MIC板制备：第一孔先加培养基173.6μL，其它各孔加培养基90μL，在第一孔再加6.4μL抗菌药物，对倍稀释至第11孔；第12孔作为加菌不加药对照，保留90μL培养基。
(3)菌液制备：取固体平板上对数期生长的H.pylori用BHI培养基制作成菌悬液，调整菌液浓度为1×108CFU/mL(OD600为0.3)，稀释10倍、100倍、1000倍，使终浓度为1×106CFU/mL、1×105CFU/mL、1×104CFU/mL，备用。
(4)接种菌液：取上述备用菌液10μL加至第1-10孔和第12孔(细菌工作浓度为1×106CFU/mL)，第11孔作为不加菌对照，只加无菌水。培养72h判断结果。1-10孔药物浓度分别为32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL、0.0625μg/mL。
(5)结果：标准敏感菌株G27、26695菌量为1×105CFU/mL时，对左氧氟沙星、克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林的MIC(单位μg/mL)分别为0.0625、0.0312～0.0625、0.25、0.01562～0.0325，耐药菌株159、161、162、163、286、287、289、290菌量为1×105CFU/mL时，对左氧氟沙星、克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林的MIC(单位μg/mL)分别为0.5～32、0.0625～8、1～16、0.0625～2，(见表3)。但当菌量为1×105CFU/mL时，MIC检测值的稳定性欠佳，部分结果不能重复；当菌量为1×104CFU/mL时，检测值的稳定性差，甚至部分菌株的MIC无法测出。
表3微量稀释法检测幽门螺杆菌的最低抑菌浓度(MIC，单位μg/mL)
Figure BDA0003972613360000121
Figure BDA0003972613360000131
备注(菌量为1×105CFU/mL检测值的稳定性欠佳，菌量1×104CFU/mL检测值的稳定性差。为提高稳定性，故菌量为1×105CFU/mL、1×104CFU/mL时MIC检测所用培养基，小牛血清由10％增加至15％)。
2.3推算菌量为1×105CFU/m时H.pylori产生耐药的折点
根据表3药敏结果，发现实验室已有的菌株中，菌量由1×106CFU/mL降为1×105CFU/mL时，H.pylori对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星的MIC实测值变化了约为1/4～1倍。而根据CLSI指南，菌量为1×106CFU/mL时，H.pylor对这四种药物的耐药折点分别为0.5μg/mL、2μg/mL、8μg/mL、2μg/mL，相对应的，推算当菌量为1×105CFU/mL时，H.pylori的耐药折点也应变化1/4～1倍，即H.pylori菌量为1×105CFU/mL时，其对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星的耐药折点分别为0.125～0.5μg/mL、0.5～2μg/mL、2～8μg/mL、0.5～2μg/mL。
2.4验证菌量为1×105CFU/m时H.pylori耐药的折点
(1)加入选择性抗生素：根据所得推算值，按1/2倍、1倍和2倍推算值的梯度，将选择性抗生素阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星分别加入哥伦比亚固体培养基中，冷却倒板约10mL/个，做好标记，备用。
(2)菌液制备：取固体平板上对数期生长的H.pylori用BHI制作成菌悬液，调整浓度OD600为0.3(1×108CFU/mL)，稀释10倍，备用。
(3)接种菌液：取10μL菌液加至哥伦比亚培养基上，培养72h后判断结果。
(4)结果判断：平板上无菌落生长的最低药物浓度为该细菌对药物的最低抑菌浓度。
(5)结果：左氧氟沙星加入浓度为0.5μg/mL、克拉霉素加入浓度为0.5μg/mL、甲硝唑加入浓度为4μg/mL、阿莫西林加入浓度为0.5μg/mL时，能使敏感菌株均不生长，并且能使得90％的实验耐药菌株生长，(见表4)。
表4实验室菌株验证添加抗生素浓度(单位μg/mL)
Figure BDA0003972613360000141
备注(“+”代表细菌生长，“-”代表细菌不生长)。
(5)结论：加入抗生素的最佳浓度为左氧氟沙星0.5μg/mL、克拉霉素0.5μg/mL，甲硝唑4μg/mL，阿莫西林0.0625μg/mL。
2.5验证加入特色培养基中的抗生素浓度
(1)抗菌药液制备：配制阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星均为4mg/mL。
(2)抗菌药物加入固体平板：按左氧氟沙星0.5μg/mL、克拉霉素0.5μg/mL，甲硝唑4μg/mL，阿莫西林0.0625μg/mL的量分别加入哥伦比亚培养基和特色培养基中。
(3)菌液制备：取固体平板上对数期生长的H.pylori，用BHI制作成菌悬液，调整浓度OD600为0.3(1×108CFU/mL)，稀释10倍，备用。
(4)接种菌液：取10μL菌液滴加至特色培养基上，培养36h后判断结果。
(5)结果：抗生素加入哥伦比亚培养基与加入特色培养基结果一致性良好。
表5抗生素(单位μg/mL)加入特色固体培养基时H.pylori生长情况
Figure BDA0003972613360000151
备注：(“+”指H.pylori生长；“-”指H.pylori不生长；“×”指培养至72h时H.pylori不生长，且培养基不变色；“*”指培养36h有变色而培养72h时H.pylori生长)。
(6)结论：固体培养基的最终成分为100mL体系中，哥伦比亚培养基4g，小牛血清为14mL，尿素160mg，H.pylori选择性添加剂1mL，酚红8mg，氯化镍10μmol，调节pH为7.35；加入耐药检测的抗生素组成分别为：左氧氟沙星0.5μg/mL，克拉霉素0.5μg/mL，甲硝唑4μg/mL，阿莫西林0.0625μg/mL。具体制备方法如实施例1所述。
2.6本发明对实验室菌株的耐药性检测
(1)菌液制备：取固体平板上对数期生长的H.pylori，用BHI制作成菌悬液，调整浓度OD600为0.3(1×108CFU/mL)，稀释10倍，备用。
(2)接种菌液：取10μL菌液滴加在特色培养基上，共5块(ABCDE)，其中A为特色培养基不含抗生素，B为特色培养基含左氧氟沙星，C为特色培养基含克拉霉素，D为特色培养基含甲硝唑，E为特色培养基含阿莫西林；另取100μL菌液涂于哥伦比亚培养基并涂板。
(3)培养：所有平板移至三气培养箱内37℃培养36h，取出静置于自然环境30min后，根据特色培养基变色情况判断细菌是否产生耐药。
(4)结果：H.pyloriG27菌株菌量为1×105CFU/mL在不含抗生素的特色培养基上，培养36h，局部变红色；在含有抗生素(阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星)的特色培养基上不变色，判定H.pyloriG27菌株对这四中抗生素未产生耐药(如图4)。H.pylori286、287、289菌株菌量为1×105CFU/mL在不含抗生素的特色培养基上，培养36h，局部变红；在含有抗生素(阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星)的特色培养基上也变红色，判定H.pylori286、287、289菌株对这四中抗生素已产生耐药(如图5、图6、图7)。H.pylori159菌株菌量为1×105CFU/mL在不含抗生素的特色培养基上，培养36h，局部变红色；在含有克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星的特色培养基上变色，在含有阿莫西林的特色培养基上不变色，判定为对克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星已产生耐药，对阿莫西林敏感，(如图8)。所有的特色培养基判定结果与微量稀释法检测MIC(表3)的结论一致。
(5)结论：本发明对实验室菌株的耐药性检测与微量稀释法所判断耐药结论一致。
2.7本发明方法对临床样本的耐药性检测
(1)转移液体制备：灭菌并冷却后的BHI培养基，加入10％的小牛血清，再加入30％甘油制备H.pylori保存液，在此基础上再加入1％H.pylori选择性添加剂制成转移液。取1mL转移液至无菌EP管，再倒入灭菌后的小钢珠6-8枚，备用。
(2)临床样本选择：选择近期未使用抗生素或取样前，已停用抗生素4周、质子泵抑制剂2周的病例，征得患者同意并签知情同意书。
(3)标本获取：经胃镜活检孔道，在患者胃窦、胃体小弯侧各取织组1块放入EP管中，(严格无菌操作)，置于冰面并尽快(2h内)转移完成后续操作步骤。
(4)含组织的菌液制备：将含组织的EP管放于匀浆仪中300hz破碎处理5min，转移至另一EP，离心机12000rmp离心2min，弃上清，BHI重悬至200μL，制作成菌悬液备用。
(5)接种菌液：取10μL菌液滴加至特色培养基中(共5块)。三气培养箱37℃培养36h移出，放置30min后判断结果；另取100μL涂于哥伦比亚培养基上，做传统细菌培养。
(6)用传统细菌培养+微量稀释法检测临床菌株的MIC：配备阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星溶液1mg/mL。取哥伦比亚培养基上生长的H.pylori单菌落(经经尿素酶实验、氧化酶实验、过氧化氢酶实验及PCR检测CagA基因验证为H.pylori，见图13)，增菌。制备MIC板、菌液制备时取对数生长期的H.pylori，用BHI制作成菌悬液，调整浓度OD600为0.3(1×108CFU/mL，稀释10倍，取10μL加至1-8孔(每孔菌液浓度约为1.0×105CFU/mL，培养72h判断结果。
(7)结果：临床H.pylori菌株FY-31对左氧氟沙星耐药，对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑敏感，(如图9)；临床H.pylori菌株FY-47对甲硝唑耐药，对阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星敏感，(如图10)；临床H.pylori菌株FY-43、FY-52对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星均敏感，(如图11、12)。所有的特色培养基判定结果与微量稀释法检测MIC(表6)的结论一致。
表6微量稀释法检测临床幽门螺杆菌菌株MIC(单位μg/mL)
Figure BDA0003972613360000171
(8)结论本发明对不同菌株的耐药性检测结果与微量稀释法判断幽门螺杆菌耐药的结论一致。

Claims (6)

1.检测幽门螺杆菌耐药性的培养基，其特征在于，组成以哥伦比亚培养基为基础，添加占培养基10wt.%～15wt.%的小牛血清、尿素含量1.2～2.4mg/mL 、酚红含量0.004～0.016mg/mL、氯化镍含量10～100µmol/L、占培养基总体积1%的幽门螺杆菌选择性添加剂，同时加入检测耐药的抗生素，调节pH至7.15～7.35。
2.根据权利要求1所述培养基，其特征在于，所述哥伦比亚培养基4g，小牛血清为14mL，尿素160mg，幽门螺杆菌选择性添加剂（Dent，SR0147E）1mL，酚红0.8mg，氯化镍10μmol，加无菌水配成100mL体系，pH调节剂为5wt.%氢氧化钠溶液。
3.根据权利要求1所述培养基，其特征在于，所述抗生素为左氧氟沙星0.5µg/mL、克拉霉素0.5µg/mL、甲硝唑4µg/mL或阿莫西林0.0625µg/mL。
4.根据权利要求2所述培养基，其特征在于，所述培养基的pH为7.35。
5.权利要求1-4任一所述培养基的制备方法，其特征在于，步骤为：称取哥伦比亚培养基，加入纯水，高压灭菌后自然冷却至50℃，加入小牛血清、20wt.%无菌尿素溶液、幽门螺杆菌选择性添加剂、0.2wt.%酚红溶液、氯化镍，用5wt.%氢氧化钠溶液滴定法调节培养基的pH至7.35，再加入耐药检测抗生素，在培养基凝固前倒板，10mL/个。
6.权利要求1-4任一所述培养基在制备检测幽门螺杆菌耐药性产品中的应用。
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