CN115806612A - 一种抗app的纳米抗体的vhh链及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种抗APP的纳米抗体的VHH链及其应用。本发明的抗APP的纳米抗体具有以下有益效果：(1)分子小，药物递送。(2)易制造和表达。(3)亲和力高，特异性强。(4)性能稳定，可塑性好。(5)免疫原性低，代谢特征好。本发明APP的纳米抗体保留了VVH链抗体的能力，又尽可能避免了非人外源蛋白的引入，兼顾了有效结合抗APP的功能和尽可能低的异源性。另外，异源性的降低除了减少超敏反应以外还能延长了其在体内的半衰期，改善代谢特征。

Description

一种抗APP的纳米抗体的VHH链及其应用

技术领域

本发明涉及免疫技术领域，尤其涉及一种抗APP的纳米抗体的VHH链及其应用。

背景技术

全球约5千万病人经受阿尔兹海默症(Alzheimer's Disease，AD)的困扰，目前随着全球老龄化的加剧，AD已经成为世界上的第四大杀手，严重威胁着人类的健康和生活质量。针对阿尔兹海默症分子机制的研究早在19世纪80年代已经开展，数以千计的科学家投身这一多因素病症，以期破解阿尔兹海默之谜。大量研究表明阿尔茨海默氏病中，淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein，APP)的异常酶切是重要病因之一。

APP是一种典型的I型跨膜蛋白，有多种亚型，其中最主要的是APP770/APP751/APP695。APP通过淀粉样(β-途径)和非淀粉样(α-途径)两种途径进行代谢。前者经β-分泌酶剪切后产生sAPPβ(secreted APP-N terminal fragment,sAPPβ)和C99，C99再经γ-分泌酶作用后产生淀粉样多肽(βamyloid peptide，Aβ)和APP胞内功能域AICD(APPintracellular domain,AICD)；后者经α-分泌酶的切割后产生sAPPα和C83，C83再经γ-分泌酶作用后产生AICD。Aβ多肽聚集形成SP，进而诱发AD病理特征。

驼类抗体为天然存在的不含轻链的特殊抗体，只包含一个可以结合抗原的重链可变区(variable domain of heavy chain antibody，VHH)和两个常规的CH2与CH3区。驼类抗体的重链可变区(VHH)可以单独稳定地在体外存在，被称为纳米抗体(Nanobody)。纳米抗体晶体宽为2.5nm，长4nm，分子量仅为传统完整抗体的1/10(约15KD)但依然具有完整的抗原识别能力。得益于纳米抗体微小的结构和完整的抗原识别能力，相比较传统抗体纳米抗体表现出高亲合力、高特异性、强穿透性、高稳定性、易于表达和改造等优势。最重要的是相比较传统抗体，纳米抗体更容易作用于较小的抗原表位，因此通过驼类动物免疫得到纳米抗体库的多样性远远高于传统抗体。

目前，纳米抗体的应用主要在三个方面。首先在结构生物学领域，纳米抗体被用于特异性的结合某些蛋白质中不稳定的结构域，从而使得这些蛋白质的结构解析成为可能。例如2012年诺贝尔化学奖得主科比尔卡教授开创性地通过使用纳米抗体而解决了肾上腺素受体活性状态下的晶体结构(PDB：3P0G)。其次，将纳米抗体在细胞内表达可以作为生物探针(biosensor)特异性的追踪细胞中的目标蛋白质。最重要的是在药物研发领域，纳米抗体可以通过特异性的维持某些疾病相关的蛋白质构象而作为治疗药物，或推动药物发现的过程。2019年2月，FDA批准了第一款纳米抗体药物Caplacizumab，用于治疗成人获得性血栓性血小板紫癜(aTTP)。全球多个医药公司和科研机构都在积极探索纳米抗体在肿瘤、炎症和代谢性疾病中的表现。

因此，现有技术存在缺陷，需要改进。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种抗APP的纳米抗体的VHH链及其应用，以满足抗APP的应用。

本发明的技术方案如下：提供一种抗APP的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，框架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4，互补决定区CDR包括：CDR1、CDR2和CDR3；具体的氨基酸序列如下：FR1为SEQ ID NO:1，CDR1为SEQ ID NO:2，FR2为SEQ ID NO:3，CDR2为SEQ ID NO:4，FR3为SEQ ID NO:5，CDR3为SEQ ID NO:6，FR4为SEQ ID NO:7。

在一个优选的方案中，抗APP的纳米抗体的VHH链至包含框架区FR和互补决定区CDR，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

本发明还提供一种抗APP的纳米抗体，包括：前述的抗APP的纳米抗体的VHH链。所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1的氨基酸序列如SEQID NO.5所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。在一个优选的技术方案中。在本发明中具有该可变区序列的纳米抗体的一个优选实施例为纳米抗体P2-10C。

本发明还提供一种基因序列，其编码前述的抗APP的纳米抗体的VHH链或者其编码前述的抗APP的纳米抗体。该基因序列其具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

本发明还提供一种核苷酸构建体，其包含有前述的基因序列。

本发明还提供一种重组表达载体，其包含前述的核苷酸构建体。所述表达载体为pET22b。

本发明还提供一种重组宿主细胞，其包含前述的核苷酸构建体或前述的重组表达载体。述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还提供一种生产抗APP的纳米抗体的方法，其通过培养前述的重组宿主细胞，诱导重组宿主细胞表达抗APP的纳米抗体的形式来制备。

本发明还提供一种检测APP的诊断试剂中的应用，采用前述的抗APP的纳米抗体的VHH链或者采用前述的抗APP的纳米抗体。

采用上述方案，本发明提供一种抗APP的纳米抗体的VHM链及其应用。本发明的抗APP的纳米抗体具有以下有益效果：

(1)分子小，药物递送。本发明抗APP的纳米抗体分子小，当作为靶向分子时，对活性部位(效应分子)的构象影响和空间位阻都更小，效应分子活性更高，可应用于药物传递系统中。

(2)易制造和表达：本发明抗APP的纳米抗体可利用大肠杆菌可高效表达。

(3)亲和力高，特异性强：本发明抗APP的纳米抗体具有VHH链，获得了对APP蛋白的高亲和力。

(4)性能稳定，可塑性好：本发明抗APP的纳米抗体能够其他分子偶联，能保持对抗APP的稳定的结合能力。

(5)免疫原性低，代谢特征好：本发明APP的纳米抗体保留了VVH链抗体的能力，又尽可能避免了非人外源蛋白的引入，兼顾了有效结合抗APP的功能和尽可能低的异源性。另外，异源性的降低除了减少超敏反应以外还能延长了其在体内的半衰期，改善代谢特征。

本发明提供的抗APP的纳米抗体具有独特的抗原决定簇识别位点，对APP抗原具有特异的识别和结合能力，该纳米抗体具有较高的抗原亲和力，所述亲和力可达到7×10^-8M，显示出了优异的检测效果。

附图说明

图1为根据本发明实施方式的APP免疫羊驼的效价检测；

图2为根据本发明实施方式的APP纳米抗体的氨基酸序列图；

图3为纳米抗体P2-10C表达纯化SDS-PAGE图；

图4为纳米抗体P2-10C亲和力测试曲线图(KD＝7×10^-8M)。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

抗APP单域重链抗体噬菌体文库的构建

取800μg APP蛋白与弗氏完全佐剂乳化后，对羊驼(Lama pacos)进行皮下多点注射免疫。加强免疫采用800μg APP蛋白与弗氏不完全佐剂乳化，间隔2周进行，每次免疫7天后静脉取血，采用间接ELISA法测定血清效价，选择血清效价最高的样品分离淋巴细胞，提取总RNA，反转录为cDNA，经过两轮PCR扩增后得到抗体序列扩增产物，选择载体进行酶切后连接，最后转化至TG1大肠杆菌感受态细胞得到细菌文库，经过辅助噬箘体(M13KO7)侵染并诱导后制备获得噬菌体文库。

抗APP单域重链抗体的淘选与鉴定

采用固相亲和淘选的方法从抗APP单域重链抗体噬菌体文库中淘选针对APP的单域重链抗体。向每个酶标孔中加入120μL用PBS稀释的APP，4℃，包被过夜，每轮淘选的包被浓度分别为100，75，50μg/mL；吸出包被液，PBS洗板5次，每孔加入300μL 3％BSA-PBS，37℃，封闭2h；PBS洗板5次，加入100μL噬菌体抗体文库(约含1×1011CFU)，37℃，孵育2h；吸出未结合的噬菌体，用PBST(含0.5％Tween-20)洗板3-5次(逐轮增加5次)，再用PBS洗板15-25次；以100μL洗脱液(甘氨酸-盐酸，pH 2.2)洗脱吸附在酶标孔中的噬菌体，用35μL Tris-HCl(1mol/L，pH8.0)中和洗脱物，取10μL用于滴度测定，其余125μL洗脱物扩增后用于下一轮淘选。经四轮淘选后，采用辅助噬菌体KM13对随机挑取的单克隆进行救援，分别得到展示抗体可变区的噬菌体颗粒，再用间接phage-ELISA测定噬菌体颗粒的结合活性和特异性。将ELISA阳性克隆送生物技术服务公司进行序列测定，得到插入片段的DNA序列，其编码针对APP的单域重链抗体。

请参阅图2，所得单价纳米抗体P2-10C的氨基酸序列(SEQ ID NO.8)为:

DVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIIFSGYYMSWVRQAPGKGPEWVSSINPSGSSTRYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMYSLKPEDTALYYCSRSRDGLGDVRGQGTQVTVSS，其中第1-25位氨基酸序列为FR1，第26-33位氨基酸序列为CDR1，第34-50位氨基酸序列为FR2，第51-57位氨基酸序列为CDR2，第58-95位氨基酸序列为FR3，第96-111位氨基酸序列为CDR3，第112-122位氨基酸序列为FR4。

抗APP单域重链抗体的制备

将抗APP单域重链抗体基因片段(SEQ ID NO.9)

atgtgcagctgcaagagtccggcgggggcctggtgcaacctggcggcagcctgagactgagctgcgccgctagcggcatcatcttcagcggctactacatgagctgggtgagacaagcccccggcaagggccccgagtgggtgagcagcatcaaccctagcggcagcagcacaagatacgccgacagcgtgaagggcagattcaccatcagcagagacaacgccaagaacaccgtgtacctgcagatgtacagcctgaagcccgaggacaccgccctgtactactgcagcagaagcagagacggcctgggcgacgtgagaggccaaggcacccaagtgaccgtgagcagc克隆至表达载体pET22b，经PCR和酶切鉴定，构建完成抗APP单域重链抗体的表达载体转化至大肠杆菌BL21，挑单克隆菌落到5ml含抗生素的LB培养基中，37℃摇菌5h；5ml菌液加入500ml含抗生素的LB培养基中扩大培养；待菌液OD值为0.6-0.8时，加入0.5mM IPTG，18℃诱导过夜。4000rpm离心5min收集细菌沉淀；沉淀用含20mM Tris-Hcl,150mM NaCl,1mM PMSF和5mM咪唑的溶液重悬，超声破碎300W，20min；18000rpm离心15min收集上清；上清与1ml Ni resin混合孵育30min；1000rpm离心2min弃上清，含20mM咪唑的缓冲液重悬到重力柱中；并依次用20mM，40mM和60mM的咪唑溶液洗去杂蛋白，最后用6ml含500mM咪唑的溶液洗脱目的蛋白，直接流到浓缩管中，取样跑胶检测，同时3000rpm,10min/次，浓缩至1ml；过分子筛，跑胶检测没问题后冻存。抗APP纳米抗体的亲和力测定

使用分子间相互作用的测试方法SPR(surface plasmon resonance)对实施例3制备得到的纳米抗体进行亲和力测定。

亲和力KD(M)＝kdis(1/s)/kon(1/Ms)。经检测得到：kdis(1/s)＝0.009213；kon(1/Ms)＝129500；KD(M)＝kdis(1/s)/kon(1/Ms)＝7×10^-8M。

请参阅图1，图1为根据本发明的实施方式的APP免疫羊驼的效价检测；从图中可以看出本发明的抗原免疫羊驼是有效果的，这是获得高亲和性和特异性抗的APP的纳米抗体的关键，为获得有效的抗APP的纳米抗体提供基础。

图3为纳米抗体P2-10C表达纯化SDS-PAGE图；从图3中可以看出，该纳米抗体分子量小。

图4为纳米抗体P2-10C亲和力测试曲线图(KD＝7×10^-8M)。从图中可以看出该纳米抗体的亲和力高，特异性好。

综上所述，本发明提供一种抗APP的纳米抗体的VHM链及其应用。

本发明的抗APP的纳米抗体具有以下有益效果：

(1)分子小，药物递送。本发明抗APP的纳米抗体分子小，当作为靶向分子时，对活性部位(效应分子)的构象影响和空间位阻都更小，效应分子活性更高，可应用于药物传递系统中。

(2)易制造和表达：本发明抗APP的纳米抗体可利用大肠杆菌可高效表达。

(3)亲和力高，特异性强：本发明抗APP的纳米抗体具有VHH链，获得了对APP蛋白的高亲和力。

(4)性能稳定，可塑性好：本发明抗APP的纳米抗体能够其他分子偶联，能保持对抗APP的稳定的结合能力。

(5)免疫原性低，代谢特征好：本发明APP的纳米抗体保留了VVH链抗体的能力，又尽可能避免了非人外源蛋白的引入，兼顾了有效结合抗APP的功能和尽可能低的异源性。另外，异源性的降低除了减少超敏反应以外还能延长了其在体内的半衰期，改善代谢特征。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗APP的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，其特征在于，框架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4，互补决定区CDR包括：CDR1、CDR2和CDR3；具体的氨基酸序列如下：FR1为SEQ ID NO:1，CDR1为SEQ ID NO:2，FR2为SEQ ID NO:3，CDR2为SEQ ID NO:4，FR3为SEQ ID NO:5，CDR3为SEQ ID NO:6，FR4为SEQ ID NO:7。

2.根据权利要求1所述的一种抗APP的纳米抗体的VHH链，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

3.一种抗APP的纳米抗体，其特征在于，包括：权利要求1或2所述的抗APP的纳米抗体的VHH链。

4.一种基因序列，其特征在于，其编码如权利要求1或2所述的抗APP的纳米抗体的VHH链或者其编码如权利要求3所述的抗APP的纳米抗体。

5.根权利要求4所述的一种基因序列，其特征在于，其具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

6.一种核苷酸构建体，其特征在于，其包含有如权利要求4或5所述的基因序列。

7.一种重组表达载体，其特征在于，其包含如权利要求6所述的核苷酸构建体。

8.一种重组宿主细胞，其特征在于，其包含如权利要求6所述的核苷酸构建体或如权利要求7所述的重组表达载体。

9.一种生产抗APP的纳米抗体的方法，其特征在于，其通过培养如权利要求8所述的重组宿主细胞，诱导重组宿主细胞表达抗APP的纳米抗体的形式来制备。

10.一种检测APP的诊断试剂中的应用，其特征在于，采用如权利要求1或2所述的抗APP的纳米抗体的VHH链或者采用如权利要求3所述的抗APP的纳米抗体。

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