CN115803439A - 增强基于腺病毒的基因转移载体的生产 - Google Patents

Abstract

在一个方面，本文所公开的实施方案涉及在不使用腺病毒辅助病毒的情况下包装的完全缺失的基于腺病毒的基因递送载体的生产，更具体地，所述基因递送载体在基因转移和蛋白质表达、疫苗开发以及细胞工程中的用途。在另一个方面，描述了缺失所有腺病毒基因的腺病毒载体的生产，所述腺病毒载体携带对真核细胞具有有害或毒性活性的目标基因。

Description

增强基于腺病毒的基因转移载体的生产

领域

本文所公开的实施方案涉及基于完全缺失的腺病毒的载体的生产，所述载体递送对在不具有辅助腺病毒情况下包装的真核细胞有害或有毒的基因，更具体地，涉及所述载体在用于基因和蛋白质表达、疫苗接种以及细胞和组织的修饰中的基因疗法中的用途。

背景

用于将遗传物质递送至人类细胞中的最常用的载体是腺病毒。腺病毒已经从大量不同的物种中分离出来，并且已经报道了超过100种不同的血清型。腺病毒基因组的整体组织在血清型之间是保守的，因此特定功能的定位相似。不同血清型的腺病毒已被完全测序，并且其基因组序列可公开获得。许多成人已暴露于血清型5(Ad5)的人类腺病毒，这种病毒已成为许多基因转移载体的基础。

Ad5基因组是线性的、非分段的双链DNA，大约35kbp(大小因组而异)，理论上具有编码30-40个基因的能力。Ad5基因组的两侧是反向末端重复序列(LITR和RITR)，这对于腺病毒的复制是必不可少的。诸如Ad5的腺病毒的感染周期分为早期和晚期。在早期阶段，病毒没有被包裹，并且基因组被运送至细胞核，之后早期基因区(E)E1、E2、E3和E4变得具有转录活性。E1含有两个区域，即E1A和E1 B。E1A区(有时称为即刻早期区)编码两种主要蛋白质，所述蛋白质参与宿主细胞周期的修饰和其他病毒转录区的激活。E1 B区编码两种主要蛋白质19K和55K，所述两种蛋白质通过不同的途径防止由E A蛋白的活性引起的细胞凋亡的诱导。另外，后期需要E1 B-55K蛋白用于选择性病毒mRNA转运和抑制宿主蛋白表达。E2也分为E2A和E2B区，所述区一起编码三种蛋白质。DNA结合蛋白、病毒聚合酶和前末端蛋白，所述三种蛋白质都参与病毒基因组的复制。E3区不是体外复制所需的，但其编码若干种蛋白质，这些蛋白质破坏宿主对病毒感染的防御机制。E4区编码至少六种蛋白质，这些蛋白质参与与病毒mRNA剪接和转运、宿主细胞mRNA转运、病毒和细胞转录和转化相关的若干种不同的功能。

形成病毒衣壳和包装病毒基因组所必需的晚期蛋白质均由在病毒DNA复制开始后变得完全活跃的主要晚期转录单位产生。差异剪接和多腺苷酸化的复杂过程产生了超过15种共享三联前导序列的mRNA物种。早期蛋白质E1 B-55K和E4-Orf3以及Orf6在调节晚期mRNA加工和从细胞核转运中起关键作用。

新形成的病毒基因组在预制衣壳中的包装是由至少两种腺病毒蛋白介导，即晚期52/55k和中间蛋白IVa2，通过与位于Ad5基因组左端的病毒包装信号(Ψ)相互作用。第二种中间蛋白pIX是衣壳的一部分，并且已知可稳定六邻体-六邻体相互作用。另外，pIX已被描述为含有反式激活TATA的启动子，如E1A启动子和主要晚期启动子(MLP)。

基于腺病毒的载体和腺病毒包装细胞系

基于腺病毒的载体已被用作实现将高水平基因转移至各种细胞类型中，作为疫苗递送媒介的手段，用于将基因转移至用于基因疗法的组织移植物中，以及用作在其他难以高效转染的细胞系和组织中表达重组蛋白的手段。当前用于包装基于腺病毒的载体的系统由宿主细胞和腺病毒晚期基因的来源组成。包括293、OBI和PERC.6细胞的当前已知的宿主细胞系仅表达早期(非结构)腺病毒基因，而不表达包装所需的腺病毒(结构)基因。腺病毒晚期基因先前已由腺病毒载体本身以顺式形式或由辅助腺病毒病毒以反式形式提供。提供自身衣壳化所必需的基因的腺病毒载体携带主要由E1基因，以及在一些情况下E3和其他腺病毒区缺失的最小修饰的腺病毒基因组。

最近，“无肠”腺病毒载体——不含所有病毒蛋白编码DNA序列的载体已被开发出来。无肠腺病毒载体仅含有病毒基因组的末端(LITR和RITR)、目标基因(诸如治疗基因)和正常包装识别信号(ψ)，这使得所述基因组选择性地包装。然而，为了繁殖无肠腺病毒载体，需要辅助腺病毒，所述辅助腺病毒含有复制和病毒粒子组装所需的腺病毒基因以及LITR、RITR和ψ。虽然这种辅助病毒依赖型系统允许引入多达约35kb的外源DNA，但辅助病毒使用这种方法会污染无肠腺病毒载体的制剂。由于复制能力病毒并且由于宿主对辅助病毒中的腺病毒基因的免疫反应，污染复制能力辅助病毒给基因疗法、疫苗和移植应用带来了严重的问题。在这种辅助病毒依赖型载体系统中减少辅助污染的一种方法是在包装识别信号(ψ)中引入条件基因缺陷使其DNA不太可能被包装至病毒粒子中。在此类系统中产生的无肠腺病毒载体仍具有明显的辅助病毒污染。能够在不具有辅助病毒污染的情况下产生无肠腺病毒基因转移载体将消除辅助病毒污染，从而导致降低的人类受试者和动物毒性并延长基因表达。

据信腺病毒基因，尤其是在最小修饰的腺病毒载体或腺病毒辅助病毒中携带的腺病毒晚期基因：1)有助于在腺病毒介导的基因疗法后所见的炎症反应；2)降低在疫苗应用中对目标基因的免疫反应；3)干扰正常的细胞功能；和4)在蛋白质表达应用中导致蛋白质污染。此外，所述腺病毒基因占据了最小修饰的腺病毒载体中的空间，所述载体可能有益地用于携带其他遗传信息。在过去十年中，腺病毒载体取得了显着进展，但严重的缺陷继续挑战着其使用。

用于基因疗法和蛋白质表达的腺病毒载体

基因递送或基因疗法是用于治疗获得性和遗传性疾病的有前景的方法。越来越多的异常表达与威胁生命的人类疾病相关的基因正在被克隆和鉴定。在人类中表达此类克隆基因的能力最终将允许预防和/或治愈许多重要的人类疾病，对于所述疾病目前的疗法要么不足，要么不存在。

然而，不幸的是，迄今为止所描述的基因疗法方案一直受到各种问题的困扰，尤其包括载体的基因表达时间短，以及不能有效地第二次重新施用相同的载体，这两种困扰可能是由宿主对与载体和其治疗有效载荷相关的抗原的免疫反应引起的。掺入病毒和/或治疗基因的组织最初受到由CD8+细胞毒性T细胞和CD4+辅助T细胞介导的宿主细胞免疫反应的攻击，这极大地限制了来自载体的基因表达的持久性。此外，由CD4+T细胞介导的宿主体液免疫反应通过抑制相同载体的成功重新施用来进一步限制当前基因疗法方案的有效性。

例如，在最初施用腺病毒载体后，针对主要病毒衣壳蛋白的表位产生血清型特异性抗体，即五邻体、六邻体和纤维。鉴于此类衣壳蛋白是腺病毒将自身附接至细胞并随后感染细胞的手段，因此此类抗体随后能够阻断或“中和”相同血清型的腺病毒或腺病毒载体对细胞的再感染。这可能需要使用不同血清型的腺病毒，以便在基因疗法和疫苗的背景下施用一个或多个后续剂量的外源治疗DNA。另外，当使用最小修饰的腺病毒载体或腺病毒辅助病毒污染的腺病毒载体制剂时，治疗和病毒基因产物都会在靶细胞上表达。这些抗原可以被细胞免疫反应识别，导致转导的细胞或组织的破坏，因此基因疗法和疫苗接种的有益效果可能会被否定。由于这些与免疫相关的障碍，最小修饰的病毒载体的广泛使用受到阻碍。

至少53种不同形式的人类腺病毒以及许多动物腺病毒已被表征。这些病毒之间的主要区别因素是对衣壳六邻体蛋白(由L3基因的各种等位基因编码)的体液免疫(即抗体)反应。事实上，不同六邻体蛋白之间的大部分变异发生在三个“高”变区；对腺病毒的体液免疫反应集中在这些高变区。其他结构，诸如腺病毒表面的纤维蛋白也可以被体液免疫系统识别。因此，可以通过在每次应用之间转换腺病毒血清型来减轻体液免疫反应对最小修饰的腺病毒载体活性的干扰。晚期腺病毒基因展示出较少的变异性，因此通过转换载体的腺病毒血清型无法避免由最小修饰的腺病毒载体或腺病毒辅助病毒诱导的T细胞反应。

人类群体已经暴露于某些腺病毒血清型的天然腺病毒感染。因此，这些受试者携带由这些腺病毒和基于这些血清型的腺病毒的腺病毒载体表达的体液和细胞免疫反应定向基因。有两个进展试图克服这些问题。所述进展是使用“无肠”(完全缺失)腺病毒载体和使用基于表达稀有或动物血清型的稀有或动物腺病毒的腺病毒载体。虽然使用“无肠”腺病毒载体从治疗载体中去除了诸如L3的腺病毒基因，但这些“无肠”腺病毒载体的繁殖需要仍携带腺病毒基因的辅助腺病毒的存在。这些辅助病毒是“无肠”腺病毒载体制剂中的重要污染物。使用基于稀有或动物血清型的最小修饰的腺病毒载体可以避免先前已暴露于给定血清型腺病毒的受试者中预先存在的体液免疫和可能在较小程度上避免预先存在的细胞免疫的问题。尽管如此，由于最小修饰的腺病毒载体表达腺病毒基因，包括高免疫原性L3，所述基因可能会诱导对这些腺病毒基因的有效体液和细胞免疫反应。因此，不可能重复应用给定血清型的最小修饰的腺病毒载体。

作为疫苗载体的腺病毒

腺病毒载体已经从用于基因替代疗法的工具转变为真正的疫苗递送媒介。所述疫苗递送媒介是有吸引力的疫苗载体，因为其在哺乳动物宿主中诱导先天性和适应性免疫反应。腺病毒载体已经过测试，以作为亚单位疫苗系统递送给多种感染传染病，诸如疟疾、肺结核、埃博拉病毒(Ebola)和HIV-1。另外，所述腺病毒载体已作为针对不同的肿瘤相关抗原的疫苗探索。迄今为止，大多数腺病毒载体疫苗已被构建为人类和动物血清型的最小修饰的腺病毒载体。

腺病毒基因表达的动态使得腺病毒包装系统的设计变得困难：腺病毒早期功能转录区(E 1A)基因的表达诱导腺病毒晚期基因(结构性、免疫原性基因)的表达，这反过来又杀死细胞。

因此，组成型表达腺病毒早期基因的宿主细胞不能携带“野生型”腺病毒晚期顺反子。先前用于繁殖腺病毒载体的宿主细胞不是真正的“包装”细胞。具体来说，293、QBI和PERC 6细胞仅表达早期(非结构的)腺病毒基因，而不表达包装所需的腺病毒晚期基因。必须提供腺病毒晚期和早期基因。所述基因先前由最小修饰的腺病毒载体以顺式形式或辅助腺病毒以反式形式提供。

在最小修饰的腺病毒载体或污染性辅助腺病毒中发现的腺病毒基因有助于对腺病毒载体制剂的炎症和免疫反应，降低对基于腺病毒的疫苗的目标基因的免疫反应；干扰正常的细胞功能；以及基于腺病毒的蛋白质表达中的污染。

使用强效并且广泛活性的启动子(诸如病毒启动子)来表达目标基因可能是有益的。这可能是确保有效的基因疗法或强效免疫原性所必需的。然而，基因转移载体可能携带对用于包装腺病毒载体的宿主细胞有害或有毒的目标基因。因此，所述载体的表达可能会干扰腺病毒载体(即最小修饰和“有肠”的载体)的有效衣壳化。这些基因在设计上可能是有毒或有害的，例如，在转导后去除癌细胞，或这些基因可能构成细菌或病毒基因，尽管在高浓度时对宿主细胞有害或有毒，对于所述有害或有毒可能产生保护性免疫反应，诸如埃博拉病毒糖蛋白。因此，可能有必要在包装期间下调目标基因的表达。本文所描述的发明解决了这个问题。本发明提供了在不具有腺病毒辅助病毒参与的情况下，用于生产最小修饰的腺病毒载体或“有肠”(完全缺失)腺病毒载体的系统和方法，所述腺病毒载体携带具有对用于衣壳化这些载体的宿主细胞有害或有毒功能的目标基因。将描述此类载体的用途。

发明内容

本文所公开的实施方案涉及用辅助病毒包装的完全缺失的腺病毒载体的构建和生产。实施方案还涉及最小修饰的腺病毒载体和完全缺失的腺病毒载体的生产，这些腺病毒载体携带具有对用于生产或衣壳化这些载体的宿主细胞有害或有毒功能和活性的目标基因。实施方案涉及用于基因疗法、疫苗接种、癌症疗法和免疫抑制疗法的这些载体。

根据本文所说明的方面，提供了一种系统，其包括(a)用于包装腺病毒载体的腺病毒宿主细胞；(b)完全缺失的腺病毒载体模块构建体；(c)包装表达质粒，其携带能够将腺病毒载体模块衣壳化至腺病毒衣壳中的基因；(d)表达构建体，其在单独的表达载体上或掺入包装表达质粒中，所述表达质粒能够抑制目标基因在腺病毒载体模块上的表达；(e)或与腺病毒载体模块上的目标基因结合的一组短抑制性RNA或DNA片段，其能够抑制目标基因的表达。将完全缺失的腺病毒载体的最小修饰的腺病毒载体模块任选地与包装表达质粒、表达构建体或能够抑制目标基因在腺病毒载体模块上表达的RNA或DNA片段组共转染。

包装表达载体和抑制目标基因的表达构建体本身不能被衣壳化。腺病毒载体模块本身无法复制。根据本文所说明的方面，公开了一种用于繁殖具有有害的毒性基因的腺病毒载体的方法，其包括(a)提供腺病毒包装细胞；(b)将缺失了所有腺病毒基因的腺病毒载体模块转染至包装细胞系中；(c)将包装表达质粒转染至包装细胞中，其中完全缺失的腺病毒载体模块和包装表达质粒转染包装细胞，导致完全缺失的腺病毒载体模块独立于辅助病毒在腺病毒衣壳中的衣壳化；(d)将编码在完全缺失的腺病毒载体模块上发现的目标基因的反义RNA表达的抑制性表达质粒转染至包装细胞中，其中目标基因在完全缺失的腺病毒载体模块上的表达被抑制；(e)将完全缺失的腺病毒载体模块、包装表达质粒和抑制性表达质粒转染至包装细胞中，以抑制目标基因在载体衣壳化期间的表达，并改进完全腺病毒载体模块包装至腺病毒衣壳中；(f)转染与在完全缺失的腺病毒载体模块上发现的目标基因结合的短抑制性RNA或DNA片段，其中目标基因在完全缺失的载体模块上的表达被抑制；(g)将完全缺失的腺病毒载体模块、包装表达质粒和短抑制性RNA或DNA片段转染至包装细胞中，以抑制目标基因在载体衣壳化期间的表达，并改进完全腺病毒载体模块包装至腺病毒衣壳中。

根据本文所说明的方面，公开了一种用于繁殖具有有害的毒性基因的腺病毒载体的方法，其包括(a)提供腺病毒包装细胞；(b)将最小修饰的腺病毒载体转染至包装细胞中；(c)将编码在完全缺失的腺病毒载体模块上发现的目标基因的反义RNA表达的抑制性表达质粒转染至包装细胞中，其中目标基因在完全缺失的腺病毒载体模块上的表达被抑制；(d)将完全缺失的腺病毒载体模块、包装表达质粒和抑制性表达质粒转染至包装细胞中，以抑制目标基因在载体衣壳化期间的表达，并改进完全腺病毒载体模块包装至腺病毒衣壳中；(e)转染与在完全缺失的腺病毒载体模块上发现的目标基因结合的短抑制性RNA或DNA片段，其中目标基因在完全缺失的载体模块上的表达被抑制；(g)将完全缺失的腺病毒载体模块、包装表达质粒和短抑制性RNA或DNA片段转染至包装细胞中，以抑制目标基因在载体衣壳化期间的表达，并改进完全腺病毒载体模块包装至腺病毒衣壳中。

在一个实施方案中，用衣壳化的完全缺失的腺病毒载体转导靶细胞以治疗病状、疾病或病症。在一个实施方案中，将衣壳化的完全缺失的腺病毒载体注入人类受试者体内，以便目标基因的表达发挥诊治作用或诱导免疫反应。在一个实施方案中，衣壳化的完全缺失的腺病毒载体用于转导靶细胞或靶组织以修饰其活性或修饰其他细胞和组织组分对靶细胞或靶组织的反应。

在一些实施方案中，本公开的基因转移载体适用于治疗癌症的方法中。在一些实施方案中，本公开的基因转移载体适用于治疗皮肤病症的方法中。在一些实施方案中，本公开的基因转移载体适用于治疗血管疾病的方法中。在一些实施方案中，本公开的基因转移载体适用于治疗心脏病的方法中。在一些实施方案中，本公开的基因转移载体适用于治疗心脏病的方法中。在一些实施方案中，基因转移载体适用于治疗自身免疫疾病的方法中。在一些实施方案中，本公开的基因转移载体适用于治疗寄生虫感染的方法中。在一些实施方案中，本公开的基因转移载体适用于治疗病毒感染的方法中。在一些实施方案中，本公开的基因转移载体适用于治疗细菌感染的方法中。

在一些实施方案中，本公开的基因转移载体适用于酵母菌感染的方法中。在一些实施方案中，本公开的基因转移载体适用于治疗神经系统疾病的方法中。在一些实施方案中，本公开的基因转移载体适用于治疗遗传性疾病的方法中。

在一些实施方案中，通过本公开的方法生产的衣壳化的腺病毒载体用作蛋白质表达的基因递送载体。在一些实施方案中，通过本公开的方法生产的衣壳化的腺病毒载体用于开发和制造疫苗。在一些实施方案中，通过本公开的方法生产的衣壳化的腺病毒载体用作免疫抑制疗法的基因递送载体。在一个实施方案中，用先前生产的衣壳化的腺病毒载体转导靶细胞。

其他目标和特征将在下文中部分地显而易见并被部分地指出。

附图描述

图1是展示完全缺失的腺病毒载体模块的设计的实施方案的图解表示。

图2是展示具有和不具有表达盒的包装表达质粒的设计的实施方案的图解表示，所述表达盒能够抑制腺病毒载体模块上目标基因的表达。

图3是展示最小修饰的腺病毒载体的设计的实施方案的图解表示。

图4是展示携带一个或多个表达盒的抑制性表达质粒的设计的实施方案的图解表示，所述表达盒能够抑制腺病毒载体模块上所发现的一种或多种目标基因的表达。

图5是展示通过将完全缺失的腺病毒载体模块与包装表达质粒共转染来进行衣壳化的方法的实施方案的图解表示。

图6是展示通过将完全缺失的腺病毒载体模块与包装表达质粒和能够抑制腺病毒载体模块上目标基因的表达的表达质粒共转染来进行衣壳化的方法的实施方案的图解表示。

详细描述

除其他外，本公开提供了完全缺失的腺病毒载体模块、包装表达质粒和腺病毒包装细胞，用于繁殖在不具有腺病毒辅助病毒的情况下包装的基于完全缺失的腺病毒的基因转移载体。作为最小修饰和完全缺失的载体的基因转移载体用于基因和蛋白质表达的基因疗法、疫苗开发、细胞和组织操纵以及免疫抑制疗法中。任何亚型、亚型混合物或嵌合腺病毒均可用作DNA来源，用于产生腺病毒基因转移载体。在一个实施方案中，DNA来源是来自人类血清型5。

在本文所公开的系统中，将完全缺失的腺病毒载体与包装表达质粒共转染。能够干扰目标基因的表达盒是在包装表达载体上或在也共转染的单独表达载体上找到。共转染抑制腺病毒载体模块上目标基因表达的替代RNA或DNA片段。在本文所公开的另一个系统中，将最小修饰的腺病毒载体在包装细胞中暴露于表达能够干扰在包装表达载体上发现的目标基因的基因的表达载体，或暴露于抑制目标基因在另外所定义的腺病毒载体上的表达的RNA或DNA片段，本文所用的所有技术和科学术语与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的具有相同的含义。一般来说，本文所用的命名和下文所描述的细胞培养、分子遗传学和核酸化学以及杂交中的实验室程序是本领域中众所周知并普遍采用的。标准技术用于重组核酸方法、多核苷酸合成以及微生物培养和转化(例如电穿孔、脂质体转染)。一般来说，酶反应和纯化步骤是根据制造商的说明进行。技术和程序通常是根据本领域的常规方法和各种一般参考文献进行(一般参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A LabaratoryManual,第2版.(1989)Cold Spring Labaratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，所述参考文献以引用的方式并入本文)，其在整个本文件中提供。单位、前缀和符号可以其SI接受的形式来表示。除非另外指出，否则分别地核酸从左至右以5'至3'取向书写；氨基酸序列从左至右以氨基至羧基取向书写。数值范围包括限定所述范围的数字并包括所限定范围内的每个整数。氨基酸可在本文中由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样，核苷酸可以用其通常接受的单字母代码来表示。除非另外规定，否则本文所用的软件、电气和电子术语均如The New IEEE StandardDictionary of Electrical and Electronics Terms(第5'h版,1993)中所定义。如在整个公开中所使用的，除非另外说明，否则以下术语应理解为具有以下含义并通过参考整个说明书来更充分地定义。本文所用，术语“腺病毒”和“腺病毒颗粒”包括可归类为腺病毒的任何和所有病毒，包括感染人类或动物的任何腺病毒，包括所有组、子组和血清型。因此，如本文所用，“腺病毒”和“腺病毒颗粒”是指病毒本身或其衍生物，并且涵盖所有血清型和亚型以及天然存在和重组的形式。在一个实施方案中，此类腺病毒感染人类细胞。

此类腺病毒可以是野生型的或可以以本领域已知的或如本文所公开的各种方式进行修饰。此类修饰包括对包装在颗粒中的腺病毒基因组进行修饰以制备感染性病毒。此类修饰包括本领域已知的缺失，诸如E1a、EI b、E2a、E2b、E3或E4编码区中的一个或多个中的缺失。“腺病毒包装细胞”是能够包装腺病毒基因组或修饰的基因组以产生病毒颗粒的细胞。所述细胞可以提供缺失的基因产物或其等效物。因此，包装细胞可为腺病毒基因组中缺失的基因提供补充功能，并能够将腺病毒基因组包装至腺病毒颗粒中。此类颗粒的生产需要复制基因组并生产组装感染性病毒所必需的那些蛋白质。颗粒还可能需要病毒颗粒成熟所必需的某些蛋白质。此类蛋白质可由最小修饰的载体、包装表达质粒或由包装细胞提供。可用于制备根据本发明的包装细胞系的示例性宿主细胞包括但不限于A549、Hela、MRC5、W138、CHO细胞、Vera细胞、人类胚胎视网膜细胞、人类胚胎肾细胞或任何真核细胞，只要宿主细胞允许腺病毒生长。一些宿主细胞系包括脂肪细胞、软骨细胞、上皮细胞、成纤维细胞、胶质母细胞瘤、肝细胞、角质形成细胞、白血病、类淋巴母细胞、单核细胞、巨噬细胞、成肌细胞和神经元。其他细胞类型包括但不限于源自原代细胞培养物的细胞，例如人类原代前列腺细胞、人类胚胎视网膜细胞、人类干细胞。真核二倍体和非整倍体细胞系包括在本发明的范围内。包装细胞必须是能够表达腺病毒载体和/或包装表达质粒的产物以及那些产物的适当水平的抑制性表达盒和/或载体的细胞，以产生高滴度的重组基因转移载体原液。

“抗原”意指含有一个或多个表位的分子，所述表位将刺激宿主的免疫系统以产生细胞抗原特异性免疫反应或体液抗体反应。因此，抗原包括蛋白质、多肽、抗原性蛋白质片段、寡糖、多糖等。此外，抗原可以来源于任何已知的病毒、细菌、寄生虫、植物、原生动物或真菌，并且可以是完整的有机体。所述术语还包括肿瘤抗原。类似地，表达抗原的寡核苷酸或多核苷酸(诸如在DNA免疫应用中)也包括在抗原的定义中。还包括合成抗原，例如多表位、侧接表位和其他重组或合成衍生的抗原(Bergmann等人.(1993)Eur.J.Immunol.23:2777 2781、Bergmann等人.(1996)J.Immunol.157.3242 3249；Suhrbier,A.(1997)Immunol.and Cell Bioi.75:402 408；Gardner等人.(1998)第12届世界艾滋病大会(12thWorld AIDS Conference),Geneva,Switzerland,1998年6月28日-7月3日)。

“编码序列”或“编码”所选多肽的序列是当置于适当调控序列(或“控制元件”)的控制下时转录(在DNA的情况下)并在体内翻译(在mRNA的情况下)成多肽的核酸分子。编码序列的边界是由在5'(氨基)末端的起始密码子和在3'(羧基)末端的翻译终止密码子来确定。转录序列可能位于编码序列的3'端。编码序列的转录和翻译通常是由“控制元件”调节，所述控制元件包括但不限于转录启动子、转录增强子元件、Shine和Delagamo序列、转录终止信号、多腺苷酸化序列(位于翻译终止密码子的3')、用于优化翻译起始的序列(位于编码序列的5')和翻译终止序列。

术语“构建体”是指本发明的完全缺失的腺病毒载体模块、本发明的包装表达载体或位于表达质粒上的抑制性表达盒中的至少一种。如本文所用，术语“缺失”或“缺失的”是指消除、擦除或移除。

如本文所用，术语“E1区”是指存在于腺病毒基因组中的一组基因。这些基因(诸如但不限于E1A和E1B)在病毒复制的早期表达并激活其他病毒基因的表达。在一个实施方案中，本公开的腺病毒包装细胞系包括构成E1区的所有编码序列。

在一个实施方式中，本公开的腺病毒包装细胞系包括构成E1区(例如E1A或E1B)的一些编码序列。如本文所用，术语“E1A”是指腺病毒E1A区的所有基因产物，包括两种主要的RNA的表达产物：13S和12S。所述表达产物分别被翻译成289和243个氨基酸的多肽。这两种蛋白质有46个氨基酸不同，它们是从12S mRNA剪接的，如Chow等人.(1980)Cold SpringHarb Symp Quant Bioi.44Pt 1:40114和Chow等人.(1979)J.Mol.Biol.134(2):265 303中所描述，特定以引用的方式并入本文。出于本发明的目的，包装细胞系可以表达289多肽、243多肽或289和243多肽两者。术语E1A在本文中也用于参考部分和变异E1A编码序列。如本文所用，术语“E1 B”是指腺病毒E1 B区的所有基因产物，包括19kd和55kd的3种主要多肽。E1 8 19kd和55kd蛋白质在细胞转化中很重要。出于本发明的目的，包装细胞系可以表达19Kd多肽、55Kd多肽或19Kd和55Kd多肽两者。术语E1 B在本文中也用于参考部分和变异E1B编码序列。

如本文所用，术语“E2”是指具有至少3个ORF的顺反子，所述ORF都参与DNA复制，包括聚合酶。腺病毒的E2晚期启动子已由例如Swaminathan,S.和Thimmapaya,8.(1995)Gurr.Top.Microbial.Immunol.,199,177-194描述。在腺病毒系统中，E2晚期启动子与E2早期启动子一起具有控制腺病毒E2区和/或基因E2A和E2B的功能。在这种情况下，E2 mRNA的合成最初从E2早期启动子开始。细胞感染后大约五到七小时，会发生向E2晚期启动子的转换。

如本文所用，术语“E3区”是指存在于腺病毒基因组中并且在病毒复制周期的早期阶段表达的一组基因。这些基因表达与宿主免疫系统相互作用的蛋白质。这些基因不是病毒体外复制所必需的，因此可能在腺病毒载体中缺失。

如本文所用，术语“E4区”是指存在于靠近右侧ITR的腺病毒基因组中并且在病毒复制周期的早期阶段表达的一组基因。E4区包括至少7个ORF。E4区的产物促进病毒基因表达和复制，与宿主细胞组分相互作用，并参与裂解感染和瘤形成。

术语“表达”是指细胞中内源性基因、转基因或编码区的转录和/或翻译。如本文所用，术语“完全缺失的腺病毒”、“无肠”、“有肠”、“微型”、“完全缺失的”或“假”载体是指具有间隔大约26至37kb的反向末端重复序列(ITR)、病毒包装信号(ψ)和至少一个DNA插入(全部或至少一个目标基因(GOI)的片段)的线性双链DNA分子，所述目标基因包含编码目标蛋白质的序列。基因序列可以是可调节的。基因表达的调节可以通过以下中的一种实现：1)基因结构的改变：位点特异性重组酶(例如基于Cre-loxP系统的Cre)可以通过去除启动子与基因之间的插入序列来激活基因表达；2)转录变化：通过诱导(覆盖)或通过解除抑制；3)mRNA稳定性的变化，通过掺入mRNA的特定序列或通过siRNA；和4)通过mRNA中的序列的翻译变化。

完全缺失的腺病毒载体模块中不包含病毒编码基因。完全缺失的腺病毒载体模块也称为“高容量”腺病毒载体，因为它们可以容纳多达36千碱基的“外来”DNA。由于载体衣壳仅能有效包装整个腺病毒基因组大小的75-105％的DNA，并且由于治疗性表达盒的总和通常不超过36kb，因此需要使用“填充”DNA来完成基因组大小衣壳化。较早完全缺失的腺病毒载体被称为“辅助依赖型”腺病毒，因为它们需要携带必需腺病毒编码区的辅助腺病毒。

如本文所用，术语“基因表达构建体”是指启动子、目标基因的至少一个片段和多腺苷酸化信号序列。本公开的完全缺失的腺病毒载体模块包含基因表达构建体。“目标基因”或“GOI”可以是在RNA或蛋白质水平上发挥其作用的基因。目标基因的实例包括但不限于治疗基因、免疫调节基因、病毒基因、细菌基因、蛋白质生产基因、抑制性RNA或蛋白质、编码对真核细胞或调节蛋白有毒或有害的产物的基因。例如，由治疗基因编码的蛋白质可用于治疗遗传性疾病，例如使用编码囊性纤维化跨膜转导调节因子的eDNA治疗囊性纤维化。

此外，治疗基因可以在RNA水平上发挥其作用，例如，通过编码反义信息或核酶、本领域已知的siRNA、替代RNA剪接受体或供体、影响剪接或3'处理(例如多腺苷酸化)的蛋白质或影响细胞内另一个基因表达水平的蛋白质(即，基因表达被广泛认为包括从转录起始到产生处理蛋白质的所有步骤)，也许，除其他外，通过介导mRNA累积速率的改变、mRNA转运的改变和/或转录后调控的改变。

如本文所用，短语“基因疗法”是指将目标遗传物质(例如DNA或RNA)转移至宿主中以治疗或预防遗传或获得性疾病或病状。目标遗传物质编码需要在体内产生的产物(例如蛋白质多肽、肽或功能性RNA)。例如，目标遗传物质可以编码具有治疗价值的激素、受体、酶或(多)肽。目标遗传物质的实例包括DNA编码：囊性纤维化跨膜转导调节因子(cysticfibrosis transmembrane regulator，CFTR)、因子VIII、低密度脂蛋白受体、β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-葡糖脑苷脂酶、胰岛素、甲状旁腺激素和α-1-抗胰蛋白酶。另一种形式的“基因疗法”可能需要递送“有毒”基因以从有机体中去除不需要的细胞或细胞群，以治疗例如恶性生长。此类毒性基因的实例包括但不限于细菌L-甲硫氨酸酶、阻断关键细胞途径的单克隆抗体、前药转化酶、细菌毒素(肉毒杆菌毒素、破伤风毒素、志贺毒素(Shigatoxin)、白喉毒素、霍乱毒素、白喉毒素、炭疽毒素LF、李斯特菌溶血素(listeriolysin))和植物毒素(蓖麻毒素)。

“基因递送载体”意指包括在没有辅助腺病毒的情况下包装的本公开的衣壳化基于完全缺失的腺病毒的载体的组合物。

如本文所用，术语“辅助非依赖型”是指用于产生不需要辅助病毒的存在来进行其复制和衣壳化的本公开的基于衣壳化的完全缺失的腺病毒的载体模块的过程。

腺病毒包括最小修饰的“第一代”和“第二代”腺病毒载体。第一代腺病毒载体是指外源性DNA取代E1区，或任选地E3区，或任选地E1和E3区两者的腺病毒。第二代腺病毒载体是指除E1和E3区外，在E2区、E4区和腺病毒基因组的任何其他区或其组合中含有额外的缺失的第一代腺病毒载体。

如本文所用，术语“辅助病毒”是指在产生不具有自身复制能力的辅助依赖型病毒载体的拷贝时使用的病毒。辅助病毒用于与无肠病毒一起共感染细胞，并提供复制无肠病毒基因组所需的酶和组装无肠病毒衣壳所需的结构蛋白。

如本文所用，术语“抑制性表达盒”是指由启动子和多腺苷酸化位点组成的DNA构建体，在所述多腺苷酸化位点中插入并表达了具有抑制位于最小修饰的腺病毒载体或完全缺失的腺病毒载体模块上的目标基因表达的基因序列。这种“抑制性”基因可能与目标基因同源并且在取向上与目标基因反义。“抑制性”基因可编码以不同方式干扰目标基因RNA的产物，或可编码干扰由目标基因编码的蛋白质的产物。

如本文所用，术语“抑制性RNA片段”和“抑制性DNA片段”是指能够与目标基因的RNA结合并因此干扰目标基因表达的RNA和DNA多核苷酸。这些RNA和DNA片段可能与目标基因同源并且在取向上与目标基因反义。这些RNA和DNA片段可能与目标基因同源并且能够切割目标基因的RNA和/或DNA。

“免疫反应”优选意指获得性免疫反应，诸如细胞或体液免疫反应。在本说明书的上下文中，“免疫调节分子”是以一般或抗原特异性方式调节(即增加或减少)针对靶细胞的细胞和/或体液宿主免疫反应的多肽分子，并且优选地是降低宿主的免疫反应的分子。

如本文所用，术语“反向末端重复”是指位于腺病毒基因组左右末端的DNA序列。这些序列彼此相同，但方向相反。腺病毒的反向末端重复的长度从约50bp至约170bp不等，这取决于腺病毒的血清型。反向末端重复含有病毒生长所需的许多不同的顺式作用元件，诸如病毒DNA复制的核心起点和激活E1区的增强子元件。

“体内基因疗法”和“体外基因疗法”旨在涵盖本领域普通技术人员通常已知并称为“基因疗法”的所有过去、现在和未来的变体和修改，包括离体应用。

如本文所用，术语“线性DNA”是指非环化DNA分子。

如本文所用，术语“天然地”是指在自然界中发现的；野生型；天生的或遗传的。

术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非另外限制，否则涵盖具有天然核苷酸基本性质的已知类似物，因为它们以类似于天然存在的核苷酸(例如肽、核酸)的方式与单链核酸杂交。

核酸在放置成与另一种核酸序列呈功能性关系时是“可操作地连接的”。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，那么使所述启动子或增强子可操作地连接至编码序列。一般来说，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是邻接的。然而，增强子不必是连续的。连接是通过连接于适宜的限制位点处来达成。如果这些位点不存在，那么根据常规规范使用合成寡核苷酸衔接头或接头。

术语“包装表达质粒”和“包装构建体”或“pPac”是指环状双链DNA分子的工程化质粒构建体，其中在启动子的控制下，DNA分子包括腺病毒晚期基因的至少一个子集(例如，LI、L2、L3、L4、L5、E2A和E4)。pPac可能是缺失一个或两个反向末端重复(ITR)的腺病毒，并且不包括包装信号(‘T’)。pPac是“复制缺陷型的”——病毒基因组不单独包含足够的遗传信息以使独立复制能够在细胞内产生感染性病毒颗粒。任何亚型、亚型混合物或嵌合腺病毒均可用作DNA来源，用于产生完全缺失的腺病毒载体模块和pPac。pPac在本质上可以是圆状或线性的。

如本文所用，术语“包装信号”是指存在于病毒基因组中并且在病毒组装期间病毒基因组掺入病毒衣壳内所必需的核苷酸序列。

腺病毒的包装信号天然地位于左端，左反向末端重复序列的下游。所述包装信号可以表示为“ψ”。

术语“病原体”在广义上用于指引发免疫反应的任何分子的来源。因此，病原体包括但不限于毒性或减毒病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫、癌细胞等。通常，免疫反应是由这些病原体产生的一种或多种肽引发。如下文详细描述，编码来自这些和其他病原体的抗原肽的基因组DNA用于产生免疫反应，所述免疫反应消除对天然感染的反应。鉴于本文的教导，这些方法包括使用从超过一种病原体获得的基因组DNA也是显而易见的。

“允许的”细胞支持病毒的复制。

如本文所用，术语“质粒”是指与染色体DNA分开的染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA进行复制。在许多情况下，所述DNA分子是环状的并且是双链的。

术语“多接头”用于人工合成的DNA的短片段，其携带许多独特的限制性位点，允许容易插入任何启动子或DNA片段。术语“异源”用于通常在自然界中发现不密切相关的DNA序列的任何组合。

术语“启动子”旨在表示促进特定基因转录的DNA调节区。启动子通常包含TATA框，所述TATA框能够引导RNA聚合酶II以在特定编码序列的适当转录起始位点处引发RNA合成。启动子可另外包含通常位于TATA盒上游或5'处的其他识别序列(称为上游启动子元件)，其影响转录起始速率。“组成型启动子”是指允许其相关基因在许多细胞类型中连续转录的启动子。“诱导型启动子系统”是指使用调节剂(包括小分子(诸如四环素、肽和类固醇激素)、神经递质和环境因素(诸如热量和渗量))来诱导或沉默基因的系统。此类系统是“模拟的”，因为它们的响应是分级的，取决于调节剂的浓度。此外，此类系统在调节剂撤出时是可逆的。这些启动子的活性是由生物或非生物因子的存在或缺失来诱导。诱导型启动子是基因工程中的强大工具，因为与它们可操作地连接的基因的表达可以在有机体发育的某些阶段或在特定组织中被启动或停止。

如本文所用，术语“繁殖”或“繁殖的”是指通过任何过程复制、倍增或数量、量或程度增加。

如本文所用，术语“纯化”是指纯化或去除外来的、不相干或有害元件的过程。

如本文所用，术语“调控序列”(也称为“调控区”或“调控元件”)是指调控蛋白，诸如转录因子优先结合的启动子、增强子或其他DNA片段。它们控制基因表达并因此控制蛋白质表达。

如本文所用，术语“重组酶”是指催化基因重组的酶。重组酶催化两条长DNA链之间的短片段DNA的交换，特别是配对的母本染色体与父本染色体之间的同源区域的交换。

术语“限制酶”(或“限制性内切核酸酶”)是指切割双链DNA的酶。术语“限制位点”或“限制性识别位点”是指被限制酶识别为切割DNA分子的位点的特定核苷酸序列。所述位点通常但不一定是回文的(因为限制酶通常以同源二聚体形式结合)，并且特定酶可以在其识别位点内或附近某处的两个核苷酸之间切割。

如本文所用，术语“复制(replication/replicating)”是指制备对象的相同拷贝，例如但不限于病毒颗粒。如本文所用，术语“复制缺陷”是指病毒不能在自然环境中复制的特征。复制缺陷型病毒是缺失了一个或多个对其复制必不可少的基因的病毒，例如但不限于E1基因。复制缺陷型病毒可以在实验室中在表达缺失基因的细胞系中繁殖。

如本文所用，术语“填充物”是指插入另一个DNA序列中以增加其大小的DNA序列。例如，可以在腺病毒基因组内部插入填充片段，以将其大小增加到约36kb。填充片段通常不编码任何蛋白质，也不含有基因表达的调控元件，诸如转录增强子或启动子。

如本文所用，术语“靶标”或“靶向的”是指生物实体，例如但不限于蛋白质、细胞、器官或核酸，其活性可以通过外部刺激修饰。取决于刺激的性质，靶标可能没有直接变化，或可能会引起靶标的构象变化。

如本文所用，“靶细胞”可以作为单个实体存在，或可以是更大的细胞集合的一部分。此类“更大的细胞集合”可包含例如细胞培养物(混合的或纯的)、组织(例如上皮组织或其他组织)、器官(例如心脏、肺、肝脏、胆囊、膀胱、眼睛或其他器官)、器官系统(例如循环系统、呼吸系统、胃肠系统、泌尿系统、神经系统、表皮系统或其他器官系统)或有机体(例如鸟、哺乳动物，特别是人类等)。优选地，被靶向的器官/组织/细胞是循环系统(例如，包括但不限于心脏、血管和血液)、呼吸系统(例如鼻、咽、喉、气管、支气管、细支气管、肺等)、胃肠系统(例如，包括口、咽、食道、胃、肠、唾液腺、胰腺、肝脏、胆囊等)、泌尿系统(例如肾、输尿管、膀胱、尿道等)、神经系统(例如，包括但不限于脑和脊髓，以及诸如眼睛的特殊感觉器官)和表皮系统(例如皮肤)。甚至更优选地，细胞选自由以下组成的组：心脏、血管、肺、肝脏、胆囊、膀胱、眼细胞和干细胞。在一个实施方案中，靶细胞是肝细胞，并且提供了一种用于否决载体介导的同种异体肝细胞移植到受试者体内的方法。在一个实施方案中，靶细胞是角质形成细胞，并且提供了一种用于否决载体介导的同种异体角质形成细胞移植到受试者体内，例如工程化皮肤中的方法。在一个实施方案中，靶细胞是胰岛。在一个实施方案中，靶细胞是心肌细胞。在一个实施方案中，靶细胞是肾细胞，并且提供了一种用于否决载体介导的同种异体肾细胞移植到受试者体内的方法。在一个实施方案中，靶细胞是成纤维细胞，并且提供了一种用于否决载体介导的同种异体成纤维细胞移植到受试者体内，例如工程化皮肤中的方法。在一个实施方案中，靶细胞是神经元。

在一个实施方式中，靶细胞是神经胶质细胞。

如本文所用，术语“转染”是指将DNA作为DNA引入细胞中(例如引入分离的核酸分子或本公开的构建体)。本文所公开的腺病毒包装细胞系可以用本公开的完全缺失的腺病毒载体模块或pPac中的至少一种转染。本文所公开的腺病毒包装细胞系可以用最小修饰的腺病毒载体的DNA或病毒颗粒转染或转导。

如本文所用，术语“转导”是指将DNA作为DNA或借助于本公开的基因转移载体引入细胞中。可以将本公开的基因转移载体转导至靶细胞中。

术语“载体”是指用于感染宿主细胞并且可以插入多核苷酸的核酸。载体通常是复制子。表达载体允许插入其中的核酸转录。一些常见的载体包括但不限于质粒、粘粒、病毒、噬菌体、重组表达盒和转座子。术语“载体”也可以指有助于将基因从一个位置转移至另一个位置的元件。

如本文所用，术语“病毒DNA”是指在病毒颗粒中发现的DNA序列。如本文所用，术语“病毒基因组”是指在病毒颗粒中发现的DNA整体，并且其含有病毒复制所必需的所有元件。在病毒复制的每个循环中，基因组被复制并传递给病毒后代。

如本文所用，术语“病毒粒子”是指病毒颗粒。每个病毒粒子都由保护性蛋白质衣壳内的遗传物质组成。

如本文所用，术语“野生型”是指有机体、菌株、基因、蛋白质、核酸的典型形式，或如其在自然界中存在的特征。野生型是指自然种群中最常见的表型。

术语“野生型”和“天然存在的”可互换地使用。

完全缺失的腺病毒载体

如本文所用，完全缺失的腺病毒载体模块是指线性DNA序列或可以释放线性DNA序列的环状序列，所述载体模块仅含有病毒复制和将完全腺病毒载体模块衣壳化至腺病毒衣壳中所必须的顺式作用腺病毒序列(即ITRs，\II)。完全缺失的腺病毒载体仅携带病毒基因组复制和衣壳化所必需的顺式作用序列(即ITR，W)。用于包装完全缺失的腺病毒载体(完全缺失的腺病毒载体模块)的一些系统和方法需要它们与腺病毒“辅助”病毒共同感染，所述腺病毒“辅助”病毒可能是免疫原性腺病毒抗原的来源。已经提出了从治疗性腺病毒载体制剂中去除污染性腺病毒辅助病毒的方法。一个实例是用Cre重组酶的lox序列来侧接(flax)腺病毒辅助病毒中的包装位点ψ。理论上，完全缺失的腺病毒载体和“絮状”腺病毒辅助病毒的传代会通过从腺病毒辅助病毒中切除ψ(包装)序列来减少污染，从而防止腺病毒辅助病毒的包装。在实践中，这种方法无法将腺病毒辅助病毒污染降低到1/1000以下。

图1是展示完全缺失的腺病毒载体模块的设计的实施方案的图解表示。这个完全缺失的腺病毒载体模块含有顺式作用腺病毒序列(即ITRs，ψ)，这是病毒复制和将完全腺病毒载体模块衣壳化至腺病毒衣壳中所必需的，以及非腺病毒填充序列和多接头位点所必须的，可以将单个或多个目标基因的表达盒克隆至所述位点中。在填充序列中发现了额外限制位点，可以将单个或多个目标基因的额外表达盒克隆至所述额外限制位点中。

图2是展示具有和不具有表达盒的包装表达质粒的设计的实施方案的图解表示，所述表达盒能够抑制腺病毒载体模块上目标基因的表达。包装表达质粒由双链DNA的质粒组成，该质粒由启动子控制下的腺病毒晚期基因(例如LI、L2、L3、L4、L5、E2A和E4)的子集构成。所述表达质粒可以缺失反向末端重复序(ITR)的一个或两个腺病毒，并且不包括包装信号(ψ)。

图3是展示最小修饰的腺病毒载体的实施方案的图解表示，所述载体携带在启动子控制下的腺病毒晚期基因(例如LI、L2、L3、L4、L5、E2A和E4)的子集，以及两个腺病毒反向重复(ITR)和包装信号(ψ)。

图4是展示抑制性表达质粒的设计的实施方案的图解表示。抑制性表达质粒携带一个或多个能够抑制腺病毒载体模块上所发现的一种或多种目标基因的表达的表达盒。

图5是展示通过将完全缺失的腺病毒载体模块与包装表达质粒共转染来进行包装的方法的实施方案的图解表示。两种DNA构建体以一定的摩尔比混合并共转染至包装细胞中，其中完全缺失的腺病毒载体模块被复制和衣壳化。所述过程的遗传程序在包装表达质粒上编码。从包装细胞中收获衣壳化的完全缺失的腺病毒载体。

图6是展示通过将完全缺失的腺病毒载体模块与包装表达质粒和能够抑制腺病毒载体模块上目标基因的表达的表达质粒共转染来进行衣壳化的方法的实施方案的图解表示。DNA构建体以一定的摩尔比混合并共转染至包装细胞中，其中完全缺失的腺病毒载体模块被复制和衣壳化。所述过程的遗传程序在包装表达质粒上编码。一种或多种目标基因的表达被抑制性表达质粒上表达的基因抑制，诸如目标基因的反义构建体的反义。从包装细胞中收获衣壳化的完全缺失的腺病毒载体。

一种或多种目标基因的表达被RNA或DNA片段的存在抑制，诸如目标基因的反义构建体的反义。从包装细胞中收获衣壳化的完全缺失的腺病毒载体。

本领域技术人员将理解出于治疗目的，向人类受试者或动物施用本公开的基因转移载体的适合的方法，例如基因疗法、免疫抑制疗法、组织工程改造、疫苗接种等(参见例如Rosenfeld等人.,Science,252,431 434(1991)、Jaffe等人,Clin.Res.,39(2),302A(1991)、Rosenfeld等人,Clin.Res.,.39(2),311A(1991),Berkner,BioTechniques,6,616629(19SS))是可用的，并且尽管可以使用超过一种途径来施用基因转移载体，但可以提供一种比另一种施用更直接和更有效的反应的特定途径，即排泄率、药物组合、途径的严重性。药学上可接受的赋形剂也是本领域技术人员熟知的并且容易获得。赋形剂的选择将部分取决于接受疗法的宿主情况。

在本发明的上下文中，向动物，尤其是人施用的剂量将随治疗性目标转基因和/或分子的性质、所用组合物、施用方法和特定位点而变化并通过用于施用基因转移载体的特定方法而变化。因此，存在本发明的基因转移载体的广泛多种合适制剂。以下制剂和方法仅具有示例性并且决不具有限制性。然而，优选口服、注射剂和气雾剂制剂。适合于口服施用的制剂可以由a)液体溶液；(b)胶囊、小袋或片剂；(c)在适当液体中的悬浮液；和(d)合适的乳液组成。在一个实施方案中，单独的或与其他合适的组分组合的本发明的基因转移载体可制成通过吸入施用的气溶胶制剂。这些气溶胶制剂可被置于加压可接受的推进剂中，诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。本发明的基因转移载体也可被配制成药物用于非加压制备，诸如在喷雾器或雾化器中。适合于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性等张无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和致使制剂与预定接受者的血液等张的溶质；及水性和非水性无菌混悬液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。

制剂可以存在于单位剂量或多剂量密封容器中，诸如安瓿和小瓶中，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下存储，仅需要在临使用之前添加无菌液体赋形剂，例如水来注射。可以从前述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备临时注射溶液和悬浮液。在本发明的上下文中，向动物，尤其是人施用的剂量将随基因或其他目标序列、所用组合物、施用方法和特定位点以及待治疗的器官而变化。剂量应足以在所需的时间范围内产生所需的反应，例如治疗或免疫反应。因此，以下途径中的一种或多种可以施用本公开的基因转移载体：口服施用、注射(例如直接注射)、局部、吸入、肠胃外施用、粘膜施用、肌肉内施用、静脉内施用、皮下施用、眼内施用或透皮施用。在一个实施方案中，本公开的衣壳化的完全缺失的腺病毒载体是通过注射施用。在一个实施方案中，本公开的基因转移载体是局部施用的。在一个实施方案中，本公开的基因转移载体是通过吸入施用的。在一个实施方案中，本公开的基因转移载体是通过以下中的一种或多种施用的：肠胃外、粘膜、肌肉内、静脉内、皮下、眼内或透皮施用方式，并且是被配制用于此类施用。通常，医生会确定最适合个体受试者的基因转移载体的实际剂量，并且会随特定患者的年龄、体重和反应以及病状的严重程度而变化。对于任何具体患者的特定剂量水平和剂量频率可不同，并且将取决于多种因素，包括所采用的特定化合物的活性、所述化合物的代谢稳定性和作用时间长度、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用模式和时间、排泄率、药物组合、具体病状的严重程度，以及经历疗法的宿主。在本发明的上下文中，向动物，尤其是人施用的剂量将随治疗性目标转基因和/或免疫调节分子的性质、所用组合物、施用方法和特定位点以及所治疗的有机体而变化。然而，优选地，使用对应于GDV的有效量的剂量。“有效量”是足以在宿主中产生所需效果的量，可以使用本领域技术人员已知的若干个端点对其进行监测。例如，一种所需效果是将核酸转移至宿主细胞。诸如但不限于治疗效果(例如减轻与所治疗的疾病、病状、病症或综合征相关的一些症状)，或通过转移基因或编码序列或其在宿主内的表达的证据(例如使用聚合酶链式反应、Northern或杂交、或转录测定来检测宿主细胞中的核酸，或使用分析、抗体介导的检测或详细说明的测定来检测由转移的核酸编码的蛋白质或多肽，或在由于这种转移而产生的水平或功能)。

所描述的这些方法绝不是包罗万象的，并且适合特定应用的其他方法对于普通技术人员将是显而易见的。在这方面，应该注意的是，宿主对引入基因转移载体的反应可能会因施用的病毒剂量、递送位点和基因转移载体的基因组成以及转基因和抑制免疫反应的手段而变化。

通常，为了确保本发明的基因转移载体的有效转移，鉴于给定的施用途径，基于要接触的细胞的近似数量，优选地，根据本发明的基因转移载体的约1至约5000个拷贝用于每个要接触的细胞，并且甚至更优选约3至约300pfu进入每个细胞。然而，这只是一个一般性的指导方针，绝不排除使用更高或更低的量，这在特定应用中可能是必要的，无论是在体外还是在体内。类似地，如果以包含蛋白质的组合物的形式，抑制免疫反应的手段的量应足以抑制对包含转基因或目标基因的重组基因转移载体的免疫反应。例如，可依据所述组合物是否与其他药物组合物组合施用或依据个体间药代动力学、药物处置和代谢方面的差异改变实际剂量和方案。类似地，在体外应用中，量可能会有所不同，这取决于所靶向的特定细胞类型或基因转移载体的转移方式。本领域技术人员根据具体情况下的必要性可容易地作出任何必要的调整。

基因转移载体的递送可以在体外、离体完成，如在用于转染或转导细胞系的实验室程序中，或在体内或离体完成，如在某些疾病状态的治疗中。一旦基因转移载体已被递送至细胞中，编码所需寡核苷酸或多核苷酸序列的核酸就可被定位并在不同位点表达。在某些实施方案中，编码构建体的核酸可稳定地整合入细胞的基因组中。这种整合可以通过同源重组(基因替换)在特定位置和取向进行，或可以在重组中整合(基因替换)，或可以随机、非特定位置整合(基因增强)。在其他和优选的实施方案中，核酸可以作为单独的、游离的DNA片段稳定地维持在细胞中。此类核酸区段或“附加体”编码足以允许独立于宿主细胞周期或与宿主细胞周期同步地维持和复制的序列。免疫调节基因可以编码CD8多肽的全部或功能部分。

考虑了编码免疫调节分子的其他免疫调节基因，包括但不限于IL-10、TGF-β、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-4和GMCSF。

基因和蛋白质表达的基因疗法

基因疗法通常涉及将治疗基因引入细胞，也称为目标基因或转基因，其表达导致遗传病症的改善或治疗。所涉及的治疗基因可以是编码蛋白质、结构或酶促RNA、抑制性产物(诸如反义RNA或DNA)或任何其他基因产物的那些基因。表达是这种基因产物的产生或这种基因产物产生的作用。因此，增强的表达包括任何治疗基因的更多生产或增强产物在确定细胞、组织、器官或有机体状况中的作用。

通常，本发明涉及用于将所选的目标遗传物质(例如DNA或RNA)转移至体内细胞的GDV。本发明还涉及使用所公开的基因转移载体的基因疗法的方法和由所述方法产生的基因工程细胞。可以通过本发明治疗的疾病包括但不限于A型血友病(具有因子VIII)、帕金森病(Parkinson’s Disease)、充血性心力衰竭和囊性纤维化。

在一个实施方案中，携带目标基因的至少一个片段的本公开的基因转移载体可以在心内注射后在体内感染心肌。在一个实施方案中，可以通过气溶胶吸入将携带CFTR基因的至少一个片段的本公开的基因转移载体原位引入囊性纤维化患者的肺中。在一个实施方案中，可以将携带编码因子VIII的基因的至少一个片段的本公开的基因治疗载体原位引入患有A型血友病患者手臂的肌肉中。在一个实施方案中，可以将携带ADA基因的至少一个片段的本公开的基因转移载体离体转导至骨髓细胞的亚群中，并且然后可以将所转导的骨髓细胞移植到患有腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症的患者体内。由本公开的基因疗法载体编码的特定治疗基因是非限制性的，并且包括适用于各种治疗和研究目的的那些基因，以及适用于追踪转基因表达和腺病毒载体转导有效性的报道基因和报道基因系统以及构建体。因此，举例来说，以下是可能的基因类别，所述细胞表达可以通过使用本公开的GDV来增强：发育基因(例如粘附分子、细胞周期蛋白激酶抑制剂、Wnt家族成员、Pax家族成员、翼状螺旋家族成员、Hox家族成员、细胞因子/淋巴因子和其受体、生长或分化因子和其受体、神经递质和其受体)、癌基因(例如ABU、BLCI、BCL6、CBFAI、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETSI、ETSI、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、L YN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCU、MYCN、NRAS、PIMI、PML、RET、SRC、TAU、TCL3和YES)、肿瘤抑制基因(例如APC、BRCAI、BRCA2、MADH4、MCC、NFI、NF2、R131、TP53和WTI)、酶(例如ACP脱饱和酶和羟化酶、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、ATP酶、乙醇脱氢酶、淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、过氧化氢酶、纤维素酶、环氧合酶、脱羧酶、糊精酶、酯酶、DNA和RNA聚合酶、透明质酸合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、GTP酶、解旋酶、半纤维素酶、透明质酸酶、整合酶、转化酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂氧合酶、裂合酶、溶菌酶、果胶酯酶、过氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、多半乳糖醛酸酶、蛋白酶和肽酶、普鲁兰酶(pullanase)、重组酶、逆转录酶、拓扑异构酶、木聚糖酶、报道基因(例如绿荧光蛋白和其许多颜色变体、萤光素酶、CAT报道基因系统、β-半乳糖苷酶等))、血液衍生物、急速、淋巴因子(包括白介素)、干扰素、TNF、生长因子、神经递质或其前体或合成酶、营养因子(诸如BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NTS等)、脱脂载脂蛋白(诸如ApoAI、ApoAIV、ApoE等)、肌萎缩蛋白或小肌营养不良蛋白、肿瘤抑制基因(诸如p53、Rb、RapiA、DCC、k-rev等)、编码参与凝血因子(诸如因子VII、VI、IX等)的基因、自杀基因(诸如胸腺嘧啶核苷激酶)、胞嘧啶脱氨酶或全部或部分天然或人工免疫球蛋白(Fab、ScFv等)。治疗基因的其他实例包括fus、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、和腺病毒死亡蛋白(Adenoviraldeath protein，ADP)。治疗基因也可以是反义基因或序列，其在靶细胞中的表达能够控制细胞基因的表达或细胞mRNA的转录。例如，这种序列可以在靶细胞中转录成与细胞mRNA互补的RNA。治疗基因也可以是编码能够在人体中产生免疫反应的抗原肽的基因。在这个特定实施方案中，本公开使得生产能够使人类免疫的疫苗成为可能，特别是针对微生物、病毒和癌症。各种酶基因也被认为是治疗基因。用于表达的特别适合的基因包括被认为在受试哺乳动物的靶细胞中以低于正常水平表达的那些基因。特别有用的基因产物的实例包括但不限于氨甲酰基合成酶I、鸟氨酸氨甲酰基转移酶、精氨基琥珀酸合成酶、精氨基琥珀酸裂解酶和精氨酸酶。其他合乎需要的基因产物包括延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α-抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、低密度脂蛋白受体、胆色素原脱氨酶、因子VIII、因子IX、胱硫醚、β-合酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰基-CoA脱氢酶、丙酰基CoA羧化酶、甲基丙二酰基CoA变位酶、戊二酰基CoA脱氢酶、胰岛素、α-葡糖苷酶、丙酮酸羧化酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶(也称为asP-蛋白)、H-蛋白、T-蛋白、门克斯病(Menkesdisease)铜转运ATP酶和威尔逊氏症(Wilson’s disease)铜转运ATP酶。基因产物的其他实例包括但不限于胞嘧啶脱氨酶、半乳糖-1-磷酸次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、尿苷酰转移酶、苯丙氨酸羟化酶、葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、α-L-艾杜糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、HSV胸腺嘧啶核苷激酶和人类胸腺嘧啶核苷激酶。激素是可用于本文所描述的腺病毒衍生载体的另一组基因。包括生长激素、催乳素、胎盘催乳素、黄体生成素、促卵泡激素、绒毛膜促性腺激素、促甲状腺激素、瘦素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、血管紧张素I和II、内啡肽、促黑素细胞激素(melanocyte stimulating hormone，MSH)、胆囊收缩素、内皮素、甘丙肽、抑胃肽(gastric inhibitory peptide，GIP)、胰高血糖素、胰岛素、促脂解素、后叶激素运载蛋白、生长抑素、降钙素、降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)、降钙素基因相关肽、恶性肿瘤因子的高钙血症(1-40)、甲状旁腺激素相关蛋白(107-139)(ΡTH-_RΡ)、甲状旁腺激素相关蛋白(107-111)(PTH-_RP)、胰高血糖素样肽(GLP-1)、胰抑释素、胰腺肽、肽YY、PHM、促胰液素、舒血管肠肽(VASOACTIVE INTESTINAL PEPTIDE，VIP)、缩宫素、升压素(AVP)、精催产素、脑啡肽酰胺、甲八肽酰胺(METORPHINAMIDE)、_Α促黑素细胞激素(Α-MSH)、心房利钠因子(5-28)(ATRIAL NATRIURETIC FACTOR，ANF)、胰淀粉样P组分(SAP-1)、促肾上腺皮质激素释放激素(CORTICOTROPIN RELEASING HORMONE，CRH)、生长激素释放因子(GHRH)、促黄体素释放素(LHRH)、神经肽Y、物质K(神经激肽A)、物质P和促甲状腺素释放素(TRH)。预期插入本公开的GDV中的其他类别的基因包括但不限于白介素和细胞因子，包括白介素1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-S、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、GM-CSF和G-CSF。

本发明可治疗的疾病包括但不限于常见的遗传疾病，诸如苯丙酮尿症(苯丙氨酸-L-单加氧酶)、腺苷脱氨酶缺乏症、囊性纤维化(囊性纤维化转导调节因子)、帕金森病、鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症(OTC)、血友病(因子IX缺乏症、因子VIII缺乏症)、泰-萨克斯病(Tay-Sachs)(N-乙酰己糖胺酶A)、囊性纤维化，这将涉及更换囊性纤维化转导调节因子基因和其他脂质存储疾病。此外，可以使用编码促红细胞生成素(EPO)的基因。

另外，细菌、植物和真核毒素被设想为转基因。所述毒素是但不限于肉毒杆菌毒素、破伤风毒素、志贺毒素、白喉毒素、霍乱毒素、白喉毒素、炭疽毒素LF、李斯特菌溶血素和蓖麻毒素。

本公开的完全缺失的腺病毒载体不含腺病毒早期区和晚期基因。本公开的基因转移载体可用于通过转移编码血管生成抑制因子或细胞周期抑制因子的基因来治疗过度增殖性疾病，诸如类风湿性关节炎或再狭窄。前药激活因子，诸如HSVTK基因的转移也可用于治疗过度增殖性病症，包括癌症。在一个实施方案中，本公开的基因转移载体包括治疗基因序列和CD8基因序列，其中CD8基因序列能够阻止对治疗基因序列的免疫反应，如下所描述。此类应用包括但不限于因子VIII缺乏症(A型血友病)，其中患者不从缺陷基因(无效等位基因)产生任何蛋白质。在这些患者中，可能会针对治疗基因的产物产生免疫反应，就像通过注射因子VIII蛋白治疗的A型血友病患者中经常发生的免疫反应一样。腺病毒载体已用于生产可用于治疗疾病的重组蛋白。然而，治疗性重组蛋白被腺病毒蛋白和/或腺病毒污染是一个持续的挑战。因此，需要支持腺病毒来源的生长的系统，以减少腺病毒基因的补充和/或不受复制能力或辅助腺病毒的污染。多聚体蛋白的多肽的协同表达可以通过来自腺病毒载体的共表达来协调。例如，等摩尔量的免疫球蛋白重链和轻链的表达通过来自腺病毒载体的协同表达来促进。根据本文所说明的方面，在一个实施方案中，蛋白质表达方案包括施用本公开的基因转移载体。

疫苗开发

在一个实施方案中，本发明涉及生物技术以及疫苗的开发和制造。本发明特别适用于生产疫苗以帮助保护脊椎动物，特别是哺乳动物，尤其人类免受病毒和细菌病原体的侵害。

本发明的疫苗可以是防治性的(例如预防或减轻任何天然或“野生”病原体未来感染的影响)，或治疗性的(例如抗癌疫苗)。疫苗接种是应对病毒感染的最重要途径。尽管有许多抗病毒剂可供使用，但通常这些药剂的功效有限。一旦个体被感染被动免疫，施用针对病毒的抗体可能是处理病毒感染的好方法，并且通常人类或人源化抗体似乎确实有希望处理许多病毒感染。但最有效并且最安全的处理病毒感染的方法是并且可能将是通过主动免疫进行防治。主动免疫通常称为疫苗接种和疫苗，所述疫苗包含至少一种病毒的抗原决定簇，优选至少一种病毒的多种不同的抗原决定簇，例如通过在疫苗中掺入至少一种来源于病毒(亚单位疫苗)的病毒多肽或蛋白质。通常，迄今为止提到的形式包括佐剂以增强免疫反应。这对于基于完整病毒的疫苗也是可能的，例如灭活形式的疫苗。另一种可能性是使用活的但减毒形式的病原病毒。另一种可能性是使用野生型病毒，例如在成人个体没有感染危险的情况下，但婴儿受到并且可能通过母体抗体等得到保护。疫苗的生产并不总是一个简单的过程。在一些情况下，病毒材料的生产是在鸡蛋上进行的，这导致难以纯化材料和采取广泛的安全措施防止污染等。此外，有时但并非总是可以替代鸡蛋的细菌和/或酵母菌的生产也需要许多纯化和安全步骤。在哺乳动物细胞上生产是一种替代方法，但迄今为止所用的哺乳动物细胞都需要，例如存在血清和/或粘附至固体支持物上才能生长。在第一种情况下，纯化和安全性以及例如需要蛋白酶来支持一些病毒的复制成为一个问题。在第二种情况下，高产量和易于生产成为另一个问题。许多具有重大公共卫生重要性的病毒性疾病的疫苗仍然缺乏。灭活病毒疫苗的生产可能既危险又昂贵，而且通常不具有免疫原性。在腺病毒载体中包含病毒蛋白编码序列可能会规避这些问题，但是，产生这样的腺病毒载体存在挑战。例如，腺病毒载体的空间很小，并且对腺病毒载体的免疫反应会干扰对疫苗蛋白的免疫反应。

因此，本发明的一个目的是提供基因转移载体，其能够在宿主体内大量并且数量不断增加的不同细胞中长期维持，从而能够提供一种或多种所需抗原的稳定表达。本发明的另一个目的是提供基因转移载体，其在最初接受所述载体的细胞中维持很长一段时间，并在有丝分裂细胞分裂后将其转移至子细胞中。本发明的又一个目的是提供基因转移载体，其除了表达一种或多种目标基因之外，优选仅表达在接受者细胞中长期维持所必需的基因，因此不含对接受者有毒或引起疾病症状的组分。本发明的另一个目的是提供基因转移载体，其模拟减毒活病毒疫苗，尤其其在体内倍增的功能方面，而不引起任何明显的疾病迹象并且不表达可能在注射了DNA疫苗的宿主中引起不良反应的非所需蛋白质。本发明的疫苗包含本发明的基因转移载体或所述载体在合适的药物载剂中的混合物。使用疫苗配制的标准方法配制本发明的疫苗以生产通过任何常规施用途径施用的疫苗，即肌肉内、皮内等。在具体实施方案中，本发明的基因转移载体用于治疗和/或预防感染(被动免疫)，并且通常人类或人源化抗体似乎确实有望用于处理多种病毒感染。但处理病毒感染最有效和最安全的方法是并且可能会是通过主动免疫进行防治。主动免疫通常称为疫苗接种和疫苗，所述疫苗包含至少一种病毒的抗原决定簇，优选至少一种病毒的多种不同的抗原决定簇，例如通过在疫苗中掺入至少一种来源于病毒(亚单位疫苗)的病毒多肽或蛋白质。通常，迄今为止提到的形式包括佐剂以增强免疫反应。这对于基于完整病毒的疫苗也是可能的，例如灭活形式的疫苗。另一种可能性是使用活的但减毒形式的病原病毒。另一种可能性是使用野生型病毒，例如在成人个体没有感染危险的情况下，但婴儿受到并且可能通过母体抗体等得到保护。疫苗的生产并不总是一个简单的过程。在一些情况下，病毒材料的生产是在鸡蛋上进行的，这导致难以纯化材料和采取广泛的安全措施防止污染等。此外，有时但并非总是可以替代鸡蛋的细菌和/或酵母菌的生产也需要许多纯化和安全步骤。在哺乳动物细胞上生产是一种替代方法，但迄今为止所用的哺乳动物细胞都需要，例如存在血清和/或粘附至固体支持物上才能生长。在第一种情况下，纯化和安全性以及例如需要蛋白酶来支持一些病毒的复制成为一个问题。在第二种情况下，高产量和易于生产成为另一个问题。许多具有重大公共卫生重要性的病毒性疾病的疫苗仍然缺乏。灭活病毒疫苗的生产可能既危险又昂贵，而且通常不具有免疫原性。在腺病毒载体中包含病毒蛋白编码序列可能会规避这些问题，但是，产生这样的腺病毒载体存在挑战。例如，腺病毒载体的空间很小，并且对腺病毒载体的免疫反应会干扰对疫苗蛋白的免疫反应。因此，本发明的一个目的是提供基因转移载体，其能够在宿主体内大量并且数量不断增加的不同细胞中长期维持，从而能够提供一种或多种所需抗原的稳定表达。本发明的另一个目的是提供基因转移载体，其在最初接受所述载体的细胞中维持很长一段时间，并在有丝分裂细胞分裂后将其转移至子细胞中。本发明的又一个目的是提供基因转移载体，其除了表达一种或多种目标基因之外，优选仅表达在接受者细胞中长期维持所必需的基因，因此不含对接受者有毒或引起疾病症状的组分。本发明的另一个目的是提供基因转移载体，其模拟减毒活病毒疫苗，尤其其在体内倍增的功能方面，而不引起任何明显的疾病迹象并且不表达可能在注射了DNA疫苗的宿主中引起不良反应的非所需蛋白质。本发明的疫苗包含本发明的基因转移载体或所述载体在合适的药物载剂中的混合物。使用疫苗配制的标准方法配制本发明的疫苗以生产通过任何常规施用途径施用的疫苗，即肌肉内、皮内等。在具体实施方案中，本发明的基因转移载体用于治疗和/或预防传染病。

本公开的基因转移载体可用于疫苗开发以通过诱导免疫来保护个体免受疾病侵害。将本公开的GDV用于疫苗开发的一个优点是接受者的免疫反应不会被Ad基因影响。在一个实施方案中，本公开的基因转移载体编码来自对人类健康或农业重要的病毒的一种或多种蛋白质和/或RNA(抗原)。在一个实施方案中，疫苗用于通过诱导免疫来保护个体免于疾病。在一个实施方案中，多价疫苗可能包括来自相同或不同病原体的多个目标基因。在某些实施方案中，基因转移载体还包含目标DNA序列的一个或多个表达盒。在某些实施方案中，目标DNA序列是传染性病原体的序列。在某些实施方案中，传染性病原体是病毒。

在某些具体实施方案中，病毒选自由以下组成的组：人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(Herpex Simplex Virus，HSV)、丙型肝炎病毒、流感病毒、轮状病毒、乳头瘤病毒、慢病毒、肠病毒或其组合。在某些实施方案中，目标DNA序列是细菌的DNA序列。在某些实施方案中，细菌选自由以下组成的组：沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和支原体肺炎(Mycoplasma pneumonia)。在某些实施方案中，目标DNA序列是真菌病原体的DNA序列。在某些实施方案中，目标DNA序列具有HIV来源。

在一个实施方案中，疫苗用于保护个体免受流感病毒的侵害。在一个实施方案中，流感病毒是猪流感。在一个实施方案中，流感病毒是禽流感。在一个实施方案中，本公开的基因转移载体的一种或多种蛋白质和/或RNA选自血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核衣壳(NP)、M1(基质蛋白)、M2(离子通道)、NS 1、NS2 40(NEP)、脂质双层、PBI、PB2或PA。下文列出了本公开的疫苗的代表性病毒和细菌候选物。这些疫苗的基因在括号中说明：

病毒——正粘病毒

甲型流感——血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、Mu M2、NSI、NS2(NEP)、PA、PB、PB1-F2和PB2

乙型流感

丙型流感

病毒——疱疹病毒

单纯疱疹1(口腔疱疹)、单纯疱疹2(生殖器疱疹)——多肽；病毒糖蛋白(指定为gB、gC、gD、gE、gG、gH、gi、gJ、gK、gL和gM)是已知的，并且另一种预测是(gN)；糖蛋白带0。

EB病毒(Epstein-Barr)(单核细胞增多症、伯基特淋巴瘤、鼻咽癌)——EB病毒核抗原[EBNA]1、2、3A、38、3C、LP和LMP；gp3501220aka gp340巨细胞病毒——糖蛋白B、1EI、pp89、gB和pp 65是疫苗中诱导中和抗体和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应的最低要求。用额外的蛋白质免疫，例如用于中和抗体的gH、gN和用于CTL反应的El、外显子4和pp 150将加强保护性免疫反应。

水痘带状疱疹病毒(水痘和带状疱疹)——来自gE、gI和gB基因的重组蛋白

卡波西肉瘤相关疱疹病毒8(卡波西肉瘤)

疱疹6(A和8)

疱疹7

疱疹8——糖蛋白B(gB)；

病毒——乳头状瘤病毒：

对于所有HPV L1衣壳蛋白、EI、E2、E6和E7基因

HPV(宫颈癌高危16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59，可能高危的：26、53、66、68、73、82)

HPV(寻常疣：2、7)

HPV(跖疣：1、2、4、63)

HPV(扁平疣：3、10)

HPV(生殖肛门疣：6、11、42、43、44、55)

病毒——呼肠孤病毒科(Reoviridae)

轮状病毒A(胃肠炎)——VP2和VP6蛋白

病毒——冠状病毒

严重急性呼吸综合征冠状病毒(严重急性呼吸综合征)——SARS-CoV和MERS-CoV是有包膜的正链RNA病毒，具有-30kb基因组编码复制酶(Rep)和结构蛋白突起(S)、包膜(E)、膜(M)和核衣壳(N)突起或核衣壳蛋白，分别是S和N基因——人类冠状病毒229E突起和包膜基因

人类冠状病毒NL63

病毒——星状病毒(胃肠炎)——星状病毒87-kDa结构多蛋白

病毒-诺如病毒(胃肠炎)——病毒衣壳基因、VPI和VP2

病毒——黄病毒科

登革热——前膜(prM)和包膜(E)基因

日本脑炎(Japanese encephalitis)——prM、E和NSI基因；JE病毒的prM和包膜(E)编码区。

凯萨努森林病(Kyasanur Forest disease)

墨累山谷脑炎(Murray Valley encephalitis)

圣路易斯脑炎(St.Louis encephalitis)

蜱媒脑炎(Tick-borne encephalitis)

西尼罗脑炎(West Nile encephalitis)

丙型肝炎——丙型肝炎病毒糖蛋白E2；丙型肝炎的糖蛋白E1和E2；HCV的核心基因

病毒——微小核糖核酸病毒科——肠道病毒

人类肠道病毒A(21种，包括一些柯萨奇A病毒)

人类肠道病毒B(57种，包括肠道病毒、柯萨奇B病毒)

人类肠道病毒C(14种，包括一些柯萨奇A病毒)

人类肠道病毒0(三种类型：EV-68、EV-70、EV-94)——VPI基因；

病毒——微小核糖核酸病毒科——鼻病毒

人类鼻病毒A(74种血清型)

人类鼻病毒B(25种血清型)

人类鼻病毒C(7种血清型)——鼻病毒衍生的VPI；与呼吸道细胞感染密切相关的表面蛋白

病毒——微小核糖核酸病毒科——肝病毒

甲型肝炎

病毒——披膜病毒科——甲病毒属

辛德比斯病毒(Sindbis virus)

东方马脑炎病毒(Eastern equine encephalitis virus)

西方马脑炎病毒(Western equine encephalitis virus)

委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)

罗斯河病毒(Ross River virus)

阿良良病毒(O'nyong'nyong virus)

病毒——披膜病毒科——风疹病毒

风疹病毒

病毒——披膜病毒科——肝炎病毒

戊型肝炎病毒——ORF2蛋白；重组HEY衣壳蛋白；疫苗肽从HEY衣壳蛋白的另一个肽E2的N端延伸出26个氨基酸

病毒——披膜病毒科——博马病毒科

巴纳病病毒——BDV核蛋白(BDV-N)

病毒——披膜病毒科——丝状病毒科

埃博拉病毒

马尔堡病毒

病毒——披膜病毒科——副粘病毒

麻疹

仙台病毒(Sendai virus)

人类副流感病毒1和3

腮腺炎病毒

人类副流感病毒2和4

人类呼吸道合胞病毒

新城疫病毒(Newcastle disease virus)

病毒——披膜病毒科——逆转录病毒

HIV-gag；p18、p24、p55、pol:p31、p51、p66；env:p41、p120、p160

乙肝病毒

HTLVI，II

病毒——披膜病毒科——弹状病毒

狂犬病

病毒——披膜病毒科——沙粒病毒

蛙病毒

朝鲜出血热(Korean hemorrhagic fever)

淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒

Junin

Machupo

Lass a

Sabia

Guanarito

加利福尼亚脑炎(California encephalitis)

刚果-克里米亚出血热

裂谷热

病毒——细小病毒

人类细小病毒(B 19)

细菌

巴尔通体(Bartonella)

布鲁氏菌(Brucella)包括流产布鲁氏菌(B.abortus)、犬布鲁氏菌(B.canis)、猪布鲁氏菌(B.suis)

鼻疽伯克霍尔德菌(假单胞菌)，假鼻疽伯克霍尔德菌

贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)

土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)

牛分枝杆菌(BCG菌株除外，参见附录B-L1-A，风险组2(RG2)——包括衣原体在内的细菌剂)，结核分枝杆菌

B型多杀巴斯德菌——“水牛”和其他毒株

小蛛立克次体(Rickettsia akari)、澳大利亚立克次体(R.australis)、加拿大立克次体(R.Canada)、康氏立克次体(R.conorii)、普氏立克次体(R.prowazekii)、立氏立克次体(R.rickettsii)、西伯利亚立克次体(R.siberica)、恙虫病立克次体(R.tsutsugamushi)、地方性斑疹伤寒立克次体(R.typhi)(莫氏立克次体(Rickettsiamooseri))

鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)

在个体中调节免疫反应的方法包括向个体施用本公开的基因转移载体，其中所述基因转移载体编码至少一种治疗基因(目标基因，“GOI”)。

载体

除了基于腺病毒的基因转移载体之外，还设想了其他载体系统，其组装受到载体内转基因编码的蛋白质的生产的阻碍。此类基因转移载体属于病毒载体组，诸如但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒载体、基于SV40的载体、牛痘病毒载体和EB病毒载体。

本发明在以下实例中进行了描述，这些实例旨在帮助理解本发明，并且不应解释为以任何方式限制其后的内容。提出以下实例以便向本领域普通技术人员提供如何制备和使用所描述的本发明的完整公开内容和描述，并且这些实例不旨在限制本发明人视为的发明范围，也不旨在表示下文的实验是所执行的全部或唯一实验。已经努力确保所用数字(例如量、温度等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另外指出，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度并且压力是大气压或接近大气压。

当然，所述实例应理解为仅是对本发明的某些实施方案的说明，而不是对本发明范围的限制，本发明的范围是由附在本说明书末尾的权利要求限定。

已经详细描述了本公开，显而易见的，在不脱离权利要求的范围的情况下，修改和变化是可能的。

实例

提供以下非限制性实例以进一步说明本公开。

实例1

将诸如人类胚胎肾细胞的宿主细胞接种到真核组织培养基中的组织培养瓶中。将所述宿主细胞在CO₂(5％)和大气氧张力下培养三天。将以下DNA构建体的混合物以一定比例与诸如但不限于磷酸钙的转染子一起添加：a)线性完全缺失的腺病毒载体模块，其在由CMV启动子驱动的表达盒中携带埃博拉糖蛋白基因；b)包装表达质粒；c)抑制性表达质粒，其携带由CMV启动子驱动的埃博拉糖蛋白的反义构建体。培养三天后，收获宿主细胞并通过冻融裂解以释放衣壳化的完全缺失的腺病毒载体。

当介绍本公开或其一个或多个优选实施方案的要素时，冠词“一个/种(a/an)”、“所述(the)”和“所述(said)”旨在表示存在一个或多个要素。术语“包含”、“包括”和“具有”意图是包括性的，并且意指除了所列要素之外，可能存在其他要素。

鉴于以上，将明白的是：实现了本公开的若干目标，并且获得其他有利结果。

因为在不背离本公开的范围的情况下，可在上述产物和方法中做出各种改变，所以以上说明书中含有的所有内容均应理解为是说明性的并且不具有限制意义。

Claims (74)

1.一种用于繁殖基于完全缺失的腺病毒的基因转移载体的方法，其包括：(a)提供腺病毒包装细胞系；(b)将完全缺失的腺病毒载体模块转染至所述细胞系中，所述腺病毒载体模块的构建体包括腺病毒反向末端重复、包装信号和至少一个或多个DNA插入，所述插入包含编码一种或多种目标蛋白质的一个或多个基因序列，但不包含腺病毒结构基因；(c)将具有包含L1、L2、L3、L4、L5、E2A和E4的腺病毒晚期基因子集和包装信号的复制缺陷型环状包装表达质粒转染至所述细胞系中，其中完全缺失的腺病毒载体构建体和包装构建体可以转染所述腺病毒包装细胞系，导致基于完全缺失的腺病毒的基因转移载体独立于辅助腺病毒载体的衣壳化；和(d)将抑制性表达载体转染至所述细胞系中，所述表达载体携带编码所述基因序列的一个或多个反义构建体的一个或多个表达盒，所述基因序列编码所述完全缺失的腺病毒载体模块上的一种或多种目标蛋白质。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述完全缺失的腺病毒载体模块在不具有腺病毒辅助病毒帮助的情况下被包装至腺病毒衣壳中。

3.如权利要求1所述的方法，其中将携带对宿主细胞有害或有毒功能的一种或多种目标基因的所述完全缺失的腺病毒载体模块包装至腺病毒衣壳中。

4.一种用于繁殖基于完全缺失的腺病毒的基因转移载体的方法，其包括：(a)提供腺病毒包装细胞系、(b)将完全缺失的腺病毒载体模块转染至所述细胞系中，所述腺病毒载体模块的构建体包括腺病毒反向末端重复、包装信号和至少一个或多个DNA插入，所述插入包含编码一种或多种目标蛋白质的一个或多个基因序列，但不包含腺病毒结构基因、(c)将具有包含L1、L2、L3、L4、L5、E2A和E4的腺病毒晚期基因子集和包装信号的复制缺陷型环状包装表达质粒转染至所述细胞系中，其中完全缺失的腺病毒载体构建体和包装构建体可以转染所述腺病毒包装细胞系，导致基于完全缺失的腺病毒的基因转移载体独立于辅助腺病毒载体的衣壳化、和(d)将所述完全缺失的腺病毒载体模块上的一种或多种目标基因的反义RNA片段转染至所述细胞系中。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述完全缺失的腺病毒载体模块在不具有腺病毒辅助病毒帮助的情况下被包装至腺病毒衣壳中。

6.如权利要求4所述的方法，其中将携带对宿主细胞有害或有毒功能的一种或多种目标基因的所述完全缺失的腺病毒载体模块包装至腺病毒衣壳中。

7.一种用于繁殖基于完全缺失的腺病毒的基因转移载体的方法，其包括：(a)提供腺病毒包装细胞系；(b)将完全缺失的腺病毒载体模块转染至所述细胞系中，所述腺病毒载体模块的构建体包括腺病毒反向末端重复、包装信号和至少一个或多个DNA插入，所述插入包含编码一种或多种目标蛋白质的一个或多个基因序列，但不包含腺病毒结构基因；(c)将具有包含L1、L2、L3、L4、L5、E2A和E4的腺病毒晚期基因子集和包装信号的复制缺陷型环状包装表达质粒转染至所述细胞系中，其中完全缺失的腺病毒载体构建体和包装构建体可以转染所述腺病毒包装细胞系，导致基于完全缺失的腺病毒的基因转移载体独立于辅助腺病毒载体的衣壳化；和(d)将所述完全缺失的腺病毒载体模块上的一种或多种目标基因的反义DNA片段转染至所述细胞系中。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述完全缺失的腺病毒载体模块在不具有腺病毒辅助病毒帮助的情况下被包装至腺病毒衣壳中。

9.如权利要求7所述的方法，其中将携带对宿主细胞有害或有毒功能的一种或多种目标基因的所述完全缺失的腺病毒载体模块包装至腺病毒衣壳中。

10.一种用于繁殖基于完全缺失的腺病毒的基因转移载体的方法，其包括：(a)提供腺病毒包装细胞系；(b)将衣壳化的完全缺失的腺病毒载体转导至所述细胞系中，所述腺病毒载体的构建体包括腺病毒反向末端重复、包装信号和至少一个或多个DNA插入，所述插入包含编码一种或多种目标蛋白质的一个或多个基因序列，但不包含腺病毒结构基因；(c)将具有包含L1、L2、L3、L4、L5、E2A和E4的腺病毒晚期基因子集和包装信号的复制缺陷型环状包装表达质粒转染至所述细胞系中，其中完全缺失的腺病毒载体构建体和包装构建体可以转染所述腺病毒包装细胞系，导致基于完全缺失的腺病毒的基因转移载体独立于辅助腺病毒载体的衣壳化；和(d)将抑制性表达载体转染至所述细胞系中，所述表达载体携带编码所述基因序列的反义构建体的一个或多个表达盒，所述基因序列编码一种或多种目标蛋白质。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述完全缺失的腺病毒载体模块在不具有腺病毒辅助病毒帮助的情况下被包装至腺病毒衣壳中。

12.如权利要求10所述的方法，其中将携带对宿主细胞有害或有毒功能的一种或多种目标基因的所述完全缺失的腺病毒载体模块包装至腺病毒衣壳中。

13.一种用于繁殖基于完全缺失的腺病毒的基因转移载体的方法，其包括：(a)提供腺病毒包装细胞系；(b)将衣壳化的完全缺失的腺病毒载体转导至所述细胞系中，所述腺病毒载体的构建体包括腺病毒反向末端重复、包装信号和至少一个或多个DNA插入，所述插入包含编码一种或多种目标蛋白质的一个或多个基因序列，但不包含腺病毒结构基因；(c)将具有包含L1、L2、L3、L4、L5、E2A和E4的腺病毒晚期基因子集和包装信号的复制缺陷型环状包装表达质粒转染至所述细胞系中，其中完全缺失的腺病毒载体构建体和包装构建体可以转染所述腺病毒包装细胞系，导致基于完全缺失的腺病毒的基因转移载体独立于辅助腺病毒载体的衣壳化；和(d)将所述完全缺失的腺病毒载体模块上的一种或多种目标基因的反义片段转染至所述细胞系中。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述完全缺失的腺病毒载体模块在不具有腺病毒辅助病毒帮助的情况下被包装至腺病毒衣壳中。

15.如权利要求13所述的方法，其中将携带对宿主细胞有害或有毒功能的一种或多种目标基因的所述完全缺失的腺病毒载体模块包装至腺病毒衣壳中。

16.一种用于繁殖基于完全缺失的腺病毒的基因转移载体的方法，其包括：(a)提供腺病毒包装细胞系；(b)将衣壳化的完全缺失的腺病毒载体模块转导至所述细胞系中，所述腺病毒载体模块的构建体包括腺病毒反向末端重复、包装信号和至少一个或多个DNA插入，所述插入包含编码一种或多种目标蛋白质的一个或多个基因序列，但不包含腺病毒结构基因；(c)将具有包含L1、L2、L3、L4、L5、E2A和E4的腺病毒晚期基因子集和包装信号的复制缺陷型环状包装表达质粒转染至所述细胞系中，其中完全缺失的腺病毒载体构建体和包装构建体可以转染所述腺病毒包装细胞系，导致基于完全缺失的腺病毒的基因转移载体独立于辅助腺病毒载体的衣壳化；和(d)将所述完全缺失的腺病毒载体模块上的一种或多种目标基因的反义DNA片段转染至所述细胞系中。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述完全缺失的腺病毒载体模块在不具有腺病毒辅助病毒帮助的情况下被包装至腺病毒衣壳中。

18.如权利要求16所述的方法，其中将携带对宿主细胞有害或有毒功能的一种或多种目标基因的所述完全缺失的腺病毒载体模块包装至腺病毒衣壳中。

19.一种用于繁殖最小修饰的腺病毒基因转移载体的方法，其包括：(a)提供腺病毒包装细胞系；(b)将编码最小修饰的腺病毒载体的构建体转染至所述细胞系中，所述载体携带两个ITR、包装信号和腺病毒晚期基因的子集，诸如包含L1、L2、L3、L4、L5、E2A和E4，并携带一个或多个表达盒，所述表达盒携带一种或多种目标基因；和(c)将抑制性表达载体转染至所述细胞系中，所述表达载体携带编码基因序列的反义构建体的一个或多个表达盒，所述基因序列编码所述最小修饰的腺病毒载体上的一种或多种目标蛋白质。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述最小修饰的腺病毒载体在不具有腺病毒辅助病毒帮助的情况下被包装至腺病毒衣壳中。

21.如权利要求19所述的方法，其中将携带对宿主细胞有害或有毒功能的一种或多种目标基因的所述最小修饰的腺病毒载体包装至腺病毒衣壳中。

22.一种用于繁殖最小修饰的腺病毒转移载体的方法，其包括：(a)提供腺病毒包装细胞系；(b)将编码最小修饰的腺病毒载体的构建体转染至所述细胞系中，所述载体携带两个ITR、包装信号和腺病毒晚期基因的子集，诸如包含L1、L2、L3、L4、L5、E2A和E4，并携带一个或多个表达盒，所述表达盒携带一种或多种目标基因；和(c)将所述最小修饰的腺病毒载体上的一种或多种目标基因的反义RNA片段转染至所述细胞系中。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述最小修饰的腺病毒载体在不具有腺病毒辅助病毒帮助的情况下被包装至腺病毒衣壳中。

24.如权利要求22所述的方法，其中将携带对宿主细胞有害或有毒功能的一种或多种目标基因的所述最小修饰的腺病毒载体包装至腺病毒衣壳中。

25.一种用于繁殖最小修饰的腺病毒基因转移载体的方法，其包括：(a)提供腺病毒包装细胞系；(b)将编码最小修饰的腺病毒载体的构建体转染至所述细胞系中，所述载体携带两个ITR、包装信号和腺病毒晚期基因的子集，诸如包含L1、L2、L3、L4、L5、E2A和E4，并携带一个或多个表达盒，所述表达盒携带一种或多种目标基因；和(c)将所述最小修饰的腺病毒载体上的一种或多种目标基因的反义DNA片段转染至所述细胞系中。

26.如权利要求15所述的方法，其中所述最小修饰的腺病毒载体在不具有腺病毒辅助病毒帮助的情况下被包装至腺病毒衣壳中。

27.如权利要求15所述的方法，其中将携带对宿主细胞有害或有毒功能的一种或多种目标基因的所述最小修饰的腺病毒载体包装至腺病毒衣壳中。

28.一种用于繁殖最小修饰的腺病毒基因转移载体的方法，其包括：(a)提供腺病毒包装细胞系；(b)将最小修饰的腺病毒载体转导至所述细胞系中，所述载体携带两个ITR、包装信号和腺病毒晚期基因的子集，诸如包含L1、L2、L3、L4、L5、E2A和E4，并携带一个或多个表达盒，所述表达盒携带一种或多种目标基因；和(c)将抑制性表达载体转染至所述细胞系中，所述表达载体携带编码基因序列的反义构建体的一个或多个表达盒，所述基因序列编码所述最小修饰的腺病毒载体上的一种或多种目标蛋白质。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述最小修饰的腺病毒载体在不具有腺病毒辅助病毒帮助的情况下被包装至腺病毒衣壳中。

30.如权利要求28所述的方法，其中将携带对宿主细胞有害或有毒功能的一种或多种目标基因的所述最小修饰的腺病毒载体包装至腺病毒衣壳中。

31.一种用于繁殖基于最小修饰的腺病毒的基因转移载体的方法，其包括：(a)提供腺病毒包装细胞系；(b)将最小修饰的腺病毒载体转导至所述细胞系中，所述载体携带两个ITR、包装信号和腺病毒晚期基因的子集，诸如包含L1、L2、L3、L4、L5、E2A和E4，并携带一个或多个表达盒，所述表达盒携带一种或多种目标基因；和(c)将所述最小修饰的腺病毒载体上的一种或多种目标基因的反义RNA片段转染至所述细胞系中。

32.如权利要求28所述的方法，其中所述最小修饰的腺病毒载体在不具有腺病毒辅助病毒帮助的情况下被包装至腺病毒衣壳中。

33.如权利要求28所述的方法，其中将携带对宿主细胞有害或有毒功能的一种或多种目标基因的所述最小修饰的腺病毒载体包装至腺病毒衣壳中。

34.一种用于繁殖基于最小修饰的腺病毒的基因转移载体的方法，其包括：(a)提供腺病毒包装细胞系；(b)将最小修饰的腺病毒载体转导至所述细胞系中，所述载体携带两个ITR、包装信号和腺病毒晚期基因的子集，诸如包含L1、L2、L3、L4、L5、E2A和E4，并携带一个或多个表达盒，所述表达盒携带一种或多种目标基因；和(c)将所述最小修饰的腺病毒载体上的一种或多种目标基因的反义DNA片段转染至所述细胞系中。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述最小修饰的腺病毒载体在不具有腺病毒辅助病毒帮助的情况下被包装至腺病毒衣壳中。

36.如权利要求34所述的方法，其中将携带对宿主细胞有害或有毒功能的一种或多种目标基因的所述最小修饰的腺病毒载体包装至腺病毒衣壳中。

37.一种用于繁殖基于辅助依赖型腺病毒的基因转移载体的方法，其包括：(a)提供腺病毒包装细胞系；(b)将完全缺失的腺病毒载体模块转染至所述细胞系中，所述腺病毒载体模块的构建体包括腺病毒反向末端重复、包装信号和至少一个或多个DNA插入，所述插入包含编码一种或多种目标蛋白质的一个或多个基因序列，但不包含腺病毒结构基因；(c)将编码具有包含L1、L2、L3、L4、L5、E2A和E4的腺病毒晚期基因子集、具有或不具有包装信号的腺病毒辅助病毒的构建体转染或转导至所述细胞系中，其中完全缺失的腺病毒载体构建体和包装构建体可以转染所述腺病毒包装细胞系，导致基于完全缺失的腺病毒的基因转移载体独立于辅助腺病毒载体的衣壳化；和(d)将抑制性表达载体转染至所述细胞系中，所述表达载体携带编码所述基因序列的一个或多个反义构建体的一个或多个表达盒，所述基因序列编码所述完全缺失的腺病毒载体模块上的一种或多种目标蛋白质。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述完全缺失的腺病毒载体模块在不具有腺病毒辅助病毒帮助的情况下被包装至腺病毒衣壳中。

39.如权利要求37所述的方法，其中将携带对宿主细胞有害或有毒功能的一种或多种目标基因的所述完全缺失的腺病毒载体模块包装至腺病毒衣壳中。

40.一种用于繁殖基于辅助依赖型腺病毒的基因转移载体的方法，其包括：(a)提供腺病毒包装细胞系；(b)将完全缺失的腺病毒载体模块转染至所述细胞系中，所述腺病毒载体模块的构建体包括腺病毒反向末端重复、包装信号和至少一个或多个DNA插入，所述插入包含编码一种或多种目标蛋白质的一个或多个基因序列，但不包含腺病毒结构基因；(c)将编码具有包含L1、L2、L3、L4、L5、E2A和E4的腺病毒晚期基因子集、具有或不具有包装信号的腺病毒辅助病毒的构建体转染或转导至所述细胞系中，其中完全缺失的腺病毒载体构建体和包装构建体可以转染所述腺病毒包装细胞系，导致基于完全缺失的腺病毒的基因转移载体独立于辅助腺病毒载体的衣壳化；和(d)将所述完全缺失的腺病毒载体模块上的一种或多种目标基因的反义RNA片段转染至所述细胞系中。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述完全缺失的腺病毒载体模块在不具有腺病毒辅助病毒帮助的情况下被包装至腺病毒衣壳中。

42.如权利要求40所述的方法，其中将携带对宿主细胞有害或有毒功能的一种或多种目标基因的所述完全缺失的腺病毒载体模块包装至腺病毒衣壳中。

43.一种用于繁殖基于辅助依赖型腺病毒的基因转移载体的方法，其包括：(a)提供腺病毒包装细胞系；(b)将完全缺失的腺病毒载体模块转染至所述细胞系中，所述腺病毒载体模块的构建体包括腺病毒反向末端重复、包装信号和至少一个或多个插入，所述插入包含编码一种或多种目标蛋白质的一个或多个基因序列，但不包含腺病毒结构基因；(c)将编码具有包含L1、L2、L3、L4、L5、E2A和E4的腺病毒晚期基因子集、具有或不具有包装信号的腺病毒辅助病毒的构建体转染或转导至所述细胞系中，其中完全缺失的腺病毒载体构建体和包装构建体可以转染所述腺病毒包装细胞系，导致基于完全缺失的腺病毒的基因转移载体独立于辅助腺病毒载体的衣壳化；和(d)将所述完全缺失的腺病毒载体模块上的一种或多种目标基因的反义DNA片段转染至所述细胞系中。

44.如权利要求40所述的方法，其中所述完全缺失的腺病毒载体模块在不具有腺病毒辅助病毒帮助的情况下被包装至腺病毒衣壳中。

45.如权利要求40所述的方法，其中将携带对宿主细胞有害或有毒功能的一种或多种目标基因的所述完全缺失的腺病毒载体模块包装至腺病毒衣壳中。

46.一种用于繁殖基于辅助依赖型腺病毒的基因转移载体的方法，其包括：(a)提供腺病毒包装细胞系；(b)将包装的完全缺失的腺病毒载体模块转导至所述细胞系中，所述腺病毒载体模块的构建体包括腺病毒反向末端重复、包装信号和至少一个或多个DNA插入，所述插入包含编码一种或多种目标蛋白质的一个或多个基因序列，但不包含腺病毒结构基因；(c)将编码具有包含L1、L2、L3、L4、L5、E2A和E4的腺病毒晚期基因子集、具有或不具有包装信号的腺病毒辅助病毒的构建体转染或转导至所述细胞系中，其中完全缺失的腺病毒载体构建体和包装构建体可以转染所述腺病毒包装细胞系，导致基于完全缺失的腺病毒的基因转移载体独立于辅助腺病毒载体的衣壳化；和(d)将抑制性表达载体转染至所述细胞系中，所述表达载体携带编码所述基因序列的一个或多个反义构建体的一个或多个表达盒，所述基因序列编码所述完全缺失的腺病毒载体模块上的一种或多种目标蛋白质。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述完全缺失的腺病毒载体模块在不具有腺病毒辅助病毒帮助的情况下被包装至腺病毒衣壳中。

48.如权利要求46所述的方法，其中将携带对宿主细胞有害或有毒功能的一种或多种目标基因的所述完全缺失的腺病毒载体模块包装至腺病毒衣壳中。

49.一种用于繁殖基于辅助依赖型腺病毒的基因转移载体的方法，其包括：(a)提供腺病毒包装细胞系；(b)将包装的完全缺失的腺病毒载体模块转导至所述细胞系中，所述腺病毒载体模块的构建体包括腺病毒反向末端重复、包装信号和至少一个或多个DNA插入，所述插入包含编码一种或多种目标蛋白质的一个或多个基因序列，但不包含腺病毒结构基因；(c)将编码具有包含L1、L2、L3、L4、L5、E2A和E4的腺病毒晚期基因子集、具有或不具有包装信号的腺病毒辅助病毒的构建体转染或转导至所述细胞系中，其中完全缺失的腺病毒载体构建体和包装构建体可以转染所述腺病毒包装细胞系，导致基于完全缺失的腺病毒的基因转移载体独立于辅助腺病毒载体的衣壳化；和(d)将所述完全缺失的腺病毒载体模块上的一种或多种目标基因的反义RNA片段转染至所述细胞系中。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述完全缺失的腺病毒载体模块在不具有腺病毒辅助病毒帮助的情况下被包装至腺病毒衣壳中。

51.如权利要求49所述的方法，其中将携带对宿主细胞有害或有毒功能的一种或多种目标基因的所述完全缺失的腺病毒载体模块包装至腺病毒衣壳中。

52.一种用于繁殖基于辅助依赖型腺病毒的基因转移载体的方法，其包括：(a)提供腺病毒包装细胞系；(b)将包装的完全缺失的腺病毒载体模块转导至所述细胞系中，所述腺病毒载体模块的构建体包括腺病毒反向末端重复、包装信号和至少一个或多个DNA插入，所述插入包含编码一种或多种目标蛋白质的一个或多个基因序列，但不包含腺病毒结构基因；(c)将具有包含L1、L2、L3、L4、L5、E2A和E4的腺病毒晚期基因子集和包装信号的复制缺陷型环状包装表达质粒转染至所述细胞系中，其中完全缺失的腺病毒载体构建体和包装构建体可以转染所述腺病毒包装细胞系，导致基于完全缺失的腺病毒的基因转移载体独立于辅助腺病毒载体的衣壳化；和(d)将所述完全缺失的腺病毒载体模块上的一种或多种目标基因的反义DNA片段转染至所述细胞系中。

53.如权利要求52所述的方法，其中所述完全缺失的腺病毒载体模块在不具有腺病毒辅助病毒帮助的情况下被包装至腺病毒衣壳中。

54.如权利要求52所述的方法，其中将携带对宿主细胞有害或有毒功能的一种或多种目标基因的所述完全缺失的腺病毒载体模块包装至腺病毒衣壳中。

55.一种用于繁殖基于完全缺失的腺病毒的基因转移载体的方法，其包括：(a)提供腺病毒包装细胞系；(b)将完全缺失的腺病毒载体模块转染至所述细胞系中，所述腺病毒载体模块的构建体包括腺病毒反向末端重复、包装信号和至少一个或多个DNA插入，所述插入包含编码一种或多种目标蛋白质的一个或多个基因序列，但不包含腺病毒结构基因；和(c)将具有包含L1、L2、L3、L4、L5、E2A和E4的腺病毒晚期基因子集和包装信号的复制缺陷型环状包装表达质粒转染至所述细胞系中，所述表达质粒携带编码所述基因序列的一个或多个反义构建体的一个或多个表达盒，所述基因序列编码所述完全缺失的腺病毒载体模块上的一种或多种目标蛋白质，其中完全缺失的腺病毒载体构建体和包装构建体可以转染所述腺病毒包装细胞系，导致基于完全缺失的腺病毒的基因转移载体独立于辅助腺病毒载体的衣壳化。

56.如权利要求55所述的方法，其中所述完全缺失的腺病毒载体模块在不具有腺病毒辅助病毒帮助的情况下被包装至腺病毒衣壳中。

57.如权利要求55所述的方法，其中将携带对宿主细胞有害或有毒功能的一种或多种目标基因的所述完全缺失的腺病毒载体模块包装至腺病毒衣壳中。

58.一种用于繁殖基于完全缺失的腺病毒的基因转移载体的方法，其包括：(a)提供腺病毒包装细胞系；(b)将衣壳化的完全缺失的腺病毒载体转导至所述细胞系中，所述腺病毒载体的构建体包括腺病毒反向末端重复、包装信号和至少一个或多个DNA插入，所述插入包含编码一种或多种目标蛋白质的一个或多个基因序列，但不包含腺病毒结构基因；和(c)将具有包含L1、L2、L3、L4、L5、E2A和E4的腺病毒晚期基因子集和包装信号的复制缺陷型环状包装表达质粒转染至所述细胞系中，所述表达质粒携带编码所述基因序列的一个或多个反义构建体的一个或多个表达盒，所述基因序列编码所述完全缺失的腺病毒载体模块上的一种或多种目标蛋白质，其中完全缺失的腺病毒载体构建体和包装构建体可以转染所述腺病毒包装细胞系，导致基于完全缺失的腺病毒的基因转移载体独立于辅助腺病毒载体的衣壳化。

59.如权利要求58所述的方法，其中所述完全缺失的腺病毒载体模块在不具有腺病毒辅助病毒帮助的情况下被包装至腺病毒衣壳中。

60.如权利要求58所述的方法，其中将携带对宿主细胞有害或有毒功能的一种或多种目标基因的所述完全缺失的腺病毒载体模块包装至腺病毒衣壳中。

61.一种用于繁殖基于辅助依赖型腺病毒的基因转移载体的方法，其包括：(a)提供腺病毒包装细胞系；(b)将完全缺失的腺病毒载体模块转染至所述细胞系中，所述腺病毒载体模块的构建体包括腺病毒反向末端重复、包装信号和至少一个或多个DNA插入，所述插入包含编码一种或多种目标蛋白质的一个或多个基因序列，但不包含腺病毒结构基因；和(c)将编码具有包含L1、L2、L3、L4、L5、E2A和E4的腺病毒晚期基因子集、具有或不具有包装信号的腺病毒辅助病毒的构建体转染或转导至所述细胞系中，所述构建体携带编码所述基因序列的一个或多个反义构建体的一个或多个表达盒，所述基因序列编码所述完全缺失的腺病毒载体模块上的一种或多种目标蛋白质，其中完全缺失的腺病毒载体构建体和包装构建体可以转染所述腺病毒包装细胞系，导致基于完全缺失的腺病毒的基因转移载体独立于辅助腺病毒载体的衣壳化。

62.如权利要求61所述的方法，其中所述完全缺失的腺病毒载体模块在不具有腺病毒辅助病毒帮助的情况下被包装至腺病毒衣壳中。

63.如权利要求61所述的方法，其中将携带对宿主细胞有害或有毒功能的一种或多种目标基因的所述完全缺失的腺病毒载体模块包装至腺病毒衣壳中。

64.一种用于繁殖基于辅助依赖型腺病毒的基因转移载体的方法，其包括：(a)提供腺病毒包装细胞系；(b)将包装的完全缺失的腺病毒载体模块转染至所述细胞系中，所述腺病毒载体模块的构建体包括腺病毒反向末端重复、包装信号和至少一个或多个DNA插入，所述插入包含编码一种或多种目标蛋白质的一个或多个基因序列，但不包含腺病毒结构基因；和(c)将编码具有包含L1、L2、L3、L4、L5、E2A和E4的腺病毒晚期基因子集、具有或不具有包装信号的腺病毒晚期病毒的构建体转染或转导至所述细胞系中，所述构建体携带编码所述基因序列的一个或多个反义构建体的一个或多个表达盒，所述基因序列编码所述完全缺失的腺病毒载体模块上的一种或多种目标蛋白质，其中完全缺失的腺病毒载体构建体和包装构建体可以转染所述腺病毒包装细胞系，导致基于完全缺失的腺病毒的基因转移载体独立于辅助腺病毒载体的衣壳化。

65.如权利要求64所述的方法，其中所述完全缺失的腺病毒载体模块在不具有腺病毒辅助病毒帮助的情况下被包装至腺病毒衣壳中。

66.如权利要求64所述的方法，其中将携带对宿主细胞有害或有毒功能的一种或多种目标基因的所述完全缺失的腺病毒载体模块包装至腺病毒衣壳中。

67.一种用于繁殖病毒载体的方法，其包括：(a)生产细胞；(b)将能够为所述病毒载体的繁殖提供遗传信息的工程化载体基因组递送至所述生产细胞；和(c)将抑制性表达载体递送至所述生产细胞，所述表达载体携带编码基因序列的一个或多个反义构建体的一个或多个表达盒，所述基因序列编码病毒载体基因组内所编码的一种或多种目标蛋白质。

68.如权利要求67所述的方法，其中所述病毒载体属于基于逆转录病毒或基于DNA病毒的载体的组。

69.如权利要求67所述的方法，其中用于所述病毒载体的繁殖的所述遗传信息被分成超过一个DNA片段。

70.如权利要求67所述的方法，其中用于所述病毒载体的繁殖的所述遗传信息以RNA片段的形式传递。

71.一种用于繁殖病毒载体的方法，其包括：(a)生产细胞；(b)将能够为所述病毒载体的繁殖提供遗传信息的工程化载体基因组递送至所述生产细胞；和(c)将基因序列的一个或多个反义构建体的一个或多个抑制性遗传片段递送至所述生产细胞，所述基因序列编码病毒载体基因组内所编码的一种或多种目标蛋白质。

72.如权利要求71所述的方法，其中所述抑制性遗传片段是DNA表达载体。

73.如权利要求71所述的方法，其中所述抑制性遗传片段由DNA构成。

74.如权利要求71所述的方法，其中所述抑制性遗传片段由RNA构成。

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