CN115792075A - 4′-单磷酰脂质a类化合物的检测方法 - Google Patents
4′-单磷酰脂质a类化合物的检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115792075A CN115792075A CN202111060447.4A CN202111060447A CN115792075A CN 115792075 A CN115792075 A CN 115792075A CN 202111060447 A CN202111060447 A CN 202111060447A CN 115792075 A CN115792075 A CN 115792075A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- thin layer
- detection method
- layer chromatography
- sample
- methanol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 title claims abstract description 24
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 17
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 75
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 72
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 34
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 claims abstract description 31
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 claims abstract description 25
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims abstract description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 238000011161 development Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 69
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 11
- KMUONIBRACKNSN-UHFFFAOYSA-N potassium dichromate Chemical compound [K+].[K+].[O-][Cr](=O)(=O)O[Cr]([O-])(=O)=O KMUONIBRACKNSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 9
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 8
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 8
- YGPZYYDTPXVBRA-RTDBHSBRSA-N [(2r,3s,4r,5r,6s)-2-[[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-[[(3r)-3-dodecanoyloxytetradecanoyl]amino]-6-(hydroxymethyl)-5-phosphonooxy-4-[(3r)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl]oxyoxan-2-yl]oxymethyl]-3,6-dihydroxy-5-[[(3r)-3-hydroxytetradecanoyl]amino]oxan-4-yl] (3r)-3-hydr Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](O)O1 YGPZYYDTPXVBRA-RTDBHSBRSA-N 0.000 claims description 7
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 7
- PTKRHFQQMJPPJN-UHFFFAOYSA-N dipotassium;oxido-(oxido(dioxo)chromio)oxy-dioxochromium;sulfuric acid Chemical group [K+].[K+].OS(O)(=O)=O.[O-][Cr](=O)(=O)O[Cr]([O-])(=O)=O PTKRHFQQMJPPJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- GOWLTLODGKPXMN-MWJFIXGVSA-N [(3r)-1-[[(2r,3r,4r,5s,6r)-2-[[(2r,3s,4r,5r,6r)-3,4-dihydroxy-5-[[(3r)-3-hydroxytetradecanoyl]amino]-6-phosphonooxyoxan-2-yl]methoxy]-4-hydroxy-6-(hydroxymethyl)-5-phosphonooxyoxan-3-yl]amino]-1-oxotetradecan-3-yl] dodecanoate Chemical compound O1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1CO[C@H]1[C@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](CO)O1 GOWLTLODGKPXMN-MWJFIXGVSA-N 0.000 claims description 3
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical class O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 abstract description 3
- 238000005507 spraying Methods 0.000 abstract description 3
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 abstract description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 26
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 17
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 15
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 14
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 13
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002585 base Substances 0.000 description 7
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 6
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 6
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000000908 micropen lithography Methods 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical group 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 3
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241001222774 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Minnesota Species 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 description 2
- XORIEPKOPNETRU-UHFFFAOYSA-N acetic acid;dichloromethane;methanol;hydrate Chemical compound O.OC.ClCCl.CC(O)=O XORIEPKOPNETRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- -1 organic base amine Chemical class 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 2
- QAEDZJGFFMLHHQ-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic anhydride Chemical compound FC(F)(F)C(=O)OC(=O)C(F)(F)F QAEDZJGFFMLHHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- FZHXIRIBWMQPQF-UHFFFAOYSA-N Glc-NH2 Natural products O=CC(N)C(O)C(O)C(O)CO FZHXIRIBWMQPQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 150000001447 alkali salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000003973 alkyl amines Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004103 aminoalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- WGLUMOCWFMKWIL-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;methanol Chemical compound OC.ClCCl WGLUMOCWFMKWIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NPBYAAHMSCSBQK-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;n,n-diethylethanamine;methanol;hydrate Chemical compound O.OC.ClCCl.CCN(CC)CC NPBYAAHMSCSBQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000005485 electric heating Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- HWJHWSBFPPPIPD-UHFFFAOYSA-N ethoxyethane;propan-2-one Chemical compound CC(C)=O.CCOCC HWJHWSBFPPPIPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 1
- 150000002190 fatty acyls Chemical group 0.000 description 1
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000008271 glucosaminides Chemical class 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000010439 graphite Substances 0.000 description 1
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 239000011736 potassium bicarbonate Substances 0.000 description 1
- 235000015497 potassium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011181 potassium carbonates Nutrition 0.000 description 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000011118 potassium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 239000012905 visible particle Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明涉及一种4′‑单磷酰脂质A类化合物的薄层色谱检测方法，包括：将样品溶液和对照品溶液点样在薄层板上，利用展开剂展开后，喷洒显色剂进行显色，其中，所述展开剂包括二氯甲烷、甲醇、水和浓氨水；所述展开剂中二氯甲烷、甲醇、水和浓氨水的体积比为(28‑33):(11.5‑13.5):(1.5‑2.5):1。本发明的检测方法采用低毒性的展开剂，可以提高实验安全性，降低对实验人员和环境的危害，同时具有灵敏度高、检测时间短、检测成本低、操作简单、显色容易等优点，能有效准确地检测多种MPL类化合物。
Description
技术领域
本发明涉及一种4′-单磷酰脂质A类化合物的检测方法，具体涉及关于MPL类化合物的薄层色谱检测方法。
背景技术
4′-单磷酰脂质A(4′-monophosphoryl lipidA，MPL)可以通过将从革兰氏阴性细菌的深粗糙突变株提取的LPS(Lipopolysaccharide，LPS)经过酸水解获得，其保留LPS的佐剂特性，同时证明毒性减少超过1000的因数(由鸡胚卵中的致死剂量测量)(Johnson等，1987 Rev.Infect.Dis.9Suppl：S512-S516)。LPS在中等强度的无机酸溶液(如0.1M HCl)中回流大约30分钟(酸水解)导致1位的去磷酸化和6’位的去糖化，产生MPL。MPL是由多种同源物(congeners)组成的混合物。这些同源物的共同点在于骨架均为2-脱氧-2-氨基葡萄糖以β1′→6连接的二糖，并在4’位置有磷酸化修饰；但是，2、2’和3’位置所连接的脂肪酸链在各同源物间存在差异。LPS酸水解获得的MPL进一步温和碱水解可以获得3-O-脱酰基单磷酰脂质A，其具有进一步减少的毒性，同时也保持佐剂性。3-O-脱酰基单磷酰脂质A可以作为疫苗佐剂，其免疫刺激活性包括上调抗原提呈细胞的共刺激分子表达水平和促炎性细胞因子的分泌，进而增强针对抗原的Th1型免疫应答。
欧洲药典中通过气相色谱法定量由MPL在水/甲醇(50:50 V/V)溶液中水解得到的3-氧-脱酰基化-4’-单磷酰基脂A脂肪酸的脂肪酸甲酯(由三氟乙酸酐衍生)来测量MPL的含量。但是该方法的操作步骤复杂，且成本较高。
薄层色谱(Thin Layer Chromatography，TLC)是一种层析分离技术。具有操作方便、设备简单、显色容易、结果直观、展开速率快、兼具分离和鉴定双重功能，以及节省时间、成本低、检测手段多、信息来源广等优点，广泛应用于药品和疫苗的杂质控制。然而，利用薄层色谱检测MPL存在分离效果差和灵敏度较低的缺点。另外，现有的薄层色谱中采用含有氯仿的展开剂，氯仿属于有毒物质，容易对实验人员和环境造成危害，且其购买和使用受公安部门管制，对薄层色谱的推广应用造成了阻碍。
发明内容
本发明的目的是提供一种4′-单磷酰脂质A(MPL)类化合物的薄层色谱检测方法，其中采用低毒性的展开剂，可以提高实验安全性，降低对实验人员和环境的危害。
本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的：
一种4′-单磷酰脂质A类化合物的薄层色谱检测方法，包括：将样品溶液和对照品溶液点样在薄层板上，利用展开剂展开后，喷洒显色剂进行显色，其中，所述展开剂包括二氯甲烷、甲醇、水和浓氨水；所述展开剂中二氯甲烷、甲醇、水和浓氨水的体积比为(28-33):(11.5-13.5):(1.5-2.5):1。
本发明的样品包括但不限于来源于“脂多糖”(LPS)，其来源于革兰阴性细菌的外膜获得的两亲糖磷脂，它具有被称作类脂A的疏水部分和糖部分(多糖或者寡糖)，例如来源于明尼苏达沙门氏菌R595、也可以来源于LPS进一步纯化的酸水解产物、碱水解产物、MPL精制样品(即MPL)。在一些实施例中样品是来自野生型或突变型E.coli的类脂A提取获得的MPL，例如基因工程菌为E.coli W3110通过菌株改造提取后获得的MPL或MPL类似物的检测，在一个实施例中参照CN201680078202.5专利申请文本中公开的技术获得的MPL，在一些实施例中样品为吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)，一种合成的脂质A-样分子(参见，例如Fox等人(2012)Clin.Vaccine Immunol19:1633)。在另外的实施方案中，所述TLR4拮抗剂可以是合成的TLR4激动剂，诸如合成的二糖分子，与MPL和3D-MPL结构类似，或可以是合成的单糖分子，诸如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)化合物。
在一些实施例中，所述展开剂中二氯甲烷、甲醇、水和浓氨水的体积比为(29-32):(12-13):(1.8-2.2):1，最优选为30:12.5:2:1。
在一些实施例中，所述显色剂为硫酸-重铬酸钾溶液；优选地，所述硫酸-重铬酸钾溶液通过将重铬酸钾溶于30-50％的硫酸制备而成，重铬酸钾与硫酸比例为1g:(20-30)mL。
在一些实施例中，所述薄层板上的固相选自硅胶G、硅胶GF254、硅胶H或硅胶HF254中的至少一种。
在一些实施例中，用于溶解样品和对照品的溶剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶液，二氯甲烷和甲醇的体积比为(1.5-4):1。
在一些实施例中，所述样品溶液和对照品溶液的浓度为5～30mg/mL，优选为10-20mg/mL；点样量为20～50μL，优选为30-40μL。
在一些实施例中，薄层色谱检测的温度为15～40℃，优选为20～25℃。
在一些实施例中，薄层色谱检测的相对湿度为10～75％，优选为20％～50％。
在一些实施例中，显色温度为140-180℃，优选为150-170℃，更优选为155-165℃。
在一些实施例中，显色时间为5-50分钟，优选为30-40分钟。
在一些实施例中，所述4′-单磷酰脂质A类化合物选自3-O-脱酰基单磷酰脂质A、RC529佐剂、三酰基脂质A OM-174、E6020佐剂、脂质A类似物ONO-4007、吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)以及SLA佐剂中的至少一种。需要说明的是，本发明所述的4′-单磷酰脂质A类化合物并不限于以上几种，通过选择相应的对照品，本发明所述方法还可以检测其他4′-单磷酰脂质A类化合物。
本发明提供的4′-单磷酰脂质A(MPL)类化合物的薄层色谱检测方法的具体过程如下：
1)样品溶液的制备：称取待测样品，加入体积比(1.5-4):1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液，完全溶解得到浓度为5～30mg/mL的样品溶液。
2)对照品溶液的制备：称取3D-(6-acyl)
(Avanti Polar Lipids,Inc.，货号699855P，一种具有六酰基的3-O-脱酰基单磷酰脂质A)，加入体积比(1.5-4):1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液，完全溶解得到浓度为5～30mg/mL的对照品溶液。
3)展开剂和显色剂的制备：
以二氯甲烷、甲醇、水、浓氨水、三乙胺、乙酸、石油醚和丙酮等试剂以不同组合和比例配制展开剂，其中浓氨水的质量浓度为20-30％，优选为25-28％；
准确量取72.1ml的浓硫酸于提前放置适量水的烧杯中，缓慢加入后搅拌均匀，晾至室温后转移到250ml容量瓶中，定容摇匀，制得40％硫酸，备用；
将5g重铬酸钾溶于100ml 40％硫酸中，混合均匀，制得硫酸-重铬酸钾显色剂。
4)薄层色谱检测：
薄层板的活化：将薄层板放入100-120℃(例如110℃)烘箱中，烘烤30-50min(例如40min)，然后取出置于干燥器中，备用。
记录环境温湿度，打开展开缸，加入少量体积的展开剂，注意展开剂的上沿不得超过薄层板的点样线，为使展开缸达到溶剂蒸气饱和的状态，可以在展开缸的内壁贴与展开缸高、宽同样大小的滤纸，一端浸入展开剂中，密闭，保持约10-20min(例如15min)，使溶剂蒸气达到饱和状态；.
用毛细管将样品点在薄层板上，视样品浓度点样多次，注意待样品干燥后再重复点样，点样量可以为20～50μL；
点样完毕后，将薄层板放至展开缸中，盖上盖子，密闭，展开剂前沿接近薄层板上沿约1cm处停止，取出薄层板；
将薄层板取出后，晾干，均匀喷洒显色剂后，置于石墨电热板上140-180℃干燥5-50min左右显色。如果待测样品与对照品样品在同一位置显示同一颜色斑点则表示样品溶液中含有MPL类化合物。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明所述检测方法可以在确保薄层色谱法检测时间短、检测成本低、操作简单、显色容易等优点的情况下，通过采用低毒性的展开剂提高实验安全性，降低对实验人员和环境的危害，同时本发明所述组成的展开剂具有适当的极性，可以对MPL中具有不同极性的各组分实现较好的分离效果，因而灵敏度高，能有效准确地检测多种MPL类化合物。
附图说明
以下附图仅旨在对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围。其中：
图1为本发明实施例2中的检测结果；
图2和图3为本发明实施例7中的检测结果；
图4为本发明对比例9中的检测结果；
图5为本发明对比例10中的检测结果；
图6为本发明对比例11中的检测结果；
图7为不同点样量下的检测结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
在本发明的说明书中，提及“一个实施例”时均意指在该实施例中描述的具体参数、步骤等至少包含在根据本发明的一个实施例中。因而，在本发明的说明书中，若采用了诸如“根据本发明的一个实施例”、“在一个实施例中”等用语并不用于特指在同一个实施例中，若采用了诸如“在另外的实施例中”、“根据本发明的不同实施例”、“根据本发明另外的实施例”等用语，也并不用于特指提及的特征只能包含在特定的不同的实施例中。本领域的技术人员应该理解，在本发明说明书的一个或者多个实施例中公开的各具体参数、步骤等可以以任何合适的方式组合。
本发明中的4′-单磷酰脂质A类化合物是脂多糖LPS的衍生物，通过酸水解和/或碱水解对LPS分子进行改造，从而降低LPS的毒性、同时保留其大部分甚至全部的免疫调节活性；不同的4′-单磷酰脂质A具有不同数量和/或不同长度的脂肪酰基链，本发明中的4′-单磷酰脂质A可以是3-O-脱酰基单磷酰脂质A、RC529、OM-174、E6020、ONO-4007、GLA以及SLA中的至少一种。
以下实施例中所述的酸水解样品是指LPS经酸水解得到的MPL粗产物，酸水解过程可以为在中等强度的无机酸溶液(如0.1M HCl或硫酸)中回流20-40分钟，去掉LPS分子中的一个或多个酰基链、多糖侧链和三个磷酸基团中的随机2个，得到毒性显著降低的MPL。
以下实施例中所述的碱水解样品是指对上述酸水解样品进一步进行碱水解的产物，碱水解可以进一步去酰基化，从而获得毒性更低的临床佐剂级MPL。碱水解可在水性或有机介质中进行，反应条件可以为在20℃-80℃的温度下进行10-30分钟，反应pH值在10-14之间、优选为12-13.5；上述有机介质可选自甲醇、乙醇、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、氯仿、二氯甲烷等或者它们的混合物，碱性基质可选自无机碱(例如氢氧化物、碳酸盐、磷酸盐等)或有机碱胺(例如烷基胺)等，具体可以为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、二乙胺、三乙胺等。
实施例1样品的制备
(1)LPS样品制备
一级种子培养：取R595菌种(Salmonella minnesota,strain R595)接种于LB培养基中，接种量0.01％，转速150±20rpm，温度37±1℃，培养12～15小时。种子罐培养培养：将装有一级种子液的接种瓶接种入已灭菌30L种子罐(含有14～16升种子培养基，种子培养基的成分包含蛋白胨、蛋白粉和氯化钠)，接种量2～3％。培养过程中控制转速、空气流量，使罐内溶解氧不低于30％；控制罐压在0.3～0.5bar；培养时间5～7h，培养期间每隔1～2小时取样测OD600值及显微镜镜检，当OD600≥2且镜检无杂菌时培养结束。发酵罐培养：将装有种子罐的培养物接种入已灭菌200L发酵罐(含有酵母粉的基础盐培养基，主要成分包含：酵母粉、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化铵、氯化钠、硫酸镁)，接种量6～10％。培养过程中控制转速、空气流量使罐内溶解氧不低于30％，通过50％磷酸、氨水自动调节控制pH值在7.0±0.5；培养期间每隔1～2小时取样测OD600值及显微镜镜检。培养期间溶氧值回升较高时(溶氧显示至少60％以上)，开始补加50％葡萄糖补料培养基。培养至两次间隔OD600比值≤1.105(2小时间隔取样)后，继续培养5～8h，结束培养。
离心收集100L发酵菌体，按照1:5(w/v，kg/L)比例分别用水和75％乙醇(或医用酒精)重悬菌体，50℃加热搅拌1h，再次离心收集菌体，加入95％乙醇重复操作1次；乙醇离心沉淀用甲醇按照1:5(w/v，kg/L)比例重悬，离心收集沉淀，沉淀干燥后制备成约1kg干菌。
1kg菌粉用氯仿-甲醇(4:1，v/v)按照1:10(w/v，kg/L)比例置于反应釜内，50℃搅拌；收集清液，旋转蒸发去除有机相收集析出沉淀，干燥后，获得约50g LPS。
(2)酸水解样品制备(SS)
取50g LPS分散成5mg/ml溶液，按反应体积加入0.25％～0.75％浓盐酸，92～95℃酸水解，二氯甲烷萃取收集下层水解产物，得酸水解样品。
(3)碱水解样品制备(JS)
将酸水解样品进一步用0.5M碳酸盐缓冲液(pH 10.3～11.0)进行碱水解，获得约25g MPL粗品，即为碱水解样品。
(4)MPL精制样品制备
上述MPL粗品上样于阴离子交换层析柱，用乙酸铵梯度洗脱带电物质，收集洗脱液，萃取后，收集下层有机相，并进一步旋转蒸发至干燥，获得约6g MPL精制样品。
(5)MPL制剂冻干样品(ZJ)
MPL精制样品用0.2％三乙胺(TEA)溶液，按照5mg/ml浓度溶解，高剪切力分散，直至无肉眼可见颗粒，透乳光。用0.2μm滤膜过滤。
过滤后溶液分装至已清洗灭菌并去除热原的12ml西林瓶，用胶塞半密封后转移入冻干机中，开启冻干程序。冻干制成MPL成品，2～8℃保存。
在以下的实施例中，对实施例1中制备的LPS、酸水解样品、碱水解样品和制剂冻干样品进行TLC检测。
在配制展开剂的过程中发现，以二氯甲烷、甲醇、水和浓氨水(质量浓度25％，下同)配制展开剂时，各组分的比例对体系的稳定性有明显的影响，例如体积比为45:12.5:2:1、42.5:12.5:2:1、40:12.5:2:1、40:10:2:1、35:12.5:2:1、30:12.5:2:2、30:12.5:3:1、30:11:2:1、30:10:2:1等时出现浑浊，无法用于检测。
实施例2样品检测
将10mg LPS、酸水解样品(SS)、碱水解样品(JS)、MPL制剂冻干样品(ZJ)以及对照品3D-(6-acyl)
分别加入到1ml二氯甲烷和甲醇的混合溶液(体积比2:1)中，超声溶解，得到样品溶液。
取30μL的样品溶液和对照品溶液，分别点样于同一硅胶G薄层板上，将薄层板置于层析缸中，于23℃、44％相对湿度环境中以体积比为30:12.5:2:1的二氯甲烷-甲醇-水-浓氨水混合溶液为展开剂展开，取出晾干；用显色剂喷洒薄层板，在160℃加热30分钟显色，检测结果如图1所示(图中展开方向为自下往上，下同)。
可以看出，酸水解样品呈现分离的斑点，碱水解样品和制剂样品在与对照品相同的位置出现六酰基的MPL，其下方依次为五酰基的MPL的两个异构体和四酰基的MPL，这是由于六酰基的MPL中的脂肪酸链更多，极性更小，因而展开速度更快，对应的斑点出现在最上方。
实施例3样品检测
将20mg LPS、酸水解样品(SS)、碱水解样品(JS)、制剂冻干样品(ZJ)以及对照品3D-(6-acyl)
分别加入到1ml二氯甲烷和甲醇的混合溶液(体积比2:1)中，超声溶解，得到样品溶液。
取20μL的样品溶液和对照品溶液，分别点样于同一硅胶G薄层板上，将薄层板置于层析缸中，于23℃、60％相对湿度环境中以体积比为32.5:12.5:2:1的二氯甲烷-甲醇-水-浓氨水混合溶液为展开剂展开，取出晾干；用显色剂喷洒薄层板，在140℃加热50分钟显色。结果表明，利用该展开剂可以分离并检测不同的MPL，但效果不如实施例2的展开剂。
实施例4样品检测
将10mg LPS、酸水解样品(SS)、碱水解样品(JS)、制剂冻干样品(ZJ)以及对照品3D-(6-acyl)
分别加入到1ml二氯甲烷和甲醇的混合溶液(体积比2:1)中，超声溶解，得到样品溶液。
取40μL的样品溶液和对照品溶液，分别点样于同一硅胶G薄层板上，将薄层板置于层析缸中，于22℃、30％相对湿度环境中以体积比为30:12:2:1的二氯甲烷-甲醇-水-浓氨水混合溶液为展开剂展开，取出晾干；用显色剂喷洒薄层板，在170℃加热30分钟显色。结果表明，利用该展开剂可以分离并检测不同的MPL，但效果不如实施例2的展开剂。
实施例5样品检测
将30mg LPS、酸水解样品(SS)、碱水解样品(JS)、制剂冻干样品(ZJ)以及对照品3D-(6-acyl)
分别加入到1ml二氯甲烷和甲醇的混合溶液(体积比2:1)中，超声溶解，得到样品溶液。
取20μL的样品溶液和对照品溶液，分别点样于同一硅胶G薄层板上，将薄层板置于层析缸中，于22℃、20％相对湿度环境中以体积比为30:12.5:2.5:1的二氯甲烷-甲醇-水-浓氨水混合溶液为展开剂展开，取出晾干；用显色剂喷洒薄层板，在180℃加热30分钟显色。结果表明，利用该展开剂可以分离并检测不同的MPL，但效果不如实施例2的展开剂。
实施例6样品检测
将30mg LPS、酸水解样品(SS)、碱水解样品(JS)、制剂冻干样品(ZJ)以及对照品3D-(6-acyl)
分别加入到1ml二氯甲烷和甲醇的混合溶液(体积比2:1)中，超声溶解，得到样品溶液。
取20μL的样品溶液和对照品溶液，分别点样于同一硅胶G薄层板上，将薄层板置于层析缸中，于22℃、50％相对湿度环境中以体积比为30:12.5:1.5:1的二氯甲烷-甲醇-水-浓氨水混合溶液为展开剂展开，取出晾干；用显色剂喷洒薄层板，在160℃加热30分钟显色。结果表明，利用该展开剂可以分离并检测不同的MPL，但效果不如实施例2的展开剂。
实施例7样品检测
对经DEAE纤维素DE52层析洗脱得到的LPS酸水解和碱水解精制样品洗脱液及精制萃取样品进行TLC检测，检测条件与实施例2相同，可以看出精制样品洗脱液分离效果较佳(图2，底部代码为不同批次样品编号)，精制萃取样品分离效果也较好，但仍有拖尾现象(图3，其中JS24和JS25均为碱水解样品，ZJ为冻干制剂样品，其余代码为不同批次样品编号)，推测可能与萃取前后样品极性或pH有关。
实施例8样品制备与检测
购买MPL-A来源于大肠杆菌，血清型R515(Re)，0.5mg(供应商Hycult，产品货号HC4050)以及对照品3D-(6-acyl)
分别加入到1ml二氯甲烷和甲醇的混合溶液(体积比2:1)中，超声溶解，得到样品和对照品溶液。
取30μL的样品溶液和对照品溶液，分别点样于同一硅胶G薄层板上，将薄层板置于层析缸中，于23℃、44％相对湿度环境中以体积比为30:12.5:2:1的二氯甲烷-甲醇-水-浓氨水混合溶液为展开剂展开，取出晾干；用显色剂喷洒薄层板，在160℃加热30分钟显色，检测结果显示与图1类似。
对比例1
以体积比为20:12.5:2:1的二氯甲烷-甲醇-水-浓氨水混合溶液为展开剂，按照实施例2中的步骤对样品进行检测，检测结果表明该展开剂分离效果较差，同时出现拖尾现象。
对比例2
以体积比为25:12.5:2:1的二氯甲烷-甲醇-水-浓氨水混合溶液为展开剂，按照实施例2中的步骤对样品进行检测，检测结果表明该展开剂分离效果较差，同时出现拖尾现象。
对比例3
以体积比为30:10:2的二氯甲烷-甲醇-浓氨水混合溶液为展开剂，按照实施例2中的步骤对样品进行检测，检测结果表明该无水的展开剂无法对样品进行分离。
对比例4
以体积比为30:15:2:2的二氯甲烷-甲醇-水-浓氨水混合溶液为展开剂，按照实施例2中的步骤对样品进行检测，检测结果表明该展开剂分离效果较差，同时出现拖尾现象。
对比例5
以体积比为30:12.5:2:1.5的二氯甲烷-甲醇-水-浓氨水混合溶液为展开剂，按照实施例2中的步骤对样品进行检测，检测结果表明该展开剂分离效果较差。
对比例6
以体积比为30:15:2:1.5的二氯甲烷-甲醇-水-浓氨水混合溶液为展开剂，按照实施例2中的步骤对样品进行检测，检测结果表明该展开剂分离效果较差，同时出现拖尾现象。
对比例7
以体积比为30:12.5:1:1的二氯甲烷-甲醇-水-浓氨水混合溶液为展开剂，按照实施例2中的步骤对样品进行检测，检测结果表明该展开剂分离效果较差。
对比例8
以体积比为30:12.5:1.5:1.5的二氯甲烷-甲醇-水-浓氨水混合溶液为展开剂，按照实施例2中的步骤对样品进行检测，检测结果表明该展开剂分离效果较差。
对比例9
以二氯甲烷-甲醇-水-三乙胺(30:12.5:2:1)混合溶液为展开剂，展开温度为23℃，相对湿度为20％，其他步骤与实施例2相同，其中JS24和JS25均为碱水解样品。虽然三乙胺和浓氨水均呈现碱性，但利用三乙胺替代浓氨水时分离效果不佳，检测结果如图4所示。
对比例10
以二氯甲烷-甲醇-水-乙酸(25:12.5:2:1)混合溶液为展开剂，其他步骤与实施例2相同，其中SS为LPS酸水解样品，JS为碱水解样品，LH20为经葡聚糖凝胶LH20纯化后的碱水解样品。可见，以二氯甲烷-甲醇-水-乙酸为展开剂时无法实现分离效果，检测结果如图5所示。
对比例11
以石油醚-丙酮(4:1)混合溶液为展开剂，其他步骤与实施例2相同，其中SS为LPS酸水解样品，JS为碱水解样品，LH20为经葡聚糖凝胶LH20纯化后的碱水解样品。可见，以石油醚-丙酮为展开剂时无法实现分离效果，检测结果如图6所示。
本发明中部分实施例和对比例的检测结果如下表所示：
根据上述结果可知，展开剂中二氯甲烷、甲醇、水和浓氨水的体积比为(28-33):(11.5-13.5):(1.5-2.5):1时能够取得较好的分离效果(即相对于1体积的浓氨水，二氯甲烷的用量可以为28、29、30、31、32和33，甲醇的用量可以为11.5、12.0、12.5、13.0和13.5；水的用量可以为1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4和2.5)，并且二氯甲烷-甲醇比例在2.4～2.6，且水-浓氨水体积比2:1时，TLC分离效果最佳。
另外，本发明实施例还考察了不同点样量对检测结果的影响，如图7所示，其中ZJ为制剂冻干样品，其余代码为不同批次样品编号。样品浓度为10mg/mL，从左至右点样量依次增大，结果显示第一组的点样量(10μL)较少，分离效果不佳；第二组的点样量(30μL)适当，呈现出较好的分离效果；第三组点样量(80μL)较大，出现了脱尾的情况。结果表明，在出现拖尾现象的情况下，适当降低点样量，能缓解拖尾现象；在样品浓度为5～25mg/mL时，优选的点样量为20～50μL。
本发明的一些实施例采用硅胶GF254、硅胶HF254等作为薄层板，由于其中含有荧光物质，在紫外光下观测结果时，效果更佳。
本发明提供了一种适用于MPL类化合物检测的新型展开剂，以避免使用氯仿，提高实验安全性，降低对实验人员和环境的危害。同时，本发明所述组成的展开剂具有适当的极性，可以对含有MPL的检测样品不限于LPS样品、酸水解样品、碱水解样品、精制样品及制剂冻干样品中具有不同极性的各组分实现较好的分离效果，因而灵敏度高，因此解决了现有TLC法存在的分离效果差和灵敏度较低的问题，通过建立和实施该检测方法，为佐剂原料MPL类化合物的质量标准制定提供依据，以便更好地控制产品质量，确保食用和药用安全。
以上所述的具体实施例对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种4′-单磷酰脂质A类化合物的薄层色谱检测方法，包括：将样品溶液和对照品溶液点样在薄层板上，利用展开剂展开后，喷洒显色剂进行显色，其特征在于，所述展开剂包括二氯甲烷、甲醇、水和浓氨水；所述展开剂中二氯甲烷、甲醇、水和浓氨水的体积比为(28-33):(11.5-13.5):(1.5-2.5):1。
2.根据权利要求1所述的薄层色谱检测方法，其中，所述展开剂中二氯甲烷、甲醇、水和浓氨水的体积比为(29-32):(12-13):(1.8-2.2):1，最优选为30:12.5:2:1。
3.根据权利要求1所述的薄层色谱检测方法，其中，所述显色剂为硫酸-重铬酸钾溶液；优选地，所述硫酸-重铬酸钾溶液通过将重铬酸钾溶于30-50％的硫酸制备而成，重铬酸钾与硫酸比例为1g:(20-30)mL。
4.根据权利要求1所述的薄层色谱检测方法，其中，薄层板上的固相选自硅胶G、硅胶GF254、硅胶H或硅胶HF254中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的薄层色谱检测方法，其中，用于溶解样品和对照品的溶剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶液，其中二氯甲烷和甲醇的体积比为(1.5-4):1。
6.根据权利要求1所述的薄层色谱检测方法，其中，样品溶液和对照品溶液的浓度为5～30mg/mL，优选为10-20mg/mL；点样量为20～50μL，优选为30-40μL。
7.根据权利要求1所述的薄层色谱检测方法，其中，薄层色谱检测的温度为15～40℃，优选为20～25℃。
8.根据权利要求1所述的薄层色谱检测方法，其中，薄层色谱检测的相对湿度为10～75％，优选为20％～50％。
9.根据权利要求1所述的薄层色谱检测方法，其中，显色温度为140-180℃，优选为150-170℃，更优选为155-165℃。
10.根据权利要求1所述的薄层色谱检测方法，其中，显色时间为5-50分钟，优选为30-40分钟。
11.根据权利要求1所述的薄层色谱检测方法，其中，所述4′-单磷酰脂质A类化合物选自3-O-脱酰基单磷酰脂质A、RC529佐剂、三酰基脂质A OM-174、E6020佐剂、脂质A类似物ONO-4007、吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)以及SLA佐剂中的至少一种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111060447.4A CN115792075B (zh) | 2021-09-10 | 2021-09-10 | 4′-单磷酰脂质a类化合物的检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111060447.4A CN115792075B (zh) | 2021-09-10 | 2021-09-10 | 4′-单磷酰脂质a类化合物的检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115792075A true CN115792075A (zh) | 2023-03-14 |
| CN115792075B CN115792075B (zh) | 2023-11-03 |
Family
ID=85473531
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111060447.4A Active CN115792075B (zh) | 2021-09-10 | 2021-09-10 | 4′-单磷酰脂质a类化合物的检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115792075B (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003089574A2 (en) * | 2002-04-15 | 2003-10-30 | Biomira, Inc. | Synthetic glyco-lipo-peptides as vaccines |
| US20070072825A1 (en) * | 2005-09-28 | 2007-03-29 | Inotek Pharmaceuticals Corporation | N-benzyl substituted pyridyl porphyrin compounds and methods of use thereof |
| WO2007109810A2 (en) * | 2006-03-23 | 2007-09-27 | Novartis Ag | Methods for the preparation of imidazole-containing compounds |
| US20140057299A1 (en) * | 2012-08-21 | 2014-02-27 | Janssen Pharmaceutica Nv | Antibodies to Aripiprazole Haptens and Use Thereof |
| FR3002454A1 (fr) * | 2013-02-26 | 2014-08-29 | Commissariat Energie Atomique | Composition immunogene sous forme d'emulsion |
| WO2016054388A1 (en) * | 2014-10-03 | 2016-04-07 | University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Glutaminase inhibitors |
| US20160136288A1 (en) * | 2013-02-26 | 2016-05-19 | Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives | Immunogenic composition in emulsion form comprising two dispersed phases, one comprising an antigen and the other comprising an immunostimulating agent |
-
2021
- 2021-09-10 CN CN202111060447.4A patent/CN115792075B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003089574A2 (en) * | 2002-04-15 | 2003-10-30 | Biomira, Inc. | Synthetic glyco-lipo-peptides as vaccines |
| US20070072825A1 (en) * | 2005-09-28 | 2007-03-29 | Inotek Pharmaceuticals Corporation | N-benzyl substituted pyridyl porphyrin compounds and methods of use thereof |
| WO2007109810A2 (en) * | 2006-03-23 | 2007-09-27 | Novartis Ag | Methods for the preparation of imidazole-containing compounds |
| US20140057299A1 (en) * | 2012-08-21 | 2014-02-27 | Janssen Pharmaceutica Nv | Antibodies to Aripiprazole Haptens and Use Thereof |
| FR3002454A1 (fr) * | 2013-02-26 | 2014-08-29 | Commissariat Energie Atomique | Composition immunogene sous forme d'emulsion |
| US20160136288A1 (en) * | 2013-02-26 | 2016-05-19 | Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives | Immunogenic composition in emulsion form comprising two dispersed phases, one comprising an antigen and the other comprising an immunostimulating agent |
| WO2016054388A1 (en) * | 2014-10-03 | 2016-04-07 | University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Glutaminase inhibitors |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| YANING HAN等: "Construction of Monophosphoryl Lipid A Producing Escherichia coli Mutants and Comparison of Immuno-Stimulatory Activities of Their Lipopolysaccharides", MAR. DRUGS, vol. 11, pages 363 - 376, XP055397358, DOI: 10.3390/md11020363 * |
| 张丽: "全国普通高等中医药院校药学类专业十三五规划教材 第二轮规划教材 中药分析学", vol. 2, 中国医药科技出版社, pages: 53 - 61 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115792075B (zh) | 2023-11-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5730178B2 (ja) | ３−ｏ−脱アシル化された−４’−モノホスホリルリピドａ（３ｄ−ｍｌａ）の製造法 | |
| Smit et al. | Isolation and structural characterization of the equine erythrocyte receptor for enterotoxigenic Escherichia coli K99 fimbrial adhesin | |
| Taylor et al. | Chemical and biological properties of an extracellular lipopolysaccharide from Escherichia coli grown under lysine-limiting conditions | |
| Smith et al. | Distribution and composition of lipopolysaccharides from mycoplasmas | |
| US9499639B2 (en) | LPS extraction process | |
| CN115792075B (zh) | 4′-单磷酰脂质a类化合物的检测方法 | |
| Greatrex et al. | Synthesis, Formulation, and Adjuvanticity of Monodesmosidic Saponins with Olenanolic Acid, Hederagenin and Gypsogenin Aglycones, and some C‐28 Ester Derivatives | |
| Rooney et al. | Isolation and characterization of 2-keto-3-deoxyoctonate-lipid A from a heptose-deficient mutant of Escherichia coli | |
| Percival et al. | Carrageen mucilage | |
| JP2001247601A (ja) | ロドコッカス属に属する細菌の生産する細胞外多糖及びそれを用いた海洋環境の浄化方法 | |
| Vorob’eva et al. | Some peculiarities of the outer membrane composition of marine Gram-negative bacterium Chryseobacterium indoltheticum CIP 103168 T | |
| SMITH | Mass cultivation of ureaplasmas and some applications |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |